专利名称：：金黄色葡萄球菌中的RNaseⅢ蛋白在金葡菌感染防治中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及金葡菌RNaseIII蛋白的应用，具体而言，本发明涉及RNaseIII蛋白作为核糖核酸酶，参与调控金葡菌毒力蛋白的合成和分泌，从而影响金葡菌分泌毒力因子及抗宿主免疫的能力。因此，RNaseIII蛋白在金葡菌感染的防治领域有良好的应用前景。细菌RNaseIII包含一个特定的核糖核酸酶区和一个双链RNA结合区，属于第一类核糖核酸内切酶家族[MengWetal.(2008)MethodsEnzymo1447:119-29，Carme11MAetal.(2004)NatStructMolBiol11(3):214-8]，其参与了16srRNA和23srRNA从30srRNA前体成熟的过程[MengWetal.(2008)MethodsEnzymol447:119-29]。在E.coli中，RNaseIII还在反义RNA的介导下参与了mRNA的降解过程[DarfeuilleFetal.(2007)MolCell26(3):381-92，WagnerEGetal.(2002)AdvGenet46:361-98]。在金黄色葡萄球菌中，RNaselII在30srRNA的形成中发挥了重要作用[SchaferkordtJetal.(2001)NucleicAcidsRes29(16):3394-3403]，而且参与了重要的毒力调控小RNA分子一RNAIII对耙mRNA的降解过程[DarfeuilleFetal.(2007)MolCell26(3):381-92，WagnerEGetal.(2002)AdvGenet46:361-98]。金葡菌外分泌蛋白中包含大量的毒素(如溶血素、杀白细胞素、肠毒素等)和酶(如血浆凝固酶、e内酰胺酶、透明质酸酶等)，是其致病性的重要组成部分。在革兰氏阳性细菌中，外分泌蛋白的跨膜运输由sec系统所调控，sec系统由secA，secDF和secY组成，。目前在金葡菌中，未见有关sec系统的研究报道。申请人:在实验中发现，在金葡菌RNaseIII缺失突变株中，金葡菌外分泌蛋白的总量明显减少。进一步的实验表明，缺失了RNaseIII的金葡菌，其分泌上清对MDBK细胞的细胞毒性明显降低；在腹膜炎动物模型中，金葡菌RNaseIII突变菌株对Balb/C小鼠的致死率明显下降。实时荧光定量PCR结果表明，在RNaseIII突变菌株中secY的mRNA水平明显下降，将含有secY基因的表达载体转导入RNaseIII突变菌株后，其外分泌蛋白总量与突变株相比明显增多。至此，申请人不仅证明了RNaseIII蛋白在金葡菌蛋白的分泌过程中具有重要作用，而且还阐明了其中的生物学机制，即RNaseIII蛋白作为核糖核酸酶，通过调节secY蛋白的表达，影响了金葡菌外分泌蛋白的分泌过程，从而进一步影响了金葡菌的致病性。由此完成了本发明。
发明内容具体地，本发明提供了1.金葡菌中RNaseIII蛋白在金葡菌感染防治中的应用。其特征在于RNaseIII蛋白具有SEQIDNO2的氨基酸序列。2.权利要求1中RNaseIII蛋白的抑制物在金葡菌感染防治中的应用。3.权利要求1，2中的RNaseIII蛋白，包括天然RNaseIII蛋白，重组RNaseIII蛋白，含RNaseIII蛋白的融合蛋白，RNaseIII蛋白的活性片段等形式。4.核苷酸序列，编码权利要求1中的氨基酸序列SEQIDNO2的核苷酸序列。5.核苷酸序列，编码权利要求2中的氨基酸序列的核苷酸序列。6.权利要求1、2中的氨基酸序列在制备抗金葡菌感染的疫苗中的用途。7.权利要求1、2中的氨基酸序列在制备治疗金葡菌感染的药物中的用途。8.权利要求3、4中的核苷酸序列在制备抗金葡菌感染的疫苗中的用途。9.权利要求3、4中的核苷酸序列在制备治疗金葡菌感染的药物中的用途。图1图2图3图4图5图6图7图8表示金葡菌野生型和RNaseIII突变株的表面电荷实验结果。表示金葡菌野生型和RNaseIII突变株的疏水性实验结果。表示野生型和RNaseIII突变株的MTT法细胞毒性实验结果。表示野生型和RNaseIII突变株的流式细胞术细胞毒性实验结果。表示野生型和RNaseIII突变株的腹膜炎动物实验结果。表示野生型和RNaseIII突变株的菌体总蛋白和外分泌蛋白的鉴定结果,表示野生型和RNaseIII突变株的mRNA表达水平的实时定量PCR结果。表示野生型和RNaseIII突变株的sRNA表达水平的实时定量PCR结果。具体实施例方式为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。实施例1、金葡菌突变体菌株的构建根据拟突变基因上下游各长500800bp序列分别设计引物(见表1)，再通过PCR的方法扩增得到这两段序列；经过重叠PCR将这两段序列扩增为l，OOObp的序列并引入酶切位点KpnI。将经KpnI酶切的卡那基因插入到上述序列中，再将此序列通过EcoRI和SalI连入穿梭载体pAUL-A中，产生质粒pAUL-A-A。将pAUL-A-A电转化S.aureusRN4220，先置于3(TC培养，再42。C培养，通过卡那抗性筛选，得到基因组发生同源重组的RN4220-ARN4220。利用噬菌体(pll裂解ARN4220培养物，将裂解上清加入S.aureus8325-4培养物中，37°C孵育1h，再进一步通过42°C温度筛选和卡那抗性筛选，获得S.aureus8325-4基因组发生双交换的重组菌。进一步通过突变体的基因组PCR、PT-PCR、WesternBlot等方法验证是否该基因发生了突变。利用此方法获得了突变体ARNaseIII。2、金葡菌回复突变体菌株的构建根据拟回复基因序列设计引物(见表1)，再通过PCR的方法扩增得到这段序列并引入酶切位点SalI和EcoRI。将此序列通过EcoRI和SalI连入穿梭载体pMAD中，产生质粒pMAD-gene。将pMAD-gene电转化S.aureusRN4220，置于30。C培养，通过红霉素抗性筛选，得到重组菌RN4220-gene。再从RN4220-gene中提取质粒pMAD-gene，并电转化S.aureusARNaselII，先置于30。C培养，再42。C培养，同时进行红霉素抗性筛选，得到基因组发生同源重组的S.aureusARNaseIII-ARNaseIIIR。进一步通过回复突变体的基因组PCR、PT-PCR、WesternBlot等方法验证是否该基因发生了回复突变。利用此方法获得了回复RNaseIII活性的突变株-ARNaseIIIR。3、表面电荷实验金葡菌过夜培养，离心收取菌体(10，000g，10min)，使用MOPS缓冲液(20mM，pH=7)洗涤两次。使用M0PS缓冲液重悬细菌至0D600=IO，加入细胞色素C至终浓度为O.5mg/ml，共同孵育lh，离心收取上清(13，OOOg，10min)，利用可见光分光光度计测定上清中剩余细胞色素C含量(0D530nm)。与野生型菌株相比，突变株表面电荷明显增强(见图1)4、疏水性实验离心(10，OOOg，10min)收取0.5ml过夜培养金葡菌，PBS缓冲液洗涤两次并用lmlPBS重悬菌体，测定600nm吸光值计算细菌浓度，将300y1N_十六烷溶液加入到细菌悬液顶部，震荡混匀60s，室温放置30min，移出水相，测定水相0D600nm吸光值，计算水相0D600nm吸光值与PBS0D600nm吸光值的比值。结果表明，RNaseIII突变株表面疏水性发生明显下降(图2)。5、MTT法检测细胞毒性实验取96孔细胞培养板，每孔中加0.lml含2X104MDBK细胞的培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养液)，在37°C5%C02的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养23小时让细胞帖壁。每孔加细菌培养上清10iU，4个重复孔。对照孔4个，每孔加10iU细菌培养基。在37°05%(1)2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。吸去培养液，用PBS洗涤一次。每孔加0.lmlPBS和10illMTT染液，在37°C5%C02的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。每孔加含10%SDS的10mmol/LHC1，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。将细胞培养板置于酶联检测仪上测定光密度(0D)值，检测波长595nm。结果显示RNaseIII突变株细胞毒性明显下降(图3)。6、流式细胞术检测细胞毒性实验取6孔细胞培养板，每孔中加lml含1X106MDBK细胞的培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养液)，在37°C5%C02的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养23小时让细胞帖壁。每孔加细菌培养上清100iU，3个重复孔。对照孔3个，每孔加100iU细菌培养基。在37°05%(1)2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。吸去培养液，用PBS洗涤一次，O.25X胰酶消化细胞5min，吹打吸取细胞悬液，离心(1，OOOg，5min)收取细胞，PBS洗涤两次，500ii1PBS重悬细胞，每管加入碘化丙啶(PI)至10mg/ml和FITC标记的annexinV至25ng/ml，室温孵育15min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡数量。结果显示RNaseIII突变之后，金葡菌上清致细胞凋亡及坏死数明显下降(图4)。7、腹膜炎动物实验培养野生型和RNaseIII突变株金葡菌至对数生长早期，离心(10，OOOg，5min)收取菌体，PBS缓冲液洗涤两次，测定0D600nm吸光值，计算细菌数目。将2乂108个金葡菌腹腔注射入4-6周Balb/c小鼠(每组8只)，12h后观察小鼠存活率。结果显示，RNaseIII突变之后，金葡菌对小鼠致死性明显降低(图5)。8、SDS-PAGE实验检测菌体总蛋白和外分泌蛋白培养细菌至对数生长中期，测定0D600吸光值，计算细菌数，离心(10，000g，55min)收取5ml菌体及上清。菌体总蛋白样品制备用lm10.01yg/yl溶葡萄球菌素(lysost即hin)重悬1X108菌体，37。C孵育30min，超声3次，每次30s，间隔30s。取15ii1样品进行15%SDS-PAGE电泳检测。外分泌蛋白取800iU细菌上清，加入三氯乙酸至终浓度为20X，4。C孵育过夜，离心(14，000g，30min)收取沉淀，30yl重悬缓冲液(8M尿素，2M硫脲)重悬沉淀，取15iU样品进行15%SDS-PAGE电泳检测。结果显示，与野生型相比，RNaseIII突变之后，金葡菌菌体总蛋白没有明显改变，但是外分泌蛋白数量明显下降(图6)。9、实时定量PCR检测RNaseIII突变株中mRNA和sRNA表达水平的变化细菌总RNA利用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取，取80y1加入10U无RNA酶的DNaseI(Promega公司)、10ii1DNaseI缓冲液，在100ii1体系中37。C反应30min。取2illRNA进行1.2%甲醛变性胶电泳，以检测RNA的完整性。反转录体系为25yl，其中总RNA1iig，六聚寡核苷酸随机引物(TaKaRa公司)500ng，5iU5X第一链缓冲液，2iU5mMdNTP，20URNasin(TaKaRa公司)，1ii1反转录酶M-MLV(Promega)，65。C反应10min。实时定量PCR体系为25iil，其中12.5ii12XSYBR染料(GenePharma公司)，0.3iiM基因特异的上下游引物(见表1)，1Pl模板。其中样品管的模板为cDNA，阴性对照的模板为去离子水，标准管的模板是以100500ng基因组DNA为模板、利用基因特异的引物扩增目的基因的PCR产物。循环参数为95°C10min，94。C30s变性，58。C30s退火，72。C40s延伸。每个扩增的基因均测定其溶解曲线，以确定PCR产物的特异性。与野生型相比，RNaseIII突变株中某些sRNA和毒力相关mRNA的表达水平发生了明显改变(图7，图8)，表明RNaseIII蛋白可能参与金葡菌中sRNA和毒力相关基因的表达调控。综上可知，本申请通过一系列生物学实验验证了金葡菌中的RNaseIII具有调控金葡菌外分泌蛋白分泌的功能，而且RNaseIII蛋白对金葡菌毒力具有重要影响，由此完成了本发明。表l:引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求金葡菌中RNaseIII蛋白在金葡菌感染防治中的应用。其特征在于RNaseIII蛋白具有SEQIDNO2的氨基酸序列。2.权利要求1中RNaselll蛋白的抑制物在金葡菌感染防治中的应用。3.权利要求1，2中的RNaselll蛋白，包括天然RNaselll蛋白，重组RNaselll蛋白，含RNaselll蛋白的融合蛋白，RNaselll蛋白的活性片段等形式。4.核苷酸序列，编码权利要求1中的氨基酸序列SEQIDNO2的核苷酸序列。5.核苷酸序列，编码权利要求2中的氨基酸序列的核苷酸序列。6.权利要求1、2中的氨基酸序列在制备抗金葡菌感染的疫苗中的用途。7.权利要求1、2中的氨基酸序列在制备治疗金葡菌感染的药物中的用途。8.权利要求3、4中的核苷酸序列在制备抗金葡菌感染的疫苗中的用途。9.权利要求3、4中的核苷酸序列在制备治疗金葡菌感染的药物中的用途。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，涉及金葡菌RNaseIII蛋白的应用。RNaeIII蛋白作为金葡菌中一种核糖核酸酶，参与金葡菌外分泌蛋白的合成和分泌，从而影响金葡菌致病力。因此，RNaseIII蛋白在金葡菌感染的防治领域有良好的应用前景。文档编号A61K45/00GK101791397SQ20101012793公开日2010年8月4日申请日期2010年3月17日优先权日2010年3月17日发明者刘玉,吴娜,杨光,董洁,邵宁生,高亚萍申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所