专利名称：结核Ag85B基因的玉米表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种包含了结核Ag85B基因的玉米表达 载体及其应用。
背景技术：
结核病(tuberculosis，TB)是成人中发病率和致死亡率最高的慢性传染性疾病 之一，是由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis, MTB)引起的。结核杆菌主要通过 呼吸道感染，引起人体内多种脏器疾病，如肺结核、肠结核等。2006年以来全世界每年大约 有9百万新发病例，估计其中有300万死于结核病。WHO预计，2010-2020年将有约10亿人 感染，3500万人死于结核病。联合国已将TB与疟疾、艾滋病列为21世纪重点控制的三大疾 病。我国属于世界上结核病感染人数最多的国家之一，仅次于印度。全国至少5亿以 上人口感染了结核菌，有活动性肺结核患者约600万，具有传染性的约200万人，其中有 80%在农村。每年死于结核病的人约13万之多，是我国各类传染病死亡人数总和的两倍 多。而标准的结核病治疗疗程周期长且较为复杂，耐药菌株的出现，结核与艾滋病双重感 染，使得结核病的防治工作越发严峻。卡介苗是目前唯一的结核病防治疫苗。1920年法国科学家Calmett等经历13年 230此传代培养，获得1株减毒株，命名为卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)，并于 1924年全世界推广应用，迄今已经超过30亿人接种BCG，该疫苗在防治结核病上发挥巨大 作用。但由于BCG在传代和减毒过程中发生变异，它对防治儿童的结核病取得比较好的效 果，对于成人在不同地区的免疫保护力作用差异很大(0 80%)。此外，BCG在临床应用 过程中，出现其他不良反应，如全菌疫苗BCG可引起淋巴结肿大、化脓等、BCG接种干扰了纯 蛋白衍生物(Purified protein derivatives,PPD)诊断MTB感染的价值、BCG接种免疫缺 陷病人可引起全身播散性感染等。因此，研制一种新型长效多价、安全、廉价的结核疫苗成 为结核病防治工作中的当务之急。Ag85B是结核分枝杆菌的主要的早期培养物滤液蛋白之一，是Ag85B复合物中的 成分。Ag85B 复合物包括 Ag85A(30kDa)、Ag85B(31kDa)和 Ag85C(31. 5kDa)，其中，对机体 有保护作用的主要是Ag85A和Ag85B，约占该复合物中60%。Ag85B是目前确认的结核杆 菌蛋白中唯一能诱发保护性免疫的一类蛋白，能诱导较高水平的特异性抗体应答和特异性 Thl型细胞免疫应答，其编码基因长975bp，前120bp的核酸编码信号肽。Dietrich等将包 含粘膜佐剂肠杆菌突变脱毒肠毒素(LTK63)和Ag85B-ESAT-6的疫苗通过鼻粘膜给药，获得 比BCG更强而持久的特异性Thl细胞免疫应答。Elvang等证实Ag85B_TB10. 4亚单位基因 疫苗能促进IFN-Y，IL-2，和TNF-α等细胞因子的分泌，促进⑶4+T和⑶8+T cells分化 增殖，获得较强的细胞免疫和体液免疫。此外，Ag85B蛋白容易结合人纤维蛋白，促进吞噬 细胞吞噬结核杆菌，有较强的防止结核杆菌再感染作用。攻克结核病关键在于尽快开发一种安全、廉价、长效的新型结核疫苗，亦是各国研究人员共同的使命。迄今为止，结核病疫苗的研究主要有减毒活疫苗(live attenuated vaccine)BCG、亚单位疫苗(subunit vaccine)、DNA 疫苗(DNA vaccine)等。由于传统 BCG 在应用中出现种种问题，研究人员尝试用重组BCG、改变免疫途径等办法，以期尽可能刺激 所有的T细胞群体，从而得到更强、更持久的免疫保护力。结核杆菌生长过程中表达具有免疫保护作用的蛋白，主要有热休克蛋白、分泌性 蛋白等，将这些蛋白分离纯化制成菌苗，即亚单位疫苗。此类疫苗能刺激特异性T细胞亚 群，免疫特异性强，无脂多糖，减少毒副作用。但，该疫苗刺激的免疫反应较单一，必须添加 佐剂，并与BCG联合接种，才能引起更强的免疫应答保护机体。结核DNA疫苗是运用分子生物学技术，将目的抗原的编码基因插入到适当的质粒 中，再肌肉注射免疫小鼠，可以诱导出很强的细胞和体液免疫。目前已证实Ag85A、Ag85B、 ESAT26、MPT-63、MPT-64、MPT-83、HSP65、HSP70和Psts23等编码基因的质粒免疫小鼠可产 生很强的细胞与体液免疫应答。从20世纪90年代初提出转基因植物口服疫苗的概念，随着基因克隆技术不断完 善和发展，植物基因工程发展迅猛，对转基因口服疫苗的研究越来越多。具体过程包括将病 原微生物中与机体保护性的免疫应答相关的蛋白的编码基因克隆出来构建穿梭质粒载体， 然后利用根瘤农杆菌或基因枪等方法，将携带目的基因的载体转化入植物中，从而用转基 因植物作为生物反应器，使与机体保护性的免疫应答相关的蛋白在转达基因植物组织中以 较低的生产成本生产出来，并且以口服形式接种动物以达到使动物获得免疫保护的目的。转基因植物疫苗是将植物分子生物学技术与机体免疫机理相结合，使外源基因在 植物中表达，免疫人体后获得特异性抗体的新型疫苗，和其他疫苗相比有安全、高效、廉价、 易运输、易推广等优点。但外源基因在植物中低表达是研究人员面临的重大难题之一，开发 并建立高效表达体系和高效植物表达载体的研究是克服该问题的重要途径。理论上，用于 生产口服疫苗的植物反应器要需符合以下条件①表达蛋白的含量较高，至少能占可溶性 总蛋白0. 01-0. 1%;②抗原蛋白的浓度要稳定、一致，以便定量口服；③常温下长期保存，并 保证抗原蛋白生物活性稳定；④转基因植物表达抗原蛋白的组织要可口、服用方便；⑤种 植技术普及，人人可种植。玉米作为植物反应器候选之一，具有其独特的优势①表达外源性蛋白的玉米种 子在常温下至少保存一年；②抗原蛋白浓度稳定；③检测到在转基因玉米中表达的LT-B蛋 白占可溶性总蛋白0. 05% 0. 到之间，有的达到1.8%。Jeffrey和St印hen等在对外 源性基因Lt-B表达进行定位，发现其编码的蛋白被定位到液泡当中蛋白表达量最高，其次 是在细胞表面，再次是在内质网中，而定位到细胞核或质体当中，或者不进行定位时蛋白表 达量最低。相反，Lt-B基因在烟叶中或马铃薯茎中表达时，定位在内质网的蛋白质表达量 可达到在细胞表面的三到四倍；④玉米是全世界三大主食之一，广受人们的喜爱。正因为玉 米具备多项优势，已经成功表达外源性基因，并取得较好的效果。1986年Fromm等首次在玉 米中成功表达除草剂pat基因，经过约十年深入研究，1995年后转基因玉米已经进入商业 化阶段。其中，抗虫(Bt)转基因玉米和除草剂已经被批准商业化。到了 2005年，全球转基 因玉米种植面积超过2120万hm2，转基因玉米市场价值达到19. 1亿美元。当然，玉米真正 成为人类防治传染病的口服疫苗，还需要进一步探索。
发明内容
本发明的目在于克服现有技术的缺点，提供一种包含结核Ag85B基因的玉米表达 载体的构建方法。本发明的另一目的在于提供上述方法构建的玉米表达载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种包含了结核Ag85B基因的玉米表达载 体的构建方法，包括以下步骤(1)根据MTB_Ag85B序列设计1对引物上游引物序列为Pl5' -TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3'，含 BamH I 酶 切位点和起始密码子；下游引物序列为P25' -CGCGCT GGATCCTCAAATGTATACCCAAAG-3 ‘，含 XbaI 酶切 位点和终止密码子；
(2)提取人结核分支杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，用步骤(1)设计的引物Pl 和P2进行常规 链式聚合酶反应扩增结核Ag85B基因；(3)pCRG_Ag85B 载体的构建用BamH I和XbaI分别双酶切步骤(2)所得结核Ag85B基因和 pCR-G(pCR-Globulin)载体，经琼脂糖电泳分离，纯化后进行连接、转化获得重组质粒 pCRG-Ag85B ；(4)重组载体pCAMG_Ag85B的克隆与构建将重组载体pCRG_Ag85B用Hindi 11和Xba I双酶切，经过琼脂糖电泳分离、纯化， 得到G-Ag85B片段；将植物表达载体pCAMBIA-1300-N0S分别用HindIII和Xba I双酶切， 再将酶切产物与上述G-Ag85B片段进行连接、转化筛选获得重组载体pCAMG-Ag85B。步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94°C预变性5min， 然后进入下列循环94°C、45S，52°C、45S，72°C、60S，共进行30个循环，最后72°C延伸 lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为lOumol/1的上游引物Pl 1 μ 1浓度为IOumo 1/1的下游引物Ρ2 1 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1H37Rv 基因组 DNA4 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 μ 1Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 μ 1灭菌水34. 75 μ 1。上述方法构建的结核Ag85B基因的玉米表达载体作为制备疫苗的用途。该载体是 植物双元表达载体，可以携带结核Ag85B基因被转化到农杆菌中，介导转化玉米幼胚，继而 获得玉米转基因植株，也可以将结核Ag85B基因整合到植物基因组中，使抗原基因在植物 中正常表达出含有结核Ag85B基因的表达蛋白质作为口服疫苗。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果本发明选择具有驱动外 源性基因在组织或器官表达特异性和高水平表达的双重优势的玉米种子特异性启动子 Globulin-Ι，构建了由玉米种子特异表达启动子Globulin-I调控的结核优势结核Ag85B基因，使其特异、高效地在玉米种子中表达，可以克服组成型启动子在应用中的缺陷，这一研 究在国内外鲜有报道；目前，发明人已经利用农杆菌介导转化玉米幼胚，获得部分转基因植 株，为进一步研究利用转基因玉米生产结核Ag85B基因口服疫苗的免疫效果奠定基础。
图1为重组载体pCAMG_Ag85B的构建示意图。图2是PCR扩增的结核Ag85B基因，其中，Ml为 DNA marker DL_1200(bp) ； 1 2 为结核 Ag85B 基因的 PCR 产物；M2 为 DNA marker DL-10000(bp)。图3为重组载体pCAMG_Ag85B双酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中，Ml为 DNA markerDL-1200 (bp) ；1 为 pCAMG_Ag85B 的 BamH I 和 Xba I 双酶 切产物；M2 为 DNA marker DL-10000 (bp)。图4为在农杆菌中提取出的pCAMG_Ag85B重组质粒的双酶切鉴定图，其中，Ml为 DNA marker DL_1200(bp) ；1 为 pCAMG-L 的 BamH I 和 Xbal 双酶切产 物。图5为载体pCRG构建示意图。图6为载体pCRG示意图。图7为载体pCAMBIA-1300-N0S构建示意图。图 8 为载体 pCAMBIA-1300-N0S 示意图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。在下面实施中所要用到的材料为质粒pUC18购于华美生物工程公司；PCR2. 1与pCAMBIA1300均购于上海二医新 生基因科技有限公司；PBI 121购于北京天恩泽基因公司；Globulin-1基因根据Genbank 上登录号(M24845. 1 GI =168480)，由大连宝生物公司合成；Bar基因根据Genbank上登录号 (X05822. 1 GI 47126)由上海英骏生物有限公司合成。人结核分支杆菌H37Rv购自中科院微生物菌种保藏中心；大肠杆菌E. coli T0P10购自天津天有利科技有限公司。试剂Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶(HindIII、Xba I和BamH I)和DL-lkb Ladder购自大连宝生物公司；试剂盒(质粒提取试剂盒，PCR产物清洁试剂 盒，DNA胶回收纯化试剂盒)购自OMEGA公司；PCR引物合成和重组质粒上目的基因的序列 测定均由上海生工生物工程公司完成。农杆菌菌株LBA4404购自Invitrogen公司。培养基LB培养基用于大肠杆菌 的培养。YEB培养基用于农杆菌的培养。实施例1 包含了结核Ag85B基因的玉米表达载体pCAMG_Ag85B的构建示意图如 图1所示(1)克隆基因引物的设计
根据MTB_Ag85B序列设计1对引物上游引物序列为P15' -TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3'，含 BamHI 酶 切位点和起始密码子；下游引物序列为P25' -CGCGCT GGATCCTCAAATGTATACCCAAAG-3 ‘，含 Xbal 酶切 位点和终止密码子。(2)PCR反应与克隆人结核分支杆菌H37Rv基因组DNA的提取与纯化将MTB H37Rv接种于改良罗氏 培养基，器皿口加橡皮塞于37°C培养，每周观察1次；结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2 4 周长成肉眼可见的菌落；培养2-4周后，刮取少量细菌于生理盐水中磨菌，用OMEGA细菌基 因组DNA抽提试剂盒提取纯化基因组DNA ；以上述方法提取的基因组DNA为模板，用引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应， 扩增Ag85B基因，扩增的PCR产物大小约为860bp ；所述常规链式聚合酶反应具体步骤如 下将混合液在94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C、45s，52°C、45s，72°C、60s，共进 行30个循环，最后72°C延伸lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为10umol/l的上游引物PI 1 Pi浓度为10umol/l的下游引物P2 lu 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 u 1H37Rv 基因组 DNA4 u 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 u 1Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 ii 1灭菌水34. 75u 1 ；将扩增产物分离纯化后，用1XTAE电泳缓冲液制备质量百分比浓度为1. 0%的琼 脂糖凝胶，取其中5 yl进行电泳，以DNAmarker DLlkb分子量参照，在紫外透射分析仪下观 察PCR产物片段大小，并拍照；结果如图2所示，产物片段大小与预期结果相符。(3) pCRG-Ag85B 载体的构建用BamH I和Xbal分别双酶切步骤(2)所得结核Ag85B基因和 pCR-G(pCR-Globulin)载体，酶切后用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离，并经过DNA凝胶回 收纯化试剂盒回收酶切产物，将上述酶切纯化的产物按照3 1的摩尔比混合，用T4DNA 连接酶连接过夜；转化至低温CaC12制备的大肠杆菌E. coli ToplO感受态中，然后涂布含 50 u g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中；次日，随机挑取多个单菌落，分别接种于3mL含 卡那霉素的LB培养液中，37°C下130r/min振荡培养过夜；先取少量菌液煮沸作为模板进行 菌液PCR检测是否有Ag85B的存在，再将菌液PCR筛选呈阳性的菌落用质粒小量提取试剂 盒抽提质粒DNA ；将提取的质粒DNA进行双酶切鉴定，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行 测序鉴定；测序采用Sanger双脱氧链终止法，对插入序列的两端进行测定，测序工作由上 海生物工程有限公司完成；所述pCR-G载体的构建方法(构建示意图见5)如下用Hindlll和BamHI分别 双酶切Globulin-1和pCR2. 1，经质量分数为0. 8%的琼脂糖分离，用胶回收试剂盒回收酶 切产物，将两个回收片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌T0P10，酶切鉴定获得pCR-G载体(示意图见7)。(4)重组载体pCAMG_Ag85B的克隆与构建将测序正确的重组载体pCRG_Ag85B用HindiII和Xba I双酶切，经过琼 脂糖电泳分离、纯化，得到G-Ag85B片段；将植物表达载体pCAMBIA-1300-N0S (载体 PCAMBIA-1300-N0S示意图如图7所示)用Hindlll和Xba I双酶切；用胶回收试剂盒纯化 回收上述酶切产物，并以3 1的摩尔比混合，用T4DNA连接酶连接过夜；转化至低温CaC12 制备的E. coliToplO感受态中，然后涂布50ii g/mL卡那霉素的LB固体培养基中；次日，随 机挑取单菌落接种于LB培养液中，37°C下振荡培养过夜；首先进行菌液PCR鉴定，抽提质粒 DNA，进行双酶切鉴定(见图3)，获得重组载体pCAMG-Ag85B ；所述pCAMBIA-1300-N0S载体的构建方法(见图6)如下通过per技术以PBI 121 为模板扩增N0S终止子，用SacI和EcoRI完全双酶切N0S和pUC18，经1 %琼脂糖分离后用 胶回收试剂盒纯化回收酶切产物，将二者以T4连接酶连接，然后转化大肠杆菌，酶切鉴定 重组质粒，命名为PUC18-N0S ；再用Xbal和EcoRI酶切pUC18_N0S，回收含有N0S及部分多 克隆位点的DNA片段，与经Xbal和EcoRI酶切的质粒pCAMBIA_130连接、转化，获得的重组 质粒命名为pCAMBIA-1300-N0S ；用Xho I切除质粒pCAMBIA-1300_N0S内潮霉素抗性基因， 回收并进行末端脱磷酸；将含有bar基因片段的DNA与pCAMBIA-1300_N0S连接，转化获得 的重组质粒，测序鉴定，将构建的质粒的命名为pCAMBIA-1300-N0S-Bar (见图8)。实施例2提取筛选实施例1所得重组表达载体pCAMG_Ag85B，转化农杆菌LBA4404 预先制 备农杆菌LBA4404感受态，储存于_80°C冰箱备用；取200 u L感受态细胞，冰上放置30min ； 将1 ii gDNA加入感受态细胞中，液氮中速冻5min以上；37°C水浴快速解冻小于5min ；加入 800 uL LB培养基；28°C摇床低速培养3h ；取200 u L涂布于含50 u g/mL卡那霉素的平板， 28°C摇床培养2d 3d ；经菌落PCR验证，挑选阳性克隆子摇菌，提取质粒后用Hindlll和 Xba I双酶切进行双酶切鉴定，最终确定重组质粒转入到了 LBA4404中，_80°C保存菌株。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种包含了结核Ag85B基因的玉米表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)根据MTB-Ag85B序列设计1对引物上游引物序列为P1 5′-TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3′，含BamH I酶切位点和起始密码子；下游引物序列为P2 5′-CGCGCT GGATCCTCAAATGTATACCCAAAG-3′，含XbaI酶切位点和终止密码子；(2)提取人结核分支杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增结核Ag85B基因；(3)pCRG-Ag85B载体的构建用BamH I和XbaI分别双酶切步骤(2)所得结核Ag85B基因和pCR-G载体，经琼脂糖电泳分离，纯化后进行连接、转化获得重组质粒pCRG-Ag85B；(4)重组载体pCAMG-Ag85B的克隆与构建将重组载体pCRG-Ag85B用HindIII和Xba I双酶切，经过琼脂糖电泳分离、纯化，得到G-Ag85B片段；将植物表达载体pCAMBIA1300用HindIII和Xba I双酶切，再将酶切产物与上述G-Ag85B片段进行连接、转化筛选获得重组载体pCAMG-Ag85B。
2.根据权利要求1所述的一种包含了结核Ag85B基因的玉米表达载体的构建方法， 其特征在于步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在94°C预变性 5min,然后进入下列循环94°C、45s，52°C、45s，72°C、60s，共进行30个循环，最后72°C延伸 lOmin，扩增完毕后置4°C终止反应；所述混合液组成如下浓度为lOumol/1的上游引物PI1 yl浓度为lOumol/1的下游引物P21 ill dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度各为2. 5mM的dNTP混合物4 u 1H37Rv 基因组 DNA4 u 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液5 u 1Ex耐热性DNA聚合酶0. 25 ill灭菌水34. 75 ill。
3.根据权利要求1所述方法构建的玉米表达载体作为制备疫苗的用途。
全文摘要
本发明公开了一种包含了结核Ag85B基因的玉米表达载体及其应用。该载体的构建方法是(1)根据结核Ag85B基因的编码序列设计1对引物P1和P2；(2)用引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增结核Ag85B基因；(3)pCRG-Ag85B载体的构建；(4)重组载体pCRG-Ag85B的构建，并转化农杆菌。本发明选择具有驱动外源性基因在组织或器官表达特异性和高水平表达的双重优势的玉米种子特异性启动子Globulin-1，构建了由玉米种子特异表达启动子Globulin-1调控的结核优势结核Ag85B基因，使其特异、高效地在玉米种子中表达。本发明结核Ag85B基因的玉米表达载体可用于制备疫苗。
文档编号A61P31/06GK101845456SQ20101014085
公开日2010年9月29日 申请日期2010年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者李君武 申请人:暨南大学