专利名称：一种革兰氏阳性菌dna疫苗及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种革兰氏阳性菌DNA疫苗及其构建和应用。
背景技术：
海豚链球菌(Str印tococcus iniae)是一种革兰氏阳性菌，能够感染人、动物和多 种鱼类，包括罗非鱼、真鲷、牙鲆、鲈鱼、虹鳟、大菱鲆、条石斑等。海豚链球菌已被公认为一 种重要的水产养殖病原菌，每年给我国以及世界养殖业造成巨大的经济损失。目前，商业化 海豚链球菌疫苗只有简单的灭活疫苗，这种疫苗在以色列的使用已证明其具有各种缺点， 包括保护效应短并具有区域性等。不同于简单的灭活疫苗，DNA疫苗是一种分子疫苗，其构 建原理是用将疫苗抗原基因克隆于真核表达载体，随后将携带疫苗抗原的表达载体导入所 要免疫的动物；随着疫苗载体进入宿主动物细胞，疫苗抗原在机体细胞内表达、合成并刺激 机体的免疫系统，从而诱发一系列保护性免疫应答。研究表明，灭活疫苗主要诱发以抗体为 主的体液免疫，而DNA疫苗则既能诱发体液免疫也能诱发细胞免疫，并且其免疫效应可以 很长。另外，DNA疫苗具有稳定、应用简单、可以长期储存等优点，因而是一种具有良好应用 和发展前景的疫苗形式。目前在水产养殖中，针对细菌的DNA疫苗很少。
发明内容
本发明目的在于提供一种革兰氏阳性菌DNA疫苗及其构建和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种革兰氏阳性菌DNA疫苗疫苗序列表由SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。构建以海豚链球菌G26为模板，用引物F4和R2进行PCR扩增，扩增产物与载 体pBS-T连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α而后在含有100Ug/ml安卡青霉素(Ap)、 40ug/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(Xgal)和24ug/ml异丙基-β -D-硫代半乳 糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养，挑出白色转化子，提取质粒；所得质粒用SmaI酶切， 回收0. 5kb片段，同时将质粒pCN3用SmaI酶切回收5. 5kb片段，将上述回收的两片段用 T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有Ap(100ug/ml) 的LB固体培养基上培养24小时，挑取转化子，提取质粒，即为含有序列表SEQ ID No. 1中 的碱基序列的DNA疫苗质粒pCNSlO ；所述引物F4为5，-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAA TCAAA-3' ；R2 为 5’ -CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3，。应用所述DNA疫苗对海豚链球菌具有免疫保护作用。所述DNA疫苗使牙鲆对海 豚链球菌具有免疫保护作用。所述将DNA疫苗质粒溶于PBS至浓度为200ug/ml，DNA疫苗 悬液以100-120ul的剂量对鱼类进行肌肉注射。本发明具有如下优点1.高保护率。本发明的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达86%以上。2.长效。本发明的疫苗在免疫后两个月的保护效率仍然可达86.7%。
3.安全。本发明的疫苗没有任何细胞毒性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相 应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrookand Russell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1DNA疫苗由序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。序列表1ATGAAAAAAATCGCAACTATTACTACATTAACAGCAGGCATTGGCGCTGCATATTTCGGTACAACTGCT CATCACGCAGATGCTGCAGAATTTAATCAATCAAATAATCAATCATATAATTATAATACAGCTCAAACATCTACTAGCAA TACTACATCAGAAAGATCTGCTTCTGGTAACTTATATACAGCTGGTCAATGTACTTGGTACGTTTATGACAAAGTTGGCG GAAAAGTAGGCTCAACTTGGGGAGACGCTAGAAACTGGGCATCAGCTGCACAACAAGCTGGTTATACAGTCAATCATACA CCAAAAGCTGGATCAATTTTACAATCATCAGCAGGTGGTTATGGTCACGTTGCTTATGTTGAAAGTGTTGGTTCTGACGG TTCAGTTACAGTTTCTGAAATGAACTATAGCGGTGGACCTTTCTCAGTAAGCACACGTACTATTTCTGCAGGTGAAGCAA GCTCATATAATTATATTCATATCTAA(a)序列特征 长度495bp 类型碱基序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型双链DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源海豚链球菌G26(f)特异性名称SiGHlO实施例2
海豚链球菌DNA疫苗的构建方法以海豚链球菌G26为模板，采用F4/R2为引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C 60s 预变性模板 DNA，然后 94°C 40s, 47 °C 60s, 72 °C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s, 65 °C 60s， 72°C 60s，25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒 纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2-4 小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5ci后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml 5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(Xgal)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 的LB固体培养基上培养18小时，挑出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBSSlO。将pBSSlO 用SmaI酶切回收0. 5kb片段，同时将质粒pCN3用SmaI酶切回收5. 5kb片段(所述质粒 pCN3 Jiao X, Zhang Μ, Hu Y, Sun L. Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiellatarda antigens. Vaccine. 2009 ；27 5195-5202)；将上 述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含 有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，挑取转化子，提取质粒，命名为pCNSlO。 将pCNSlO用引物CNFl (5，-TGCGTTTCTGATAGGCACCTAT-3，)测序，结果表明其含有序列表 SEQ ID No. 1中的疫苗碱基序列。所述LB组成成分按重量百分比计1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 1984，分类命名为海豚链球菌(Sti^ptococcus iniae)。
所述弓丨物 F4 为 5，-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3，和 R2 为 5，-CTCGA GCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。实施例3海豚链球菌DNA疫苗的应用步骤1)疫苗制备液的制备。将上述所得质粒pCNSlO悬浮于PBS中至终浓度为 200ug/ml,即为DNA疫苗制备液。所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2P04。步骤2)疫苗的免疫注射。将50条牙鲆(每条重约9g)随机分为2组(25条/ 组)，分别命名为A和B。将A组(免疫组)的每条鱼肌肉注射IOOul上述步骤1)的DNA 疫苗制备液，将B组(对照组)的每条鱼肌肉注射IOOul PBS0步骤3)海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中培养海豚链球菌G26至0D_为 0. 7，然后以5000g，4°C离心lOmin。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为2 X 108cfu/ml， 即为海豚链球菌悬液。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第60天，用上述步骤 3)的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后 的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组， 2条；B组，15条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = 100X (1_免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)据此算出DNA疫苗针对海豚链球菌的免疫保护效率为86. 7%。故本发明的DNA疫苗能够高效并较长期性地保护牙鲆抵御海豚链球菌感染。
权利要求
一种革兰氏阳性菌DNA疫苗，其特征在于疫苗序列表由SEQ IDNo.1中的碱基序列所示。
2.一种按权利要求1所述的革兰氏阳性菌DNA疫苗的构建，其特征在于以海豚链球菌G26为模板，用引物F4和R2进行PCR扩增，扩增产物与载体pBS_T连 接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α而后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml 5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(Xgal)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 的LB固体培养基上培养，挑出白色转化子，提取质粒；所得质粒用SmaI酶切，回收0. 5kb片 段，同时将质粒PCN3用SmaI酶切回收5. 5kb片段，将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于 室温连接2-4小时，连接液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有Ap (100ug/ml)的LB固体培养基 上培养24小时，挑取转化子，提取质粒，即为含有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的DNA 疫苗质粒pCNSlO ；所述引物 F4 为 5’ -CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3，；R2 为 5’ -CTCGAGCCCG GGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。
3.一种按按权利要求1所述的革兰氏阳性菌DNA疫苗的应用，其特征在于所述DNA疫 苗对海豚链球菌具有免疫保护作用。
4.按权利要求3所述的革兰氏阳性菌DNA疫苗的应用，其特征在于所述DNA疫苗使 牙鲆对海豚链球菌具有免疫保护作用。
5.按权利要求3所述的革兰氏阳性菌DNA疫苗的应用，其特征在于所述将DNA疫苗 质粒溶于PBS至浓度为200ug/ml，DNA疫苗悬液以100_120ul的剂量对鱼类进行肌肉注射。
全文摘要
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种革兰氏阳性菌DNA疫苗及其构建和应用。所述疫苗具序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。其制备方法利用真核表达载体pCN3构建海豚链球菌DNA疫苗质粒pCNS10，后者悬浮于PBS中即可作为DNA疫苗。DNA疫苗对海豚链球菌具有免疫保护作用。本发明所得对海豚链球菌具有免疫保护作用的DNA疫苗为国际上首次构建，其应用简单，一次免疫即可达到高效和长期的免疫保护效果。
文档编号A61P31/04GK101837133SQ20101015185
公开日2010年9月22日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者孙云, 孙黎 申请人:中国科学院海洋研究所