专利名称：Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途，尤其是Immt基因敲除鼠模型的培育方法及Immt基因敲除鼠作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠的用途，并为寻找治疗神经退行性疾病药物提供模型。
背景技术：
随着后基因组时代的来临，对基因功能特别是基因体内功能和作用机理的研究越来越重要。基因打靶这一技术的发明和应用为基因功能的研究翻开了革命性一页，2007年 10月 8 日，美国科学家 Mario R. Capecchi 和 Oliver Smithies 英国科学家 Martin J. Evans 因为基因打靶技术的建立，分享了 2007年诺贝尔生理学和医学奖。基因诱捕是一种高通量的基因打靶技术。运用这种技术可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体和筛选ES克隆的工作及费用，可以更有效、更快捷地进行小鼠基因功能分析。线粒体是细胞内重要的亚细胞器，不仅是细胞的“能量工厂”，为机体提供ATP，而且细胞内90%以上的活性氧(ROS)来自于线粒体，在细胞的钙稳态中发挥重要的作用。线粒体在神经组织中扮演重要角色，ATP生成降低，ROS生成增多，钙稳态失衡，都会引起神经退行性变。神经退行性变疾病给人们的生产生活带来很大的灾难。目前对神经退行性变疾病发病原因及其发病机制还不是很清楚。因而，在科学研究中，需要提供一种神经退行性疾病发病机制的研究的小鼠动物模型。I匪T(InnerMembrane Protein of Mitochondria(IMMT))是线粒体内膜蛋白，现有技术中，小鼠Immt基因位于6号染色体，基因组长441Λ，有15个外显子，其转录本为2. 71Λ，编码758个氨基酸。目前Immt基因敲除鼠还没有文献报道。
发明内容
本发明的技术方案是Immt基因敲除鼠的培育方法，成年后杂合子小鼠显现神经退行性变的行为，其特征在于，包含下述步骤在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养胚胎干细胞，收集Immt突变的产生Immt基因敲除的胚胎干细胞(ES)，制备小鼠供体囊胚，将Immt基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚，将含有Immt敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫，该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠，小鼠随机进入种系的嵌合体小鼠，得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。在本发明所述的Immt基因敲除鼠的培育方法的实施方案中，所述的胚胎干细胞优选是AW0256株胚胎干细胞。
在本发明所述的Immt基因敲除鼠的培育方法实施方案中，优选将12-15个Immt 基因敲除的胚胎干细胞注入囊胚腔。在本发明所述的Immt基因敲除鼠的培育方法实施方案中，优选所述的胚胎干细胞显示Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第观34个碱基后。本发明还提供一种Immt基因敲除鼠作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠的用途。换言之,本发明人从Wellcome Trust Sanger Institute 的Gene Trap胚胎干细胞 (ES)库中选取AW0256株细胞，通过5' RACE对Immt基因诱捕突变ES株进行鉴定，确认其插入位点在第三内含子内，诱捕后Immt基因后12个外显子均无转录本。通过囊胚注射，将 Immt突变的胚胎干细胞(EQ注入到受体胚胎中，得到进入种系的嵌合体。将得到进入种系的嵌合体，与C57BL/6J回交后得到仔鼠，通过PCR初筛，Immtv_杂合子通过5‘ RACE实验再次证明载体插在第三内含子，再结合PCR分段扩增测序，获知载体插入的具体位置，根据此来分别设计引物，一对与诱捕载体插入位置的基因退火，另一对与Immt基因退火，PCR的鉴定结果再进一步通过Southern blot确认，在mRNA水平验证其诱捕效率，结果证明E7. 5 天的Immt+纯合子，Immt转录终止在第三外显子，IMMT失去了后面大部分有活性的区域。 观察八月至12月龄Immt杂合子的步态，利用Morris水迷宫检测杂合子的学习与记忆能力，结果发现，部分缺失IMMT会导致其步态不稳，学习记忆能力下降，并且随着与C57BL/6J 回交代数的增多，即遗传背景的纯化，出现上述症状的鼠龄提前。
图1:显示5' RACE设计方案图IA显示了 5 ‘ RACE第一轮PCR结果图IB显示了 5 ‘ RACE第二轮PCR结果图1C、D、E、F测序结果显示Immt Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第观34个碱基后图2 显示了 Immt基因敲除鼠Southern印记鉴定引物的设计图3 显示了 Immt基因敲除鼠在转录水平鉴定的引物设计。图4:显示Immt基因敲除鼠基因组PCR鉴定结果(图4A)，转录水平鉴定结果(图 4B)，Southern印记鉴定结果(图4C)，及蛋白水平鉴定结果(图4D)。图5 显示Immt有表型的杂合子异常的步态。图6 显示Immt有表型的杂合子异常的游泳轨迹及与同窝野生型比较减退的学习记忆能力。
具体实施例方式以下将结合附图，进一步说明本发明，通过参考下述的一些具体实施例可进一步理解本发明，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明做出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。实施例1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备及培养
滋养层细胞培养液成分500ml DMEM, 6ml L-Glutamine，6ml 非必需氨基酸，6ml 青链霉素溶液.4ul β -巯基乙醇，90ml胎牛血清。用一次性滤器过滤，4°C保存。细胞冻存液30%胎牛血清，63% DMEM,7% DMS0，现用现配并且预冷。上述所有试剂均购自美国GIBCO公司。小鼠原代胚胎成纤维细胞制备引颈处死妊娠13. 5d的雌鼠(什么种类的小鼠？)。75%酒精喷湿消毒，在超净台打开腹腔，取出有胚胎的雌鼠子宫；在无菌PBS中分离胚胎，去除卵黄囊、羊膜和胎盘；将胎鼠移入另一装有无菌PBS的培养皿中，去除内脏、头；在无菌PBS中洗净，用无菌的眼科剪将胎鼠剪碎后移入15mL离心管中，加anL PBS，IOOOrpm离心，2min，弃上清。加入5mL 0. 25%胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，37°C消化15min后，加入适量滋养层细胞培养液终止反应，IOOOrpm离心，2min,弃上清。加入适量培养液，吹打成细胞悬液，转移到IOcm培养皿中，37°C，5% C02培养。 一般在第3天细胞长满培养皿，经传4代后，此细胞即原代小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)。小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备将丝裂霉素C (Roche公司)按0. lmg/ml的浓度添加到培养的MEF细胞中，37°C继续培养2 3h，MEF细胞停止增殖，此时即可用作ES细胞培养的滋养层。经丝裂霉素C处理得到的滋养层细胞也可冻存备用。实施例2ES细胞的培养ES细胞培养液DMEM高糖培养基，添加15%胎牛血清，1000u/ml的LIF，2mM的L-谷氨酰胺，0. ImM 非必需氨基酸，ImM丙酮酸钠，1000X β-巯基乙醇。ES细胞的复苏及传代培养本领域技术人员都可以直接从Wellcome Trust Sanger Institute的Gene Trap 胚胎干细胞(ES)库中获得AW0256细胞株。购买网站http://mmrrc. compmed. ucdavis. edu/ index, py ？ _action_ = baygen取出冻存的ES细胞，即胚胎干细胞AW0256株，将其迅速置于37°C水浴中，使细胞悬液尽快融化；将融化的细胞悬液吸到已预先加入5mL ES细胞培养液的无菌离心管中，吹打混勻，IOOOrpm, 2min,弃上清。加入ES细胞培养液，吹打成细胞悬液，移入已预先铺好经实施例1得到滋养层细胞的IOOmrn培养皿中，补加适量的培养液至总体积约为10mL，将培养皿放入37°C，5% C02培养。ES细胞的传代，吸去原培养液，加入IOmL PBS洗涤2次。加入2mL 0. 25%胰蛋白酶，37°C消化5min ；加入5mL ES细胞培养液终止消化，用吸管轻轻吹打，移入无菌离心管中，1000rpm，2min，弃上清。加入ES细胞培养液，吹打成细胞悬液。按1 3或1 6的比例移入已预先铺好滋养层细胞的IOcm培养皿中，补加适量的培养液至总体积约为IOml将培养皿放入37°C， 5% C02培养，每天更换新鲜的ES细胞培养液。
ES细胞的冻存在冻存前2 池给ES细胞更换新鲜的培养液。按现有技术ES细胞传代培养的步骤将细胞进行消化洗涤后，用冻存液(预冷)悬浮细胞，使细胞充分分散，将其转移至冻存管中。快速移到保温材料内(厚消毒脱脂棉)，_80°C保存，24h后移到液氮中。囊胚沣射生长在滋养层上的ES细胞，从一个ES细胞，迅速生长为一个小集落，在倒置显微镜下，ES细胞集落呈岛状或巢状，向四周生长，细胞集落与周围滋养层细胞存在明显界限， 集落内部细胞之间连接致密，相差显微镜下细胞表面有折光较强的脂状小滴，而单个细胞体积较小，细胞核大。ES细胞生长迅速，且易分化，隔天培养后即进行囊胚注射。Gene-Trap方法获得的是高通量基因突变ES细胞，故注射前一定要将待注射的突变ES细胞再鉴定，首先通过5’ RACE来确定所用的细胞株是否是Immt突变。结果显示，在AW0256ES突变细胞系中，Genelrap载体是插入在Immt基因第三外显子后，形成携带有前三个外显子及β-geo的融合蛋白。而在进一步的基因组的PCR及测序结果显示，Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第观34个碱基后，基因组 PCR的结果如图1所示。实施例3供体囊胚的制备很多因素都可以影响囊胚的数量，如小鼠的品系、小鼠的健康状况、适应性、超排卵和实验时所处的季节等等。本发明采用3 5周龄(12g 14g)，C57BL/6J的雌鼠。超排卵供体小鼠的准备挑选12 14g的C57BL/6J的不动情雌鼠，在第一天下午，腹腔注射5IU的孕马血清(PMS)。距前次注射PMS的时间不超过48h，腹腔注射5IU的人绒膜促性腺激素(HCG)，并将雌鼠转移至有种雄鼠的笼中交配。第四天9:00前检查有阴栓者为供体雌鼠，单笼放置，此天记作0.5天。同天下午再挑选左右的昆明白动情雌鼠与输精管结扎的雄鼠交配。第五天9 00前检查有阴栓者为受体雌鼠，单笼放置。第七天，即在交配后的第四天，收集供体雌鼠子宫中的囊胚。囊胚的收集和培养引颈处死3. 5dpc的超排卵供体C57BL/6J雌鼠，70%的酒精棉球消毒腹部，在腹中线处做一横向切口。剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。将肠组织向上提到翻转的腹膜上，找到子宫，用剪刀将左右两侧子宫在输卵管与子宫角的衔接剪下，然后小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。再用剪刀分别在子宫头与子宫尾剪去输卵管及子宫角部分，使得两根单独的子宫通畅。用5ml的一次性注射器吸取足量的M2，套上5号针头，在体视解剖镜下插入子宫腔，推动注射针栓，正反方向冲洗子宫腔，子宫在冲洗时会轻度膨胀，小鼠胚胎将迅速沉至培养皿底部。取一个35mm的培养皿，滴上数滴Brinster，s BM0C-3培养液(Sigma)，每滴约 200ul，上面覆盖上矿物油(Sigma)。
在体视解剖镜下用移卵管收集胚胎，并转移至石蜡油密封的培养液滴中，置于 37°C>5% C02培养箱中培养2小时。囊胚沣射操作步骤将持卵管、注射针的针管和操作平皿充满石蜡油。用显微镜的微调将其调至相同的聚焦平面。注射用的ES细胞应在数天前解冻，注射当天早晨换上新鲜的ES培养液，1-2小时后胰酶处理，做成单细胞悬液保存在Brinster’ s BM0C-3培养液中。从35mm培养皿中挑选约10个形态饱满、边界清晰、囊胚腔较大的囊胚转移至安装好持卵管和注射针的注射槽内，用移卵管吸取少量的ES细胞放入其中。在10倍镜下用注射针吸取12 15枚小而圆的ES细胞。40倍镜下用持卵管吸附囊胚的一侧，将注射针调整至对准囊胚的中心并使他们处于同一水平面。转动注射针的操纵杆，使注射针快速刺破囊胚的壁，进入囊胚腔，推动注射泵使ES 细胞(12-15个)顺序进入囊胚腔，小心拔出注射针。将注射过的囊胚放置在操作视野的另一侧，继续下一个囊胚的注射。旋至10倍镜下用移卵管吸取注射后的囊胚到大培养皿中，置于加了 Brinster' sBM0C-3 (Sigma)培养液滴里培养，做好标记，以备移植。实施例4胚胎的子宫移植将移卵管接上口控管，在体视解剖镜下依次小心吸入培养液、气泡、培养液、气泡、 注射后的囊胚、气泡、少量培养液。麻醉受体雌鼠，用75%酒精消毒受体鼠背部，在右侧靠近第一腰锥的部位做一个 Icm的横向切口。向两侧拉展直至可透过腹膜看见右侧卵巢及其脂肪垫。在腹膜上用尖镊撕一个3mm的小口。左手夹住脂肪垫向外拉出，子宫随之可见。用小号止血钳夹住少许脂肪垫稍作固定。左手持尖镊夹住在子宫和输卵管接口处附近2mm远的子宫壁，右手持一个4号注射器针头和移卵管。在解剖显微镜下.针头在紧挨尖镊处避开血管扎一个小孔，将移卵管的前端小心插入小孔中。将实施例3得到的胚胎缓慢吹入子宫中。子宫和肠系膜送回腹腔，封闭切口。如果移植手术成功，17天后可有幼鼠出生， 数天后可从毛色上判断是否获得高嵌合度的嵌合体小鼠。其中获得进入种系的嵌合体与 C57BL/6J交配，获得Immt杂合子。敲除鼠基因型(Genotype)鉴定实施例5利用PCR鉴定敲除鼠剪下经实施例4得到的Immt杂合子小鼠的耳(约3mm2)或脚趾于鼠耳消化液中， 55°C消化至少4小时，煮沸5-10分钟，室温12，OOOrpm离心5分钟，上清即可作为PCR模板。鼠耳消化液成分KC1 500mM, Tris-HCl IOOmM,明胶 0. lmg/ml, NP-400. 45 %, Tween200. 45 %，蛋白酶 K (临用时加入)0. 5mg/ml。用于鉴定Lac Z 的引物S :AAGCGGTGAAGTGCCTCTGG ；ACGTTAGGGTCAATGCGGGTC
片段大小为422bp。反应条件94°C5 分钟，(94 °C 20 秒，53 °C 20 秒，72 °C 30 秒)30 循环，72 V 10 分
钟。结果详见图4A。 实施例6利用Southern杂交鉴定敲除鼠从Immt杂合子鼠组织中提取DNA在1.5ml Eppendorf (EP)管中，加入 530 μ 1 鼠尾抽提缓冲液(IOmM Tris-HCl, pH7. 4, IOmM NaCl, 25mM EDTA) ,70 μ 1 10% SDS、40 μ 1 蛋白酶 K(10mg/ml)，混勻。取实施例4得到的小鼠，剪取 2cm长鼠尾，以微火焰去毛，放入上述1中的EP管。 鼠尾创口用烧烫的大镊子止血。以消毒过的手术剪剪碎鼠尾(15 30’)，至溶液浑浊、无明显大的组织块，55°C保温过夜，不时轻轻颠倒混勻。消化完全后，加入70 μ 1 5MNaCl。加入20ul RNase A (10mg/ml)，37 °C lh。冷却至室温，加等体积Tris饱和酚 (ρΗ8· 0)，缓慢来回颠倒离心管IOmin形成乳浊液。12000 13000rpm, 5 IOmin0将Iml枪头剪去枪尖，用火烤圆。用此枪头将粘稠的水相移至一洁净的1. 5EP管中。再用酚抽提一次。用酚氯仿异丙醇05 24 1)抽提2次。用氯仿抽提一次。水相不太粘稠后可用200ul枪头吸取，同样需剪去枪尖，用火烤圆。沉淀DNA 加1/20 1/10体积3M NaAc (pH5. 2)，混勻。加2倍体积无水乙醇(或等体积异丙醇，如用异丙醇沉淀则不加NaAc)，缓慢来回颠倒离心管混勻，可见白色丝状沉淀生成。将200ul枪头剪去枪尖，用火烤圆。用此枪头将沉淀挑出或吸出，移入新管。70% 乙醇洗涤沉淀两次将沉淀悬起，缓慢来回颠倒离心管，12，000 13，OOOrpm, 5 ~ IOmin0用真空泵吸去液体，尽可能彻底除去70%乙醇，室温晾干至可见的痕量乙醇挥发殆尽。不要使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解。加100 400ul TE (pH8. 0)充分溶解DNA 50 55°C水浴过夜。不时摇晃。溶液粘稠，成透明胶体状。测OD 测前55°C温育，稀释40倍，1. 75，否则表明制备物中存留有显著的蛋白质，影响酶切；如太高，> 2. 0表明制备物中存留有较多的RNA。计算DNA浓度， 可稀释为lug/ul。DNA质量鉴定电泳0. 7%琼脂糖，>> 231Λ，Iul，DNA主带应清晰无降解。将DNA 溶液保存于4°C。不能存于一 20°C或一 80°C，冷冻过程中的张力会使DNA断裂。取15 μ g上述提取的细胞基因组DNA，在200 μ L反应体系中用150U EcoRI和Bgl II酶切24h (杂交目的片段为2. Ikb和51Λ)。酶切体系的配制要点是充分混勻。取1. 5 μ L 在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳，观察是否完全酶解。如仍有主带，再加入30U酶切4h。向酶解样品中加入等体积的酚氯仿，混勻IOmin后，12，000r/min离心IOminJf 上清转移到一个新的1. 5mlEP管中，加入1/10体积的3mol/L NaAC，两倍体积的乙醇，混勻后 _20°C放置 2h，12，000r/min, 4°C离心 lOmin，弃上清，用 70% 乙醇洗涤一次，12，000r/min 4°C离心lOmin，弃上清。
晾干后，加入15 μ L TE溶解。取1 μ L稀释到80 μ L测量0D260nm值及0拟80nm 值，计算DNA浓度。取10 μ g酶切后的细胞基因组DNA，在琼脂糖凝胶上于lV/cm条件下电泳，待溴酚兰泳动至距点样孔约12cm处，停止电泳。电泳完毕，EB染色后紫外灯下观察电泳结果，呈现均一的弥散状，拍照后，估计条带所在的位置，切除多余的边缘。凝胶经变性、中和。将胶块倒置于水平玻璃上，胶下有纸桥与20XSSC相连，胶上依次覆盖有尼龙膜、 Whatman 3M滤纸、普通新华滤纸或吸水纸及500g重物。室温下转移12 Mh。转移完毕，检查硝酸纤维素膜上及胶上EB染料分布情况，判断转移效率。用滤纸吸去多余水分，室温晾干Ih后进行紫外交联。将转移了 DNA的尼龙膜在6X SSC中润湿后， 放入杂交管中，加入适量的快速杂交液，42°C预杂交40min。在等待预杂交的过程中标记探针。探针的标记按照随机引物标记试剂盒提供的说明书操作，具体方法如下在微量离心管中配置下列反应液，95°C加热;3min后迅速置于冰中冷却，放置加入IOX 缓冲液，dNTP mixture 各 2. 5 μ L，由于标记的 dCTP 5 μ L.力口入 1 μ L Exo-free Klenow Fragment, 37"Cβ.jS lOmin。65°C加热5min使酶失活，95°C加热3min后迅速置于冰中冷却，放置5min。取适量的反应液作为探针。探针模板对应于Immt基因组DNA的第三内含子中，用PCR产物切胶回收的方法得到。PCR引物序列如下S CCTAACTAGGCAGTTCATTCTCATAAGAGGTGGGAAGGGAAGCAAATC预杂交结束后加入标记好的探针，继续杂交1. 5 2h。杂交结束后洗膜，放射自显影观察结果。探针设计及Southern引物设计见图2所示。Southern结果详见图4(C)实施例7在转录水平鉴定Immt基因敲除鼠提取总RNA采用TRIZOL法提取胚胎组织的总RNA，具体方法如下胚胎组织置于勻浆器中，加入TRIZOL lmL，放置冰上勻浆，待样品充分破碎并溶于 TRIZOL中，室温放置5min，用移液器将样品小心吸入1. 5mLEP管中。加入200 μ L氯仿，用手猛烈震荡15s，室温静置2 ;3min，4°C 15，OOOr/min离心15min，此时样品分为三层下层为红色的酚-氯仿层，中层呈云雾状，上层为含RNA的透明水相。小心地将上清液转移至新的1. 5mLEp管中，加入500 μ L异丙醇，此时可见管内有絮状RNA沉淀，摇勻，室温孵育10min，4°C 15，OOOr/min离心lOmin，此时可见离心管底部和侧壁出现白色或浅黄色RNA沉淀。立即弃上清，加入75%乙醇lmL，涡旋震荡RNA沉淀，4°C 10，OOOr/min离心lOmin。
5min。
权利要求
1.Immt基因敲除鼠的培育方法，成年后杂合子小鼠显现神经退行性变的行为，其特征在于，包含下述步骤在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养胚胎干细胞， 收集Immt突变的产生Immt基因敲除的胚胎干细胞(ES)， 制备小鼠供体囊胚，将Immt基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚， 将含有Immt敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫， 该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠， 小鼠随机进入种系的嵌合体小鼠，得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。
2.根据权利要求1所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于所述的胚胎干细胞是AW0256株胚胎干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于将12-15个 Immt基因敲除的胚胎干细胞注入囊胚腔。
4.根据权利要求1或2所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于所述的胚胎干细胞显示Gene-Trap载体是插入在Immt基因的第三内含子的第观34个碱基后。
5.根据权利要求1或2所述的Immt基因敲除鼠的培育方法，其特征在于将Immt突变的胚胎干细胞(EQ注入到受体胚胎中，得到进入种系的嵌合体。
6.如权利要求1所述的Immt基因敲除鼠作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠的用途。
全文摘要
本发明涉及Immt基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途，尤其是Immt基因敲除鼠模型的培育方法及Immt基因敲除鼠作为神经退行性疾病发病研究的模型鼠的用途，并为寻找治疗神经退行性疾病药物提供模型。
文档编号A61B19/00GK102257988SQ20101018647
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者刘光, 刘德培, 孙立红, 张媛, 杨瑞锋, 梁植权, 肖培根, 陈厚早 申请人:中国医学科学院基础医学研究所