专利名称：一种复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及疫苗佐剂领域，具体涉及一种可以和抗原形成组合物的复方黄芪多糖和紫锥菊提取物油包水纳米乳佐剂，具有增强抗原的免疫效果，用于动物疾病的预防和治疗。
背景技术：
近年来，随着越来越多的动物疾病或者人畜共患疾病的发生，对疫苗生产的需求 和要求也越来越高。但实际在疫苗的应用中往往发现有多方面的缺点，出现了种种问题① 目前商品化灭活苗和弱毒苗尽管都可减轻临床症状，但不能阻止病毒的再次感染和病猪的 排毒；②各地所分离的病毒致病力往往也是不一样的，甚至同一病毒的重复性也不是很好， 且有时效性，导致生产的灭活疫苗和弱毒疫苗往往使用效果不佳；③灭活疫苗虽然安全，但 产生的保护力不强，往往需要反复多次的免疫接种；④和灭活苗相比，弱毒疫苗诱导的免疫 反应持续时间较长，也较有效，但本身存在散毒问题，而且有返强的潜在危险。因此，开发新型疫苗佐剂，有效提高疫苗使用效果，减少疫苗使用时的散毒问题， 将是防疫的研究重点。本项目拟通过先进的纳米技术，将已证明具有良好的免疫增强效果 的中药多糖应用于蓝耳病疫苗佐剂中，充分发挥纳米技术具有的药物控制释放、提高药物 疗效等作用和多糖良好的免疫增强效果，研制开发出一种高效、安全的纳米疫苗佐剂，以解 决实际生产中动物疾病频繁发生的问题。为增强疫苗的免疫原性，常在病毒性疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗的研制中加入免疫 佐剂。免疫佐剂是一种免疫调节剂，可以先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内，能非 特异性地增强抗原的免疫原性，提高免疫效果。紫锥菊属(Echinacea Moenck)植物是原产 于美洲的一类菊科野生花卉，也称“松果菊”。其紫锥菊药用历史可追溯到北美印地安人时 期。印第安人将紫锥菊的根咀嚼后吐渣吞汁，用于治疗咳嗽和咽喉炎。紫锥菊还可治疗扁 桃体炎、口腔溃疡、急性腹痛、感冒、败血病、狂犬病、虫鳌、蛇毒、淋病、烧伤、烫伤等，在印第 安人心目中紫锥菊历来被视为神草。紫锥菊属植物制剂可作为免疫促进和调节剂，有许多 剂型已大量用于临床。而中药黄芪多糖作为一类有效的抗病毒物质，预示着其在疫苗佐剂 领域将有着重要的应用，已经被越来越多的研究者重视。纳米乳剂是指乳滴的直径大小处在纳米尺度的一种特殊的乳剂。一般情况下，将 两种互不相溶液体在表面活性剂作用下形成的热力学稳定的、各向同性、外观透明或半透 明、粒径I-IOOnm的分散体系称为纳米乳液。纳米乳液作为极具潜力的新型药物载体，具有 其他药物载体不可比拟的优点物理稳定性好；可提高难溶性药物的溶解度；可促进大分 子水溶性药物在体内的吸收，提高药物的生物利用度，等等。油佐剂是目前在动物用灭活疫 苗中使用较广的佐剂，但这类佐剂通常为油包水乳剂，不稳定，较粘稠，注射时需要用力，且 矿物油在机体内不易分散和代谢，容易产生红斑、脓疱等局部副反应，影响动物外形和肉类 的品质。而本发明纳米乳油包水佐剂用植物油或动物油取代不可代谢的矿物油，筛选性质良好的表面活性剂，采用更先进的乳化工艺，制备出粘稠度低，毒副小、便于使用的新型佐剂苗
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种复方黄芪多 糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂，该纳米乳佐剂生产工艺简单、黏度合适、稳定性好、高效和 副作用小的油包水佐剂。实现上述发明目的技术方案是，一种复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂， 该纳米乳佐剂的粒径在1 IOOnm之间，由下述重量百分比的原料组成紫锥菊提取物 0. 10% 2. 00%、黄芪多糖0. 10% 10. 00%、表面活性剂15. 00% 60. 00%、助表面活性 剂1.00% 15. 00%、油1.50% 25. 00%、余量为蒸馏水，上述原料的总重量为100%。本发明复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂的优选配比为紫锥菊提取物 0. 50%~ 1. 50%、黄芪多糖1.00%~ 5. 00%、表面活性剂25. 00% 45. 00%、助表面活性 剂5. 00% 10. 00%、油5. 00% 20. 00%，余量为蒸馏水，上述原料的总重量为100%。本发明所述的表面活性剂是HLB >8的非离子表面活性剂，优先选用聚司盘80、司 盘60、吐温-80和吐温-60中的一种或几种的混合。本发明所述的助表面活性剂是乙醇、聚乙二醇200、甘油和丙二醇中的一种或几种。本发明所述的油为花生油、橄榄油、肉豆蔻酸异丙酯、维生素E油、液体石蜡和麦 芽油中的一种或几种。本发明的另一目的是提供上述复方黄芪多糖和紫锥菊提取物油包水型纳米乳佐 剂的制备方法，包括以下步骤1)称取黄芪多糖、紫锥菊提取物、表面活性剂、助表面活性剂、油和蒸馏水，备用；2)在室温下将表面活性剂、助表面活性剂和油搅拌均勻形成，所得即为油相；3)室温下，将黄芪多糖和紫锥菊提取物溶于蒸馏水中，搅拌使其完全溶解，所得即 为水相；4)室温下，将油相缓慢滴加到水相中，滴加的同时不断搅拌，直至形成透明的体 系，即得。与现有技术相比，本发明复方黄芪多糖和紫锥菊提取物油包水型纳米乳佐剂具以 下优点1)本发明制备方法简单、不需特殊设备；所制的复方纳米乳佐剂黏度低、方便注 射，于4 8°C或者室温存放保持透明态，不会出现药物析出、分层等现象。2)本发明原料易获得，具有较好的生物相容性；复方纳米乳佐剂在相同的抗原使 用量时，增强了抗原的免疫原性，提高了疫苗的免疫效果，在一定程度上降低了养殖成本； 通过改良配方组成，降低了动物对疫苗的注射反应。3)本发明复方纳米乳佐剂配苗时无须特殊乳化，只需简单混合，对设备要求低，操 作简单，产品质量容易控制。
图1为纳米乳佐剂的透射电镜照片。
具体实施例方式试验例1纳米乳佐剂的理化性质1. 1外观和pH值本发明的纳米乳佐剂为淡黄色透明液体，流动性良好，pH为6. 71。1.2黏度取出口内径为1.2mm玻璃吸管，吸取lmL样品，室温条件下记录流出 0.4mL样品所需要的时间(s)，即为其黏度。本发明的纳米乳佐剂黏度为4. 60s。1. 3形态观察纳米乳佐剂用蒸馏水适当稀释后，滴在覆有支持膜的铜网上，静置 lOmin，再滴加3%的磷钨酸溶液于铜网上负染5min，自然挥干，透射电子镜下纳米乳呈圆 球形，见附图1。1. 4粒径及其分布Zetasizer Nano ZS纳米粒度仪测得纳米乳佐剂的粒径分布。 其平均粒径为45. 2nm,粒径在33. 8 78. 8nm的粒子占97. 7 %，大于78. 8nm或小于33. 8nm 的粒子仅占2. 3%。本发明的纳米乳佐剂的粒径分布范围窄，粒径比较均勻。1. 5稳定性考察纳米乳佐剂于lOOOOrpm速度离心lOmin，仍保持透明均一的外观，未出现分层和 药物析出等现象。将纳米乳佐剂分装于西林瓶中，密封包装后，分别于4、25、37、40、60°C及强光 (4500士500) lx条件下放置，于第15天和第30天取样，测定pH值、乳滴粒径和药物含量 (黄芪多糖)等各指标，见表1。纳米乳佐剂在4、25、37、40°C和光照条件下放置30d，液体 保持澄清透明状态，未见分层、絮凝和破乳，PH值、乳滴粒径和药物含量未见明显变化。但 在60°C条件下，纳米乳佐剂变浑浊，置室温下又恢复澄清透明态。表明本发明纳米乳佐剂在 室温或4°C较为稳定。表1纳米乳佐剂的稳定性 试验例2纳米乳佐剂的免疫佐剂效应试验将ICR雌性小鼠随机分成12组，每组10只。具体分组分别为生理盐水组，OVA抗原 (100 u g/只)组，其余各组在0VA抗原(100 u g/只)基础上，分别加入铝胶(Alum 50 u g/ 只)，或由不同剂量的黄芪多糖(APS)和紫锥菊提取物(EM)制备的纳米乳佐剂。小鼠首免 后21d进行二次免疫，颈部皮下注射0. 4ml药物，二免后2周采血，分离血清，ELISA检测血 清0VA诱导特异性抗体水平，实验数据用支表示，所有数据用SAS软件处理，检查各组间 的差异性。并观察免疫前后小鼠行为和体重变化。
第一次免疫后各组小鼠少量出现怕冷应激反应和体重有所下降外，但很快消失， 体重逐渐恢复正常生长趋势；二免后各组小鼠体重没有发生明显变化，小鼠在食欲和行动 能力等方面均无异常变化。各组OVA受免小鼠血清特异性抗体水平的影响见表2。表2各组受免小鼠血清OVA诱导特异性抗体水平的影响(n = 10，I士S ) 注a表示与OVA抗原组比较，P< 0.05 ;b表示与Alum+OVA抗原组比较，P < 0. 05。由表2可知，小鼠二次免疫后，Alum+OVA抗原组和NE (APS+EM)各试验组血 清0VA特异性IgG、IgGl和IgG2a抗体水平均显著高于OVA抗原对照组(P < 0. 05)； NE (APS 100 u g+EM 50 u g) +0VA 抗原组、NE (APS 100 u g+EM 100 u g) +0VA 抗原组、NE (APS 100 u g+EM 200 u g) +0VA 抗原组、NE (APS 200 u g+EM 50 u g) +0VA 抗原组、NE (APS 200 u g+EM 100 u g) +0VA 抗原组、NE (APS 400 u g+EM 50 u g) +0VA 抗原组以及 NE (APS 400 u g+EM 100 u g) +0VA抗原组各试验组的IgG、IgGl和IgG2a抗体水平与Alum+OVA 抗原组在统计上无显著性差异，但NE (APS 200 u g+EM 200 y g)+0VA抗原组和NE (APS 400 u g+EM 200 u g) +0VA抗原组的IgG、IgGl和IgG2a抗体水平显著高于Alum+OVA抗原组 (P < 0. 05)；而NE (APS+EM)各试验组之间IgG、IgGl和IgG2a抗体水平无显著性差异，其中 又以NE (APS400 u g+EM 200 u g) +0VA抗原组三种抗体水平最高。据报道，黄芪多糖和紫锥菊提取物均有调节机体免疫、增强机体抵抗力的作用
6(Matsuzaki 等，2007 ；Predy 等，2005 ； Can ike 等，2007 ；Biggs 等，2007)，其具体表现能促进 Thl型和Th2型抗体反应。Thl型免疫应答主要产生IgG2a等抗体，Th2型主要产生IgGl等 抗体。本试验发现，纳米乳佐剂在APS 200 u g+EM 200iig和APS 400 u g+EM 200 y g时产 生特异性抗体水平，明显优于铝胶的。因此黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂可以增强 疫苗的免疫活性，促进Thl和Th2免疫应答，减少抗原的使用剂量，从而达到增强抗原的免 疫原性，提高疫苗使用效果，以及减少疫苗使用过程中的免疫反应。
下面通过实施例来进一步介绍本发明的产品和制备方法。 实施例1
1)精确称取或量取以下组分，备用
2)在室温下将吐温80、甘油、液体石蜡和丙二醇搅拌均勻，形成溶液，所得即为油
3)室温下，将黄芪多糖和紫锥菊提取物溶于蒸馏水中，搅拌使其完全溶解，所得即
相；
为水相；4)室温下，将油相缓慢滴加到水相中，滴加的同时不断搅拌，直至形成透明的体 系，即得。实施例2
实施例3 实施例4 实施 例5 实施例6 蒸馏水35 4% (v/v)实施例7 实施例8 吐温 6020.0% (ν/ν) 液体石蜡17.0% (ν/ν) 乙醇5.0% (ν/ν) 蒸馏水56.0% (ν/ν)实施例9 黄芪多糖8.0% (m/v) 紫锥菊提取物0.5% (m/v)
实施例10
权利要求
一种复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂，其特征在于，该纳米乳佐剂的粒径在1～100nm之间，由下述重量百分比的原料制成紫锥菊提取物 0.10％～2.00％黄芪多糖 0.10％～10.00％表面活性剂15.00％～60.00％助表面活性剂 1.00％～15.00％油1.50％～25.00％余量为蒸馏水上述原料的总重量为100％；所述的表面活性剂是司盘80、司盘60、吐温80、吐温60中的一种或几种；所述的助表面活性剂是乙醇、聚乙二醇、甘油和丙二醇中的一种或几种；所述的油为花生油、橄榄油、肉豆蔻酸异丙酯、维生素E油、液体石蜡和麦芽油中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂，其特征在于，由 下述重量百分比的原料制成紫锥菊提取物0. 50% 1. 50%、黄芪多糖1. 00% 5. 00%、表面活性剂25. 00% 45. 00%、助表面活性剂5. 00% 10. 00%、油5. 00% 20. 00%，余量为蒸馏水，上述原料 的总重量为100%。
3.权利要求1所述的复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂的制备方法，其特征在 于，包括下列步骤1)称取黄芪多糖、紫锥菊提取物、表面活性剂、助表面活性剂、油和蒸馏水，备用；2)在室温下将表面活性剂、助表面活性剂和油搅拌均勻形成，所得即为油相；3)室温下，将黄芪多糖和紫锥菊提取物溶于蒸馏水中，搅拌使其完全溶解，所得即为水相；4)室温下，将油相缓慢滴加到水相中，滴加的同时不断搅拌，直至形成透明的体系，即 得复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂。
全文摘要
本发明公开了一种复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂，该佐剂的粒径在1～100nm之间，由紫锥菊提取物、黄芪多糖、表面活性剂、助表面活性剂、油和蒸馏水组成。该产品外观呈透明淡黄色液体，粒径小于100nm；粘度较低，稳定性较好，配苗时无须特殊乳化，对设备要求低，产品质量容易控制。以卵清白蛋白OVA为模式抗原，证明本发明的复方黄芪多糖和紫锥菊提取物纳米乳佐剂在一定剂量上比使用铝佐剂能诱导较好的免疫反应，产生较高的抗体滴度，减少佐剂中油或者抗原的使用量，刺激Th1和Th2反应，增强机体的体液和细胞免疫作用，对机体具有良好的免疫保护作用。
文档编号A61K39/39GK101869706SQ20101021034
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者李树鹏, 李雅, 欧阳五庆 申请人:西北农林科技大学