专利名称：一种针对PKC γ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域。具体涉及一种针对PKC y基因RNA 干扰的重组慢病毒载体及其构建方法，并将这种病毒载体用于制备治疗慢性神经病理性疼 痛的药物。
背景技术：
(l)PKCy基因是慢性神经病理性疼痛治疗重要的分子靶。慢性疼痛不仅是医学界的一个难题，而且已成为社会经济的一大负担，据统计，全 世界有三亿二千多万人受到慢性疼痛的困扰。神经病理性疼痛(Neuropathic Pain)是与多 种周围神经障碍相关联的一组共同表现的症状，包括与糖尿病、甲状腺功能低下、尿毒症、 营养缺乏和化疗药物(长春新碱、顺钼等)相关的神经障碍；也包括格-巴二氏综合征、带 状疱疹后神经痛、进行性神经病性肌萎缩病、复合性局部疼痛综合征I型和缺血性神经病 变等(Gregory T，2001)。国际疼痛研究会(IASP，1994)将这种由于外周或中枢神经系统的 直接损伤功能紊乱引起的疼痛称为神经病理性疼痛。神经病理性疼痛是医学领域的挑战性 研究课题，目前发病机制不清，尚缺乏有效的治疗措施。近年来，对外周神经损伤所致的神 经病理性疼痛的分子、细胞机制，特别是在初级感觉神经原和脊髓水平的研究积累了比较 丰富的资料，为进一步研究提供了基础。在外周神经受损引起的慢性神经病理性疼痛，常表现痛觉过敏、自发性疼痛、痛感 觉异常等。众多研究表明痛觉过敏等反应性增强过程可能与中枢敏感化有关，众多致痛性 物质、神经递质以及其所引起的细胞内第二信使的变化在中枢敏感化的形成过程中可能发 挥重要作用，尤其是蛋白激酶〔(protein kinase C，PKC)在其中起着关键性的作用。PKC是 重要的细胞内信号转导分子，是磷酸脂依赖的丝氨酸和苏氨酸激酶异构酶，在细胞内信号 转导起重要作用。PKC cDNA克隆的研究表明PKC包含一个超家族。其中PKCy主要存在于 大脑和脊髓中，研究表明PKC y阳性神经元主要位于脊髓背角的II层内侧部及II、III层 的交界处，而脊髓背角浅层(I、II层)是外周伤害性信息传递和调控的初级中枢，传递伤害 性信息的AS纤维和C纤维多终止于I、II层，尤其是II层，它们在伤害性信息传递、整合 过程中发挥重要作用。Him等在结扎一侧坐骨神经的大鼠鞘内注射PKC抑制剂GF109203X， 发现其具有明显的抗痛觉过敏效应，由此推断PKC在神经损伤诱发的痛觉过敏中发挥重要 作用。Martin等在大鼠完全氟氏佐剂致痛模型中发现，在致痛侧L4 L5背角浅层各时间点 PKC y免疫性反应增加70 100倍，行为学表现为机械性痛觉过敏，上述结果提示PKC y 免疫反应的持续性改变与机械性痛觉过敏相一致，痛觉过敏的维持依赖于PKC Y调节兴奋 性中间神经元所致。Malmberg等发现.PKCy基因敲除的小鼠发育正常，在坐骨神经结扎 疼痛模型上，几乎不能形成神经痛但其急性痛行为正常，说明PKCy在痛觉过敏中起关键 性作用。国内万丽等报道对大鼠鞘内注射反义PKCy寡核甘酸对慢性神经痛有明显镇痛效 应，但是具体机制尚不清楚。因此PKCy基因是慢性神经病理性疼痛治疗重要的分子靶。
(2)鞘内注射高转染效率的编码PKCy基因shRNA重组慢病毒载体对NP大鼠的镇 痛效应。所谓RNA 干扰 RNAi 就是利用双链 RNA(double stranded RNA，dsRNA)高效、特 异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的过程，即 诱导序列特异的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。RNA 干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA诱导的，其作用机制起始阶段和效应阶段 (initiationand effector st印s)。在起始阶段，外源导入或者由转基因、病毒感染等各种 方式引入的双链RNA将被RNase III家族中的一个能够特异性识别双链RNA的酶Dicer，以 ATP依赖的方式逐步切割为21 23nt的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs， si RNA)。siRNA3’末端有2 3个游离末配对的核苷酸(dTdT或UU)。在效应阶段，siRNA双 链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。 RISC以ATP依赖性方式激活，RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义链，反义链仍结合在 复合物上，并引导RISC与同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，自距离siRNA 3’ 端12个碱基的位置处将靶mRNA切断，从而阻断了基因表达。siRNA还可以作为一种特殊的 引物，在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA分子，后者 又可被RISC降解为新的siRNA，新生成的siRNA又进入上述循环，这一过程被称为随机降 解性聚合酶链反应(random degradative PCR)。新生的dsRNA反复合成与降解，不断形成 新的siRNA，从而使靶mRNA不断减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象。RdRP —般只对 所表达的靶mRNA发挥特异性扩增作用，每个细胞仅需少量dsRNA即有可能完全抑制相应基 因表达。RNAi干扰(RNA interference,RNAi)技术是封闭特异基因表达，从而无法指导合 成相应的蛋白质，导致该基因表达沉默的新技术。且双链RNA抑制基因表达的效率比单链 RNA高得多，1998年首次发现RANi现象的Andrew Fire和Craig Mello获得了 2006年诺 贝尔医学奖。RNAi技术与其他技术相比较有其独特的优点比基因敲除周期短，成本低；比 反义技术具有高度特异性和高效性；可进行高通量基因功能分析。从而应用RNAi技术对慢 性疼痛进行治疗的前景非常值得期待。国外已有少数报道初步肯定了这一点，Medline目 前收录有7篇文献，其中选出的分子靶有野香草受体(vanilloid receptor TRPV1)，河豚毒 素不敏感的电压门控钠离子通道NaVl. 8，P2X3受体及血管加压素受体V2亚型。由于RNAi抑制基因表达的作用在很大程度上受到转染效率的限制，提高转染效 率的关键是选择合适的载体。慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但 也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动 物制备。利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的 shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus-shRNA克隆经 过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、 悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行 长时间的稳定表达。慢病毒载体(lentivirus-based vector,LV)具有可感染非分裂细胞、 目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，是一种比较理想的用于中 枢神经系统基因治疗的理想载体。我们选用第三代自我失活慢病毒载体，能很好解RNAi技 术基因治疗的靶向性、安全性、整合效率的问题。鞘内是慢性疼痛治疗给药的经典途径，最 近有学者报道在大鼠鞘内注射NMDA受体亚单位NR2B的shRNA，可以有效地减轻福尔马林引起的疼痛；也有报道鞘内持续给予P2X3siRNA，发现P2X3在脊髓背角和背根神经节表达显 著下调，同时大鼠的疼痛反应明显减轻。提示鞘内注射针对某特定基因的RNAi技术是一种 很有前景的疼痛治疗方法，shRNA具有长时程表达的特点，重组病毒载体能够作用于PKC y 较密集的脊髓表层，局部浓度高，能够达到最佳转染效率。从而有效治疗神经病理性疼痛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对PKC y基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其制 备方法。本发明的另一目的是提供该病毒载体的用途。本发明的目的是通过以下方式实现的一种针对PKCY基因RNA干扰的重组慢病毒载体，是自身失活的第三代慢病毒载 体SIN。所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh PKC y重组载体，所述的pGCSIL_GFP/U6_Sh PKC y重组载体是在pGCSIL-GFP载体的MCS中连接了针对ShRNA的双链DNA片段；所述的 双链DNA片段为以下序列中的一种PSCSI625 5’ -CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’3，"GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTMGTTCTCTMAGTGCCAGMACAGMGACMMACTTM-5，PSCSI626 5’ -CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG-3’3，"CTTCMACTC0GGACATTMTMGTTCTCTATTMTGTC0GGAGTTTGMGMMACTTM-5，PSCSI627 5 ’ -CCGGAACTCTATGCCATCAAGATACTTCAAGAGAGTATCTTGATGGCATAGAGTTTTTTTG-3’3’ -TTGAGATA0GGTAGTTCTATGMGTTCTCTCATAGMCTAC0GTATCTCMMMACTTM-5’ PSCSI628 5’ -CCGGCAGACTACATAGCACCTGAGATTCAAGAGATCTCAGGTGCTATGTAGTCTGTTTTTG-3’3 ’ -GTCTGATGTATCGTGGACTCTAAGTTCTCTAGAGTCCACGATACATCAGACAAAAACTTAA-5’。所述的针对PKC y基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法如下根据 PKC y mRNA序列，设计合成了针对ShRNA的双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以下序列 中的一种:PSCSI625 正义链:5，"C0GGCAGMGACMAGACCGTGMATTCMGAGATTTCA0GGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3，反义链:3，"GICnOGTnOGGCMTMGTICICrAAAGTGOQ\GMAQ\GAAGACMMACnM"5，PSCSI626正义链:5，"C0GGGMGTTTGAGGCCTGTMTTATTCMGAGATMTTACAGGCCTCMACTTCTTTTTG-3，反义链:3，"CnU\AACr00GGAQVnMTMGTICICrATrMTGT00GGAGTTKMGMMACnM"5，PSCSI627正义链5，"C0GGMCTCTATGCCATCMGATACTTCMGAGAGTATCTTGATGGCATAGAGTTTTTTTG-3，反义链:3，-TTGAGATAOGGTAGTICrATGMGTICIOCATAGMCTAaETAIOCMMMACnM"5，PSCSI628正义链:5，"C0GGCAGACTACATAGCACCTGAGATTCMGAGATCTCAGGTGCTATGTAGTCTGTTTTTG-3，反义链3，"GTCTGATGTAT0GTGGACTCTMGTTCTCTAGAGTCCACGATACATCAGACMMACTTM-5，，然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的MCS中构建成pGCSIL_GFP/ U6-ShPKC y 重组载体；再将 pGCSIL_GFP/U6_Sh PKC y 重组载体、pHelper 1. 0、pHelper 2. 0三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。在DNA片段末端引入Age I和EcoR I酶切位点；用Agel和EcoRI酶将pGCSIL-GFP 载体酶切，回收大片段，将所述的大片段与DNA片段用T4DNA连接酶连接后转化感受态菌 DH5a，挑取重组阳性克隆。
所述的重组慢病毒载体可用于制备治疗慢性神经病理性疼痛的制剂。针对PKC γ基因的RNA干扰，被识别的序列为
权利要求
一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体，是自身失活的第三代慢病毒载体SIN，其特征在于，所述的载体SIN含有pGCSIL GFP/U6 Sh PKCγ重组载体，所述的pGCSIL GFP/U6 Sh PKCγ重组载体是在pGCSIL GFP载体的MCS中连接了针对ShRNA的双链DNA片段；所述的双链DNA片段的序列如下PSCSI6265’ CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG 3’3’ CTTCAAACTCCGGACATTAATAAGTTCTCTATTAATGTCCGGAGTTTGAAGAAAAACTTAA 5’。
2.权利要求1所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征 在于，根据PKC y mRNA序列，设计合成了针对ShRNA的双链DNA片段，所述的双链DNA片段 的序列如下PSCSI626 正义链5’ -CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG-3，反义链3’ -CTTCAAACTCCGGACATTAATAAGTTCTCTATTAATGTCCGGAGTTTGAAGAAAAACTTAA-5，然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的MCS中构建成pGCSIL_GFP/ TO-ShPKCY重组载体；再将pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCy重组载体、具有图2所示结构的 pHelperl. 0、具有图3所示结构的pHelper 2. 0三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。
3.根据权利要求2所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其 特征在于，在所述的DNA片段末端引入Age I和EcoR I酶切位点。
4.根据权利要求2所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其 特征在于，用AgeI和EcoRI酶将pGCSIL-GFP载体酶切，回收大片段，将所述的大片段与DNA 片段用T4DNA连接酶连接后转化感受态菌DH5 α，挑取重组阳性克隆。
5.权利要求1所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的应用，其特征在于， 所述的重组慢病毒载体用于制备治疗慢性神经病理性疼痛的制剂。 全文摘要
本发明涉及一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其构建和应用。实验构建了针对PKCγ基因的ShRNA的慢病毒载体，将合成的针对ShRNA的DNA片段通过慢病毒载体介导，还与pHelper 1.0、pHelper 2.0两种载体共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，实现针对PKCγ基因的RNA干扰。采用的自身失活的第三代慢病毒载体(SIN)，具有安全可靠、可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，是一种理想载体。本发明的慢病毒载体，对大鼠原代培养神经元干扰效果达85％以上，因此本发明重组慢病毒载体可能成为慢性神经病理性疼痛基因治疗的有力工具。
文档编号A61K48/00GK101942481SQ20101022215
公开日2011年1月12日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者刘畅, 宋宗斌, 张重, 赵媛, 邹望远, 郭曲练 申请人:中南大学