专利名称：鱼藤酮作为非小细胞肺癌细胞增敏剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮在逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿 瘤药物耐受的新用途。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病。江苏省近几年开展了以恶性肿瘤为主的全 人口死因回顾性调查，结果显示男女性第1位死因均为恶性肿瘤，其死亡率占全部死因的 27. 41 %。资料显示，2003年江苏省城市地区位于恶性肿瘤死亡前4位的分别是肺癌、胃癌、 肝癌、食管癌；而农村地区为肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明显高于农 村。尤其是通过分析1973至2004年几种主要恶性肿瘤的死亡情况发现，肺癌死亡率大幅 上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5. 65倍。由此可见，肺癌已经成为我省恶性肿瘤数一 数二的“杀手”，严重威胁着我省人民的生存健康。为什么在短短的几十年间，肺癌的发病率及死亡率有如此迅猛的发展趋势？ 1 大样品调查研究表明肺癌的主要危险因素为吸烟和大气污染，而近年来吸烟人数有增加的 趋势，汽车尾气和工业废气的大量排放，又加重了大气环境污染的程度。因此，随着我省经 济的发展，城市化、工业化进程的加快，空气污染将会越来越严重，这将不可避免地导致肺 癌死亡率进一步增加。2:肺癌在早期时往往没有明显的症状，当有症状被诊断出来时，常常 已经是局部晚期或晚期无法手术切除的情形。一般而言，新诊断的肺癌仅约不到20%的病 人属于早期可以有机会接受手术切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人则失去了外科手 术根治的最佳时机。3:到目前为止，对肺癌的治疗，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治 疗干预手段。临床上，肺癌通常分为小细胞与非小细胞肺癌两种类型，总的肺癌病例中，非小细 胞肺癌(包括肺鳞癌，肺腺癌)约占80%。因此针对非小细胞肺癌的治疗研究是攻克肺癌 的一项极其重要的课题，引起了全世界医学界的广泛关注。如上所述，虽然手术治疗是治疗非小细胞肺癌的重要手段，但对绝大部分晚期肺 癌病人来说手术治疗并不能有效解决肿瘤转移的问题。因此对于这些晚期或已经有远端转 移的肺癌病人，全身性的化学治疗是非小细胞肺癌多学科综合治疗的主要策略之一。尤其 是化疗与手术、放射等疗法综合运用能明显防止癌肿转移、复发，提高长期生存率。现在，非 小细胞肺癌化疗已经初步形成共识，通常采用顺钼加泰索帝、紫杉醇、健择、诺维本等中的 一种。根据患者的具体情况，选择不同的组合，可以达到提高疗效，降低毒性反应的目的，特 别是出现了一些极具前景的新型靶向药物，其作用机制与传统化疗药物不同。传统化疗药 物属于细胞毒性药物，是通过毒性杀死肿瘤细胞，但同时不可避免会伤害正常细胞。而靶向 药物进入肿瘤细胞后，可以通过特异性作用于肿瘤生长的细胞信号途径，抑制肿瘤细胞的 增殖、浸润、转移，不良反应轻，患者可以很好耐受。在这些靶向药物中，TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)越来越受到人们 的关注。TRAIL是由Wiley于1995年检索EST时首次发现并克隆的，是一种II型糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族，与相应受体结合后，可以快速诱导细胞发生凋亡。但与其它凋亡 诱导分子显著不同的是，TRAIL主要杀伤转化细胞和肿瘤细胞，而正常细胞可以逃逸它的杀 伤作用。体内研究表明，TRAIL可以明显抑制肿瘤生长，甚至彻底清除肿瘤。TRAIL的这种 肿瘤细胞选择性杀伤作用使该蛋白在抗肿瘤方面具有很强的开发价值与潜力。但是值得注 意的是，并非所有的肿瘤细胞对TRAIL都具有很强的敏感性。体外研究表明，有些肿瘤细胞 对TRAIL诱导凋亡作用具有很强的耐受性。这可能与肿瘤细胞表面缺乏TRAIL受体(DR4， DR5)，或分布有假受体(DcRl，DcR2)，或过度表达一些抗凋亡蛋白如bcl_2，FLIP, survivin 有关。因此TRAIL的抗肿瘤作用因不同的肿瘤类型而异。研究表明，非小细胞肺癌细胞对TRAIL有明显的耐受性，但具体的机理目前并不 清楚。为了充分发挥TRAIL对肿瘤细胞的选择杀伤作用，有必要寻找新的策略以逆转非小 细胞肺癌细胞株对TRAIL的敏感性，从而达到运用TRAIL有效治疗非小细胞肺癌的目的。鱼藤酮(rotenone)是从天然植物中分离出来的化合物，其结构见式1。该物质能 与线粒体呼吸链复合物I结合，从而抑制线粒体氧化磷酸化、降低线粒体膜电位、导致细胞 发生损伤，该化学物质是杀虫剂的重要组成成分之一，能通过抑制昆虫细胞线粒体功能杀 死昆虫细胞。但有研究表明长期使用含该化合物的杀虫剂使农民易患帕金森氏病与老年痴 呆。进一步研究表明，该物质在田间作业，通过农民长期吸入、吸收后能抑制神经元细胞线式1但是近来也有研究表明，鱼藤酮能抑制肿瘤细胞增殖，或促进肿瘤细胞凋亡。 如鱼藤酮能诱导白血病细胞K562或Jurkat细胞凋亡，或诱导神经瘤细胞SH SY-5Y细胞凋 亡，因而显示了该物质在抗肿瘤药物开发上的应用。由上述背景可知，鱼藤酮能抑制肿瘤细胞，但该化合物本身也能诱导神经细胞凋 亡而产生诸多毒副作用，如何扬长避短，充分发挥该化合物潜在的抗肿瘤效果是值得深入 研究的问题。遵循这样的思路，我们发现低剂量的鱼藤酮能增强非小细胞肺癌细胞对TRAIL 的敏感性，从而为TRAIL的联合用药抗肿瘤提供了一个新的侯选化合物。
发明内容
为了克服非小细胞肺癌细胞对TRAIL的耐受性问题，本发明提供了鱼藤酮化合物 的新用途，有效地解决了非小细胞肺癌细胞对TRAIL的耐受性问题。本发明所采用的技术方案是鱼藤酮化合物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的
粒体功能，从而诱导神经元细胞凋亡。
4应用。上述所说的应用，具体可以是将鱼藤酮与TRAIL制成治疗非小细胞肺癌的组合 物。具体地，鱼藤酮作为非小细胞肺癌细胞增敏剂的应用。本发明表明鱼藤化合物与TRAIL的联合用药本身对正常细胞(HEK293)的无明显 毒副作用，表明鱼藤酮与TRAIL是一种新的可用于治疗非小细胞肺癌的药物组合。
图1鱼藤酮联合TRAIL对A549细胞凋亡的影响；图2鱼藤酮联合TRAIL对 NCI-H460细胞凋亡的影响；图3鱼藤酮增强TRAIL诱导的A549细胞caspase 3激活；图4 鱼藤酮选择性增强非小细胞肺癌细胞对TRAIL的敏感性；图5鱼藤酮上调A549细胞表面死 亡受体DR4与DR5 mRNA表达水平；图6鱼藤酮抑制A549细胞FLIP^与FLIPs的表达水平。
具体实施例方式实验材料A549、NCI-H460非小细胞肺癌细胞株均购自ATCC公司。DMEM细胞培养 液、胰酶购自美国Hyclone公司。MTT、PI、RNAase购自美国Sigma公司。鱼藤酮购自美国 Sigma公司。Caspase 3检测试剂盒购自美国Biovision公司。EGFP标记的Annexin V由 本实验室自行制备获得。实施例一鱼藤酮对TRAIL诱导的非小细胞肺癌细胞(A549)死亡的影响非小细胞 肺癌细胞A549或NCI-H460于DMEM+10%胎牛血清培养液中培养，培养条件为37°C，5% CO2 的湿润无菌环境。细胞长至80%-90%融合时，用PBS洗涤2次，0.25%胰酶消化。按细胞 量6X IO4/孔接种于24孔细胞培养板中。待细胞贴壁生长完全后，加入药物分别为TRAIL 50ng/ml,TRAIL 100ng/ml，鱼藤酮 10nM，TRAIL 50ng/ml+鱼藤酮 10nM，TRAIL 100ng/ml+鱼 藤酮 10nM，鱼藤酮 ΙΟΟηΜ，TRAIL 50ng/ml+鱼藤酮 ΙΟΟηΜ，TRAIL100ng/ml+鱼藤酮 ΙΟΟηΜ， 鱼藤酮 ΙΟΟΟηΜ，TRAIL 50ng/ml+鱼藤酮 ΙΟΟΟηΜ，TRAIL100ng/ml+鱼藤酮 ΙΟΟΟηΜ，鱼藤酮 10 μ Μ, TRAIL 50ng/ml+ 鱼藤酮 10 μ Μ, TRAIL100ng/ml+ 鱼藤酮 10 μ Μ,每组 3 个孔(图 1， 2)，细胞经药物处理12h后收集，用预冷PBS洗2遍，加入EGFP标记的Armexin V(2yL),冰 上孵育20min，迅速加入PI (1 μ g/mL)，于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，Annexin V(+)/ PI(-)为早期凋亡细胞。结果采用Armexin V/PI双染法考察A549细胞对TRAIL的敏感性，发现在无鱼 藤酮存在的情况下，TRAIL 50ng/ml或lOOng/ml能引起小部分A549细胞凋亡(图1)，当 加入鱼藤酮浓度彡IOOnM时，对TRAIL诱导的A549细胞凋亡增效作用并不强，但当加入鱼 藤酮浓度> IOOnM时，可以明显看出鱼藤酮显著增强TRAIL诱导的A549细胞凋亡，如在 鱼藤酮IOOOnM时，能将TRAIL 100ng/ml诱导的细胞凋亡由15. 3 %提高到26. 8 %，同样 地，在鱼藤酮10 μ M时，能将TRAIL诱导的细胞凋亡由25. 3%提高到72. 5%，由此，鱼藤酮 (IOOnM-IO μ Μ)能显著性增强Α549细胞对TRAIL的敏感性。类似的结果在NCI-H460细胞 中也得到验证(见图2)。实施例二TRAIL与鱼藤酮对caspase 3水解酶活性的影响非小细胞肺癌细胞A549 于DMEM+10%胎牛血清培养液中培养，培养条件为37°C，5% CO2的湿润无菌环境。细胞长
5至80% -90%融合时，用PBS洗涤2次，0. 25%胰酶消化。按细胞量6 X IO4/孔接种于24孔 细胞培养板中。加入药物处理，分别为对照组、TRAIL 100ng/ml, TRAIL lOOng/ml+鱼藤酮 1 μ Μ，鱼藤酮1 μ Μ，每组重复3个孔(图3)。处理12h后，将细胞用胰酶消化后，加入FITC 标记的DEVD. fmk 1-2 μ 1，于冰上孵育30min后，PBS洗2遍，流式细胞仪分析FITC荧光强度。结果caspase 3的激活是细胞凋亡的重要指标，无论是死亡受体介导的，还是线 粒体通路所介导的细胞凋亡，最终均体现在caspase 3的激活上，因此通过测量caspase 3 的活性可以作为细胞凋亡的重要指标。在本研究中，采用FITC标记的caspase 3底物，与 细胞共孵育，该底物能穿透细胞膜进入到细胞内部，遇激活的caspase 3时被酶切，释放出 FITC，从而被流式细胞仪检测到。结果与免疫荧光相符(图3)，在单用TRAIL时，细胞内 caspasee3部分激活，而单用鱼藤酮对caspase 3酶活性无太大影响，细胞内caspase 3酶 激活不明显，但是两药的联用，细胞内caspase 3明显被激活。实施例三毒性实验HEK293与A549细胞分别于DMEM+10%胎牛血清培养液中培养， 培养条件为37°C，5% CO2的湿润无菌环境。细胞长至80% -90%融合时，用PBS洗涤2次， 0.25%胰酶消化。按细胞量5X IO3/孔接种于96孔细胞培养板中。加入药物TRAIL IOOng/ ml+鱼藤酮1 μ M处理12h，每组重复3个孔(图4)，处理12h后，收集细胞，按实施例一检测 A549与HEK293细胞凋亡。结果为考察TRAIL与鱼藤酮的联用增效作用是否对正常细胞具有毒性副作用。 本研究比较TRAIL100ng/ml+鱼藤酮(1 μ M)在正常细胞株(ΗΕΚ293)及肿瘤细胞株(Α549) 上的细胞毒性差异。结果见图4，在明显诱导Α549细胞凋亡的情况下，TRAIL+鱼藤酮对正 常细胞无明显的毒性，这些数据说明TRAIL+鱼藤酮对肿瘤具有明显的选择性，是具有开发 前景的治疗方案。实施例四鱼藤酮对A549细胞DR4与DR5mRNA的影响1、细胞mRNA的提取所有物品 均提前用DEPC处理并灭菌。非小细胞肺癌细胞A549于DMEM+10%胎牛血清培养液中培养， 培养条件为37°C，5% CO2的湿润无菌环境。细胞长至80% -90%融合时，用PBS洗涤2次， 0. 25%胰酶消化。按细胞量IX IO5/孔接种于6孔细胞培养板中。铺细胞于6孔板，等细胞 长到80% -90%后，加药(分别为鱼藤酮1 μ M处理0，2，4，6h ；或鱼藤酮0，10，100，IOOOnM 处理12h)，处理后收集细胞，PBS洗涤一次。加入lmLTRIZOL，用枪吹打至细胞完全溶解，室 温放置5min。加入200 μ L的氯仿，振荡15s后放置2_3min，2-8°C 12000g离心15min。吸 取上层，转移到干净印pendorf管中，加入500 μ L异丙醇，放置lOmin，2-8°C下12000g离心 lOmin，可见RNA沉淀。弃上清，加入ImL 75%乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，在空气中晾 干RNA沉淀，加入30 μ LDEPC处理的DDW溶解。2.、逆转录PCR采用20 μ L逆转录体系，将提取的模板RNA约Iyg与5Xbuffer 4μ L, dNTP(10mM)2y L, oligo (dT) 18 (10 μ mol/L) 1 μ L, RNase Inhibitor lyL，逆转录酶 1 μ L混勻后30°C水浴lOmin，42°C水浴30min，98°C水浴lOmin。取等量的cDNA做模板做 PCR 扩增，采用 20yL PCR 反应体系DDW 15. 2 μ L，10 X Taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2 μ L, Mg2+2 μ L，上游引物 1 μ L，下游引物 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq polymeraseO. 3 μ L。PCR 条 件94°C热变性4min后；94°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸40s (循环数为20-45个)； 最后72°C延伸7min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB显色。
结果TRAIL死亡受体是决定肿瘤细胞对TRAIL是否有敏感性的重要因素，本研究 发现鱼藤酮能时间依赖性与剂量依赖性地提高A549细胞内DR4与DR5mRNA的表达量(图 5)。实施例四鱼藤酮对A549细胞FLIP蛋白表达的影响非小细胞肺癌细胞A549于 DMEM+10%胎牛血清培养液中培养，培养条件为37°C，5% CO2的湿润无菌环境。细胞长至 80% -90%融合时，用PBS洗涤2次，0. 25%胰酶消化。按细胞量IX IO5/孔接种于6孔细 胞培养板中。铺细胞于6孔板，等细胞长到80%-90%后，加药(分别为鱼藤酮0，10，100， 1000，IOOOOnM)，处理12h后收集细胞。用预冷的PBS将细胞沉淀洗涤一次后，加入细胞裂解液混勻，冰上放置30min后， 12000rpm离心15min，吸取上清，通过考马斯亮蓝法进行蛋白定量，最后加入4X loading buffer沸水浴5min，样品-20°C长期保存。按照分子克隆中的配方配制12% SDS-PAGE gel, 通过测定的样品蛋白含量计算，保持各个样品上样量一致，上样量为30-100yg。上层胶 采用80伏恒压进行压缩，下层胶120伏电压分离，然后使用半干法将PAGE胶中蛋白转印 至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上，恒压IOV电转2h。转膜结束后丽春红S(0. 5% ponceaus S in 1% acetic acid)对膜进行染色，确定转膜效率。配制5%的脱脂奶粉(PBST 配制)对膜进行4°C封闭过夜或者室温lh。包被结束后，用PBST将牛奶洗去，根据抗体说 明用PBST稀释FLIP—抗(1 1000)，将膜一抗包被室温孵育Ih或4°C过夜。将膜放置在 摇床，用PBST洗涤5次，每次5-lOmin。再包被二抗，将HRP (辣根过氧化物酶)标记的二抗 1 2000稀释(PBST配置的牛奶)，与膜共同孵育Ih后，同样PBST洗涤5次，每次5-lOmin。 按照产品说明配制发光底物溶液滴加于PVDF膜上，室温放置l-2min，用滤纸将多余发光液 吸干，将膜用保鲜膜包被后放入压片夹移入暗房，取X光片置于膜上曝光l-5min后，冲洗胶 片，根据曝光条带判断蛋白的表达结果。结果FLIP是细胞内重要的抗凋亡蛋白，分为？！^？^与FLIPs两种形式。它们通过 与Caspase 8竞争结合蛋白，从而抑制细胞凋亡过程中死亡复合物(DISC)的形成，从而抑 制细胞凋亡。FLIP在很多肿瘤如肝癌、乳腺癌均为高表达，它的蛋白质表达受诸多因素调 控，如泛素化、磷酸化等过程。在本研究中发现鱼藤酮处理的A549细胞，其FLIPl与FLIPs 蛋白水平的表达呈现逐渐下降的趋势(图6)，显示鱼藤酮可能是抑制了 FLIP的表达，从而 增强A549对TRAIL诱导凋亡的敏感性。
权利要求
鱼藤酮作为非小细胞肺癌细胞增敏剂的应用。
2.鱼藤酮在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮在逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受的新用途。鱼藤酮作为非小细胞肺癌细胞增敏剂，能逆转非小细胞肺癌细胞对靶向性抗肿瘤药物耐受性。本发明表明鱼藤化合物与TRAIL的联合用药本身对正常细胞无明显毒副作用，是一种新的可用于治疗非小细胞肺癌的药物组合。
文档编号A61K31/352GK101904837SQ20101024124
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月31日 优先权日2010年7月31日
发明者华子春, 施怡琳, 殷武 申请人:南京大学