专利名称：一种补中益气丸提取物的辐射防护用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从补中益气丸6种提取物筛选出辐射防护的提取物。确切的说就是以 补中益气丸成药为原料，通过水提，醇提的方法从中提取获得6种提取物，即水提液、醇提 液、水提醇沉上清液、水提醇沉沉淀液、醇提水沉上清液、醇提水沉上沉淀液，通过抗辐射的 实验研究，证明其中一种具有辐射防护的作用。也涉及该提取物的制剂。
背景技术：
由于核能和核技术在农业生产、医疗卫生、科学研究和国防中的大量应用，以及世 界核军备竞赛的加剧，受辐射的人员越来越多，核能源在给人类带来益处的同时，核辐射也 对人类造成了极大的伤害。当今面临的核辐射损伤主要来源为战争核辐射(包括核武器、 贫铀武器所致的辐射)与非战争核辐射(包括核泄漏、民用放射源、医疗照射、职业照射、宇 航人员受到的空间辐射等)，比如放射治疗，它是治疗恶性肿瘤的重要手段之，在杀伤肿瘤 细胞的同时，也对正常组织细胞有一定的损伤作用，即电离辐射损伤，放射治疗对机体正常 组织、器官的损伤制约了其肿瘤治疗价值。所以，无论是从提供战时防护的角度还是和平时 期对在放射性环境条件下的人员提供预防保护，或是应对突发性核事故的急救措施，开发 高效、低毒、使用方便的抗辐射药物都是十分必要的。对于辐射防护剂的研究始于20世纪 早期，目前，国际上已经发现了许多对辐射具有防治作用的化学药物和生物制剂，辐射损伤 治疗的主要药物有WR-2721 (氨磷汀)、超氧化物歧化酶(SOD)、金属元素螯合物(CU、Fe、Zn 等)、碘化钾和细胞因子类药物的义5 、11^-6』 0、1 等)。随着研究的深入，人们发现其 中的很多药物对健康细胞的毒害也较大，并可能诱发其他病变，于是人们开始重视从天然 产物中寻找抗辐射药。电离辐射使组织和细胞中产生大量活性氧(ROS)，通过直接和间接作用损伤生物 大分子(如DNA，蛋白质，脂类等)，引起细胞死亡和机体功能丧失，而补中益气丸具有抗氧 化和保护DNA的作用，具有辐射防护作用。补中益气汤出自金·李东垣《脾胃论》，由黄芪 (炙)、甘草(炙)、人参、当归、陈皮、升麻、柴胡、白术组成，功能补中益气，升阳举陷。现代 研究表明补中益气汤含有多糖类、总黄酮类、皂苷类、阿魏酸等成分。郝晓玲对补中益气丸 等中成药进行辐射防护作用筛选，发现补中益气丸有辐射防护作用。日本学者Takako报道 了其对糖尿病大鼠腺嘌呤核苷酸水平的影响，其中单味药人参、苍术能产生与补中益气汤 相同的效果，升高腺嘌呤核苷酸的水平，黄芪、当归、甘草、枳壳、升麻无显著影响，柴胡、干 姜降低腺嘌呤核苷酸的水平。Tamura报道了补中益气汤能增强白细胞介素-18的诱导细胞 免疫，并可能加强对病原体宿主防御机制。Kim，Simg-Ho等发现补中益气汤增加了内源性 脾集落形成，减少了辐射诱导凋亡的频率。本发明提供了补中益气丸一种提取物的辐射防 护用途，现有技术未见报道。
发明内容
本发明通过水提及醇提的方法从补中益气丸中获得6种提取物，通过细胞、动物水平对6种提取物抗辐射活性进行反复筛选，实验结果表明补中益气丸水提醇沉沉淀可以 抑制6°C。Y射线照射导致的V79细胞活力丧失，并能提高6°C。Y射线8Gy—次全身照射昆明 种小鼠的活存率，从而完成了本发明。本发明中所述水提醇沉沉淀主要成份为多糖类，主要包括黄芪多糖、白术多糖、当 归多糖、党参多糖、陈皮多糖等。水提醇沉沉淀可与药学上可接受的载体按本领域已知方法制备成各种药物组合 物，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等各种固体、液体制剂等；或和其他中药单体组合制成 各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于预防及治疗辐射损伤。本发明的优点1.发现了补中益气丸沉淀的新的医疗用途。2.以补中益气丸为原料用水提醇沉法获得的提取物具有辐射防护作用，其效果比 服用补中益气丸更加有效，而且制备工艺简单，得率高，成本低。3.以该提取物为主要成分的辐射防护制剂将比现有的辐射药物减少服用剂量，降 低毒性，提高了口服辐射防护药物的效果。所以，本发明作为口服用药的辐射防护制剂将是 抗辐射药物的有益补充。
图1补中益气丸6种提取物制备线路2补中益气丸6种提取物对6°C。γ射线5Gy照射的V79细胞存活率的影响图3不同药物浓度的补中益气丸水提醇沉沉淀对6°C0 γ射线5Gy照射的V79细胞 存活率的影响图4补中益气丸6种提取物对6°C。γ射线5Gy照射的V79细胞凋亡率的影响图5补中益气丸6种提取物对6°C。γ射线SGy照射的昆明小鼠30天存活率的影 响
具体实施例方式下面结合实施案例对本发明作进一步的说明实施例一6种提取物的制备(见附图1)1.水提物的制备精密称取补中益气丸粗粉180g，加水煎煮2次，第1次10倍量水，第2次加7倍量 水，每次提取时间为2h，过滤(四层纱布)、合并滤液，离心(2000r IirT1JOmin),减压浓 缩，得浓缩液450mL，浓度为0. 4g/mL。2.水提醇沉上清液的制备 取1项下浓缩液225ml，冷却到室温后，加乙醇至含醇量为70 %，冷藏24h，过滤，滤 液减压回收乙醇至225ml，得水提醇沉上清液，浓度为0. 4g/mL。3.水提醇沉沉淀液的制备取2项下过滤所得沉淀，加水至225ml，得水提醇沉沉淀液，浓度为0. 4g/mL。4.醇提物的制备精密称取补中益气丸粗粉180g，加70%乙醇煎煮2次，第1次10倍量，第2次加7倍量，每次提取时间为2h，过滤(四层纱布)、合并滤液，离心(2000r .mirTUOmin),减压 浓缩，得浓缩液450mL，浓度为0. 4g/mL。5.醇提水沉上清液的制备取4项下所得浓缩液225ml，冷却到室温后，加水至1000ml，搅勻，冷藏24h，过滤， 滤液减压回收水至225ml，得醇提水沉上清液，浓度为0. 4g/mL。6.醇提水沉沉淀液的制备取5项下过滤所得沉淀，加水至225ml，得醇提水沉沉淀液，浓度为0. 4g/mL。实施例二6种提取物对6°C。γ射线导致的V79细胞活力丧失的保护作用细胞特征中国仓鼠肺成纤维细胞V79，贴壁生长，倍增时间12-14小时。1.培养条件细胞培养于DMEM培养液(含10% FBS, 100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，37°C、 5% CO2培养箱，2-3天更换培养液，推荐细胞培养密度l_2X105/mL。2.药物准备采用加热回流提取法制备补中益气汤水体液、醇提液、水提醇沉液、醇提水沉液、 水提醇沉滤渣液、醇提水沉滤渣液等6种提取物，浓度均为0. 4g/mL。将中药提取物用DMEM 培养液溶解，DMSO或超声助溶，配置储存浓度10mg/ml母液备用。3. 6种提取物对v79细胞的辐射防护作用取对数生长期v79细胞(1 X IO5个/mL)接种于96孔培养板，100 μ L/孔，每孔药 物100 μ L，使终浓度为1000 μ g/mL(简称药物组)，另设空白对照组细胞悬液、辐照组细胞 悬液。于药物作用24h后5Gy辐照，照后24h于每孔中加入CCK-8溶液10 μ L，继续培养4h， 于多功能酶标仪490nm处测定各孔吸光值。细胞存活率％ =实验组/正常组X 100%。结 果表明，水提醇沉沉淀组分具有辐射防护效果。(见附图2)4.不同浓度药物对v79细胞的辐射防护作用取对数生长期V79细胞(1 X IO5个/mL)接种于96孔培养板，100 μ L/孔，每孔药 物100 μ L，使终浓度为1000、500、100、50、25μ g/mL的补中益气丸水提醇沉沉淀组分，另设 空白对照组细胞悬液、辐照组细胞悬液。于药物作用24h后5Gy辐照，照后24h于每孔中加 入CCK-8溶液10 μ L，继续培养4h，于多功能酶标仪490nm处测定各孔吸光值。细胞存活 率％ =实验组/正常组X100%。结果表明，水提醇沉沉淀组分的最优浓度是ΙΟΟΟμ g/mL。 (见附图3)5. Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡取对数生长期V79细胞(IX IO6个/mL)接种于6孔培养板，根据实验筛选的结果 采用1000 μ g/mL的6种提取物处理细胞，于药物作用24h后5Gy辐照，照后24h分别收集正 常组、辐照组和药物组细胞，离心lOOOrpm，IOmin,弃上清，用预冷的PBS洗涤2次后悬浮在 200 μ L Binding Buffer 中，加入 IOyL Annexin V-FITC，轻轻摇勻，室温避光反应 15min， 加入300yL Binding Buffei^PSyL PI，然后样品用流式细胞仪进行分析。结果表明，水 提醇沉沉淀组分具有明显降低辐照引起的细胞凋亡率的作用。(见附图4)实施例三水提醇沉沉淀对6°C。Y射线SGy—次全身照射昆明种小鼠活存率的影 响动物分组、给药及照射将雄性昆明种种小鼠适应环境后根据需要分为正常组、照射组、阳性药组和用药
5组，每组10只。正常组和照射组灌胃给予蒸馏水，用药组照前灌胃给予相应药物，剂量3g/ kg，连续6天，阳性药组照前24h灌胃给予“523” 一次，剂量5mg/kg，给药后全身一次性照 射，剂量为8Gy，剂量率228. 27cGy/min，照后连续观察30天。(见表1，附图5)表1补中益气丸6种提取物对6°C。γ射线SGy照射的昆明小鼠30天存活率和存 活时间的影响 与辐照组比较*，P < 0.0权利要求
补中益气丸粗粉180g，加水煎煮2次，第1次10倍量水，第2次加7倍量水，过滤(四层纱布)、合并滤液，离心(2000r·min 1，20min)，减压浓缩，得浓缩液450mL。冷却到室温后，加乙醇至含醇量为70％，冷藏24h，过滤，得沉淀，即为水提醇沉沉淀。
2.根据权利要求1所述的水提醇沉沉淀的组分用于细胞及动物辐射防护的实验。
3.根据权利要求2所述的水提醇沉沉淀的组分具有辐射防护的活性。
4.根据权利要求3所述的应用方面在于含有有效剂量的补中益气丸水提醇沉沉淀的 组分可以和一种或多种符合药典规定的其它药用成分及药用赋形剂制成制剂。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其包括含有 99%的补中益气丸水提醇沉沉 淀组分和99% 的药用赋形剂及其它可组方的药物制成口服制剂的剂型。
6.根据权利要求5所述的口服制剂包括片剂，丸剂，胶囊剂，软胶囊剂，颗粒剂，混悬 剂，滴丸的任何一种。
7.根据权利要求6所述的制剂，活性成分为补中益气丸总多糖(主要为黄芪多糖、白术 多糖、当归多糖、党参多糖、陈皮多糖等)。全文摘要
本发明属于医药技术领域，提供了一种中药复方补中益气丸水提醇沉沉淀的辐射防护新用途。通过水提取结合乙醇提取的方法，从补中益气丸中获得6种提取物。经过细胞及动物的辐射防护实验，首次筛选出水提醇沉沉淀具有辐射防护的药用活性。为开发新的口服途径给药的辐射防护药物奠定了坚实的基础。
文档编号A61P17/16GK101912469SQ20101024570
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年5月25日
发明者崔向君, 张敏丽, 徐萍, 江恩进, 王升启, 赵海峰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所