专利名称:一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物的制作方法
技术领域:
本发明涉及生物工程技术领域,具体的说是一种用于肿瘤等疾病生物靶向治疗的 新型复合物。
背景技术:
在本发明提出之前,应用于肿瘤生物治疗方面的药物已经有很多,如免疫刺激剂、 抗体药物、基因干扰药物等等,但是都存在着各种各样的问题使得其效果并不明显,免疫刺 激剂的使用容易引起免疫过度导致自身免疫疾病,抗体药物因为其外界蛋白的属性而引起 的免疫反应很常见,基因干扰技术其疗效是值得肯定的,但是使用的载体却存在很大问题, 严重的阻碍着基因干扰技术在临床疾病特别是肿瘤疾病中的使用。目前存在的主要的应 用于临床疾病干预的基因干扰制剂包括裸小分子核糖核酸(siRNA)、胆固醇结合的siRNA、 脂质体或者阳离子复合物结合的siRNA复合物以及抗体siRNA复合物等等,但是这些应用 均有局限性,裸siRNA的使用只能在眼睛、呼吸道以及脊髓中属于局部使用,胆固醇结合的 siRNA制剂的使用则是主要针对高血脂的治疗,脂质体或者阳离子复合物和siRNA的复合 物没有特定细胞的靶向性,抗体和siRNA结合的使用受抗体免疫原性的限制,所以探讨一 种新的靶向性强、安全的可以广泛使用的用于肿瘤等疾病治疗的RNAi载体势在必行。发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物,以解决上述肿 瘤治疗特别是肿瘤的生物靶向治疗中的难题。本发明设计人通过大量研究,提出和构建了 一种基于核糖核酸干扰技术(RNAi)的新型肿瘤靶向治疗载体即核酸适体-鱼精蛋白-小 分子干扰核糖核酸复合物(aptamer-protamine-siRNA),这种复合物的构成由三部分构成, 本发明复合物的合成方式将aptamer和siRNA按照摩尔比1 1的比例用生理盐水或者 磷酸盐缓冲液溶解,超声混勻,计算鱼精蛋白的摩尔数,其和aptamer以及siRNA的最佳摩 尔比为1 1 1(可以使用的范围为[1 10] [1 10] [1 10]),溶解于生理盐 水或者磷酸盐缓冲液,超声混勻促溶,然后将核酸混合液缓慢加入鱼精蛋白中,低速震荡混 勻5min,室温静置20-30min,置于-20°C长期保存。其中鱼精蛋白起到桥梁作用,它具有结 合核酸的功能,可以将另外两种核酸成分结合起来形成复合物,核酸适体具有识别靶向细 胞表面特异性抗原的作用,而所携带的siRNA则可以起到沉默靶向基因的作用,所以该新 型复合物可以靶向识别特定细胞(如肿瘤细胞)并且靶向沉默关键基因(如癌基因等)从 而起到疾病(如肿瘤)治疗的作用。
应用本发明,该复合物可以用于肿瘤等疾病的生物靶向治疗,也可以应用于科学 研究中siRNA进行基因干扰的研究。
本发明与现有的肿瘤生物靶向药物相比较,充分显示其创新点和优点为①特异 性和多重靶向性^ptamer高效靶向识别肿瘤细胞表面特异性抗原、siRNA特异沉默靶基 因,其靶向性非常明确,不影响其他正常细胞的功能,只针对目的肿瘤细胞;不干预其他基因,只针对靶向基因;②安全性该复合物为小分子纳米级制剂,鱼精蛋白是临床医学得以 批准应用的小分子多肽,安全性得以保障;aptamer、siRNA是经过化学修饰的较稳定的小 分子RNA制剂,降解和清除时间为3-4天,无毒副作用;③aptamer和siRNA都可以进行靶向 性替换,针对不同肿瘤选用不同的表面抗原的aptamer (如针对乳腺癌中的erbB3、erbB2, 前列腺癌的PMSA、宫颈癌的ScFv,直肠癌的CEA等肿瘤细胞特异性的细胞表面抗原的 aptamer均适应本复合物)以及不同肿瘤关键基因的siRNA(如针对Ras、Jak、Pi;3k、c-myc、 XIAP, survivin、livin、CDKs等在肿瘤生成以及肿瘤转移中其重要作用的基因的siRNA均 适应于本复合物)。
附图1 本发明复合物合成结构示意附图2 通过荧光显微镜观察vehicle组为生理盐水对照组,未看到有荧光表达; APFAMsiRNA组为加入了携带荧光siRNA的复合物组,可以看到有荧光表达,说明可以复合 物进入到肿瘤细胞中;
附图3 通过流式细胞仪检测荧光表达在APFAMsiRNA组表达明显高于vehicle 生理盐水对照组;
附图4 通过荧光显微镜观察加入携带EGFP siRNA的复合物组,EGFP荧光表达的 细胞较未加入的EGFP组明显减少,说明复合物可以起到干扰EGFP表达的作用;
附图5 流式细胞仪检测加入携带EGFP siRNA的复合物组细胞绿色荧光表达明显 较单纯转染EGFP质粒组降低;
附图6 蛋白质免疫印迹法检测发现加入携带EGFP siRNA的复合物组细胞GFP蛋 白的表达水平明显降低;
附图7 逆转录-聚合酶链反应法检测加入携带survivin siRNA的复合物组细胞 survivin在mRNA水平的表达明显降低,说明aptamer-protamine-sisurvivin复合物可以 明显的降低细胞中survivin这一癌基因的表达;
附图8 蛋白质免疫印迹法检测发现加入aptamer-protamine-sisurvivin复合物 组细胞survivin在蛋白质水平的表达明显降低;
附图9 =MTT法检测发现加入aptamer-protamine-sisurvivin复合物组细胞的生 长明显变缓,说明在关键癌基因survivin受到抑制之后,细胞的生长受到明显影响;
附图10 细胞凋亡检测(Armexin-V/PI法)发现加入 aptamer-protamine-sisurvivin复合物组细胞凋亡发生率明显升高,说明在survivin表 达受到沉默之后,部分细胞走向凋亡;
附图11 逆转录-聚合酶链反应法检测加入携带⑶KlsiRNA的复合物组细胞⑶Kl 在mRNA水平的表达明显降低,说明aptamer-protamine-si⑶Kl复合物可以明显的降低细 胞中CDKl这一关键细胞周期调控基因的表达;
附图12 蛋白质免疫印迹法检测发现加入aptamer-protamine-siCDKl复合物组 细胞CDKl在蛋白质水平的表达明显降低;
附图13 :MTT法检测发现加入aptamer-protamine-siCDKl复合物组细胞的生长变 缓,说明在关键细胞周期调控基因CDKl受到抑制之后,细胞的生长受到比较明显影响,增殖变慢;
附图14 流式细胞仪检测发现加入aptamer-protamine-siCDKl复合物组处于 G2-M期的细胞比例明显增加,说明在关键的细胞周期调控基因CDKl受到干扰之后,细胞周 期运行受到明显改变;
附图15 在体尾静脉注射aptamer-protamine-sisurvivin组裸鼠成瘤能力下降, 肿瘤大小和重量均较生理盐水对照组小得多,说明复合物在体内也可以发挥干扰癌基因的 表达的作用,起到抑制肿瘤生长的效果;
附图16 逆转录-聚合酶链反应法检测发现aptamer-protamine-sisurvivin组 裸鼠肿瘤组织survivin在mRNA水平的表达明显较生理盐水对照组低;
附图17 蛋白质免疫印迹法检测发现aptamer-protamine-sisurvivin组裸鼠肿 瘤组织survivin在蛋白质水平的表达明显较生理盐水对照组低。
具体实施方式
本发明的合成方法实例
本发明提出和构建了一种基于核糖核酸干扰技术(RNAi)的新型肿瘤靶向治疗载 体即核酸适体-鱼精蛋白-小分子干扰核糖核酸复合物(aptamer-protamine-siRNA),这 种复合物的构成由三部分构成,本发明复合物的合成方式将aptamer和siRNA按照摩尔 比1 1的比例用生理盐水或者磷酸盐缓冲液溶解,超声混勻,计算鱼精蛋白的摩尔数,其 和aptamer以及siRNA的最佳摩尔比为1 1 1 (可以使用的范围为[1 10] [1 10] [1 10]),溶解于生理盐水或者磷酸盐缓冲液,超声混勻促溶,然后将核酸混合液缓 慢加入鱼精蛋白中,低速震荡混勻5min,室温静置20-30min,置于_20°C长期保存。
发明的技术性说明以及发明的有效性验证
1)细胞体外实验验证该新型复合物可以靶向的进入到特定肿瘤细胞中在 表达有erbB3抗原的乳腺癌细胞系MCF-7细胞中加入合成的aptamer (针对erbB3抗 原)-pr0tamine-FAMSiRNA(FAM绿色荧光颗粒标记的无靶点的siRNA)复合物,然后通过荧 光显微镜可以看到加入复合物组有明显的荧光表达(见图1),流式细胞仪检测到加入复合 物组其荧光表达率明显高于生理盐水对照组(见图幻,说明该新型复合物可以靶向的进入 到特定细胞中去。
2)体外实验验证该新型复合物可以靶向的沉默特定细胞中特定基因在表达有 erbB3抗原的转染了 pEGFP质粒的乳腺癌细胞系MCF-7细胞中加入合成的aptamer (针对 erbB3抗原)-protamine-siEGFP (针对EGFP基因的siRNA)复合物,通过荧光显微镜、流式 细胞仪以及蛋白质免疫印迹反应检测EGFP的表达在加入复合物组明显的降低,如图3、4、 5。
3)体外实验验证该新型复合物靶向沉默肿瘤关键癌基因后肿瘤的生物学特性得 以明显改变在表达有erbB3抗原的乳腺癌细胞系MCF-7细胞中加入合成的aptamer (针对 erbB3抗原)-protamine-sisurvivin(针对凋亡抑制蛋白家族成员survivin)复合物,我们 通过逆转录-多聚酶链反应和蛋白质免疫印迹反应检测到survivin的表达在信使核糖核 酸(mRNA)和蛋白质水平均明显降低(见图6、7),肿瘤细胞生长受到抑制(见图8),凋亡细 胞增多(见图9)。
4)体外实验验证该新型复合物靶向沉默肿瘤关键细胞周期调节蛋白后细胞周期 受到明显阻滞在表达有erbB3抗原的乳腺癌细胞系MCF-7细胞中加入合成的aptamer (针 对erbB3抗原)-protamine-si⑶K1 (针对细胞周期关键调节蛋白细胞周期依赖性激酶 1-CDK1)复合物,我们通过逆转录-多聚酶链反应和蛋白质免疫印迹反应检测到CDKl的表 达在mRNA和蛋白质水平均明显降低(见图10、11),细胞生长变慢(见图12),细胞周期主 要阻滞在G2-M期(见图13)。
5)体内实验验证该新型复合物在肿瘤治疗中是有效的对裸鼠进行皮下MCF-7细 胞成瘤,然后尾静脉注射aptamer-protamine-sisurvivin复合物,在6周后取出肿瘤发现 注射复合物组肿瘤大小和重量明显小于对照的生理盐水组(见图14),并且survivin在肿 瘤组织中的表达和生理盐水对照组相比明显降低(见图15、16),说明该复合物在体内环境 下可以通过靶向的沉默肿瘤组织中的survivin的表达来达到抑制肿瘤生长的目的。
权利要求
1.一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物,它由核酸适体、鱼精蛋白和小分子干扰 核糖核酸三部分构成,其特征在于复合物的复合方法步骤是,1)将核酸适体和小分子干扰核糖核酸按照摩尔比1 1的比例用生理盐水或者磷酸盐 缓冲液溶解,超声混勻;2)将鱼精蛋白溶解于生理盐水或者磷酸盐缓冲液,超声混勻促溶,然后将1)中的混 合液缓慢加入鱼精蛋白中,鱼精蛋白和核酸适体以及小分子干扰核糖核酸的最佳摩尔比为 1:1: 1,低速震荡混勻5min,室温静置20-30min,置于-20°C长期保存。
2.一种肿瘤基因干预的新型靶向复合物的用途,其特征在于该复合物经制备组合成 药物可以用于肿瘤疾病的生物靶向治疗或者作为一种试剂用于基因干扰。
全文摘要
一种用于肿瘤基因干预的新型靶向复合物,它由核酸适体、鱼精蛋白和小分子干扰核糖核酸三部分构成,复合物的复合方法步骤是,将核酸适体和小分子干扰核糖核酸按照摩尔比1∶1的比例用生理盐水或者磷酸盐缓冲液溶解,超声混匀。将鱼精蛋白溶解于生理盐水或者磷酸盐缓冲液,超声混匀促溶,然后将混合液缓慢加入鱼精蛋白中,鱼精蛋白和核酸适体以及小分子干扰核糖核酸的最佳摩尔比为1∶1∶1,低速震荡混匀5min,室温静置20-30min,置于-20℃长期保存。
文档编号A61P35/00GK102028955SQ20101024879
公开日2011年4月27日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者张鹏, 徐向上, 曹志新, 陶德定, 龚建平 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院