专利名称：表达鸡α-干扰素的大肠杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达鸡α “干扰素的大肠杆菌及其应用。
背景技术：
家禽肿瘤和病毒感染性疾病的有效治疗一直是困扰禽病防治的重大难题之一。鸡 的免疫系统以及在病原感染或注射疫苗时所产生的免疫反应与哺乳动物相似，所以可考虑 应用细胞因子来控制疾病。相对来说，禽类的饲养简单、廉价，出笼时间短，而且数量较大， 这就需要考虑所用疫苗或者治疗药物的经济价值。绿色食品工程的启动，人们对食品安全 重视的升温，常用的抗病毒类药物带来严重的药物残留，危及人类的健康，得到社会的普遍 关注。所以，养禽业迫切需要新一代天然治疗方法。在病原感染和疫苗免疫中，干扰素等细 胞因子可调控免疫反应的类型与程度，是一种高效、天然的治疗方法。干扰素是第一个应 用于临床的基工程产品，目前IFN-α、IFN-β和IFN-γ都有基因工程产物，在临床医学中 有40多个国家使用干扰素制剂，治疗30多种疾病，但主要是用于临床肿瘤和病毒感染等治 疗。与之相类似，IFN在家禽肿瘤和病毒性疾病的临床治疗上也有极其广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种遗传稳定、重组蛋白表达稳定的表达鸡α -干扰素的重 组菌。本发明所提供的表达鸡α-干扰素的重组菌，是稳定表达序列表中序列1第 94-582位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。其中，所述大肠杆菌可以为大肠杆菌菌株Ml5 [pREP4]。本发明的表达鸡α-干扰素的重组菌在有选择压力下经过传代培养重组菌含质 粒率均在96%以上，在无选择压力下连续传代5代时质粒丢失率小于5%，经诱导表达后， 目的蛋白表达量稳定，复性后蛋白的抗病毒活性均在2. 18Χ 109U/mg以上。本发明的表达 鸡α-干扰素的重组菌对鸡是安全的。本发明的另一个目的是提供一种生产鸡α-干扰素蛋白的方法。本发明的生产鸡α-干扰素蛋白的方法，包括如下步骤将上述表达鸡α-干扰素的重组菌进行培养，诱导表达鸡α-干扰素，收集菌体， 破碎菌体，离心收集包涵体，洗涤包涵体，离心收集包涵体；用含有5-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，离心收集上清；采用Hi S-蛋白质镍亲和层析树脂纯化上清，收集目的蛋白峰；测定收集的蛋白浓度，在冰水浴或者2°C _8°C的条件下，将收集的蛋白加入到复 性液中使蛋白质浓度在75-150 μ g/mL L，2°C _8°C静置复性20-24小时，获得猪α -干扰 素蛋白；所述复性液中盐酸胍0. 3-1. Omol/L、尿素0. 5-2. Omol/L、精氨酸0. 1-1. Omol/L、 还原型半胱氨酸 1.0-7. 0mmol/L、氧化型胱氨酸 0. 1-2. 0mmol/L、Tris-HCl 10-20mmol/ L(pH8-ll)、EDTA 1. 0-5. 0mmol/L(pH8. 0)；
采用离子柱对上述复性后的溶液进行纯化、透析，获得鸡α-干扰素蛋白。本发明的生产鸡α-干扰素蛋白的方法获得的α-干扰素蛋白能够有效地抑制 VSV病毒对细胞的破坏作用，生物学活性均在2. 18X 109U/mg以上。本发明的再一个目的是提供一种鸡α -干扰素蛋白注射液。本发明所提供的鸡α-干扰素蛋白注射液，其活性成分为上述生产鸡α-干扰素 蛋白的方法制备的鸡α _干扰素蛋白的PBS溶液或者生理盐水溶液。其中，还可含有适宜浓度的佐剂、稳定剂。如浓度为0. 1 0. 5mol/L的精氨酸、 1 10%的葡萄糖或蔗糖，0. 1 2. 5%的甘露醇或山梨醇及适量浓度的甘油、氯化钠等。本发明的鸡α-干扰素蛋白注射液，对鸡是安全的，并且提高了肉仔鸡的生产性 能，提高了肉仔鸡的胴体品质，提高了机体的吸收能力，增强了鸡的机体抵抗力。对提高肉 仔鸡的淋巴细胞免疫功能、具有一定促进作用；同时对肉仔鸡免疫器官的发育有一定的促 进作用，也能增强鸡机体巨噬细胞功能；对临床型鸡ND具有明显的治疗效果。
图1为ChIFN-α基因PCR产物电泳结果。图2为重组鸡IFN-α的标准曲线。图3为鸡体内基因工程α-干扰素的药时曲线。图4为使用重组鸡IFN- α对肉鸡免疫器官的影响。图5为胸腺、脾脏、法氏囊和肝脏的组织切片。
具体实施例方式实施例(一)鸡IFN-α基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达与复性菌种大肠杆菌JM109，宿主表达菌Μ15 (pREP4)，购自QIAGEN公司。载体pQE30表达载体，购自QIAGEN公司；pMD18_T Vector (TaKaRa产品)购自大 连宝生物公司。试剂高保真pfu DNA聚合酶(Promega)及相应的PCR回收试验盒、BamHI、EcoRI 等限制性内切酶和IPTG、X_gal等(TaKaRa产品)等购自相关生物公司。从莱航鸡肝组织中提取基因组DNA。应用PCR技术从提取的鸡基因组DNA中扩增ChIFN- α完整基因及其成熟片段基 因。 PCR 上游引物 PUl CAGAATTCCATGGCTGTGCCTGCAAGC ；PCR 上游引物 PU2TC GCA TGC AACCACCTTCGCCCCCAGGAT ；PCR 下游引物 PD IATAA GCTTAGCTGCGCGTGTTGTTGCCTG。PCR 反应条件为95 "C 2min30sec，4 V 2min，95 V 2min30sec ；95 V 30sec, 56°C 30sec,72°C lmin，30 个循环；最后 72°C延伸 5min。1 %琼脂糖凝胶电泳，观察PCR扩增结果。将相应PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，结果如图1所示，可分别见到大小约为 600bp和500bp的特异片段。按PCR Recovery Kit使用说明对600bp和500bp PCR产物进行回收，克隆入PMD18-T载体中构建测序载体pTA和pTS进行测序，测序结果表明，600bp 的DNA片段(序列表中序列1)包括582个碱基，共编码193个氨基酸，由31个氨基酸的信 号肽序列和162个成熟肽序列组成，含有4个糖基结合位点，其中成熟肽序列理论分子量为 19KDa,构建后表达成熟肽的推测分子量为21KDa。将该序列与Genebank上部分核苷酸和 氨基酸序列进行比较，核苷酸序列在信号肽序列上没有差别，在成熟肽序列上与已知参考 序列的核苷酸同源性在98. 8% -99. 8%之间；氨基酸序列同源性为97. 6% -98. 8%。500bp 的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列1第94-582位，编码162个成熟肽氨基酸。BamH I和Hind III双酶切经琼脂糖电泳后回收500bp的DNA片段，与经同样双酶 切的PQE30载体用T4DNA连接酶连接，构建ChIFN- α重组表达质粒，转化大肠杆菌JM109， 取鉴定后的阳性重组质粒转化Μ15 (pREP4)，重组大肠杆菌MRISl。取重组大肠杆菌MRISl 37 °C振荡培养，当OD6tltl = 0.4 0.6时加入IPTG，37°C 继续培养4. 5-6h，进行诱导表达。培养结束后，取表达菌体离心，收集菌体沉淀用IOmmol/ L Tris-HCl悬浮后，加样缓冲液煮沸裂解变性5min后直接用于15%聚丙烯酰胺凝胶进行 SDS-PAGE。染色结束后，用双波长非点扫描仪，对上述SDS-PAGE电泳蛋白带进行凝胶薄层 扫描。通过SDS-PAGE进行分析，以转pQE30载体的M15 (pREP4)为阴性对照，重组大肠杆 菌MRISl在分子量21kD处可见一特异蛋白带，该条带为融合表达的ChIFN-α重组蛋白。 蛋白可溶性试验表明，该菌株所表达的蛋白为不溶性包涵体，双波长非点凝胶薄层扫描对 SDS-PAGE电泳蛋白带进行扫描结果表明，特异的表达蛋白可占菌体总蛋白的37. 6 %。取大量重组大肠杆菌MRISl诱导培养物4°C 5000r/m离心15min，收集菌体，重悬 于 TE 溶液[10-50mmol/L Tris HCl (pH8. 0)，l_5mmol/L EDTA]中，置 4°C备用，或离心后将 沉淀-20°C保存。将上述重悬菌液超高压勻质二次。先低速离心去杂质后再高速离心收集 包涵体，用含并依次用含1-5% (体积百分含量)TritonX-IOO的TE溶液、2-4mol/L尿素的 TE溶液和l-3mol/L盐酸胍缓冲溶液对获得的包涵体进行洗涤，6000_10000g离心后收集的 沉淀即为初步纯化的表达干扰素包涵体。最后用含有5-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包 涵体，6000-1000g离心后收集上清即为表达干扰素的变性液。采用胱氨酸_半胱氨酸再氧化法对表达干扰素的变性液利用分段稀释法进行复 性。具体的操作如下利用BCA Protein Assay Kit测定上述变性液的蛋白浓度，然后在 冰水浴的条件下，将适量的变性液分步加入到磁力搅拌的含有0. 3-2. Omol/L盐酸胍、尿 素0. 5-2. Omol/L、精氨酸0. 1-1. Omol/L、还原型半胱氨酸1. 0-7. Ommol/L、氧化型胱氨酸 0. 1-2. 0mmol/L、Tris-HCl 10_50mmol/L (pH8_10)、EDTA 1. 0-5. Ommol/L (pH8. 0)的复性液 中，使蛋白质浓度在100-200ug/mL之间。将复性液14°C _16°C静置复性20-24小时，采用 离子柱对复性液进行蛋白质的进一步纯化获得重组鸡IFN-α。采用细胞病变抑制法(以 CEF-VSV为基本检测系统)测定重组鸡IFN- α的抗病毒活性(效价测定)。多次活性检测结果表明，采用该复性方法复性后的重组鸡IFN- α在CEF细胞上 表现出较高的抗病毒活性，能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用。复性后的重组鸡 IFN-α对VSV的抗病毒活性均在107U/mL以上，比活性在2. 18X 108U/mg以上。( 二)重组大肠杆菌MRISl质粒遗传稳定性及表达蛋白稳定性试验1)质粒在重组大肠杆菌中的遗传稳定性
将37°C振荡培养过夜的重组大肠杆菌MRIS1，按接种于IOOmL含Kan (30 μ g/ mL)和Amp (50 μ g/mL)的LB培养基中，37°C继续培养12h。将上述培养物稀释106倍，在含 Kan (30 μ g/mL)和Amp (50 μ g/mL)的LB培养基中37°C培养12h，适当稀释后，取100 μ L菌 液涂种于LB琼脂平板上。37°C过夜培养后，随机挑取100个单菌落，转种在含Kan+Amp的 LB琼脂平板上，37°C过夜培养并进行菌落计数，重组大肠杆菌MRISl的含质粒率均在96 % 以上。2)无选择压力下连续传代的质粒遗传稳定性将含Kan (30 μ g/mL)和Amp (50 μ g/mL)的LB培养基中37°C振荡培养过夜的菌体， 按5%接种于IOOmL不含Kan和Amp的LB培养基，振荡培养18_20h，连续培养5代后，适当 稀释，取100 μ L菌液涂种于普通LB琼脂平板上过夜培养，然后随机挑取100个单菌落，转 种在含Kan和Amp的LB琼脂平板上，37°C过夜培养并进行菌落计数，重组大肠杆菌MRISl 在无选择压力下连续传代5代时质粒丢失率小于5%。3)重组大肠杆菌表达重组鸡IFN- α的稳定性试验将重组大肠杆菌MRISl接种含Kan (30 μ g/mL)和Amp (50 μ g/mL)的LB培养基中 37°C发酵培养。当OD6tltl = 0. 6 1. 0时加入终浓度为lmmol/L的IPTG，37°C继续培养4_6h， 进行诱导表达。培养结束后，取表达菌体离心，收集菌体沉淀用lOmmol/L Tris-HCl悬浮后， 加样缓冲液煮沸5min后直接用于15%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。染色结束后，用双 波长非点扫描仪，对上述SDS-PAGE电泳蛋白带进行凝胶薄层扫描。收获培养物制备样品进行SDS-PAGE和薄层扫描分析，目的蛋白表达量稳定，符合 原始菌种的表达量，且与原始菌株表达图谱一致。 4)重组大肠杆菌MRISl表达重组鸡IFN- α的复性与活性检测将上述收集菌体重悬后超高压勻质表达产物按建立方法进行包涵体分离、纯化后 最后用含有5-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，6000-10000g离心后收集上清即为表 达的重组基因干扰素变性液。变性液采用胱氨酸_半胱氨酸再氧化法对纯化后的包涵体变 性液利用分段稀释法进行复性。采用细胞病变抑制法(以CEF-VSV为基本检测系统)测定 重组鸡IFN- α的抗病毒活性(效价测定)。SDS-PAGE和薄层扫描分析结果表明，目的蛋白表达量稳定，特异的表达蛋白可占 菌体总蛋白的15. 3% -19. 7%，符合原始菌种的表达量，且与原始菌株表达图谱一致。多次活性检测结果如表1表明，采用该复性方法复性后的重组鸡IFN- α在CEF细 胞上表现出相应较高且稳定的抗病毒活性，能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用， 复性后的重组鸡IFN-α生物学活性均在2. 18Χ 109U/mg以上。(三)重组鸡IFN-α对鸡的毒力试验试验动物120只17日龄健康AA肉仔鸡购自由莱阳春雪集团。重组鸡IFN-α注射液10000单位重组鸡IFN-α、0. 5mol/L的精氨酸、10%的葡 萄糖，2. 5%的甘露醇。选择120只17日龄健康AA肉仔鸡，随机分为4组，每组3个重复，每个重复10只。 第1组为对照组。第2-4组为试验组，受试鸡分别肌肉注射0. 1剂量(1000单位)、1剂量 (10000单位)和10倍剂量(100000单位)重组鸡IFN- α。对照组肌肉注射0. 6ml生理盐 水。试验期为25天。
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45日龄停饲12h后，清晨称重，清箱底法称剩余饲料，计算生产性能指标(耗料量、 增重和料重比)。每个重复随机抽取2只鸡，颈动脉放血屠宰，随后浸烫脱毛计算胴体品质 指标(全净膛率、半净膛率、腹脂率和屠宰率)、脏器指数(肝脏、心脏、脾脏和法氏囊)、肠 壁厚度(十二指肠、空肠和回肠肠壁)。1)注射不同剂量的重组鸡IFN-α对肉仔鸡的临床表现、不良反应的观察观察结果表明，各试验组鸡只在注射重组鸡IFN-α后精神状态良好、饮水正常、 饲料消耗、排便情况与对照组未见差异，羽毛光滑，注射部位也未见红肿，溃烂等不良反应。2)注射不同剂量的重组鸡IFN-α对肉仔鸡生产性能的影响结果显示，第3组受试鸡增重显著高于第1、4组(P < 0. 05)，与第2组差异不显著 (P >0.05)。各组受试鸡耗料量、料重比差异不显著。结果显示，第3组受试鸡全净膛率显著高于其余各组(P < 0. 05)，各组半净膛率、 屠宰率、腹脂率差异不显著(P > 0. 05)。3)注射不同剂量的重组鸡IFN-α对肉仔鸡脏器指数和肠壁厚度的影响结果显示，各组心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、法氏囊指数差异不显著(P > 0. 05)。结果显示，第3、4组受试鸡十二指肠肠壁厚度显著薄于对照组(P < 0. 05)，各组空 肠肠壁厚度、盲肠肠壁厚度差异不显著(ρ>0. 05)，第2、3、4组回肠肠壁厚度显著薄于对照 组(P < 0. 05)。综上所述注射重组鸡IFN-α后鸡精神状态良好、饮水正常、饲料消耗、排便情况 正常，羽毛光滑，注射部位也未见红肿，溃烂等不良反应；体重显著增高；提高了肉仔鸡的 生产性能，还提高了肉仔鸡的半净膛率、全净膛率和屠宰率等，从而提高了肉仔鸡的胴体品 质。降低肠壁厚度、增加单位面积内肠绒毛数量，从而促进营养物质在肠道的吸收，提高了 机体的吸收能力；增强了鸡的机体抵抗力，进而提高了饲料报酬。(四)重组鸡IFN-α对鸡免疫功能的影响试验动物80只10日龄健康AA肉仔鸡购自莱阳春雪集团。 选择80只10日龄健康AA肉仔鸡，随机分为4组，每组20只。第1组为对照组。 第2-4组为试验组，受试鸡分别肌肉注射0. 1剂量(1000单位)、1剂量(10000单位)和10 倍剂量(100000单位)重组鸡IFN-α。对照组肌肉注射0. 6ml生理盐水。试验期为35d。分别在肌肉注射重组鸡IFN-α前，注射后7d、14d、21d、28d、35d心脏采集肝素抗 凝血和非抗凝血进行测定。1)淋巴细胞转化率的测定(MTT法)结果显示，第3组受试鸡在注射重组鸡IFN-α后第14d、21d淋巴细胞转化率显著 高于对照组(P < 0. 05)，第28d显著高于其余各组(P < 0. 05)。2)免疫器官指数的影响测定于28日龄、45日龄每组随机取4只受试鸡，进行屠宰后用分析天平称取体重、胸 腺、脾脏、法氏囊的重量，并计算免疫器官指数(免疫器官指数=免疫器官重量(mg)/体重 (g) X100% )。结果显示，28日龄第3组受试鸡的胸腺指数显著高于对照组(P < 0. 05)，脾脏指 数，法氏囊指数各组差异不显著(P>0.05) ；45日龄各组鸡的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊
7指数差异不显著(P > 0. 05)。3)白介素-2的测定每组随机取4只受试鸡，分别于注射前，注射后7d、14d、21d、28d、35d心脏采血分 离血清，试剂盒由BPB Biomedicals Inc提供，检测方法按试剂盒要求进行，由标准品做标 准曲线后求出方程，把样品OD45tlnm值代入方程求值。结果显示，第3组受试鸡在注射重组鸡IFN-α后第14d、21d、28d白介素_2含量 显著高于其余各组(P < 0. 05)。4)血清补体总活性的测定(CH50法)每组随机取4只受试鸡，分别于注射前，注射后7d、14d、21d、28d、35d心脏采血分 离血清，自行制备鸡溶血素，标定效价，制成4IU/ml溶血素。倍比稀释待检血清，按CH50法 测定上清OD542nm值，与50%溶血标准相近的最高稀释倍数即为血清总补体效价，换算成补 体单位。结果显示，第3组受试鸡在注射重组鸡IFN- α后第14天、21天血清补体总活性含 量显著高于其余各组(P < 0. 05)。综上所述，注射重组鸡IFN-α对提高肉仔鸡的淋巴细胞免疫功能、具有一定促进 作用；同时对肉仔鸡免疫器官的发育有一定的促进作用，也能增强鸡机体巨噬细胞功能。(五)重组鸡IFN-α纯化制品在鸡体内的消长规律20只32日龄健康AA肉仔鸡，购自莱阳春雪集团。重组鸡IFN-α (40MU/ 瓶 *4ml)；重组鸡 IFN-α 检测试剂盒由 BPBBiomedicals, Inc 提供，批号 70621S。Penta-His HRP Conjugate Kit,Tetra-His HRPConjugate Kit 由 QIAGEN公司提供。选择20只32日龄健康AA肉仔鸡，肌肉注射1个剂量重组鸡IFN- α，试验期为7 天。分别在肌肉注射重组鸡IFN-α 前、注射后 0. 5h、lh、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、 96h、168h时每次随机取4只受试鸡，心脏采血分离血清，用BPBBiomedicals，Inc生产的试 剂盒进行测定内源性重组鸡IFN-α，用Penta-His HRPConjugate Kit测定外源性重组鸡 IFN- α。1)鸡内源性α -干扰素含量结果显示，注射1倍剂量的重组鸡IFN-α后8h后达到峰值；2h、4h、6h、8h和12h 肉仔鸡内源性0-干扰素含量显著高于注射前，注射后0.511、111、4811、9611和168h内源性 α -干扰素含量(P < 0. 05)见表11。2)重组鸡IFN- α含量标准曲线的制备将重组鸡IFN-α做不同浓度的稀释，测定不同干扰素浓度下对应的OD 值，以OD值为横坐标(X)，以干扰素浓度(y)为纵坐标回归，建立回归方程为ν = 5525. 9X2-513. 28X+15. 106,r2 = 0. 9911，如图2所示。给鸡肌肉注射重组鸡IFN-α后血药 浓度如图3所示。重组鸡IFN-α药动学数据经中国药理学会推荐的3p97软件处理，分别用单室、 双室、三室模型按最好二乘法进行拟合后，重组鸡IFN-α鸡体内的代谢过符合一室开放模
8型，权重为1/C2。重组鸡IFN-α的药动学参数如表12所示。表12.鸡血清中重组鸡IFN-α药动学参数(η = 4)
权利要求
表达鸡α 干扰素的重组菌，是稳定表达序列表中序列1第94 582位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株 M15[pREP4]。
3.生产鸡α-干扰素蛋白的方法，包括如下步骤将表达鸡α-干扰素的重组菌进行培养，诱导表达鸡α-干扰素，收集菌体，破碎菌体， 离心收集包涵体，洗涤包涵体，离心收集包涵体；用含有5-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，离心收集上清；采用His-蛋白质镍亲和层析树脂纯化上清，收集目的蛋白峰；测定收集的蛋白浓度，在冰水浴或者2°C-8°C的条件下，将收集的蛋白加入到复性液 中使蛋白质浓度在100-200 μ g/mL, 14°C _16°C静置复性20-24小时。所述复性液中盐酸胍 0. 3-1. Omol/L、尿素 0. 5-2. Omol/L、精氨酸 0. 1-1. Omol/L、还原型半胱氨酸 1. 0-7. Ommol/ L、氧化型胱氨酸 0. 1-2. 0mmol/L、Tris-HCl 10-20mmol/L(pH8-ll)、EDTA 1. 0-5. Ommol/ L (ρΗ8· 0)；采用离子柱对上述复性后的溶液进行纯化、透析，获得鸡α-干扰素蛋白；所述表达鸡α -干扰素的重组菌是稳定表达序列表中序列1第94-582位所示的DNA 分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的生产鸡α-干扰素蛋白的方法，其特征在于所述大肠杆菌 为大肠杆菌菌株Μ15 [pREP4]。
5.鸡α-干扰素蛋白注射液，其活性成分为权利要求3所述生产鸡α-干扰素蛋白的 方法制备的鸡α-干扰素蛋白。
6.根据权利要求5所述的鸡α-干扰素蛋白注射液，其特征在于含有佐剂和/或稳 定剂。
全文摘要
本发明公开了一种表达鸡α-干扰素的大肠杆菌及其应用。表达鸡α-干扰素的重组菌，是稳定表达序列表中序列1第94-582位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。本发明的表达鸡α-干扰素的大肠杆菌可用于生产鸡α-干扰素蛋白。生产的鸡α-干扰素蛋白可用于制备鸡α-干扰素蛋白注射液。本发明的表达鸡α-干扰素的重组菌遗传稳定，蛋白表达稳定，鸡是安全的。α-干扰素蛋白能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用。鸡α-干扰素蛋白注射液，对鸡是安全的，对提高肉仔鸡的淋巴细胞免疫功能、具有一定促进作用；同时对肉仔鸡免疫器官的发育有一定的促进作用，也能增强鸡机体巨噬细胞功能；对临床型鸡ND具有明显的治疗效果。
文档编号A61K9/08GK101974477SQ20101029592
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘焕珍, 崔增学, 李春荣, 石乔, 马凤龙 申请人:崔增学