专利名称：含有益生微生物的干全乳制品的制作方法
含有益生微生物的干全乳制品本发明涉及幼孩营养领域。特别地，本发明涉及包含益生微生物以施用至年龄大于12个月幼孩的干全乳制品。这些益生微生物可以是非复制型益生微生物，例如有生物活性的热处理的益生微生物。母乳是婴儿健康生长和发育的理想食物。在2001年，世界卫生组织(WHO)将其推荐的纯粹母乳喂养持续期从4至6个月变成6个月，因此应当相应地鼓励和促进母乳喂养。从第六个月伊始往后，婴儿的行为改变。它们第一次坐起或仅用一只手握住玩具。随着婴儿发育，婴儿的营养要求改变。营养物如铁和钙变得甚至更重要。年龄从一岁以上，基于牛乳的饮料变成婴儿膳食中的重要项。但是牛乳本身不适应于幼孩的营养要求。具体而言，牛乳含有太多的蛋白质，太多的矿物质、太少的铁、太多饱和脂肪酸和不足的不饱和脂肪。
开发了全乳制品以辅助确保这个年龄上的儿童的最佳发育。幼孩早期营养的一项重要功能是产生健康的肠道菌群并形成强的免疫系统。健康肠道菌群将有助于有功能的胃肠道，这转而会帮助恰当地消化摄入的食物并会减少婴儿和幼孩中的胃痛。幼孩一般每年患有约10次感冒。这类感冒是不舒服的，并且甚至可能造成更严重的后果。因而希望进一步改善全乳制品的免疫增强作用。也希望进一步改善全乳制品的抗炎作用。因而，本领域需要针对年龄至少12月的幼孩的需要确保最佳营养支持的全乳制品。这种全乳制品应当具有改善的免疫增强作用、抗炎作用和/或应当促进消化。如果通过使用现有工业技术，利用施用安全而无副作用并且容易掺入成长型乳组合物的天然成分实现这一点，这将是优选的。本发明人已经解决这种需要。因此本发明的目的是改善现有技术并提供满足上述需要的全乳制品。本发明人出人意料地看到他们能够通过独立权利要求的主题实现该目的。从属权利要求进一步发展本发明的构思。因此，本发明人提出来提供包含益生元(prebiotics)和益生菌的全乳制品。全乳制品是营养组合物。本发明的全乳制品是设计旨在幼孩持续发育期间最佳支持幼孩的特定的营养组合物。随着儿童发育期间的营养要求变化，可以通过提供多于一种特定的全乳制品实现这一点，每种特定的全乳制品理想地适合特定的年龄范围。例如，一种全乳制品可以在年龄12个月时开始施用，并且第二种全乳制品可以在年龄36个月时开始施用。发现益生菌能够在全乳制品的环境下提供它们的健康益处。另外，例如，双歧杆菌存在于母乳中并且是赋予母乳天然保护性特征的一部分。因而，添加益生微生物至幼孩用全乳制品将使得这些全乳制品与母乳更相似。然而，由于尤其待用水重构的粉末配方食品(formula)的货架寿命通常超过例如包含益生菌的酸乳饮品的货架寿命，故益生菌通常不添加至此类配方食品，例如，原因是在延长的货架寿命期间确保益生菌活力的不确定性。本发明人现在能够显示甚至非复制型益生菌可以提供益生菌的健康益处并且甚至可以具有改善的益处。因而，本发明涉及干全乳组合物，其包含益生微生物和选自豌豆壳纤维、果寡醣(Oligofructose)、菊粉及其组合中的益生元以施用至年龄从12个月开始的幼孩。全乳组合物提供正确量的具有平衡脂肪酸组成的脂质。脂质是最好的能量提供者(9kcal/g)，为学步幼儿增加的活动所需要。但是，也需要脂肪酸以构成细胞膜，并且它们是一些生理活性因子(例如激素、凝血因子等)的重要前体。本发明的全乳组合物包含平衡的蛋白质含量。
一方面，需要蛋白质以例如构成身体组织如肌肉，尤其在发育时间期间。另一方面，高量的蛋白质加重学步幼儿仍不成熟的肾功能的负担。如果肾功能未成熟，则高蛋白质摄入可以损害肾功能。研究提出，年龄超过I岁的儿童倾向于具有高于儿科医生建议的蛋白质摄入。闻蛋白质摄入也涉及后期生活中的肥胖症。在本发明的全乳组合物中存在的益生元组合物可以例如是豌豆壳纤维、果寡醣和菊粉的混合物。例如，它可以备选地是果寡醣和菊粉的混合物。这种益生元组合物帮助支持健康的消化系统。例如，本发明的组合物可以含有每克干重2_4g果寡醣。本发明的全乳组合物可以进一步用对于生长重要的维生素和矿物质强化。例如，一份次本发明的全乳组合物可以含有对I和3岁年龄之间的儿童每日所推荐的35%钙和15%维生素A。本发明的全乳组合物也可以含有每份次I. 5克用于儿童生长和发育的必需脂肪酸。本发明的组合物可以进一步用天然蜂蜜滋味丰富，旨在确保儿童很喜欢该全乳组合物。本发明的组合物可以含有20_27g/100g干重的量的蛋白质源、49_52g/100g干重的量的碳水化合物源和19-24g/100g干重的量的脂质源。如果该组合物待施用至年龄12-36月的儿童，它可以含有25_27g/100g干重的量的蛋白质源、50-52g/100g干重的量的碳水化合物源和19-21g/100g干重的量的脂质源。如果该组合物待施用至年龄超过36个月的儿童，它可以含有20_20g/100g干重的量的蛋白质源、49-51g/100g干重的量的碳水化合物源和23-24g/100g干重的量的脂质源。牛乳具有对幼孩营养次优的脂肪酸组成。饱和脂肪酸高和不饱和脂肪酸低，牛乳未提供最佳和最健康的脂肪酸组成。不饱和脂肪酸是生长需要的，例如用于构成神经系统中的细胞，并且研究显示许多学步幼儿没有接受推荐的水平。例如，脑非常富含DHA(n-3不饱和脂肪酸)。因此，本发明的组合物具有两类必需脂肪酸之间的良好平衡，亚油酸和a -亚油酸的大致含量为10 : I至6 : I范围内的比率。如果作为干燥的组合物提供，优选该组合物具有0. 2以下、优选0. 15以下的水活度以进一步增加货架稳定性。例如，大部分细菌在低于0.91的水活度下不生长，并且大部分霉菌在低于0. 80的水活度下停止生长。
水活度(aw)是某体系中水的能量状态的量度。其定义为水的蒸汽压除以纯水的蒸汽压。因而，蒸馏水具有水活度I。本发明的全乳组合物也可以含有每IOOmL配方食品I. 5-2. 5mg核苷酸。核苷酸及其碱基不视为‘必需’，因为它们可以由婴儿身体从更简单的化合物合成。然而，在某些时候，合成过程可能不能够满足需要，例如，在细胞快速周转期间，如在正常生长或肠道疾病中。在这些时候，身体更倚重于膳食核苷酸源。为了最佳营养支持，可以按一日至少两份次提供本发明的组合物。例如，包含约30_36g干组合物和200至250mL水的一份次可以对早餐施用一次并且当日期间施用第二次。该组合物可以部分地或仅包含非复制型益生微生物。
本发明人出人意料地看到，例如，就免疫增强作用而言和/或就抗炎作用而言，非复制型益生微生物甚至可以比复制型益生微生物更有效。这是出人意料的，因为益生菌经常被定义为“当足量施用时赋予宿主健康益处的活微生物”(FA0/WH0指南)。绝大多数的公开的文献涉及活的益生菌。此外，几项研究调查了由不复制型细菌递送的健康益处，并且这些研究中的大部分表明益生菌的灭活(例如通过热处理)导致所声称的健康益处丧失(Rachmilewitz, D.等人，2004, Gastroenterology 126 :520-528 ；Castagliuolo 等人，2005, FEMS TmmunoI. Med.Microbiol. 43 :197-204 ；Gill, H. S.和 K.J. Rutherfurd,2001, Br. J. Nutr. 86 :285-289 ；Kaila，M.等人，1995，Arch. Dis. Child 72:51-53.)。一些研究显示死的益生菌可以保留一些健康作用(Rachmilewitz,D.等人，2004,Gastroenterology 126 :520-528 ；Gill,H. S.和K. J. Rutherfurd，2001，Br. J. Nutr. 86 :285-289)，但是显然，本领域迄今认为活的益生菌表现得更好。本发明的组合物可以以任意的有效量(例如以对应于约IO6至1012CfU/g干重的量)包含益生微生物。所述益生微生物可以是非复制型益生微生物。“非复制型”益生微生物包括已经热处理过的益生细菌。这包括灭活的、死的、无活力和/或作为片段如DNA、代谢物、细胞质复合物和/或细胞壁物质存在的微生物。“非复制型”意指不能通过常规平板方法检测到活细胞和/或菌落形成单位。此类常规平板方法在微生物学书籍James Monroe Jay, Martin J. Loessner, DavidA.Golden. 2005. Modern food microbiology.第七版，Springer Science, New York,N. Y.第790页中概述。一般而言，可以如下显示活细胞的不存在在不同浓度的细菌制备物(‘非复制型’样品)并且在适宜条件(有氧和/或厌氧气氛持续至少24小时)下培养后，琼脂平板上无可见到的菌落或液体生长培养基中浊度不增加。为本发明的目的，将益生菌定义为“有益影响宿主健康或福利的微生物细胞制品或微生物细胞组分”(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人,“益生菌应当如何定义它们(Probiotics :how should they be defined)，，Trends Food Sci. Technol. 1999 10107-10)。使用非复制型益生微生物的可能性提供了几种优势。在免疫严重受损的儿童中，活益生菌的使用可能在异常情况下因发生菌血症的潜在风险而受限。可以毫无问题地使用非复制型益生菌。另外，非复制型益生微生物的提供允许热重构(hot reconstitution),同时保留健康益处。本发明的组合物以足够至少部分地产生健康益处的量包含益生微生物和/或非复制型益生微生物。将足够实现这一点的量定义为“治疗有效量”。有效用于此目的的量将取决于本领域技术人员已知的多种因素，如此儿童的重量和总体健康状况，并且取决于食物基质的作用。在预防性应用中，将本发明的组合物以这样的量施用至易患某病症或具有该病症风险的消费者，所述的量足够至少部分地降低发生 该病症的风险。将这种量定义为“预防有效量”。再次地，精确的量取决于多种因素，如所述儿童的健康状况和重量，并且取决于食物基质的作用。本领域技术人员将能够适宜地调节治疗有效量和/或预防有效量。本发明的组合物以治疗有效量和/或以预防有效量含有益生微生物和/或非复制型益生微生物。一般而言，治疗有效量和/或预防有效量处于每日剂量约0. 005mg-1000mg益生微生物和/或非复制型益生微生物的范围内。就数字量而言，“短时高温”处理的非复制型微生物可以在该组合物中以与IO4和IO12等价cfu/g的干组合物之间相对应的量存在。明显地，非复制型微生物不形成菌落，因而，该术语应理解从IO4和1012cfu/g复制型细菌中获得非复制型微生物的量。这包括灭活的、无活力的或死的或作为片段如DNA或者细胞壁物质或细胞质复合物存在的微生物。换而言之，组合物含有的微生物的量就这个量的微生物的菌落形成能力(cfu)而言进行表述，如同全部微生物是活的那样，而无论它们实际上是否不复制，如是灭活的或死的、片段化的或这些状态中任意者或全部的混合体。优选地，非复制型微生物以等同于IO4至109cfu/g干组合物之间的量、甚至更优选地以等同于IO5至109cfu/g干组合物之间的量存在。可以通过本领域已知的任意方法使得益生菌不复制。现在可用的使益生菌株不复制的技术通常是热处理、Y-辐射、UV线或使用化学试剂(福尔马林、多聚甲醛)。将优选使用在食品工业中工业条件下相对容易应用的技术来使益生菌不复制。如今市场上含有益生菌的大部分产品在其生产期间经热处理。因此，将便利的是，能够随同产生的产品一起或至少以相似方式热处理益生菌，同时益生菌保留或改善其对消费者而言的有益特征或甚至获得新的有益特征。然而，通过热处理灭活益生微生物通常在文献中与至少部分丧失益生活性有关。本发明人现在已经出人意料地发现，使得益生微生物不复制，例如通过热处理，没有导致益生性健康益处丧失，而相反，可以增强现有的健康益处并且甚至产生新的健康益处。因而，本发明的一个实施方案是组合物，其中通过热处理使得非复制型益生微生物不复制。这种热处理可以在至少71. 5°C实施至少I秒。
可以使用长时热处理或短时热处理。如今在工业规模，通常优选短时热处理，如UHT样热处理。这个类型的热处理降低细菌载量，并且减少加工时间，因而减少养分的破坏。本发明人首次展示，在高温短时热处理的益生微生物显示出抗炎免疫谱，无论其初始特征是什么。具体地，通过这种热处理，发展了新的抗炎谱(anti-inflammatoryprofile)或增强现有的抗炎谱。因此，现在可以通过使用与可工业应用的常见热处理相对应的具体参数产生具有抗炎免疫谱的非复制型益生微生物，即便活的对应菌株不是抗炎菌株。
因而，例如，热处理可以是在约71. 5_150°C高温处理约1-120秒。该高温处理可以是高温/短时(HTST)处理或超高温(UHT)处理。益生微生物可以经历在约71. 5_150°C持续约1-120秒短时的高温处理。更优选地，益生微生物可以经历在约90_140°C (例如90_120°C )持续约1_30秒短时的高温处理。这种高温处理使得微生物至少部分地不复制。该高温处理可以在常压实施，但是也可以在高压下实施。常见的压力范围是从I至50巴，优选地从1-10巴，至更优选从2至5巴。显然，当热施加时，如果益生菌在呈液态或固态的培养基中进行热处理，则这是优选。待施加的理想压力因此将取决于其中提供所述微生物的组合物的性质并且取决于所用的温度。高温处理可以在约71. 5_150°C、优选地约90_120°C、甚至更优选约120_140°C的温度范围内实施。高温处理可以实施持续约1-120秒、优选地约1-30秒、甚至更优选约5-15秒的短时。这个给定的时间框指益生微生物经历给定温度的时间。注意，取决于其中提供所述微生物的组合物的性质和量并且取决于所用加热装置的架构，热施加的时间可以不同。然而一般而言，通过高温短时(HTST)处理法、瞬间巴氏杀菌法或超高温(UHT)处理法处理本发明的组合物和/或所述微生物。UHT处理法是涉及通过在超过135°C (275 °F )的温度将某组合物加热持续短时约
1-10秒来至少部分灭菌该组合物的超高温加工或超高热处理法(二者均缩写为UHT)，其中所述的温度是杀死乳内细菌孢子所需要的温度。例如，以这种方式使用超过135°C的温度加工乳，导致细菌载量在能进行连续流操作的必需持续时间(至2-5秒)内降低。存在两种主要类型的UHT系统直接系统和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽注射或蒸汽浸入法处理产品，而在间接系统中，使用板式换热器、管式换热器或刮面式换热器对产品热处理。可以在产品制备过程中的任意步骤或多个步骤使用UHT系统的组合。HTST处理法定义如下(高温/短时)设计旨在实现乳中活微生物数目下降5个对数或杀死乳中99. 9999%活微生物的巴氏杀菌法。认为这足以摧毁几乎全部酵母、霉菌和常见的腐败细菌并且还确保充分摧毁常见的致病性耐热生物。在HTST法中，将乳加热至71. 70C (161 0F )持续 15-20 秒。瞬间巴氏杀菌是对易腐饮料如果汁和菜汁、啤酒和乳产品进行热巴氏杀菌的方法。该方法在灌装至容器之前进行，目的是杀死腐败微生物，以使产品更安全并延长它们的货架寿命。液体以受控的连续流运动，同时经历71. 5°C (160 T )至74°C (165 T )的温度约15至30秒。为本发明的目的，例如，术语“短时高温处理”应当包括高温短时(HTST)处理、UHT处理和瞬间巴氏杀菌。由于这种热处理提供具有改善抗炎谱的非复制型益生菌，故本发明的组合物可以用于炎性病症的预防或治疗中。不特别地限制可以由本发明的组合物治疗或预防的炎性病症。例如，这些炎性病症可以选自由急性炎症如脓毒病；灼伤；和慢性炎症，例如炎性肠病，例如，节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、隐窝炎(pouchitis);坏死性小肠结肠炎；皮肤炎症，如UV或化学品诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；肠激惹综合征；眼部炎症；变态反应、哮喘及其组合组成的组。
如果使用长时热处理使益生微生物不复制，这种热处理可以是在约70_150°C的温度范围实施约3分钟-2小时，优选地在80-140°C的范围实施约5分钟-40分钟。尽管现有技术一般教导就显现其益生特征而言，因长时热处理而变得不复制的细菌通常比活细胞更低效，然而，本发明人能够显示，热处理的益生菌与它们的活对应物相比在刺激免疫系统方面是优越的。本发明也涉及包含益生微生物的组合物，其中通过在至少约70°C持续至少约3分钟的热处理使得所述益生微生物不复制。通过体外免疫谱法证实非复制型益生菌的免疫增强作用。所用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子谱并且在本领域被充分接受作为检验免疫调节复合物的标准模型(Schultz 等人,2003, Journal of Dairy Research 70,165-173 ;Taylor 等人，2006, Clinical andExperimental Allergy, 36,1227-1235 ;Kekkonen等人，2008, WorldJournalof Gastroenterology,14,1192-1203)。体外PBMC测定法已经由几位作者/几个研究小组使用来例如根据益生菌的免疫谱，即根据它们的抗炎或促炎特征对其分类(Kekkonen等人,2008, World Journal ofGastroenterology, 14,1192-1203)。例如，已经显示这种测定法允许预测益生候选物在小肠结肠炎小鼠模型中的抗炎作用(Foligne, B.等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 236-243)。另外，常规地使用该测定法作为临床试验中的读出并且证明它导致与临床结果相符的结果(Schultz 等人，2003, Journal of Dairy Research 70,165-173 ;Taylor 等人，2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。变态反应性疾病具有在过去数十年期间稳定上升，并且它们目前被WHO视为流行病。在一般情况下，认为变态反应因免疫系统的Thl和Th2应答之间不平衡，从而引起强烈偏向Th2介质产生所致。因此，可以通过恢复免疫系统的Thl和Th2群之间的适宜平衡来减轻、下调或预防变态反应。这暗示降低Th2应答或增强(至少短暂)Thl应答的必要性。后者是免疫增强应答的特征，经常例如伴以较高水平的IFNy、TNF-a和IL-12。(Kekkonen等人，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203 ；Viljanen M.等人，2005，Allergy,60,494-500)。本发明的组合物因而允许治疗或预防与受损的免疫防御有关的病症。因而，不特别地限制可以由本发明的组合物治疗或预防的与受损免疫防御关联的炎性病症。例如，这些病症可以选自由感染、尤其细菌性、病毒性、真菌性和/或寄生虫感染；吞噬细胞缺损症；低至重度免疫抑制水平，如受应激或免疫抑制药物、化疗法或放疗法诱导的那些免疫抑制水平；具有较低免疫活力的免疫系统的天然状态如新生儿的那些天然状态；变态反应；及其组合组成的组。本发明中所述的组合物还允许增强儿童对疫苗、尤其对口服疫苗的应答。任何量的非复制型微生物会是有效的。然而，如果至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地全部益生菌是不复制的，这通常是优选的。在本发明的一个实施方案中，全部微生物均是不复制的。因此，在本发明的组合物中，至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、最 优选地至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地全部的益生菌可以是不复制的。全部益生微生物可以为本发明的目的使用。例如，益生微生物可选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(Iactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)，或其组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或它们的混合物。本发明的组合物可以，例如，包含选自由长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、约汉逊氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC 2287或其组合组成的组中的益生微生物。全部这些菌株是在布达佩斯条约下保藏和/或是市售的。以下菌株已经在布达佩斯条约下保藏长双歧杆菌NCC 3001 ATCC BAA-999长双歧杆菌NCC 2705 :CNCM 1-2618短双歧杆菌NCC 2950 :CNCM 1-3865乳双歧杆菌NCC 2818 :CNCM 1-3446
类干酪乳杆菌NCC 2461 : CNCM 1-2116鼠李糖乳杆菌NCC 4007 : CGMCC I. 3724嗜热链球菌NCC 2019 :CNCM 1-1422嗜热链球菌NCC 2059 :CNCM 1-4153乳酸乳球菌NCC 2287 : CNCM 1-4154干酪乳杆菌NCC 4006 :CNCM 1-1518干酪乳杆菌NCC 1825 :ACA-DC 6002 嗜酸乳杆菌NCC 3009 :ATCC 700396保加利亚乳杆菌NCC 15 : CNCM 1-1198约汉逊氏乳杆菌LalCNCM 1-1225路氏乳杆菌DSM17983DSM17983路氏乳杆菌ATCC55730ATCC55730大肠杆菌Nissle 1917 : DSM 6601本领域技术人员将理解他们可以自由地组合本文中所述发明的全部特征，而不脱离所公开的本发明的范围。本发明的其他优势和特点从以下实施例和附图中显而易见。图IA和B显示以"短时高温"处理的益生菌的抗炎免疫谱的增强。图2显示变得抗炎的非抗炎益生菌株，即以"短时高温"处理后显示明显的体外抗炎免疫谱的非抗炎益生菌株。图3A和B显示市售产品中使用的益生菌株，其以"短时高温"处理后显示增强的或新的体外抗炎免疫谱。图4A和B显示在高温热处理时显示增强的或新的体外抗炎免疫谱的乳品起子菌株(即Lcl起子菌株)。图5显示以HTST处理法处理后显示体外抗炎免疫谱的非抗炎益生菌株。图6 :对用活形式和热处理形式(140°C持续15秒)下的益生菌株和乳品起子菌株产生PBMC数据(IL-12p40、IFN-y、TNF-a、IL-10)的主要组分分析。每个点代表由其NCC编号或名称标识的一种活的或热处理的菌株。图7显示活菌株和热处理菌株(85°C，20分钟)的IL-12p40/IL_10比。总体而言，与本发明的"短时高温"处理(
图1、2、3、4和5)相反，在85°C持续20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10 比的增加。图8显示来自用热处理细菌刺激的人PBMC的体外细胞因子分泌的增强。图9显示以盐水攻击的OVA致敏小鼠(阴性对照)、以OVA攻击的OVA致敏小鼠(阳性对照)和以OVA攻击并用热处理的或活的短双歧杆菌NCC2950治疗的OVA致敏小鼠中观察到的腹泻强度百分数。结果显示为腹泻强度百分数(从4个独立实验计算的均数土SEM)，而100%腹泻强度对应于(致敏和被过敏原攻击的)阳性对照组中出现的症状。实施例I :方法学细菌制备物由活益生菌对宿主免疫系统递送的健康益处通常视为具有菌株特异性。在体外诱导高水平IL-IO和/或诱导低水平促炎细胞因子(PBMC测定法)的益生菌已经显示在体内是强力抗炎菌株(Foligne, B.等人，2007, World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。使用几种益生菌株来研究热处理的益生菌的抗炎特征。这些菌株是长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)和大肠杆菌Nissle。也试验了包括商业上用来产生NestleLcl发酵产品的一些菌株在内的几种起子培养菌株嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、保加利亚乳杆菌NCC 15和乳酸乳球菌NCC 2287。在5至15L生物反应器中为每种菌株优化的条件下培养细菌细胞。全部常见的细菌生长培养基是可用的。此类培养基是本领域技术人员已知的。当调节pH至5. 5时，连续地添加30%碱溶液(NaOH或Ca(OH)2)。当充分时，通过用CO2顶空充气维持厌氧条件。大肠杆菌在标准的有氧条件下培养。
将细菌细胞通过离心(5000x g，4°C )收集并且重悬于足够体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，旨在达到约109-101(lCfu/ml终浓度。将部分的制备物以15%甘油冷冻在-80°C。另外部分的细胞通过以下方式作热处理-超高温140°C持续15秒；通过间接蒸汽注射。-高温短时(HTST):74°C、90°C和120°C持续15秒，通过间接蒸汽注射-水浴中长时间低温(85°C，20分钟)热处理后，将样品保持在_80°C冷冻直至使用。细菌制备物的体外免疫谱评估了活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导特定细胞因子从人血细胞分泌的能力)。人外周血单核细胞(PBMC)从血液滤器分离。在通过细胞密度梯度分开后，将单核细胞收集并且用Hank平衡盐溶液洗涤两次。细胞随后重悬于补充有10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法国)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/链霉素(Sigma)和
0.1%庆大霉素(Sigma)的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基(MDM5Sigma)中。PBMC(7xl05 个细胞/孔)随后与活的和热处理的细菌(等同于7xl06cfU/孔)在48孔平板培养36小时。检验活细菌和热处理细菌对PBMC的影响，其中所述的PBMC来自分配至2个分别实验中的8位个体。在36小时孵育后，将培养平板冷冻并且保存在-20°C直至细胞因子测量。对活细菌及其热处理的对应物平行地(即在相同的实验中对相同批次的PBMC)实施细胞因子谱分析。通过ELISA (R&D DuoSet 人 IL-10，BD OptEIA 人 IL12p40，BDOptEIA 人 TNF a，BDOptEIA人IFN- y )，按照制造商的说明书测定36小时孵育后细胞因子(IFN- y、IL_12p40、TNF-a和IL-10)在细胞培养上清液中的水平。IFN-Y、IL_12p40和TNF-a是促炎细胞因子，而IL-10是强力抗炎介质。结果表述为4位独立供体的均值(pg/ml)+/-SEM并且是各自用4位供体进行的2个独立实验的代表。对每种菌株，将IL-12p40/IL-10比率算作体内抗炎作用的预测值(Foligne, B.等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。通过ELISA对每种菌株测定(见上文)的细胞因子数字值(pg/ml)转移入BioNumerics v5. 10 软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。对这组数据开展主要组分分析法(PCA，量度技术)。此分析包括从数值减去平均值和数值除以方差。
结果通过超高温(UHT)/高温短时(HTST)样处理法产生的抗炎谱处于研究下的益生菌株经历一系列热处理(超高温(UHT)、高温短时(HTST)和85°C持续20分钟)，并且将它们的免疫谱与体外活细胞的免疫谱比较。与人PBMC —起培养时，活微生物(益生菌和/或乳品起子培养物)诱导不同水平的细胞因子产生(图1、2、3、4和5)。对这些微生物的热处理以温度依赖性方式改变了由PBMC产生的细胞因子的水平。“短时高温”处理(120°C或140°C持续15秒)产生具有抗炎免疫谱的非复制型细菌(图I、
2、3和4)。实际上，UHT样处理的菌株(140°C，15秒)诱导较少的促炎细胞因子(TNF-a、IFN- y、IL-12p40)，同时维持或诱导额外的IL-10产生(与活的对应物相比)。与活细胞相t匕，得到的IL-12p40/IL-10比对于任何UHT样处理的菌株是较低的(图1、2、3和4)。这个观察结果也对经HTST样处理(即经历120°C持续15秒(图1、2、3和4)或74°C和90°C持 续15秒(图5))的细菌有效。热处理(UHT样或HTST样处理)对益生菌株(图1、2、3和5)和乳品起子培养物(图4)的体外免疫谱产生相似的影响。针对用活的和热处理(140°C，15秒)的益生菌株及乳品起子菌株产生的PBMC数据的主要组分分析揭示，活菌株均沿X轴展开，这说明菌株显示非常不同的体外免疫谱，从促炎细胞因子的低级(左侧)至高级(右侦U诱导物。热处理的菌株群集在该图的左侧，从而表明热处理的菌株诱导的促炎细胞因子少得多(图6)。相反，在85°C热处理20分钟的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，从而产生较高的IL-12p40/IL-10比(图7)。通过UHT样和HTST样处理法增强或产生抗炎谱UHT和HTST处理的菌株显示抗炎谱，无论它们各自的初始免疫谱(活细胞)是什么。已知在体内抗炎并且显示体外抗炎谱的益生菌株(长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)在“短时高温”处理后显示增强的体外抗炎谱。如图I中所示，UHT样处理的双歧杆菌菌株的IL-12p40/IL-10比低于来自活对应物的IL-12p40/IL-10比，因而显示UHT样处理的样品的改善抗炎谱。更令人震惊地，还证实非抗炎性活菌株因UHT样和HTST样处理产生抗炎谱。活的鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC 2461均显示高的体外IL-12p40/IL-10比(图2和5)。这两种活菌株显示对小鼠中TNBS诱导的结肠炎无保护性。由鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL-12p40/IL-10比在“短时高温”处理(UHT或HTST)后大幅度下降，达到与用双歧杆菌菌株获得的那些水平一样低的水平。这些低IL-12p40/IL-10比归因于低水平的IL-12p40产生，连同IL-10分泌无变化(鼠李糖乳杆菌NCC 4007)或大幅度诱导IL-10分泌(类干酪乳杆菌NCC2461)(图2)。作为结果-可以通过UHT样和HTST样热处理增强活微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌NCC2705、长双歧杆菌NCC 3001、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)。-可以通过UHT样和HTST样热处理从非抗炎性活微生物(例如鼠李糖乳杆菌NCC4007、类干酪乳杆菌NCC 2461、乳品起子嗜热链球菌NCC2019)产生抗炎谱。-也展示了从市售产品分离的菌株(包括益生性大肠杆菌菌株)的抗炎谱(图3A和B)。UHT/HTST样处理对全部受检益生菌和乳品起子(例如乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属)的影响是相似的。将UHT/HTST样处理应用于显示不同体外免疫谱的几种乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属的菌株。全部菌株在UHT/HTST样处理后比其活的对应物诱导更少的促炎细胞因子(图1，2，3，4，5和6)，表明UHT/HTST样处理对得到的非复制细菌的免疫特征的影响可以推广至全部益生菌，特别地至乳杆菌属和双歧杆菌属和特定大肠杆菌菌株，并且推广至全部乳品起子培养物，特别地至链球菌属、乳球菌属和乳杆菌属。实施例2:方法学细菌制备物使用5种益生菌株来研究非复制型益生菌的免疫增强特征3种双歧杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2种乳杆菌(类干酪乳杆菌 NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。细菌细胞以分批发酵法在37°C于MRS上培育16-18小时，同时不调控pH。将细菌细胞离心下来(5000x g，4°C)并且重悬于磷酸盐缓冲盐水中，随后稀释于盐水中，以达到约10E10Cfu/ml的终浓度。将长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007在85°C于水浴中热处理20分钟。短双歧杆菌NCC2950在90°C于水浴中热处理30分钟。将热处理的细菌悬液分装并且保持冷冻在_80°C直至使用。将活细菌在PBS-甘油15%中贮存在_80°C直至使用。细菌制备物的体外免疫谱评估了活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导特定细胞因子从人血细胞分泌的能力)。人外周血单核细胞(PBMC)从血液滤器分离。在通过细胞密度梯度分开后，将单核细胞收集并且用Hank平衡盐溶液洗涤两次。细胞随后重悬于补充有10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法国)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/链霉素(Sigma)和
0.1%庆大霉素(Sigma)的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基(MDM5Sigma)中。PBMC(7xl05 个细胞/孔)随后与活的和热处理的细菌(等同于7xl06cfU/孔)在48孔平板培养36小时。检验活细菌和热处理细菌对PBMC的影响，其中所述的PBMC来自分配至2个独立实验中的8位个体。在36小时孵育后，将培养平板冷冻并且保存在-20°C直至细胞因子测量。对活细菌及其热处理的对应物平行地(即在相同的实验中对相同批次的PBMC)实施细胞因子谱分析。通过ELISA (R&D DuoSet 人 IL-10，BD OptEIA 人 IL12p40，BDOptEIA 人 TNF，BDOptEIA人IFN- y )，按照制造商的说明书测定36小时孵育后细胞因子(IFN- y、IL_12p40、TNF-a和IL-10)在细胞培养上清液中的水平。IFN-Y、IL_12p40和TNF-a是促炎细胞因子，而IL-IO是强力抗炎介质。结果表述为4位独立供体的均值(pg/ml)+/-SEM并且是各自用4位供体进行的2个独立实验的代表。活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950在预防变态反应性腹泻中的体内作用。使用变态反应性腹泻小鼠模型来检验短双歧杆菌NCC2950的Thl促进作用(Brandt E. B等人.JCI 2003 ；112(11) =1666-1667)。致敏(间隔14日2次腹膜内注射卵清蛋白(OVA)和硫酸铝钾；第0和第14日)后，雄性Balb/c小鼠以口服方式用OVA攻击6次(第27、29、32、34、36、39日)，导致临时临床症状(腹泻)和免疫参数(总IgE血浆浓度、OVA特异性IgE、小鼠肥大细胞蛋白酶I即MMCP-1)的变化。通过管饲法在OVA致敏之前4日(第-3、-2、-1、0日和第11、12、13和14日)和攻击期间(第23至39日)施用活短双歧杆菌NCC2950或在90°C热处理30分钟的短双歧杆菌NCC2950。使用约IO9菌落形成单位(Cfu)或等价cfu/小鼠的日细菌剂量。益果热处理后‘促炎’细胞因子分泌的诱导体外评估了热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞因子的能力。将基于热处理细菌刺激PBMC时的4种细胞因子的免疫谱与相同体外测定法中由活细菌细胞诱导的4种细胞因子的免疫谱比较。将热处理的制备物铺板并且评估任何活计数的不存在。铺板后，热处理的细菌制备物不产生菌落。 与人PBMC—起培养时，活益生菌诱导不同且菌株依赖性水平的细胞因子产生(图8)。与其活的对应物相比，对益生菌的热处理改变了由PBMC产生的细胞因子的水平。热处理的细菌比其活的对应物诱导更多的促炎细胞因子(TNF-a、IFN-Y、IL-12p40)。相反，与活细胞相比，热处理的细菌诱导相似或更低的量的IL-10 (图8)。这些数据显示热处理的细菌比其活的对应物更能够刺激免疫系统并且因此更能够增强削弱的免疫防御。换而言之，体外数据显示细菌菌株在热处理后增强的免疫增强作用。为了展示热处理的短双歧杆菌NCC2950 (与活细胞相比)对免疫系统的增强作用，在变态反应性腹泻动物模型中测试活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950 (菌株A)。与阳性对照组相比，腹泻的强度在用热处理的短双歧杆菌NCC2950治疗后显著且一致地减低(41.1% ±4. 8)，而腹泻的强度在用活短双歧杆菌NCC2950治疗后仅降低20±28. 3%。这些结果表明热处理的短双歧杆菌NCC2950比其活的对应物显示出增强的抗变态反应性腹泻保护作用(图9)。因此，显示在热处理后改善了益生菌增强免疫防御的能力。其他实施例可以制备以下的全乳组合物将144g的干组合物与900mL水混合以获得即饮型制品。
权利要求
1.干全乳组合物，其包含益生微生物以及选自豌豆壳纤维、果寡醣、菊粉和它们的组合的益生元以施用至年龄从12个月开始的幼孩。
2.根据权利要求I所述的组合物，其包含20-27g/100g干重的量的蛋白质源、49-52g/100g干重的量的碳水化合物源和19-24g/100g干重的量的脂质源。
3.根据前述权利要求之一的组合物，其包含比率在10: I至6 : I范围内的亚油酸和a -亚油酸。
4.根据前述权利要求之一的组合物，其中包含约30-36g干组合物和200至250mL水的一份次早餐施用一次，并且当日期间施用第二次。
5.根据前述权利要求之一的组合物，其中益生微生物包含非复制型益生微生物。
6.根据前述权利要求之一的组合物，其以对应于每份次约IO6至IO12Cfu的量包含益生微生物。
7.根据权利要求5-6任一项所述的组合物，其中通过热处理、优选地通过在至少71. 5°C高温处理至少I秒使得非复制型益生微生物不复制。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中热处理是在约71.5-150°C高温处理约1-120秒，并且优选地是高温/短时(HTST)处理或超高温(UHT)处理。
9.根据权利要求8所述的组合物，用于预防或治疗炎性病症。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中热处理是在约70-150°C的温度范围实施约3分钟-2小时，优选地在80-140°C的范围实施约5分钟-40分钟。
11.根据权利要求10所述的组合物，用于预防或治疗与受损的免疫防御有关的病症。
12.根据前述权利要求之一的组合物，其中至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地全部益生菌是不复制的。
13.根据前述权利要求之一的组合物，其中益生微生物选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(Iactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)，或它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusp I ant arum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、双乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和/或它们的混合物。
14.根据前述权利要求之一的组合物，其中益生微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、约汉逊氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳酸乳球菌NCC 2287或它们的组合。
15.根据前述权利要求之一的组合物，其日剂量含有约0. 005mg-1000mg非复制型微生物。
全文摘要
本发明涉及幼孩营养领域。特别地，本发明涉及包含益生微生物以施用至年龄大于12个月幼孩的干全乳制品。这些益生微生物可以是非复制型益生微生物，例如有生物活性的热处理的益生微生物。
文档编号A61P37/04GK102811725SQ201080031170
公开日2012年12月5日 申请日期2010年5月11日 优先权日2009年5月11日
发明者A·梅赛尼尔, S·努特恩, G·普里乌特 申请人:雀巢产品技术援助有限公司