对人血浆样品中的至少一种病原体灭活的方法

专利名称：对人血浆样品中的至少一种病原体灭活的方法
技术领域：
本发明涉及一种对人血浆样品的至少一种病原体灭活的方法、通过该方法获得的血浆以及用于应用所述方法的设备。所获得的血浆是一种生物活性浆液，其中的至少一种病原体被灭活。所述方法以及通过所述方法获得的产品对于治疗和非治疗领域中的应用尤其有用。在下面的说明中，在本文的结尾重新列出了括号中的引用文件(R6f)。
背景技术：
目前，通过化学方法来确保人血浆的安全性。人血浆的安全性可以看作为对病原体的灭活以及确保其治疗特性。这涉及到在血浆中添加易于使其受到污染的化学物质(例如溶剂和清洗剂等)的方法，与化学物质相结合的方法以及物理-化学方法，例如通过给定波长(例如UV)的发光辐射而与照射相关的光敏分子，或者热处理，例如在添加蛋白质稳定剂后在60°c下进行巴斯德氏消毒、过滤、伽马福射...(Ref. I), C. Naegelen等人的[Evolution des techniques de preparation des produits sanguins labiles(PSL)inactivation des pathogenes dans Ies PSL], Transfusion Cliniqueet Biologique
16(2006)pp. 179-189。由于这些方法都要向人血浆中添加外来物质，因此导致方法需要有清除和/或净化血浆的步骤，否则其将影响血浆的性质，因而这些方法受到限制。这一最终步骤使得不能获得“同一(identique)”血浆。实际上，化学物质从来都不能被完全清除并可能通过例如积累产生长期毒性。另外，在较高温度下(即高于或等于60°C)处理血浆使所具备的蛋白质变性，因此还不得不添加化学产物以便稳定蛋白质。众所周知，在农产品加工领域中，在高压下的处理方法用于对诸如霉菌、细菌以及病毒(在某些情况下)进行灭活。例如A. JOFRE等人[LWTFood Science and Technology42 (5) (2009), 924-928 页，题为 “Efficiency ofhigh hydrostatic pressure at 600MPaagainst food-borne micro-organismsby challenge test convenience，，] (Ref. 2)描述了采用600MPa的压强以确保食品的安全。还采用了其它方法对病原体灭活，例如“Staphylococcus aureus (S. aureus)dans du jambon (火腿中的金黄色葡萄球菌)”(C. C TASSOU 等，“Temperature-assistedhigh hydrostatic pressure inactivation ofStaphylococcus aureus in a ham modelsystem !evaluation in selective andnon selective medium，，, J. Applied Microbiology104(2008)，1764-1773) (Ref. 3)。获得的结果显示需要在20°C下施加500MPa的压强45分钟以将存在的病原体量降到十万分之一。在400MPa的压强下55°C的中等加热情况下，在处理的前7分钟内实现降至百万分之一。该文献中使用的压强和温度不能使人血浆保持生物活性。很明显，以往的工作依然利用如下事实尤其需要达到较高的压强值(约500MPa)以在常温下实现降低，也就是说，在典型环境(例如胰蛋白胨盐的适宜条件)下,20 °C下金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus (S. aureus))总体降至百万分之一 [Y. RIGALDIE :“Sur I’ impact destraitements sous Hautes Pressions dans ladecontamination et lasterilization de formes pharmaceutiques renfermantdes moleculestherapeutiques sensibles aux procedes energetiques，，， Thesedel，UniversiteBordeaux I (2002 年 7 月 I 日)，序号 2526 (Ref. 4)]。对金黄色葡萄球菌的某些病原体灭活所需的较高的压强值是在保持人血浆的生物活性的情况下适当地运用对所述血浆中的病原体灭活的方法的主要限制。此外，Y.RIGALDIE 等的[“Pharmaceuticals perspectives of HighPressures a soft tool for sterilization of fragile drugs，，，Defect andDiffusion Forum208-209 (2002)，55-58 (Ref. 5)]表明，一方面，在600MPa下通过10分钟的持续高压处理对金黄色葡萄球菌灭活可实现在典型环境下(例如胰蛋白胨盐的适宜条件)99%到99. 9%的 消除，另一方面，相比于常温温度，低温(_17°C )对于灭活效果不明显。众所周知，人血浆具有特定的生物学特性。实际上，血浆含有约3%的多种蛋白质。在比例上占得最多的蛋白质有白蛋白，抗体或免疫球蛋白，纤维蛋白原，α I抗胰蛋白酶，α 2巨球蛋白，转铁蛋白，脂蛋白(HDL和LDL)。其还带有凝固因子，凝固因子在大多数情况下被用作为基准以测量血浆的生物活性。当凝固因子(尤其是存在于血浆中的VIIIc，V以及 XI 因子)的活性大于 50%时(Pharmacopee Europeenne 5. 6 01/2007 :1646 (Ref. 6)),血浆有“生物活性”。通过某些蛋白质，血浆可以与某些微生物的膜相互作用(A. KUNERT等，The Journal of Immunologyl79 (2007)，2979-2988 (Ref. 7))，或者导致孢子形成(在血浆中引入由50%的营养体形式的枯草杆菌(B. subtilis)以及50%的孢子形式的枯草杆菌构成的悬液液将很快引起近乎完全的孢子形成)。多项研究表明，在-10°C下以200到500MPa的压强处理血浆对于血浆产品的保存是不利的，并且这种方法不应用来对血浆产品中的病毒和微生物灭活(A. M. MATSER等，“High Pressure processing for preservation ofblood produts，，，High PressureResearch 25(2005)，p.37-41) (Ref. 8)。国际申请WO 02/056824(Ref. 9)描述了利用与保持血浆的生物活性不匹配的压强值来对血浆产品灭菌的方法。测试了不同的温度和压力组合，然而这些组合不允许保持VIIIc, V以及XI凝固因子的活性从而获得具有生物活性的人血浆。此外，在该文献中，方法依赖于病原体而不同；这使得这些方法难以在工业上应用。现有技术中还进行了其它试验以便对血浆中的金黄色葡萄球菌灭活(F.TA0等的“Deciphering Mechanisms for Infectious Agent InactivationUsing Cyclic HighPressure or Pressure Cycling Technology，，，(BBIInc. -Boston Biomedica Inc.)BIOPHYSICS 2003-Poster 021604(Ref. 10))。在S. DUSING 等的文章中[“Inactivation of viruses in plasmaby cycledpulses of high pressure，，，Trends in High Pressure BioscienceandBiotechnology, Ed. R. HAYASHI, Elsevier Science BV (2002) ] (Ref. 11)，仅考虑了应用压强的实施方式，尤其是被低温(即，约_20°C )下300秒的正常环境压强间隔开的60秒高压(即大约在400到500MPa之间)的循环。在该文献中使用的压强对于保持人血浆生物活性而言并不适合。因此，本领域中存在缓解现有技术中的这些缺陷、不便以及障碍的现实需要，尤其需要使得能够对人血浆中的至少一种病原体灭活，并且还能够确保血浆蛋白质(例如VIIIc, V，和XI因子)的活性，以便使血浆具有生物学活性的方法。本领域中还存在找出使得能够对人血浆中的至少一种病原体灭活并且还能够在不引入外部产品(例如化学产品)以及后续净化步骤以清除所引入的易于造成毒性(通过例如，积累或所有其它过程)的情况下保持生物活性的方法。尤其是，本领域存在找出使得能够降低成本、减少灭活所需时间以及改善对至少一种病原体灭活的效率，同时保持人血浆的生物活性的更有效的方法。

发明内容
本发明通过提供一种包括至少5个循环的对人血浆样品的至少一种病原体进行 灭活的方法，能够显著地克服现有技术中的这些缺陷、不便和障碍，所述5个循环中的每个包括-将初始压强Ptl的样品增压至压强P1,P1介于190到210MPa之间，由于增压而使血浆在压强P1下的温度在-10°c到-3°c之间，-可以在110到130秒的时间段范围内维持压强P1，以及-使样品降压至压强P。，-实现在47.5到52. 5MPa s—1之间的针对所述增压的压强增加速度和针对所述降压的压强减小速度。换言之，本发明的目的在于一种对人血浆样品中的至少一种病原体灭活的方法，所述方法包括至少5个循环，所述5个循环中的每一个-使所述样品从其初始压强Ptl增压至压强P1,P1在190到210MPa之间，由于增压所述血浆在压强P1下的温度介于-10°C到-3°c之间，-可将压强P1维持110到130秒的时间，以及-以47.5到52. 5MPa s_1的速度V1实现所述增压和所述降压。发明人以不同寻常并且完全出人意料的方式证明了组合本发明的方法中定义的不同参数能够以远高于现有技术中的方法的效率对至少一种病原体灭活，并且还能够保持所处理的人血浆样品的生物活性。另外，发明人以不同寻常并且出人意料的方式证明了本发明的方法的特征对于生物靶标(例如，至少一种病原体)的灭活具有辅助效果，因此允许在保持人血浆样品的生物活性的同时对所述目标进行灭活。此外，本发明的方法允许对至少一种病原体灭活而不会引入额外物质并且不需要净化步骤，因此能够缩短时间并降低成本。由此本发明的方法有利于对存在于人血浆中的至少一种病原体灭活而且还保持所述人血浆样品的生物活性。在此，“人血浆样品”意为源自任意血统、年龄、性别、身高和/或体重的人的血浆样品。样品还可以预先经由本领域技术人员熟知的任何技术处理以便例如，利于保存(通过例如冷冻)。
在此，“灭活”意为抑制至少一种病原体或一组病原体的生物活性。例如，灭活使得病原体的生物活性不能恢复。可以用本领域技术人员熟知的任意方法证实灭活。例如，其可能涉及病原体停止在适合其生长的培养基中生长以及/或者活性病原体的传播停止[“Pathogen inactivationtechniques”，J. P. R. PELLETIER, S. TRANSUE, E. L. SNYDER,BestPractice & Research Clinic Haematology vol. 19 (I) (2006), pp. 205-242](Ref. 12)。在此，“病原体”意为本领域技术人员周知的任何生物体。例如，其可能涉及细菌、霉菌、病毒、酵母、传染性蛋白质和/或寄生生物。例如，病原体可以选自包括记载在Pharmacopee Europeenne 6.0,5.ITextesGeneraux sur la microbiologie 01/2008 50101 (Ref. 13)中的欧洲药典中的病原体的组，例如，其可能涉及导致疾病的病原体，例如白色念球菌(Candida albicans)、黑曲霉菌(Aspergillus Niger)、枯草杆菌,还涉及导致传染的病原体，例如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)。在此，“绝热”意为遵从热力学第一定律，封闭系统中温度的升高或降低是由于加压或减压(尤其是液体或气体组分的加压或减压)导致的。[E. HECHT‘PhysiqueIditeur De Boech (1999)](Ref. 14)在此，初始压强Ptl为在实施本发明的方法之前所述样品所处的压强。例如，压强Ptl可以等于大气压强，或者小于P1的任何血浆存储压强。初始压强可以例如，约为O. IMPa0在本发明中，“压强的增加和/或减小的速度”是由兆帕斯卡每秒(MPa · S^1)表示的速度。其可以是线性和/或可变的，在后者的情况下，更恰当地说该变化是动态的。根据本发明，经由本发明的方法处理的人血浆样品优选地容纳在本领域技术人员所熟知的能够承受本发明的方法压强的任意容器内。例如，在密封和/或可变形容器(例如用于输血的抽取管、塑料袋、无菌器皿，例如在Y. LAMBERT，G. DEMAZEAU，A. LARGETEAU，S. LAB0RDE-CR0UBIT, M. CABANNES 以及 J. M. B0UVIER, [ “Newpackaging solutions forhigh pressure treatments of foods，，。High PressureResearch. 2000,voI 19,207-212](Ref. 15)中说明的专用包装)中。例如，该包装可以包括化学上和生物上与血浆相容的内表面以及在化学上(例如渗透性上等，如 Pharmacop6e Europeenne 5. O 01/2005 :30203 (Ref. 16)所记载的)与中间运输相容的外表面。包装可以包括例如连接件，即允许填装或清空所述包装的组件。例如，连接件允许在应用根据本发明的方法之后，添装人血浆以及/或者进行人血浆的治疗应用。例如，密封包装可以是本领域技术人员所知的任意包装并且优选确保以下四种标准(i)所述包装及其连接件的保存；(ii)封装的内表面及其连接件与血浆之间的化学相容性，以及外部与加压下的中间运输的相容性；(iii)尤其保持隔断特性，以避免透过隔板的化学气体或分子的传递；(iv)保证包装的化学完整性，即不使化学分子渗入血浆容器。在本发明中，可以借助加压下液体运输来以均匀方式施压。在本发明中，“以均匀方式施压”意为在样品的所有点上均匀施压。在本发明中，“传递介质”可以为本领域技术人员所知的能够在本发明的方法中应用的任意介质。例如，其可以涉及便于应用的液体介质，并且通常依据熔化温度来选择(尤其是在低温下应用时)，例如熔化温度低于样品的处理温度的介质，例如无极性液态介质(如正己烷，乙二醇)，或者有极性介质(例如，丙醇，正丁醇，乙醇，乙酸，异丙醇，优选的液态传递介质可以从包括如下物质的组中选择乙二醇和水的混合物，例如Kryo 30Lauda,以及乙醇。有利地，均匀施压允许以均匀方式增压或降压而不会在样品的所有点上造成压强梯度。在本发明中，“人血浆样品的生物活性”意为血浆中VIIIc、V和XI因子的活性高于由欧洲药典针对病毒灭活的人血衆的规定所给出的50%的活性(Pharmacop6e Europeenne5.6 01/2007 :1646 (Ref. 6))并且/或者对于VIIIc因子高于70%而对于V和XI因子高于50% (如法国法律所要求的(Ref. 17))。在本发明中，在增压之前样品的初始温度Ttl可以按照升压速度V1、压强传递介质的化学性质以及压强值决定。例如，初始温度可以在-18°C到-3°C之间。根据本发明的方法的具体实施方式
，加压和/或减压是绝热的。在本发明中，压强P1可以等于200MPa。在本发明中，血浆在压强P1下的温度在-10°C到-3 V之间，优选为-8 V到_4°C，更为优选地约为-5°C。在本发明中，对于每个循环压强P1可以维持110到130秒，例如每个循环维持120秒。本发明的目的还在于利用前面限定的方法对人血浆中的至少一种病原体或一组病原体灭活。本发明的目的还在于利用前面限定的方法获得人血浆。 根据本发明的方法获得的人血浆可以优选地用于医疗领域，例如用于不同疾病的治疗，用于如法国产品状况和卫生安全协会的文件“Transfusion de plasma fraiscongele produits, indications” (2002) (Ref. 18)中所记载的输血用途，以及所有其它疾病的治疗。通过本发明的方法获得的血浆有利地具有欧洲药典以及法国法律所规定的人血浆生物特性。借助下面以举例说明的目的给出并通过附图描述的实例的说明，本领域技术人员将进一步理解其它优点。


-图IA到IC是表示血浆蛋白质的活性按照兆帕斯卡(MPa)的压强(横坐标)的百分比(纵坐标)的直方图。尤其是，其分别表示压强值对VIIIc凝固因子的活性的影响(图1A)，对V凝固因子的影响(图1B)，对XI凝固因子的影响(图1C)，施加的速度为3. 33MPa s'施加时间(还被称之为加压维持)在常温温度下为10分钟。-图2A到2C是针对三种施压速度的表示血浆蛋白质的活性按照MPa压强(横坐标)的百分比(纵坐标)的直方图。尤其是，其分别表示在不同压强值(100，150，以及200MPa)下施压速度对VIIIc凝固因子的活性的影响(图2A)，对V凝固因子的影响(图2B)，对XI凝固因子的影响(图2C)，在常温温度下施压持续10分钟。-图3A到3C是针对同一处理的总持续时间的表示血浆蛋白质的活性按照MPa压强(横坐标)在不同施压模式下的百分比(纵坐标)的直方图。施压速度在常温温度下为
3.33MPa · s'尤其是图3A，3B和3C分别表示按照连续模式(10分钟)、循环模式(5个两分钟的循环)以及20个30秒的循环的施压模式对于VIIIc凝固因子、V凝固因子和XI凝固因子的影响。-图4A到4C是针对两个不同温度值(常温和_15°C)表示血浆蛋白质的活性按照MPa压强(横坐标)的百分比(纵坐标)的直方图。施压速度大于或等于SOMPa·^并且施压温度为10分钟。尤其是，图4A，4B和4C分别表示温度按照压强值对凝固因子的影响。-图5A到5C是表示血浆蛋白质的活性按照MPa压强(横坐标)、施压速度以及温度的百分比(纵坐标)的直方图。尤其是，图5A到5C分别表示较快的施压速度、循环施压以及温度的结合对于VIIIc、V以及XI凝固因子的活性的影响，其中施压速度大于或等于50MPa · s_\进行每次时间为两分钟的5次重复并且温度为-15°C。-图6是针对如下的处理特征参数表示借助温度(横坐标)的对人血液中的金黄 色葡萄球菌进行灭活(纵坐标)的图施压速度为50MPa μ—1，循环施压的模式为5个时间为2分钟的循环并且压强为200MPa。尤其是，该图表示温度对于通过高压对悬浮在人血浆中的金黄色葡萄球菌的极端影响。-图7是针对从200MPa到300MPa的压强值表示借助温度(横坐标)来对人血浆中的金黄色葡萄球菌灭活(纵坐标)的图。-图8是借助温度(横坐标)对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、黑曲霉菌、白色念珠菌灭活(纵坐标)的图。尤其是，该图表示温度对悬浮在人血浆中的4种微生物灭活的影响。-图9是表示借助压强(横坐标)和施压速度对金黄色葡萄球菌灭活(纵坐标)的直方图。尤其是，该图表示在选择约_5°C下的5个2分钟的循环的施压模式的情况下，施压速度对悬浮在人血液中的金黄色葡萄球菌灭活的影响。-图10是针对不同的施压速度值表示凝固因子的活性按照压强(横坐标)的百分比(纵坐标)。图IOA表示VIIIc因子(FVIIIc)的活性百分比，图IOB表示V因子(FV)的活性百分比。尤其是，该图表示在低温下(约_5°C度)的循环处理(5X2min)过程中施压速度对凝固因子的活性的影响。-图11是表示在光学显微镜(物镜X100)下观察到的先前受小鼠伯氏疟原虫(Plasmodium berghei) (A)污染的血衆的照片和经“高压下血衆安全处理的方法”(B)处理后的照片。(N :细胞核，C :细胞质，V:液泡)-图12表示由Western印迹分析的人血浆样品(已被或者未被仓鼠朊病毒(263K)的感染性蛋白质感染的人血浆样品)的结果,TIx :未经过本方法处理的感染对照，HPIx :经本方法处理的感染对照，TNx :未经本方法处理的阴性对照，HPNx :经本方法处理的阴性对照。-图13是表示按压强(横坐标)示出杀灭效率(l’efficacit6destructrice,ED)(纵坐标)的直方图。施压速度为3. 33MPa · s—1，施压模式为连续施压，处理持续时间为10分钟并且处理温度为25°C。-图14是表示按压强(横坐标)示出杀灭效率(ED)(纵坐标)的直方图。施压速度为3. 33MPa · s—1 (被填充满的棒)或者50MPa · s—1 (有阴影线的棒)。
-图15是表示按压强(横坐标)示出杀灭效率(ED)(纵坐标)的直方图。施压速度为3.33MPa* s'施压模式为5个两分钟的循环(有阴影线的棒)，20个三十秒的循环(空白棒)，或者I个十分钟的循环(被填充满的棒)。-图16是表示按压强(横坐标)示出杀灭效率(ED)(纵坐标)的直方图。温度为_5°C (有阴影线的棒)或25°C (被填充满的棒)。-图17是表示按温度(横坐标)示出对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念球菌、黑曲霉菌、枯草杆菌(纵坐标)的灭活。-图18A和18B是按兆帕(MPa)压强⑵(横坐标)示出血浆蛋白质活性百分比 (% act)(纵坐标)的直方图。尤其是，其分别表示压强值对VIIIc凝固因子的活性的影响(18A)和对V凝固因子的影响(18B)。-图19表示按稀释因子(横坐标)示出的荧光强度(纵坐标)。叉对应于利用本方法获得的结果(HP)，黑色方块表示借助对照“T”获得的结果。-图20表示按稀释因子(横坐标)示出的荧光强度(纵坐标)。叉对应于利用本方法获得的结果(HP)，黑色方块表示借助对照“T”获得的结果。-图21表示FACS的图。图中SSC对应于与细胞复杂度相关的信号，FSC:与细胞的相对大小相关的信号，“event”对应于所限定的总体中的事件(细胞)总数，% Parent对应于按百分比表示的所限定的总体中事件数量相比于事件总数，并且“mean”对应于荧光强度的平均值。示例示例I :在高压处理之后人血浆生物活性的测量抽取约4mL的新鲜人血浆样品并将其放置在密封试管中，然后置于_30°C下冷冻，以待在高压下进行处理。处理条件如下30秒内施加IOOMPa压强的加压速度(3. 33MPa s4)，在适当压强下以连续方式处理10分钟，也就是说从IOOMPa到250MPa，并且环境温度为20°C左右。样品被放置在通过“法马通”式直接压缩实现的液相高压产生装置中，传递介质为乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。能够理解通过连续加压可实现在给定值下的恒定加压。凝固因子活性选择VIIIc因子、V因子XI因子作为基准以确定人血浆的生物活性。通过在STA C.K PREST(斯达戈诊断公司)操作说明书(Ref. 19)中描述的部分凝血活酶时间法来测定处理之前和之后的活性。该测量法旨在在脑磷脂和活化剂存在的情况下，测量耗尽待测定免疫因子的血浆的凝固时间，缺乏的凝固因子由测试样品提供。然后，对于每种凝固因子，利用高压处理之后的活性值与高压处理之前的活性值之间的比确定剩余活性百分比。针对这三种凝固因子而言的压强值对剩余活性百分比的影响如图IA到图IC所
/Jn o如图I所示的凝固因子的剩余活性关于压强的分析表明，在IOOMPa和250MPa压强下(或1000巴和2500巴)进行处理之后，XI因子的活性几乎未受影响，相反，VIIIc因子和V因子在压强范围内对压强非常敏感，导致较大的活性损失，即，对于约250MPa的压强，损失约80%到100%的程度。如该示例所表明的，在压强从IOOMPa增加到250MPa的情况下对血浆进行处理导致VIIIc和V因子的活性的显著降低，由此可以想到，所有的人血浆安全处理，即所有通过施加高压来对微生物病原体灭活的方法都伴随着较大的凝固因子活性损失，因此血浆的生物活性受损。示例2 :在依赖加压速度的高压处理之后人血浆生物活性的测量按照示例I中所描述的方法处理新鲜的人血浆。处理条件为在20°C温度左右，以连续方式进行从100到250MPa范围内的给定压强下持续10分钟的处理。施压速度可以改变。在该示例中，选择了三种速度，一方面速度值之间明显不同，另一方面这些值对于本领域技术人员而言可以通过工业设备实现，这些速度为30秒达到IOOMPa(或3. 33MPa · s—1)(等于在示例I中使用的加压速度值)，12秒达到IOOMPa (8. 33MPa · s—1)以及 2 秒达到 IOOMPa (50MPa · s—1)。将样品放置在通过“法马通”式直接压缩实现的液相高压产生装置中来获得3. 33MPa · s—1和8. 33MPa · s—1的速度，其中传递介质为乙二醇/水的混合物(Kryo30Lauda)。对于50MPa · s—1的速度，利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现 的高压生成设备来获得。在处理之后，按照如在不例I中描述的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的活性百分比来测量人血浆的生物活性，活性百分比是利用部分凝血活酶时间测量的。图2示出了在压强值相同但加压速度改变(3. 33MPa · s—1，8. 33MPa · s—1和50MPa · s-1)的情况下每种活性因子相对于高压处理之前的剩余活性百分比。对图2所示结果的分析表明，至少对于IOOMPa和250MPa之间的压强而言，无论是什么样的处理压强值和凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)属性，从3. 33Mpa · s^1到50MPa · S-1范围内的加压速度对凝固因子的活性都只有较小影响(接近于测量误差)。在考虑现有文献中记载的技术教导(例如国际申请W000/48641(Ref. 20)中，其中声称达到直至IOOOMPa · S-1的相当快的增加)的情况下，加压速度对于血浆生物活性没有影响的结论是令人惊讶的。另外，利用工业设备来实施相当快速的增压很难实现。示例3 :在依赖加压模式的高压处理之后人血浆生物活性的测量按照示例I中描述的方法准备新鲜的人血浆。高压处理的条件为等同于30秒内达到IOOMPa的恒定加压速度(即3. 33MPa · s—1)，20°C程度的温度，在从IOOMPa到250MPa可变的压强下持续10分钟的处理。样品被放置在通过“法马通”式直接压缩实现的液相高压产生装置中，传递介质为乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。按照连续模式或循环模式改变加压模式，连续模式即在10分钟的时间内保持恒定压强，循环模式即在所选压强下进行每次2分钟的5次重复或在所选压强下进行每次30秒的20次重复。在例如样品压强的情况下，循环对应于在适当的时间长度内保持压强并对样品降压。循环的持续时间是按其能够被转换成工业级的方式而选择的。在处理之后，按照如在示例I中描述的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的剩余活性百分比来测量人血浆的生物活性，凝固因子的活性是利用借助STA C.K PREST(斯达戈诊断公司)使用说明(Ref. 19)中描述的部分凝血活酶时间法测量的。图3中给出在对应于3. 33MPa · s—1的加压速度和20°C程度的温度的条件下完成三种类型的处理(一种连续模式和两种循环模式)后，针对被作为参考选取的三种凝固因子的剩余活性而获得的值。循环模式的加压(每次2分钟重复5次)与持续10分钟并且被施加同一压强值的连续模式加压(施加速度和温度恒定)的比较表明VIIIc因子和V因子之间的特性差别。与其它两种凝固因子相比，XI因子始终呈现出特定的特性，其活性不怎么或者几乎不受压强干扰(接近与测量误差)。如在该示例中示出的，在循环加压模式下，与VIIIc因子相比V因子更为敏感，也就是说，与在同一压强值的连续施加的情况相比，在循环施加的情况下其活性被更多地保存。更意外和令人惊讶的是，相对于20次每次30秒的循环，这种现象在对应于每次2分钟重复5次的情况下更为明显。 示例4 :在依赖温度的高压处理之后人血浆生物活性的测量按照示例I中描述的方法准备新鲜的人血浆。处理条件为等于50MPa .s—1的恒定施压速度，在IOOMPa和300MPa之间的压强下持续10分钟的连续处理。将样品放置在利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备中。在该示例中，测试了两种不同的处理温度，即常温温度(约20°C )及接近_15°C的负温度。按照如在示例I中描述的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的剩余活性百分比来测量人血浆的生物活性，凝固因子的活性是利用借助STA C.K PREST(斯达戈诊断公司)使用说明(Ref. 19)中描述的部分凝血活酶时间法测量的。图4中给出在两种不同温度(约20°C和-15°C )下进行处理(两秒达到IOOMPa的加压速度(即50MPa s—1)，连续模式下持续10分钟的处理)之后，被作为参考选取的三种凝固因子的剩余活性百分比(相对于高压处理之前的活性)。令人意外和惊讶的是，三种凝固因子关于温度的改变(约20°C和_15°C )具有不同的特性。XI因子对温度不敏感(在实验误差范围内)，并无论在哪种情况下均保持了近乎90%的活性。相反，在低温下有利于VIIIc因子和V因子的活性保持。特别是对于V因子而言这种现象尤为显著。例如在_15°C、220MPa的压强下，V因子的活性高于50% (与欧洲药典的规范相适应)，而在同一压强下处于常温温度(约20°C)时，其活性相当低(约10% )。如该示例中表明的,对于保持VIIIc因子和V因子的活性而言，在低温和加压速度之间存在重要的协同效果，V因子的情况明确地表明了这一点。示例5 :在把处理中的三种特征参数(加压速度、加压模式和低温)相关联地来进行高压处理之后人血浆生物活性的测量按照示例I中详述的处理准备新鲜的人血浆。将样品放置在利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备中。处理方法在于把有关压强的一组参数相关联加压速度、加压模式和温度，尤其是低温，即约-15°C的温度。
测试了 IOOMPa和250MPa之间的不同压强值。相关参数值对于加压速度而言为50MPa s'对于施加模式而言为每次2分钟重复5次的循环并且温度约为_15°C。在示例I中已作为参考选取的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的剩余活性百分比已经如示例I中所示通过部分凝血活酶时间法测量。图5中示出在上述条件下进行处理之后三种凝固因子的剩余活性百分比(相对于高压处理之前的活性)。如该示例中所表明的，令人意外并感到惊讶的是，对于VIIIc因子和和V因子，通过将相关参数与压强参数相关联观察到相当好的协同效果(对于V因子观察到更明显的效果)。例如，在240MPa(即2400巴)的压强下，V因子的活性为90%的程度并且VIIIc因子的活性接近70%。这些活性值与法国法律(2003年5月28日，J. 0.第123号，2003年4月29日颁布的法令，确定了不稳定血液产品列表及特性)相适应，还使得所获得的人血浆用于医疗应用。如果考察其中仅考虑了压强值的示例1，则可观察到在250MPa下VIIIc因子的活性值接近10%而V因子的活性接近于O。如该示例中所表明的，把与压强相关的三种参数(加压速度，加压模式和温度)相结合令人惊讶地使得能够保持凝固因子的活性并由此保持人血浆的生物活性。示例6 :依赖于温度在高压下对人血浆中的病原体灭活的示例
金黄色葡萄球菌是一种经常被检验到的病原体并且引发多种疾病。在该示例中该病原体被选作范例。通过在胰酶大豆琼脂(TCS) (AES Chemunex)上培养48小时来在胰蛋白胨盐培养液中(TS) (AES Chemunex)制备金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)密集悬浮液(即108UFC/mL，UFC :菌落形成单位)。该悬浮液用来按照每IOmL该悬浮液用于300mL血衆来污染人血衆。之后将受污染的血浆样品置于无菌且密封的试管中，并随后保存在冷冻柜中以待通过灭活方法进行处理。在灭活处理之前和之后，实现对样品计数以便确定处理的杀灭效果。为此，在TS培养液中实现对样品的分级稀释。对于每次稀释，按照如下方式接种两个培养皿将ImL稀释液放入皿底部，然后倒入过冷状态的TCS琼脂。在经过均匀化和凝胶作用之后，将充满样品的皿在35°C的恒温箱中放置48小时。包含15到300个的分离菌落的皿随后被选择以进行计数，在对菌落进行计数之后通过以下计算确定金黄色葡萄球菌的浓度
ScN =-
(^1 +0.1 X^2) X ￠/其中N :金黄色葡萄球菌的浓度(UFC/mL)E c :对所有选定皿计算的菌落总数H1 :在第一稀释度中选定的皿的数量n2 :在第二稀释度中选定的皿的数量d :第一次稀释的稀释比例随后以如下方式计算处理的杀灭效率ED = -log (N/N0)其中ED:杀灭效率
N :高压处理之后金黄色葡萄球菌的浓度Ntl :高压处理之前金黄色葡萄球菌的浓度所采用的灭活处理为示例5中描述的处理。对于恒定的压强值(200MPa)，相关参数值为50MPa -s^1的速度，每次2分钟重复5次的施加模式。仅选取温度可变(从约_25°C到约35°C )。将样品放置在利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备中。图6示出在这样的处理过程中温度对于金黄色葡萄球菌的杀灭效率的影响。令人意外并且感到惊讶的是，在-10°C到_5°C的较窄温度范围内，对金黄色葡萄球菌的杀灭效率相当高。通过对同一设备改变传递介质(用乙二醇/水的混合物(Kryo30Lauda)替代乙醇)也会观察到同样的现象。对于非常低的温度(低于_10°C )，由于金黄 色葡萄球菌关于所施加处理的敏感性快速地降低(杀灭效率ED急剧降低)，因此看起来温度的作用是很关键的，在温度高于_5°C时变化开始变得更明显。如该示例中所证明的，本发明的借助把与压强值相关的3个参数(加压速度，加压模式和温度)适当结合的方法对金黄色葡萄球菌的灭活具有协同效果。另外，令人惊讶的是，如图6所示那样，可以看出存在使得金黄色葡萄球菌的灭活加剧的温度范围。例如在_15°C到-10°C之间，杀灭效率从I. 5显著提高到5，这样的增加是完全出人意料的。示例7 :依赖于温度和压强值在高压下对人血浆中的病原体灭活的示例在示例6中，压强值被固定在200MPa。同时保持与压强相关的参数值(施加速度50MPa s'以及每次2分钟重复5次的循环施加模式)，发明人进行了研究以评估是否能在多种压强值(200MPa，250MPa，300MPa)下，观察到在狭窄温度范围内对于金黄色葡萄球菌的杀灭效率提高的令人惊讶的效果。换言之，该示例的目的在于研究在200MPa下观察到的对金黄色葡萄球菌的灭活是否还可以在其它压强下观察到，尤其是在250MPa和300MPa压强下。制备方法和样品的计数与在示例6中说明的相同。将样品放置在利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备中。图7给出在三种压强值下依赖于温度的金黄色葡萄球菌的杀灭效率的演进，与处理有关的其它参数保持恒定(50MPa S-1的施加速度以及每次2分钟重复5次的循环施加模式)，对图7的分析表明一种完全特别的现象。如该示例所示，在介于200MPa和300MPa的压强范围内，在特定的温度区间中(尤其是在-5°C ±_2°C的狭窄范围内)对病原体的灭活最佳.另外，令人惊讶的是，可以在压强的区间内观察到对金黄色葡萄球菌的灭活增强，杀灭灭活随着压强的增大而加强。示例8 :依赖于温度在高压下对人血浆中的病原体灭活的示例在示例6中，压强值被固定在200MPa。在该示例中，与压强相关的参数值如下50MPa S-1的施加速度以及每次2分钟重复5次的循环施加模式。在将压强保持在例如，200MPa的情况下，发明人进行了研究以确定针对欧洲药典中的其它病原体(诸如绿脓杆菌(ATCC 9027)，白色念珠菌(ATCC 10231)以及黑曲霉菌(ATCC 16404))是否也可以观察到如在特定温度区间内对金黄色葡萄球菌杀灭效率的提高这样的令人惊讶的结果。制备方法和对受金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌污染的血浆样品进行计数的方法与示例6中描述的相同。对于白色念珠菌和黑曲霉菌，除了培养基为沙氏琼脂(AESChemunex)以及培养温度为28°C之外，进程与前述相同。通过在28°C在包含沙氏琼脂的Roux瓶中培养菌株14小时来获得黑曲霉菌的孢子，并且在存在玻璃微珠的情况下通过用水和吐温80 (0. 5g/L)的混合液清洗Roux瓶来回收孢子。将样品放置在利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备中。令人意外并且感到惊讶的是，对图8的分析表明，尽管病原体在结构上存在很大区别(两种细菌金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球形菌，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌，一种孢子形式的霉菌黑曲霉菌，以及一种酵母白色念珠菌)，特 定的范围或特定的温度区间仍具有增强的杀灭效率。该温度区间(温度等于_6°C ±5°C)覆盖了对于金黄色葡萄球菌而言的区间(接近于测量误差)。在较低温度下(即低于_5°C )观察到的这种不同尤其依赖于每种微生物关于压强的敏感度。如该示例中表明的，本发明的把与压强值关联的参数(加压速度、加压模式以及温度)进行特定组合的方法对于生物靶标的组的灭活具有协同效果。示例9 :依赖于加压速度在高压下对病原体灭活的示例为了评估加压速度在与灭活处理相关的三种参数(加压速度、加压模式以及温度)中对协同现象的贡献，在以下条件下处理被金黄色葡萄球菌(按照示例6描述的规则准备)污染的人血浆每次2分钟重复5次的循环施压模式，温度约_5°C，并且压强为200MPa、250Mpa或300MPa。对于每个处理，使用两种施压速度即3. 33MPa s_1和50MPa S^10图9中示出了获得的结果。所采用的规则、制备以及计数与示例6中的相同。将样品放置在通过“法马通”式直接压缩实现的液相高压产生装置中来获得3. 33MPa *s_1的速度，其中传递介质为乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。对于50MPa *s_1的速度，利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备来获得。图9中示出的结果很好地表明，为了获得最好的效果，应当在采用循环加压模式下(每次2分钟重复5次)的同时将较快的加压速度(50MPa -s^1)与负温度(约_5°C )相关联，以便获得对金黄色葡萄球菌灭活的协同效果。尤其是在200MPa下，由于使用3. 33MPa -s^1的加压速度时处理的杀灭效率ED (病原体灭活)非常低(为零)，而在使用50MPa S-1的加压速度时杀灭效率达到5，从而显著地示出了协同效果。另外可以看出，与循环加压模式(MA)，即5个每次2分钟的循环以及_5°C的温度相关联的该加压速度(VA)对于金黄色葡萄球菌的灭活起到主要作用。从图9的结果与在后面的示例14中的图14观察到的结果之间的对比可以看出，对于金黄色葡萄球菌的灭活而言，与压强相关的参数，即加压速度、加压模式以及温度的特定选择取得了的令人意外的、未被描述过的协同效果。
因此本发明的方法允许借助协同效果来对人血浆中的病原体灭活。示例10 :利用灭活方法对人血浆中的至少一种病原体灭活的示例为了评估在约_5°C的温度下进行循环处理(每次2分钟重复5次)的过程中加压速度对保持凝固因子(VIIIc因子和V因子)活性的影响，测试了两种使压强增加(从150MPa 到 250MPa)的加压速度(3. 33MPa s_1 和 50MPa s—1)。将样品放置在通过“法马通”式直接压缩实现的液相高压产生装置中来获得3. 33MPa *s_1的速度，其中传递介质为乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。对于50MPa *s_1的速度，利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备来获得。图10中示出在前述的条件下实施灭活方法之后，VIIIc凝固因子和V凝固因子的剩余活性百分比(相比于实施灭活方法之前的活性)。对图10的研究表明加压速度值几乎不对VIIIc因子和V因子活性的保持造成影 响。示例9中表明，当这一参数适当地与循环处理(每次2分钟重复5次)以及较低温度(T = -60C ±5°C )结合时，该较快的加压速度(50MPa s—1)能够相当显著地增强对病原体灭活的方法的杀灭(灭活)效率(协同效应)。此外重要的是，应指出通过选择200MPa的压强，50MPa s—1的加压速度，每次2分钟重复5次的循环以及约_5°C程度的温度，可以使VIIIc因子的活性保持高于70%，而且使V因子的活性保持高于50%，这意味着同时符合欧洲药典的要求(凝固因子的活性高于50%) (Ref. 6)以及法国法律的要求(除VIIIc因子以外的凝固因子的活性高于50%，而VIIIc因子的活性高于70% ) (Ref. 17)。因此，如该示例所表明的，本发明允许在保持人血浆的生物活性的同时对其中的至少一种病原体灭活。示例11 :利用本发明的方法对小鼠伯氏疟原虫(血内寄生生物)和布氏布氏锥虫(细胞外原生动物)灭活随后针对易于污染血液产品的如下寄生生物范例测试了根据本发明的对病原体灭活的方法，其中一种寄生生物为小鼠伯氏疟原虫(血内寄生生物)，另一种为布氏布氏锥虫(细胞外原生动物)。对于这两种寄生生物中的每一种，处理了 10份受污染的小鼠(小白鼠)血样品。与压强相关的参数值为50MPa S-1的加压速度，每次2分钟重复5次的加压模式，以及约_5°C的温度，0. IMPa的初始压强以及200MPa的压强。将样品放置在利用在内部设置诸如乙醇的传递介质的间接压缩实现的高压生成设备中。在保管未处理的样品对照的同时保证其温度(在30分钟内使样品平衡在-15°C)。用光学显微镜观察每份样品，之后注入到小鼠中。下面的表I中示出了显微镜的观察结果以及与在注入一个月之后存活小鼠的数量有关的结果。表I :显微镜的观察结果以及存活小鼠的数量
权利要求
1.一种对人血浆样品中的至少一种病原体灭活的方法，其特征在于，所述方法至少包括5次循环，每次循环包括 -将所述样品从其初始压强Ptl增压至压强P1, P1介于190MPa到2IOMPa之间，从P。增压到P1,由于所述增压，血浆在压强P1下的温度介于-10°C到_3°C之间， -能够在介于110秒到130秒之间的时间长度内保持压强P1, -使所述样品降压至压强Po， -所述增压的压强增大速度和所述降压的压强减小速度被实现为从47. 5MPa · s—1到52. 5MPa· s_1之间的速度。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述增压和所述降压是绝热的。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中病原体从如下的组中选择所述组包括细菌、霉菌、酵母、病毒、感染性蛋白质和/或寄生生物。
4.根据权利要求I到3中任意一项所述的方法，其中所述样品在增压之前的初始温度介于-18°C到_3°C之间。
5.根据权利要求I到4中任意一项所述的方法，其中初始压强Ptl为O.IMPa0
6.根据权利要求I到5中任意一项所述的方法，其中压强P1被持续保持120秒的时间长度。
7.根据权利要求I到6中任意一项所述的方法，其中压强P1等于200MPa。
8.根据权利要求I到7中任意一项所述的方法，其中所述样品处于密封包装中。
9.根据权利要求I到8中任意一项所述的方法，其中借助压强传递介质以均匀方式施加压强。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述压强传递介质是极性或非极性液态介质。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述压强传递介质是乙二醇和水的混合物和/或乙醇。
12.如权利要求I所述的方法的用途，用于有选择地消除人血浆中的至少一种病原体的应用。
13.一种按照权利要求I到12中任意一项所述的方法获得的人血浆。
全文摘要
本发明涉及一种人血浆样品中的至少一种病原体灭活的方法，所述方法包括绝热压缩所述样品，由于所述压缩，所述血浆在P1压强下的温度在-10℃到-3℃之间，可选地将压强Pi保持110秒到130秒之间，以及使所述样品绝热降压。本发明还涉及使用根据本发明的方法并且涉及通过本发明的方法获取的血浆。所述方法以及通过所述方法获得的产品对于治疗和非治疗领域中的应用尤其有用。
文档编号A61L2/00GK102762231SQ201080037784
公开日2012年10月31日 申请日期2010年7月1日 优先权日2009年7月3日
发明者佐兰·伊万诺维奇, 吉恩·罗坎, 格拉尔德·德马佐, 让-保罗·莫雷尔, 让-米歇尔·布瓦龙, 诺尔文尼希·里瓦兰, 阿兰·拉尔热托 申请人:法国国家血液中心, 波尔多第一大学, 瑟加兰-波尔多大学