双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途的制作方法

专利名称：双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途的制作方法
双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(DNL)复合物及其
治疗性用途交叉参考相关申请本申请要求2010年4月6日提交的第12/7M，740号美国专利申请；2010年4月 5日提交的第12/7M，140号美国专利申请；2010年4月1日提交的第12/752，649号美国专利申请；2010年3月25日提交的第12/731，781号美国专利申请；2009年12月22日提交的第12/644，146号美国专利申请；和2009年8月31日提交的第61/238，似4号美国临时专利申请的优先权。每一个优先权申请通过引用整体并入本文。政府资助本工作部分由来自美国国立卫生研究院的美国国家癌症研究所的基金 2R44CA108083-02A2支持。联邦政府可具有本发明的某些权利。领域本发明涉及双特异性抗体免疫细胞因子DNL构建体的组合物和使用方法，所述构建体包含第一和第二抗体或抗原结合抗体片段以及一个或多个拷贝的细胞因子。更常见地，本发明涉及任何DNL构建体的组合物和使用方法，在所述构建体中使用下面描述的 DDD ( 二聚化和停靠结构域)和AD (锚定结构域)缀合技术将3种不同效应物部分连接在一起。第一和第二抗体或其片段优选结合两种不同的靶抗原。包含治疗性细胞因子的双特异性免疫细胞因子DNL构建体的施用将细胞因子高效地递送至靶细胞、组织或器官，同时允许提高药代动力学、给药方案和/或功效。双特异性免疫细胞因子构建体显示比单独的亲代抗体、单独的细胞因子、抗体与细胞因子的非缀合组合以及缀合至对照抗体的细胞因子更强的针对靶细胞的效力。在更优选的实施方案中，DNL构建体可包含与抗-CD20 IgG和抗-HLA-DR Fab连接的干扰素-a 2b。在最优选的实施方案中，抗-⑶20IgG是veltuzumab 并且抗-HLA-DR Fab衍生自人源化L243抗体。所述DNL复合物在体外和体内显示对人淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞和其它造血癌症(hematopoietic cancer)的高毒性。然而本领域技术人员将了解，本发明的DNL复合物可包含具有针对可由任何肿瘤、自身免疫性疾病细胞或其它患病细胞表达的靶抗原的特异性的抗体或抗体片段的任何组合。类似地，本发明的DNL复合物可用于递送用于治疗许多种疾病例如癌症、免疫功能失调或自身免疫性疾病的任何治疗性细胞因子。本领域技术人员将进一步了解，本发明的双特异性复合物不限于细胞因子的递送，而且还可提供任何治疗性蛋白质、肽或本领域内已知的其它治疗性效应物部分的高效递送。
背景技术：
在美国，2009年有65，980例非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)的新发病例并且有19，500 人死于该疾病(Jemal等人，CA Cancer J Clin 2009 ；59 :225-49)。约一半NHL患者的一线治疗未获成功并且鲜有治愈的(McLaughlin等人，J Clin Oncol 1998;16:2825-33)。除了 NHL外，还存在20，580例多发性骨髓瘤(MM)新病例并且有10，580人死于该疾病(Jemal 等人，CA Cancer J Clin 2009 ；59 :225-49)。干扰素-α (IFNa)的临床活性在NHL治疗中得至IJ确定(Amitage等人，Bone Marrow Transplant 2006 ；38 :701-2 ；Ann Oncol 2000 ；11
6359-61)，并且将IFN α添加至利妥昔单抗免疫疗法已显示某些临床有利方面(Davis等人， Clin Cancer Res 2000 ；6 :2644-52 ；Kimby 等人，Leuk Lymphoma 2008 ；49 :102-12)。可获得的数据表明IFNa提高了 MM患者的无疾病进展存活率，但益处很小并且其使用因毒性而仍有争议(Gisslinger 和 Kees，Wien Klin Wochenschr 2003 ；115 :451-61)。已报导干扰素-α (IFN α )在癌症的动物模型O^errantini等人，1994，J Immunol 153 :4604-15)和人癌症患者(Gutterman 等人，1980，Ann Intern Med 93 :399-406)中都具有抗-肿瘤活性。IFNa可产生多种直接抗-肿瘤效应，包括癌基因的下调、肿瘤抑制基因的上调、经增加的肿瘤表面MHC I型蛋白质的表达产生的免疫识别的增强、细胞凋亡的增强以及对化学治疗剂的敏化(Gutterman等人，1994，PNAS USA 91 :1198-205 ；Matarrese等人，2002，Am J Pathol 160 :1507-20 ；Mecchia 等人，2000，Gene Ther 7 :167-79 ；Sabaawy 等人，1999，ht J Oncol 14 :1143-51 ;Takaoka 等人，2003，Nature 424:516-23)。对于某些肿瘤，IFNci可通过STATl的激活而具有直接且有力的抗-增殖效应 (Grimley 等人，1998 Blood 91:3017-27)。间接地，IFNa 可抑制血管生成(Sidky 和 Borden, 1987, Cancer Res 47:5155-61)并且刺激宿主免疫细胞，这对于总体抗肿瘤反应是至关重要的但一直被大大低估(Belardelli等人，1996，Immunol Today 17:369-72)。 IFNa 通过对髓样细胞(Raefsky 等人，1 985，J Immunol 135 :2507-1 2 ;Luft 等人，1998， J Immunol 161 :1947-53)、T 细胞(Carrero 等人，2006，J Exp Med 203 :933-40 ；Pilling 等人，1999，Eur J Immuol 29:1041-50)和 B 细胞(Le 等人，2001，Immunity 14:461-70) 的效应而具有对免疫反应的多效性影响。作为天然免疫系统的重要调节剂，IFNa诱导树突细胞的快速分化和活化(Belardelli 等人，2004，Cancer Res 64 :6827-30 ；Paquette 等人，1998，J Leukoc biol 64 :358-67 ；Santini 等人，2000，J Exp med 191 :1777-88)并且增强NK细胞的细胞毒性、迁移、细胞因子产量和抗体依赖性细胞毒性(ADCC) (Biron等人， 1999，Annu Rev Immunol 17 :189-220 ；Brunda 等人 1984，Cancer Res 44 :597-601)。IFNa作为癌症治疗剂的希望一直以来主要因其短暂的循环半衰期和全身性毒性而受到阻碍。IFNa 2的PEG化形式显示增加的循环时间，这增加了它们的生物功效(Harris 禾口 Chess，2003，Nat Rev Drug Discov 2 :214-21 ;0sborn 等人，2002，J Pharmacol Exp Ther 303:540-8)。IFNa与单克隆抗体(MAb)的融合可提供与PEG化相似的益处，包括减少的肾清除率、提高的溶解度和稳定性以及显著增加的循环半衰期。该融合的直接临床益处是需要更低的频率和更低的剂量，从而允许延长的治疗浓度。使用针对肿瘤相关抗原(TAA)的MAb将IFNa靶向肿瘤可显著增加其肿瘤粘连 (accretion)和贮留(retention)同时限制其全身性浓度，从而增加治疗指数。IFNa的增加的肿瘤浓度可增加其直接抗增殖、细胞凋亡和抗-血管生成活性，以及引发和集中抗肿瘤免疫反应。事实上，使用同基因型鼠IFNa-分泌性转基因肿瘤的小鼠的研究显示了由IFNa的局部浓度引发的增强的免疫反应O^errantini等人，2007，Biochimie 89 884-93)。⑶20是用于使用MAb-IFNa进行的B细胞淋巴瘤的治疗的吸引人的候选TAA。 利用利妥昔单抗的抗-CD20免疫疗法是抗淋巴瘤的最成功疗法之一，其具有相对低的毒性(McLaughlin等人，1998，J Clin Oncol 16:2825-33)。由于利妥昔单抗是可在某些患者群体中显示免疫原性并且对于最初施用具有相当长的输注时间的嵌合抗体(Cheson等人，2008，NEJM 359 :613-26)，所以更好的用于CD20-靶向的候选物是人源化MAb， veltuzumab (Stein 等人，2004，Clin Cancer Res 10:2868-78)。目前处于临床评定下的使用利妥昔单抗和IFNa的联合治疗已显示高于单独的利妥昔单抗的提高的功效(Kimby等人，2008，Leuk Lymphoma 49 :102-12 ;Salles等人， 2008, Blood 112:4824-31)。这些研究显示该组合的某些有利方面以及与IFN α相关的缺点。除了每周一次利用利妥昔单抗的输注外，患者通常还要在数月时间中每周施用IFNa 3 次，遭受流感样症状，所述症状为与IFNa疗法相关的常见副作用并且限制可耐受剂量。抗体-IFNa缀合物可允许以更少的剂量以更低的频率施用单一试剂，限制或消除了副作用， 并且可产生高得多的功效。然而，几乎不表达或不表达⑶20的淋巴瘤和白血病预期对利用免疫缀合的抗-CD20-IFNci构建体的治疗有抗性。在本领域存在对可将IFN-α或其它治疗性细胞因子靶向两种或更多种不同的肿瘤相关抗原例如CD20和HLA-DR，提供更有效的抗许多种造血恶性肿瘤和其它恶性肿瘤的治疗的双特异性免疫细胞因子构建体的需要。人白细胞抗原-DR(HLA-DR)是主要组织相容性复合体(MHC) II型抗原的3种同种型之一。HLA-DR在多种造血恶性肿瘤和某些实体瘤上高度表达，并且已被活跃地用于基于抗体的淋巴瘤治疗(Brown 等人，2001，Clin Lymphoma 2 :188-90 ;DeNardo 等人，2005， Clin Cancer Res 11 :7075s_9s ;Stein 等人，2006，Bloood 108:2736-44)。初步研究显示抗-HLA-DR mAb在淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤的体外和体内实验中比具有当前临床益处的其它裸mAb明显更有效力(Stein等人，未公布的结果)。HLA-DR也在一组正常免疫细胞(包括B细胞、单核细胞/巨噬细胞、郎格尔汉斯细胞、树突细胞和活化的T细胞)上表达(Dechant 等人，2003，Semin Oncol 30 :465-75)。MM本发明涉及包含三种或更多种不同效应物部分例如抗原、抗体片段和细胞因子的停靠-加锁(DNL)构建体(复合物)的组合物及使用方法。然而，本领域技术人员知道DNL 构建体不限定于此并且使用的效应物部分可包含可被连接至DDD或AD部分的任何蛋白质、 肽或其它分子。用于DNL构建体中的效应物部分包括但不限于蛋白质、肽、抗体、抗体片段、 免疫调节剂、细胞因子、激素、酶、反义寡核苷酸例如siRNA、毒素例如核糖核酸酶、异种抗原、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物、抗-血管生成剂、细胞毒素剂、促细胞凋亡剂和其它已知的治疗剂。优选的实施方案涉及包含三种不同效应物部分-第一和第二抗体或抗体片段以及一个或多个拷贝的细胞因子的DNL构建体。在最优选的实施方案中，DNL构建体包含抗-⑶20抗体，例如veltuzumab、抗-HLA-DR抗体片段例如hL243和细胞因子例如 IFN- α 2b。此类DNL构建体对于造血恶性肿瘤和表达⑶20、HLA-DR或两者的其它肿瘤的治疗是高度有效的。虽然多功能复合物的每一种组分(veltuzumab、抗-HLA-DR Fab和 IFN-α 2b)独立地具有抗-肿瘤活性，但所述组合的构建体显示比任何单一成分或以未缀合的形式施用的单一成分的混合物更大的功效。在具体的实施方案中，DNL构建体可包含人源化抗-HLA-DR抗体或其片段，例如 hL243抗体，其包含连接至人抗体构架(FR)和恒定区序列的重链⑶R序列⑶Rl (NYGMN, SEQ ID NO :1)、CDR2 (WINTYTREPTYADDFKG, SEQ ID NO 2)和 CDR3 (DITAVVPTGFDY, SEQ ID NO 3)以及轻链 CDR 序歹Ij CDRl (RASENIYSNLA, SEQ ID NO :4)、CDR2 (AASNLAD，SEQ ID NO 5)禾口
8⑶R3 (QHFWTTPWA，SEQ ID NO :6)(参见人，例如，第7，612，180号美国专利，其实施例部分通过引用并入本文)。在优选的实施方案中，人源化L243抗体还可包含来自鼠L243 (mL243) 重链的替代的构架残基27、38、46、68和91的一个或多个残基和/或来自mL243轻链的替代的构架残基37、39、48和49的一个或多个残基。可在美国典型培养物保藏中心，Rockville， MD (参见登录号ATCCHB55)获得mL243。在其它具体的实施方案中，DNL构建体可包含人源化抗-CD20抗体或其片段，例如 veltuzumab，其包含轻链可变区 CDR1(RASSSVSYIH，SEQ ID NO 7) ；CDR2 (ATSNLAS，SEQ ID NO 8)；和 CDR3 ^jQWTSNPPT，SEQ ID NO 9)；以及重链可变区 CDRl (SYNMH，SEQ ID NO: 10)； CDR2(AIYPGNGDTSYNQKFKG，SEQ ID NO 11)和 CDR3(STYYG⑶WYFDV 或 VVYYSNSYWYFDV，SEQ ID NO 12)(参见，例如，第7，435，803号美国专利，其实施例部分通过引用并入本文)。在更具体的实施方案中，DNL构建体可包含人IFN-α 2b氨基酸序列。包含此类序列的克隆可从多个来源商购获得，例如全长人IFNa 2b cDNA克隆(Ultimate ORF人克隆 cat# HORFOlClone IDI0H35221, Invitrogen,Carlsbad, CA) 在各种实施方案中，DNL构建体可包含一种或多种结合除⑶20和/或HLA-DR外的抗原的抗体或其片段。在优选的实施方案中，所述抗原可选自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、 CSAp, CDU CDla, CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、 CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、 CD46、CD52、CD54, CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、 CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的 ED-B、 因子H、FHL-l、Flt-3、叶酸受体、GR0B、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、ΗΜ1. Μ、胰岛素样生长因子-1 (ILGF-I)、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、 IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP_lA、 MIP-1B、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、NCA-95、NCA-90、la、HMl. 24, EGP-I、 EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、 肿瘤坏死抗原、TNF- α、TRAIL 受体(Rl 和 R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子 C3、C3a、C3b、 C5a、C5和癌基因产物。可利用的示例性抗体包括但不限于hRl (抗-IGF_1R，2010年12月3日提交的第12/722，645号美国专利申请)、hPAM4 (抗-粘蛋白，第7，282’ 567号美国专利)、 hA20 (抗-CD20，第 7，251，164 号美国专利)、hA19 (抗-CD19，第 7，109，304 号美国专利)、 hIMMU31 (抗-AFP，第 7，300, 655 号美国专利)、hLLl (抗-CD74，第 7，312，318 号美国专利)、 hLL2 (抗-CD22，第 7，074，403 号美国专利)、hMu_9 (抗-CSAp，第 7，387，773 号美国专利)、 hL243 (抗-HLA-DR，第 7，612，180 号美国专利)、hMN_14 (抗-CEACAM5，第 6，676，924 号美国专利)、hMN-15 (抗-CEACAM6，第 7，541，440 号美国专利)、hRS7 (抗-EGP-1，第 7，238，785 号美国专利)和hMN-3 (抗-CEACAM6，第7，541, 440号美国专利申请)，每一个引用的专利或申请的实施例部分通过引用并入本文。本领域技术人员将了解，该列表不是限制性的并且可使用任何已知的抗体，如在下面更详细地论述的。可被整合进入DNL构建体的示例性细胞因子包括但不限于MIF (巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-1 (高迁移率族框蛋白 1) >TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL_7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15, IL-16、IL-17, IL-18, IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-U RANTES, MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-U IP-10、Gro-β、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、干扰素-α、-β、-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt_3 配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、P1GF、胰岛素、 hGH、降钙素、因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。每一个引用的细胞因子的人形式的序列在本领域内是已知的(参见例如NCBI数据库)并且编码许多示例性细胞因子的克隆可从hvitrogen、美国典型培养物保藏中心和本领域内已知的其它来源商购获得。多种实施方案可涉及本发明的DNL构建体用于治疗或诊断疾病的用途，所述疾病包括但不限于非-何杰金氏淋巴瘤、B细胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、多毛细胞白血病，急性和慢性髓样白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌症、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。癌症可选自口腔癌、胃肠道癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌。此外，本发明的 DNL构建体可用于治疗自身免疫性疾病例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham' s chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜 (Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后白勺 1H^炎(post-streptococcal nephritis) > 结节性红斑、高安(氏)动脉炎(Takayasu' s arteritis)、艾迪生病(Addison' s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊椎炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture' s syndrome)、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiteran)、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/ 皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿(Wegener' s granulomatisis)、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病或纤维性肺泡炎。在某些实施方案中，受试抗体可用于治疗白血病例如慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病或急性髓样白血病。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗患有代谢疾病例如淀粉样变性或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的受试者。此外，本发明的药物组合物可用于治疗患有免疫失调障碍的受试者。附图简述下列附图形成本说明书的部分并且被用于进一步说明本发明的某些实施方案。通过参考与本文中提供的具体实施方案的详细描述结合的这些附图的一个或多个，可更好地理解所述实施方案。

图1.显示细胞因子-MAb DNL构建体与PEG化或天然IFNa相比较的体外IFNa活性。如实施例中所述测量的比活性(IU/pmol)。从rhIFNa 2b标准曲线推断已知浓度的每一种试验品的活性。在浓度递增的 20-2b ( · )、734-2b ( ■ )、v-mab (〇)、V-mab+734_2b ( □)、 PEGASYS ( ▼ )、PEG-Intron (A )或lR4b( ▽)存在的情况下生长培养物，并且利用MTS 测量相对活细胞密度。将获自未处理的细胞的信号％对摩尔浓度的对数作图。使用I^rism 软件产生剂量-反应曲线和EC5tl值。误差棒，SD。(A)基于细胞的报告基因测定。(B)利用
10EMC病毒和A549细胞的病毒保护测定。(C)使用Daudi细胞的体外淋巴瘤增殖测定。(D) 使用Jeko-I细胞的体外淋巴瘤增殖测定。图2.显示Swiss-Webster小鼠的药代动力学分析的结果。给小鼠施用20_2b、 α 2b-413、佩乐能(PEGINTR0N)或派罗欣(PEGASYS)，并且在96个小时内中利用ELISA分析血清样品的IFNc^b浓度。显示血清消除曲线。血清半衰期(T1/2)消除速率和平均滞留时间(MRT)概述于插入的表中。图3. (A)举例说明20_2b的ADCC效应子功能。在细胞裂解的定量之前，在新鲜分离的PBMC存在的情况下，利用5 μ g/ml的20_2b、22_2b、v_mab、依帕珠单抗(e_mab)或 h734温育Daudi或Raji细胞4小时。(B)显示20-2B的⑶C效应子功能。在人补体存在的情况下，利用系列稀释的20-2b ( · )、734-2b ( ■)或v-mab (〇)温育Daudi细胞。将补体对照％ (与只利用补体处理的细胞相比较的测试样品的活细胞的数目)对nM浓度的对数作图。误差棒，SD。图4.显示20_2b增强来自全血的NHL细胞的消耗。将新鲜的肝素化人血与Daudi 或 Ramos 混合并且利用 0. 01,0. 1 或 InM 的 20_2b ( · )、v-mab (〇)、734_2b ( ■)或 v-mab+734-2b ( □)温育2天。使用流式细胞术评估所示处理对淋巴瘤和外周血淋巴细胞的作用。误差棒，SD。图5. (A)举例说明显示20- 在播散性伯基特淋巴瘤(disseminated Burkitt's lymphoma) (Daudi)异种移植模型中的治疗功效。在第0天给雌性C. B. 17 SCID小鼠静脉内施用Daudi细胞。处理由以单次皮下剂量提供的20-2b( · )、734-2b( ■ )、v-mab ( O )、 PEGASYS( ▼)或盐水(X)组成。处理的天数用箭头指示。使用Prism软件分析存活曲线。 在早期Daudi模型中。在第1天给10只小鼠的组施用0. 7pmol (实线)或0. 07pmol (虚线)的单次剂量。(B)显示与图6(A)的相似但在晚期Daudi模型中进行的研究。在第7天给10只小鼠的组施用0. 7pmol (实线)、7pmol (虚线)或70pmol (灰色线)的单次剂量。图6. (A)显示20_2b在播散性伯基特淋巴瘤(Raji和NAMALWA)异种移植模型中的治疗功效的存活曲线。在第0天给雌性C. B. 17SCID小鼠静脉内施用NHL细胞。处理由以皮下剂量给予的20-2b ( · )、734-2b ( ■ ) ,v-mab (〇)或盐水(X)组成。处理的天数用箭头指示。使用I^rism软件分析存活曲线。在晚期Raji模型中。10只小鼠的组在第5、7、 9、12、14和16天接受250pmol的剂量。(B)显示与图7(A)的相似但在早期NAMALWA模型中的研究。6只小鼠的组在第1、3、5、8、10和127天接受250pmol剂量的20_2b或734_2b 或在第1、5、9、13、17、21和25天接受3. 5nmol剂量的v-mab。图7.显示使用EPO标准、7;34-EPO或EP0-DDD2处理72小时的TFl细胞的EPO活性的基于细胞的测定的结果。使用Graph Pad Prism软件产生剂量反应曲线和EC5tl值。图8. 20-C2-2b的生物活性。A和B，显示MAb和MAb-IFN α对活NHL细胞(Raji 或RL)的结合的间接免疫荧光。在用PE-缀合的山羊-抗人Fc探测之前，在5ηΜ(Α)或 0. 2-50ηΜ⑶的所示构建体存在的情况下于4°C温育细胞1小时。MFI，平均荧光强度；误差棒，95% Cl。(C)使用基于细胞的报告基因测定法测定的IFNa 2比活性显示为IU/pmol的完整分子和IU/pmol的IFNa 2b。图9. NHL和匪细胞的细胞凋亡。在利用流式细胞数定量膜联蛋白_V_阳性细胞％ 之前处理细胞 48 小时。(A)对于 Daudi v-mab 和 hL243 Y 4p 为 IOpM ；20-C2-2b、20-2b_2b和 V+LM3+2b (v-mab、hL243 γ 4ρ 和 7!M-2b-2b 的混合物)为 ΙρΜ。对于 Jeko-I，全部处理在 0. 5nM 上进行。(B)以 1、0. 1 和 0. OlnM 处理 CAG。(C)以 20 和 2nM 处理 KMS12-BM。V+L243， v-mab 和 hL243 γ 4ρ 的混合物；L243+2b、hL243 γ 4ρ 和 734_2b_2b 的混合物。图10.多发性骨髓瘤细胞系的表征。(A)所选择的骨髓瘤细胞系上的HLA-DR和 ⑶20的抗原密度。在利用hL243 y 4p、v-mab或hMN_14(同种型对照MAb)温育30分钟后， 利用PE-山羊抗-人IgG(Fab)探测细胞，利用流式细胞术分析细胞。(B)黑素瘤细胞系对 IFN α 2的相对敏感性。在利用MTS定量活细胞之前，在3ηΜ聚乙二醇干扰素α -2b存在或不存在的情况下温育细胞4天。图11.多发性骨髓瘤的体外细胞毒性。在浓度递增的所示构建体或组合存在的情况下培养所示细胞系，利用MTS测量相对活细胞密度。将获自未处理的细胞的信号％对摩尔浓度的对数作图。使用I^rism软件产生剂量-反应曲线和EC5tl值。误差棒，SD。图12.增强的来自全血的NHL细胞的消耗。将新鲜的肝素化人血与Daudi混合， 与InM的所示Mab-IFN α或MAb —起温育2天。利用流式细胞术评估对Daudi、B细胞、T 细胞和单核细胞的作用。误差棒，SD。发明详述定义除非另外明确地指出，否则〃 一〃或〃 一个〃可指“一个或多个”。本文所使用的术语“和”与“或”可用于合取(conjunctive)或析取 (disjunctive) 0也就是说，除非另有说明，否则这两个术语应当理解为等同于“和/或”。“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(SiRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。“诊断剂”是可用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如带有生物素-链霉抗生物素蛋白复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)。本文所使用的“抗体”是指全长(即天然存在的或经标准免疫球蛋白基因片段重组方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。“裸抗体”是未与治疗剂或诊断剂连接的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的 Fc部分可提供效应子功能，例如补体结合和ADCC(参见，例如，Markrides, Pharmacol Rev 50:59-87,1998)。裸抗体籍以诱导细胞死亡的其它机制可包括细胞凋亡。(Vaswani和 Hamilton, Ann Allergy Asthma Immunol 81 :105-119,1998.)。“抗体片段”是完整抗体的部分，例如F (ab' )2、Fab'、Fab、Fv、sFv、scFv等。无论其结构如何，抗体片段所结合的抗原与完整抗体所识别的抗原相同。抗体片段包括由可变区组成的分离的片段(例如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段)或重组单链多肽分子(其中轻链和重链可变区由肽连接体连接(“scFv蛋白”))。“单链抗体”(通常缩写为 "scFv")由包含相互作用以形成抗原结合部位的Vh和八结构域的多肽链组成。Vh和八结构域通常由1至25个氨基酸残基的肽连接。抗体片段还包括双链抗体、三链抗体和单结构域抗体(dAb)。如果所施用的剂量具有生理上的意义时，就可以说是以“治疗有效量”施用抗体或免疫缀合物制剂或本文所述的组合物。如果试剂的存在导致受体受试者的生理状态的可检测的变化，则该试剂就具有生理上的意义。在具体的实施方案中，如果抗体制剂的存在引起抗肿瘤反应或减轻自身免疫性疾病状态的体征和症状时，该抗体制剂就具有生理上的意义。生理意义的效果也可以是诱发受体受试者的体液和/或细胞免疫反应，导致靶细胞的生长抑制或死亡。停靠和加锁(DNL)法“停靠-和-加锁”(DNL)法利用cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的特定的蛋白质间相互作用(Baillie 等人，FEBS Letters. 2005 ;579 :3264. Wong 和 kott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 959)。PKA(在被最详尽研究的通过第二信使cAMP与R亚基的结合触发的信号传导途径之一中起着主要作用)于1968年首次从兔子分离(Walsh等人，J.Biol. Chem. 1968 ；243 3763)。全酶的结构由两个催化亚基组成，这两个亚基通过R亚基维持无活性形式(Taylor, J. Biol. Chem. 1989 ；264 :8443)。发现PKA的同功酶类具有两类R亚基(RI 和 RII)，并且每一类具有 α 和 β 同种型(Scott, Pharmacol. Ther. 1991 ；50 :123)。R 亚基只以稳定的二聚体被分离，而且已显示二聚化结构域由前44个氨基端残基组成(Newlon等人，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222)。cAMP与R亚基的结合导致用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，所述释放通过PKA经由其与AKAP的停靠的区室化被定向至所选择的底物(Scott 等人，J. Biol. Chem. 1990 ；265 ；21561)。由于第一 AKAP，微管缔合蛋白2，于1984年得以表征(Lohmann等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984 ；81 :6723)，在酵母至人类的物种范围中已鉴定出了超过50种具有不同结构的定位至不同亚细胞位置(包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网)的 AKAP(Wong 和 Scott,Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。PKA 的 AKAP 的 AD 是 14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J. Biol. Chem. 1991 ；266 :14188)。AD的氨基酸序列在个体AKAP中是相当多变的，所报道的对RII 二聚体的结合亲和力范围为2至90nM(Alto 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA. 2003 ； 100 :4445)。有趣地，AKAP 将只结合二聚 R 亚基。对于人RII，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和kott，Trends Cell Biol. 1999 ；6 216) ο因此，人RII α的二聚化结构域和AKAP结合结构域都位于相同的N 末端 44 个氨基酸序列中(Newlon 等人，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222 ；Newlon 等人，EMBO J. 2001 ；20 :1651)，所述氨基酸序列在本文中称为DDD。作为连接模块(Linker Module)的人RII α的DDD和AKAP的AD我们已开发了这样的平台技术，其利用人RII α的DDD和AKAP蛋白的AD作为一对优良的连接模块以用于将在下文中称为A和B的实体的任何组合停靠至非共价复合物中， 非共价复合物可通过将半胱氨酸残基引入DDD和AD两者的战略位置上以促进二硫键的形成而进一步锁入稳定束缚的结构中。“停靠-和-加锁”法的一般方法如下。通过将DDD序列与A的前体连接(结果产生在下文中称为a的第一组分)来构建的实体A。因为DDD序列可引起二聚体的自发形成，因此A可由 组成。可通过将AD序列与B的前体连接(结果产生在下文中称为b的第二组分)来构建实体B。 中包含的DDD的二聚基元可产生用于与b中包含的AD序列结合的停靠位点，从而促进％与b的容易缔合以形成由a2b组成的三聚复合物。这样的结合事件因后续反应而不可逆地进行，所述后续反应通过二硫桥共价保护了所述两个实体，所述反应基于有效的局部浓缩的原理非常有效地发生，因为起始结合相互作用应当使置于DDD和AD上的反应性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 2001 ；98 8480)以便进行位点特异性连接。虽然在某些实施方案中，％亚基可包含两个相同的效应物部分，但在下文中描述的优选的实施方案中，％亚基可包含不同的效应物部分，每一个效应物与相同的DDD序列连接。因此，三聚 b复合物可包含三种不同的效应物部分。在优选的实施方案中，免疫细胞因子DNL构建体可基于a2b结构的变化，其中第一和第二效应物与DDD部分连接并且第三效应物与AD部分连接。每一个AD部分能够结合以二聚体形式存在的两个DDD部分。通过连接远离前体的官能团的DDD和AD，此类位点特异性连接也预期保持前体的原始活性。该方法本质上是模块并且潜在地可用于位点特异性和共价地连接许多种物质。DNL法公开于第7，550，143号；第7，521，056号；第76，534，866 号；第7，527，787号和第7，666，400号美国专利中，每一个专利的实施例部分通过引用并入本文。在优选的实施方案中，效应物部分是可与DDD或AD部分连接与形成融合蛋白或肽的蛋白质或肽，更优选抗体、抗体片段或细胞因子。用于制备融合蛋白的多种方法是已知的，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目的融合蛋白的合成双链核酸。可利用标准分子生物学技术(参见，例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A laboratory manual, 第2版，1989)将此类双链核酸插入用于融合蛋白产生的表达载体。在此类优选的实施方案中，可将AD和/或DDD部分与效应蛋白或肽的N末端或C末端连接。然而，本领域技术人员将会知道，AD或DDD部分至效应物部分的连接的位点可取决于效应物部分的化学性质而变化，并且效应物部分的部分牵涉其生理活性。在最优选的实施方案中，AD或DDD部分至抗体或抗体片段的连接可在重链亚单位的C末端、来自抗原结合部位的分子的相对末端上发生。然而，如下文中所论述的，也可使用至抗体或抗体片段的N末端连接，同时保持抗原结合活性。可使用本领域已知的技术例如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术来进行多种效应物部分的位点特异性连接。DDD和AD序列变体在某些实施方案中，整合入免疫细胞因子DNL复合物的AD和DDD序列包含下文中的DDDl和ADl的氨基酸序列。在更优选的实施方案中，AD和DDD序列包含DDD2和AD2的氨基酸序列，所述序列经设计促进DDD与AD部分之间二硫键的形成。DDDlSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :13)DDD2CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :14)ADlQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :15)AD2CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO :16)
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本领域技术人员将会了解，DDDl和DDD2包含蛋白激酶A的人RII α形式的DDD序列。然而，在可选择的实施方案中，DDD和AD部分可基于蛋白激酶AWARIIa形式的DDD 序列和相应的AKAP序列，如下文中的DDD3、DDD3C和AD3中所举例说明的。DDD3SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO :17)DDD3CMSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO :18)AD3CGFEELAffKIAKMIffSDVFQQGC(SEQ ID NO :19)还可设计和利用基于已知的人RI β和RII β氨基酸序列的其它可选择的DDD部分(参见，例如，NCBI登录号ΝΡ_001158233和ΝΡ_002727，下文中的序列)。人PKA RI β氨基酸序列MASPPACPSE EDESLKGCEL YVQLHGIQQV LKDCIVHLCI SKPERPMKFLREHFEKLEKE ENRQILARQK SNSQSDSHDE EVSPTPPNPV VKARRRRGGVSAEVYTEEDA VSYVRKVIPK DYKTMTALAK AISKNVLFAH LDDNERSDIFDAMFPVTHIA GETVIQQGNE GDNFYVVDQG EVDVYVNGEff VTNISEGGSFGELALIYGTP RAATVKAKTD LKLffGIDRDS YRRILMGSTL RKRKMYEEFLSKVSILESLE KffERLTVADA LEPVQFEDGE KIVVQGEPGD DFYIITEGTASVLQRRSPNE EYVEVGRLGP SDYFGEIALL LNRPRAATVV ARGPLKCVKLDRPRFERVLG PCSEILKRNI QRYNSFISLT V (SEQ ID NO 20)人PKA RI β氨基酸序列MSIEIPAGLT ELLQGFTVEV LRHQPADLLE FALQHFTRLQ QENERKGTARFGHEGRTffGD LGAAAGGGTP SKGVNFAEEP MQSDSEDGEE EEAAPADAGAFNAPVINRFT RRASVCAEAY NPDEEEDDAE SRIIHPKTDD QRNRLQEACKDILLFKNLDP EQMSQVLDAM FEKLVKDGEH VIDQGDD⑶N FYVIDRGTFDIYVKCDGVGR CVGNYDNRGS FGELALMYNT PRAATITATS PGALffGLDRVTFRRIIVKNN AKKRKMYESF IESLPFLKSL EFSERLKVVD VIGTKVYNDGEQIIAQGDSA DSFFIVESGE VKITMKRKGK SEVEENGAVE IARCSRGQYFGELALVTNKP RAASAHAIGT VKCLAMDVQA FERLLGPCME IMKRNIATYEEQLVALFGTN MDIVEPTA(SEQ IDNO :21)在其它可选择的实施方案中，AD和/或DDD部分的不同序列变体可用于双特异性免疫细胞因子DNL复合物的构建。AD与DDD结构域的结构-功能关系一直是调查研究的主题。(参见，例如，Burns-Hamuro 等人，2005，Protein Sci 14 :2982-92 ;Carr 等人，2001，J Biol Chem 276 17332-38 ;Alto 等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100 4445-50 ；Hundsrucker 等人，2006，Biochem J 396 :297-306 ;Stokka 等人，2006，Biochem J 400 :493-99 ;Gold 等人，2006，Mol Cell 24 :383-95 ;Kinderman 等人，2006，Mol Cell 24: 397-408，每一个文献的完整文本通过引用并入本文)。例如，Kinderman等人Q006)检验了 AD-DDD结合相互作用的晶体结构并且得出人DDD序列包含许多保守氨基酸残基(所述氨基酸残基在二聚体形成和AKAP结合中特别
15重要)，在下列的序列中加下划线。(参见Kinderman等人，2006的图1，所述文献通过引用并入本文)。本领域技术人员将理解在设计DDD序列的序列变体中，期望地避免改变任何加下划线的残基，然而可对对于二聚化和AKAP结合不太紧要的残基进行保守氨基酸替代。因此，用于构建DNL复合物的潜在可选择的DDD序列示于下列序列中，其中“X”表示保守氨基酸替代。保守氨基酸序列替代在下文中进行更详细的论述，但可包括例如天冬氨酸残基替代谷氨酸残基或者亮氨酸或缬氨酸残基替代异亮氨酸残基等。此类保守氨基酸替代在本领域是公知的。来自蛋白激酶A的人DDD序列SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :13)ΧΧΙΧΙΧΧΧ ΧΧαΧΧΥΧνχν ΧΧΧΧΧΧΙ,νΧΡΧνΧΥΕΧΧ ΧΧΧΧΧ(8Ε0 ID NO :22)Alto等人Q003)进行了多种AKAP蛋白的AD序列的生物信息学分析以设计下文中显示的称为AKAP-IS的RII选择性AD序列，其具有0. 4nM的对DDD的结合常数。AKAP-IS 序列被设计为结合PKA的AKAP的肽拮抗剂。其中替代倾向于减少与DDD的结合的AKAP-IS 序列中的残基在下列的序列中加下划线。因此，本领域技术人员将会了解，可发挥DNL构建体的功能的变体由下列序列指示，其中“X”是保守氨基酸替代。AKAP-IS 序列QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO: 15)XXXXXAXXIVXXAIXXX(SEQ ID NO :23)类似地，Gold(2006)利用晶体学和肽筛选来开发下文中显示的SuperAKAP-IS序列，其显示对PKA的RII同种型的选择性高出对RI同种型的选择性5个数量级。加下划线的残基表示相对于AKAP-IS序列的氨基酸替代的位置，所述替代增加与RII α的DDD部分的结合。在该序列中，N末端Q残基被编号为残基号4并且C末端A残基是残基号20。其中可进行替代以影响对RII α的亲和力的残基为残基8、11、15、16、18、19和20 (Gold等人， 2006)。预期在某些可选择的实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列替代AKAP-IS AD部分序列以制备双特异性免疫细胞因子DNL构建体。可被用于替代AKAP-IS AD序列的其它可选择的序列示于下文中。加下划线相对于AKAP-IS序列的替代。预期，关于AKAP-IS序列，AD 部分还可包括额外的N末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸。SuperAKAP-ISQIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO 24)可选择的AKAP序列QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO 25)QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO 26)QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO 27)Gold等人的图2公开了下文中显示的来自多种AKAP蛋白的额外DDD-结合序列。RII-特异性 AKAPAKAP-KLPLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO 28)AKAP79LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO 29)
AKAP-LbcLIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO :30)RI-特异件 AKAPAKAPceALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO :31)RIADLEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO :32)PV38FEELAffKIAKMIffSDVF(SEQ ID NO :33)Dual-特异件 AKAPAKAP7ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO :34)MAP2DTAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO :35)DAKAPlQIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO :36)DAKAP2LAffKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO :37)Stokka等人Q006)还开发了下文中显示的结合PKA的AKAP的肽竞争剂。所述肽拮抗剂被命名为Ht31、RIAD和PV-38。Ht-31肽显示更大的对PKA的RII同种型的亲和力，而RIAD和V-38显示更大的对RI的亲和力。Ht31DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO :38)RIADLEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO :39)PV-38FEELAffKIAKMIffSDVFQQC(SEQ ID NO :40)Hundsrucker等人^)06)还开发了结合PKA的AKAP的其它肽竞争剂，具有低至 0. 4nM的对PKA的RII形式的DDD的结合常数。多种AKAP拮抗性肽的序列提供于下文中复制的Hundsrucker等人的表1中。表IAKAP肽序列AKAPIS表示合成RII亚基结合肽。所有其它肽衍生自所示AKAP的RII结合结构域。肽序列AKAPlSQIEYLAKQlVDNAJQQA (SF.Q ID NO 1 5)
AKAPIS-PQTEYLAKQiPDNAIQQA (SEQ ID NO :41)
Ht31KGADIJHHAASRIVDAVIEQVKAAG (SEQ JD NO:42)
HtJl-FKGADLIEEAASRIPDAPIEOVKAAG (SEQ ID NO:43)
ΑΚΛΡ7( -wt-pep PEDAF.LVRLSKRLVENAVLIC4VQQY (SEQ ID NO:44) AKAP7c>-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (SHQ 1DN0:45) AKAf7ci-l308D-pep FHDAF,L￥RLSKRDVENAVLKAVQQY (SEQ ID NO;46) AJC4P ci-P-pep PEDAELVRLSKRLPEKAVLKAVQQ Y (SEQ ID NO:47) AK/\P7d-FP^pcp FEDAKLVRLSKRLPENAPLKAVQQY (SEQ ID NO;48j AKAP7d'-L314E-pep PEDAELVRLSICRLVtNAVEKAVQQY (SHQ ID NO:49) AKAP1 'pepEFriLDRNEElKRj-XAFQIISQVISFA (SEQ ID M0:50)
AK/\P2-pcpLVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ (SEQ ID KO:511
AKAP5-pepQYRTI,LIFTASS『-VKNAIQLSTRQI, (SEQ fD NO:52)
AKAP9-pepLHKQYQHQLEEEVAICVIVSMSIAFA (SEQ ID NO:55)
AKAP!0-pepNTOEAQEELAWKiAKMiVSDIMQQA (SEQ fD NO:54)
ΛΚAPU-pepVWLDKKAVLAHKlVAEAtiiKAERHL (SEQ ID NO:55j
AKAP12-pepNGILELETKSSKLVQNHQTAVDQF (SEQ ID NO:56)
AKAP14-pepTQDO YHOHLl'OVALALVtD VIN YA (SHQ ID KO:57)
Rab32冊pepETRAKDNiNIEEAARFLVEKILVNH (SEQ II) NO:58)在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基通过参考下列AKAP IS序列在下文中由加下划线标示。除了 C末端丙氨酸残基的添加外，所述残基与由Alto等人Q003) 观察到的相同。(参见Hundsrucker等人Q006)的图4，将所述文献通过引用并入本文)。 具有特别高的对RII DDD序列的亲和力的肽拮抗剂的序列是AKAP-IS、AKAP7 δ -wt-pep, AKAP7 δ -L304T-p印和 ΑΚΑΡ7 δ -L308D_p印的序列。AKAP-ISQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO: 15)Carr等人QOO1)检验了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度并且鉴定了 DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的残基。这些可通过参考人PKA RIIa DDD序列在下文中由加下划线标示。特别保守的残基进一步由斜体字标示。所述残基与由Kinderman等人Q006)提出的对于结合AKAP蛋白重要的那些残基重叠，但不与其相同。因此，下文中指示潜在的DDD序列，其中“X”表示保守氨基酸替代。SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO 13)XHIXIPXGLXELLQGYTXEVLRXQPXDLVEFAXXYFXXLXEXRX(SEQ ID NO :59)本领域技术人员将会了解，一般而言，这些在来自不同蛋白质的DDD和AD序列中高度保守的氨基酸残基是可以优选在产生氨基酸替代中保持恒定的残基，然而不太高度保守的残基可以被更容易改变以产生本文中描述的AD和/或DDD序列的序列变体。
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除了 DDD和/或AD部分的序列变体外，在某些实施方案中，可以优选在抗体部分或连接抗体与AD序列的连接体肽序列中弓丨入序列变异。在一个举例说明性实例中，融合蛋白序列的3个可能变体示于下面。(L)QKSLSLSPGLGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO 60)(A)QKSLSLSPGAGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO 61)(-)QKSLSLSPGGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO 62)氨基酸替代在某些实施方案中，所公开的方法和组合物可包括具有一个或多个替代的氨基酸残基的蛋白质或肽的产生和使用。可通过取代一个或多个氨基酸残基来最优化天然抗体、 嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或AD或DDD序列的结构、物理和/或治疗特征。例如，众所周知可通过用亲代鼠抗体的相应FR氨基酸替代有限数目的人构架区(FR)氨基酸来改善人源化抗体的功能特征。当构架区氨基酸残基与⑶R残基十分靠近时，这种情况尤其正确。在其它情况下，可通过有限数目的氨基酸替代最优化抗体的治疗特性，例如对靶抗原的结合亲和力、抗体与其靶抗原的离解或解离速率或甚至抗体对CDC(补体依赖细胞毒性)或ADCC(抗体依赖性细胞毒性)的诱导的效率。在可选择的实施方案中，可进一步最优化用于产生本发明的DNL构建体的DDD和 /或AD序列，例如以增加DDD-AD结合亲和力。上文中论述了 DDD或AD序列中的潜在序列变异。本领域技术人员将会意识到，一般而言，氨基酸替代通常包括用具有相对相似的性质的另一种氨基酸替代氨基酸(即，保守氨基酸替代)。不同氨基酸的性质和氨基酸替代对蛋白质结构和功能的影响一直以来是本领域内广泛研究和知识的主题。例如，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte&Doolittle，1982，J.Mol. Biol.，157 105-132)。氨基酸的相对亲水特征促成了所得蛋白质的二级结构，这反过来确定了蛋白质与其它分子的相互作用。每一种氨基酸基于其疏水性和电荷特征被赋予亲水指数(Kyte&D00little，19^)，这些氨基酸是异亮氨酸(+4. 5)；缬氨酸(+4. 2)；亮氨酸 (+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)； 甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸 (-1.6)；组氨酸(-3. 2)；谷氨酸(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺 (-3. 5)；赖氨酸(-3. 9)；和精氨酸(-4. 5)。在产生保守替代中，其亲水性指数在士2内的氨基酸的使用是优选的，其亲水性指数在士 1内的是更优选的，其亲水性指数在士0. 5内的是进一步更优选的。氨基酸替代也可考虑氨基酸残基的亲水性(例如，第4，554，101号美国专利)。亲水性值已被赋予给氨基酸残基精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸 (+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)； 脯氨酸("0. 5. +-· 1)；丙氨酸(-0. 5)；组氨酸(-0. 5)；半胱氨酸(-1. 0)；甲硫氨酸(-1. 3)； 缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。用具有相似亲水性的其它氨基酸来替代氨基酸是优选的。其它考虑包括氨基酸侧链的大小。例如，用具有体积大的侧链的氨基酸例如色氨酸或酪氨酸替代具有紧凑侧链的氨基酸例如甘氨酸或丝氨酸通常不是优选的。也要考虑不同氨基酸残基对蛋白质二级结构的影响。通过经验研究，不同氨基酸残基对蛋白质结构域采取α-螺旋、β-折叠片或反转二级结构的倾向的影响已被确定并且在本领域内是已知的(参见，例如，Chou&Fasman，1974,Biochemistry, 13 :222-245 ； 1978,Ann. Rev. Biochem.， 47:251-276 ；1979，Biophys. J. ,26 :367-384)。基于这样的考虑和广泛的经验研究，保守氨基酸替代的表达已被构建并且在本领域内是已知的。例如，精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可选择地Ala(A) leu、ile、val ；Arg (R) gin、 asn、lys ;Asn(N)his、asp、lys、arg、gln ；Asp (D)asn、glu ；Cys (C)ala、ser ；Gln (Q)glu、asn ； Glu(E)gln、asp ；Gly (G) ala ；His(H) asn、gin、lys、arg ；Ile(I)val、met、ala、phe、leu ； Leu (L)val、met、ala、phe、ile ；Lys (K)gin、asn、arg ；Met (M)phe、ile、leu ；Phe (F)leu、val、 ile、ala、tyr ；Pro (P)ala ；Ser(S)、thr ；Thr (T)ser ；Trp(W)phe、tyr ；Tyr (Y)trp、phe、thr、 ser ；Val(V) ile、leu、met、phe、ala0对于氨基酸替代的其它考虑包括残基是否位于蛋白质的内部或是否暴露于溶剂。 对于内部残基，保守替代可包括:Asp和Asn ；Ser和Thr ；Ser和Ala ；Thr和Ala ；Ala和 Gly ；Ile 和 Val ；Val 和 Leu ；Leu 和 Ile ；Leu 和 Met ；Phe 和 Tyr ；Tyr 和 Trp.(参见，例如， rockefeller, edu上的PROWL网站)。对于暴露于溶剂的残基，保守替代可包括Asp和Asn ； Asp 禾口 Glu ；Glu 禾口 Gln ；Glu 禾口 Ala ；Gly 禾口 Asn ；Ala 禾口 Pro ；Ala 禾口 Gly ；Ala 禾口 Ser ；Ala 禾口 Lys ；Ser 和 Thr ；Lys 和 Arg ；Val 和 Leu ；Leu 和 Ile ；Ile 和 Val ；Phe 和 Tyr. (Id.)。已构建多种矩阵来帮助选择氨基酸替代，例如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、 McLachlan 矩阵、Doolittle 矩阵、Henikoff 矩阵、Miyata 矩阵、Fitch 矩阵、Jones 矩阵、 Rao 矩阵、Levin 矩阵和 Risler 矩阵(Idem.)。在测定氨基酸替代中，也可考虑分子间或分子内键的存在，例如带正电荷的残基 (例如，HiS、Arg、LyS)与带负电荷的残基(例如，Asp、Glu)之间离子键的形成或附近半胱氨酸残基之间二硫键的形成。用任何氨基酸替代编码的蛋白质序列中的任何其它氨基酸的方法是公知的并且对于本领域技术人员来说只不过是常规实验，例如通过定点诱变的技术或通过合成和装配编码氨基酸替代的寡核苷酸，然后将其拼接入表达载体构建体来进行。细胞因子和其它免疫调节剂在某些优选的实施方案中，效应物部分可以是免疫调节剂。免疫调节剂是当存在时改变、抑制或刺激身体的免疫系统的试剂。使用的免疫调节剂可包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴细胞毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白细胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素例如干扰素-α、_ β或-γ以及干细胞生长因子例如命名为“Si因子”的干细胞生长因子。在某些优选的实施方案中，效应物部分是细胞因子例如淋巴因子、单核细胞激活
20素、生长因子和常规多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；胎盘生长因子 (PIGF)、肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β ；苗勒抑制物质(mullerian inhibiting substance)；鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ；胰岛素样生长因子-I和-II ；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(II)例如IL_1、IL-I α、IL_2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12 ；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管生长抑素、血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤坏死因子(TNF^f^BTNF-a)和LT。蛋白质或肽免疫调节剂例如细胞因子的氨基酸序列在本领域是公知的并且任何此类已知的序列可用于实施本发明。本领域技术人员知道关于细胞因子序列的公共信息的众多来源。例如，NCBI数据库包含大量细胞因子和免疫调节剂的蛋白质和编码核酸序列， 所述细胞因子和免疫调节剂是例如红细胞生成素(GenBank NM 000799)、IL-I β (GenPept AAH08678)、GM-CSF (GenP印t AAA52578)、TNF_ α (GenP印t CAA26669)、干扰素-α (GenP印t AAA52716. 1)、干扰素-α 2b (GenP印t AAP20099. 1)和上文中所列的实际上任何肽或蛋白质免疫调节剂。鉴定基本上任何目的蛋白质或肽效应物部分的适当的氨基酸和/或核酸序列对于本领域技术人员来说是常规的事情。抗体和抗体片段用于制备实际上抗任何靶抗原的单克隆抗体的技术在本领域是公知的。参见， 例如，Kohler 和 Milstein, Nature 256 :495(1975),和 Coligan 等人(编)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第 1 卷，第 2. 5. 1-2. 6· 7 页(John ffiley&Sons 1991)。简而言之，可通过如下获得单克隆抗体用包含抗原的组合物注射小鼠，取出脾脏以获得B淋巴细胞，将所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的克隆，培养产生针对所述抗原的抗体的克隆以及从杂交瘤培养物分离抗体。可利用多种完善的技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类分离技术包括利用蛋白A琼脂糖的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。参见，例如，第2. 7. 1-2. 7. 12 页和第 2. 9. 1-2. 9. 3 页的 Coligan0 此外，参见 Baines 等人，“Purification of Immunoglobulin G(IgG), "in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 10 卷，第 79-104 页(The Humana Press, Inc.1992)。在初始产生针对免疫原的抗体后，可测定抗体的序列，随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和表征对于本领域技术人员来说是公知的。衍生自人源化抗体、嵌合抗体或人抗体的抗体成分的使用排除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。嵌合抗体嵌合抗体为重组蛋白质，其中人抗体的可变区被例如包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)的小鼠抗体的可变区取代。当给受试者施用时，嵌合抗体显示出免疫原性降低而稳定性增加。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等人，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 86:3833(1989)中。用于构建嵌抗体的技术对于本领域技术人员来说是公知的。作为例子，Leung等人，Hybridoma 13:469(1994)通过将编码鼠 LL2 (抗-⑶22单克隆抗体)的Vk和Vh结构域的DNA序列与分别的人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合抗体。人源化抗体用于产生人源化MAb的技术在本领域内是公知的(参见，例如，Jones等人，Nature 321 522 (1986)，Riechmann 等人，Nature 332 :323 (1988)，Verhoeyen 等人，Science 239 1534(1988)，Carter 等人，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 89 :4285(1992)，Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 :437(1992)和 Singer 等人，J. Immun. 150 :2844(1993)) 可通过将小鼠 CDR自小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移入人抗体的相应可变结构域来人源化嵌合或鼠单克隆抗体。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也用人FR序列取代。由于简单地将小鼠⑶R转移入人FR中通常导致抗体亲和力的减少或甚至丧失，因此为了恢复鼠抗体的原始亲和力可能需要额外的修饰。这可通过将FR区中的一个或多个人残基用它们的鼠对应物替代以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见，例如Tempest等人， Biotechnology 9 :266(1991)和 Verhoeyen 等人，Science 239 :1534(1988)。通常，与它们的鼠对应物不同并且紧位于或接触一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基可以是替代的候选者。人抗体用组合方法或经人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完整人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini 等人，2004，NewMicrobiol. 27 :315-28 ；Conrad 和 Scheller,2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8 :117-26 ；Brekke 禾口 Loset,2003, Curr. Opin. Phamaco 1. 3 :544-50)。还可利用基因或染色体转染法以及噬菌体显示技术(所有所述技术在本领域内都是已知的)构建完整人抗体。参见例如McCafferty等人，Nature 348 :552-553 (1990)。这样的完整人抗体预期表现出比嵌合抗体或人源化抗体更少的副作用并且如基本上内源的人抗体一样在体内起作用。在某些实施方案中，要求保护的方法和过程可使用通过此类技术而产生的人抗体。在一个替代实施方案中，噬菌体显示技术可用于产生人抗体(例如， Dantas-Barbosa等，2005，Genet. Mol. Res. 4 :126-40)。人抗体可从正常人或表现出特定疾病状态如癌症的人中制备(Dantas-Barbosa等，200幻。从患病个体中构建人抗体的有利方面在于循环抗体全库可能对针对疾病相关抗原的抗体具有偏好性。在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等^00 构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体显示文库。一般而言，总RNA获自循环血淋巴细胞(Id.)。从 μ、Y和κ链抗体全库中克隆重组Fab，并将其插入噬菌体显示文库(Id.)。RNA可通过使用对重链和轻链免疫球蛋白序列特异的引物转化为cDNA，并用于制备FabcDNA文库(Marks 等人，1991，J. Mol. Biol. 222 :581-97)。文库构建按 Andris-Widhopf 等(2000，在 Phage Display Laboratory Manual,Barbas^ (1 ")1 lK Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9. 1至9. 22中)进行。最终的Fab片段用限制性核酸内切酶消化，然后插入噬菌体基因组以制备所述噬菌体显示文库。此类文库可使用本领域已知的标准噬菌体显示方法进行筛选(参见，例如，Pasqualini and Ruoslahti，1996， Nature 380 :364-366 ；Pasqualini,1999, The Quart. J. Nuc1. Med. 43 :159-162)。可以以多种形式实施噬菌体显示，关于它们的综述，参见例如Johnson和 Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。还可利用体外活化的B细胞产生人抗体。参见，第5，567，610号和第5，229，275号美国专利，将所述专利通过引用整体并入本文。本领域技术人员将会了解，这些技术是示例性的并且可利用用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。在另一替代实施方案中，使用标准的免疫实验方案，经过基因工程改造以产生人抗体的转基因动物可用于产生针对基本上任何免疫靶的抗体。用于从转基因动物获得人抗体的方法由 Green 等人，Nature Genet. 7 :13(1994)，Lonberg 等人，Nature 368 856(1994)和Taylor等人，Int. Immun. 6 :579 (1994)公开。此系统的非限制性示例为 Abgenix (Fremont, CA)的 XenoMouse (例如，Green 等人，1999，J. Immunol. Methods 231 11-23)。在XenoMouse 和相似动物中，小鼠抗体基因已被失活，并替换为功能性人抗体基因，但是鼠免疫系统的剩余部分仍保持完整。XenoMouse 已转化了种系配置的YAC (酵母人工染色体)，该YAC包含部分人IgH 和IgK基因座，包括可变区序列的大部分区域，以及辅助基因和调控序列。人可变区全库可用于制备产生抗体的B细胞，而B细胞可通过已知技术融合至杂交瘤。用靶抗原免疫的 XenoMouse 将通过正常的免疫反应产生人抗体，所述人抗体可通过上述标准技术进行收获和/或产生。有多个种系的XenoMouse 可用，每个种系均能产生不同类别的抗体。转基因产生的人抗体已显示出治疗潜力，并保留了正常人抗体的药代动力学特性(Green等， 1999)。本领域技术人员将会了解，要求保护的组合物和方法并不限于使用XenoMouse 系统，而是可以使用已经过基因工程改造来产生人抗体的任何转基因动物。抗体片段可利用已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分例如F(ab' )2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。可通过胃蛋白酶降解抗体分子来产生 F(ab，)2片段，并且可通过还原F(ab，)2片段的二硫桥来产生Fab'片段。可选择地，可构建Fab'表达文库(Huse等人，1989，kience，M6 :1274-1观1)以允许快速且容易地鉴定具有期望的特异性的单克隆Fab'片段。可通过木瓜蛋白酶消化抗体来产生？(油)2片段，并且通过二硫化物还原来获得Fab片段。单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶结合部位。这两个结构域通过肽连接体(L)进一步共价连接。用于制备scFv分子和设计适当的肽连接体的方法公开于第4，704，692号美国专利，第4，946，778号美国专利，R. Raag 和 M. Whitlow, "Single Chain Fvs. ” FASEB 第 9 卷:73-80(1995)以及 R.E. Bird 和 B. W. Walker/‘Single Chain Antibody Variable Regions，”TIBTECH，第 9 卷 132-137(1991)中。用于产生单结构域抗体(DAB)的技术在本领域也是已知的，如例如Cossins等人 (2006, Prot Express Purif 51 :253-259)(通过引用并入本文)中公开的。可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌(E. coli)或另一种宿组中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段。可利用常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解全长抗体来获得抗体片段。此类方法由例如Goldenberg,第4，036，945号和第4，331，647 号美国专利以及本文中包括的参考资料描述。此外，参见Nisonoff等人，Arch Biochem. Biophys. 89 :230(1960) ；Porter，Biochem. J. 73 :119 (1959)，Edelman 等人，in METHODS IN ENZYM0L0GY 第 1 卷，第 422 页(Academic Press 1967)和第 2. 8. 1-2. 8. 10 和 2. 10. -2. 10. 4 页的 Coligan0已知抗体使用的抗体可从许多已知的来源商购获得。例如，多个抗体分泌型杂交瘤品系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)。大量抗不同疾病靶(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏在ATCC和/或具有公布的可变区序列，并且可获得用于要求保护的方法和组合物。参见，例如，第7，312，318 ；7, 282, 567 ；7, 151，164 ；7，074，403 ； 7，060，802 ；7，056，509 ；7，049，060 ；7，045，132 ；7，041，803 ；7，041，802 ；7，041，293 ； 7，038，018 ；7，037，498 ；7，012，133 ；7，001，598 ；6，998，468 ；6，994，976 ；6，994，852 ； 6，989，241 ；6，974，863 ；6，965，018 ；6，964，854 ；6，962，981 ；6，962，813 ；6，956，107 ； 6，951，924 ；6，949，244 ；6，946，129 ；6，943，020 ；6，939，547 ；6，921，645 ；6，921，645 ； 6，921，533 ；6，919，433 ；6，919，078 ；6，916，475 ；6，905，681 ；6，899，879 ；6，893，625 ； 6，887，468 ；6，887，466 ；6，884，594 ；6，881，405 ；6，878，812 ；6，875，580 ；6，872，568 ； 6，867，006 ；6，864，062 ；6，861，511 ；6，861，227 ；6，861，226 ；6，838，282 ；6，835，549 ； 6，835，370 ；6，824，780 ；6，824，778 ；6，812，206 ；6，793，924 ；6，783，758 ；6，770，450 ； 6，767，711 ；6，764，688 ；6，764，681 ；6，764，679 ；6，743，898 ；6，733，981 ；6，730，307 ； 6，720，15 ；6，716，966 ；6，709，653 ；6，693，176 ；6，692，908 ；6，689，607 ；6，689，362 ； 6，689，355 ；6，682，737 ；6，682，736 ；6，682，734 ；6，673，344 ；6，653，104 ；6，652，852 ； 6，635，482 ；6，630，144 ；6，610，833 ；6，610，294 ；6，605，441 ；6，605，279 ；6，596，852 ； 6，592，868 ；6，576，745 ；6，572 ；856 ；6，566，076 ；6，562，618 ；6，545，130 ；6，544，749 ； 6，534，058 ；6，528，625 ；6，528，269 ；6，521，227 ；6，518，404 ；6，511，665 ；6，491，915 ； 6，488，930 ；6，482，598 ；6，482，408 ；6，479，247 ；6，468，531 ；6，468，529 ；6，465，173 ； 6，461，823 ；6，458，356 ；6，455，044 ；6，455，040,6，451，310 ；6，444，206' 6，441，143 ； 6，432，404 ；6，432，402 ；6，419，928 ；6，413，726 ；6，406，694 ；6，403，770 ；6，403，091 ； 6，395，276 ；6，395，274 ；6，387，350 ；6，383，759 ；6，383，484 ；6，376，654 ；6，372，215 ； 6，359，126 ；6，355，481 ；6，355，444 ；6，355，245 ；6，355，244 ；6，346，246 ；6，344，198 ； 6，340，571 ；6，340，459 ；6，331，175 ；6，306，393 ；6，254，868 ；6，187，287 ；6，183，744 ； 6，129，914 ；6，120，767 ；6，096，289 ；6，077，499 ；5，922，302 ；5，874，540 ；5，814，440 ； 5，798，229 ；5，789，554 ；5，776，456 ；5，736，119 ；5，716，595 ；5，677，136 ；5，587，459 ； 5，443，953,5, 525，338号美国专利。这些仅是示例性的并且许多种其它抗体和它们的杂交瘤在本领域是已知的。本领域技术人员将会了解，抗几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌型杂交瘤可通过就抗所选择的疾病相关目标靶的抗体简单地搜索ATCC、NCBI和 /或USPTO数据库来获得。可使用本领域公知的标准技术扩增克隆的抗体的抗原结合结构域，将其切割，然后连接入表达载体，转移入适当的宿主细胞，并且用于蛋白质生产。免疫缀合物在某些实施方案中，可将抗体或其片段缀合至一种或多种治疗剂或诊断剂。治疗
24剂不必相同而是可以不同，例如药物和放射性同位素。例如，可将131I掺入抗体或融合蛋白的酪氨酸和连接至赖氨酸残基的ε氨基的药物。还可将治疗剂和诊断剂连接至例如还原型SH基团和/或糖类侧链。用于制备治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域是已知的并且可利用任何这样已知的方法。可通过二硫键的形成在还原型抗体成分的铰链区上连接治疗剂或诊断剂。可选择地，可使用异双功能交联剂例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)连接此类试剂。Yu等人，Int. J. Cancer 56:244(1994)。用于这样的缀合的一般技术在本领域是公知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991) ；Upeslacis等人,“Modification of Antibodies by Chemical Methods, "in MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等人(编)，第 187-230 页(ffiley-Liss, Inc.1995) ；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，” in MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter 等人(编)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。可选择地，可通过抗体的Fc区中的糖类部分缀合治疗剂或诊断剂。糖基可用于增加与巯基结合的相同试剂的装载，或糖类部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。用于将肽经由抗体的糖类部分缀合至抗体成分的方法对于本领域技术人员来说是公知的。参见，例如，Shih 等人，Int. J. Cancer 41 :832(1988) ；Shih 等人，Int. J. Cancer 46 :1101(1990)和Shih等人，U. S. Patent No. 5，057，313，将所述文献通过引用整体并入本文。一般方法包括使具有氧化型糖类部分的抗体组分与具有至少一个游离胺功能的载体聚合物反应。该反应导致产生最初的希夫碱(亚胺)键合，其可通过还原成仲胺以形成最终的缀合物来获得稳定。如果用作免疫缀合物的抗体成分的抗体是抗体片段，那么Fc区可以不存在。然而，可能将糖类部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如，Leimg等人， J. Immunol. 154 :5919 (1995) ；Hansen 等人，U. S. Patent No. 5，443，953 (1995)，Leung 等人， 第6，254，868号美国专利，将所述文献和专利通过引用整体并入本文。将基因工程改造的糖类部分用于连接治疗剂或诊断剂。在某些实施方案中，可将螯合剂连接至抗体、抗体片段或融合蛋白，然后用于螯合治疗剂或诊断剂例如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(例如Mx-DTPA)、D0TA、 TETA、NETA或Ν0ΤΑ。用于螯合剂的缀合和使用其将金属或其它配体连接至蛋白质的方法在本领域是公知的(参见，例如，第12/112，289号美国专利申请，将其通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，可通过与具有长尾的试剂反应来将放射性金属或顺磁离子连接至蛋白质或肽，可将多个用于结合离子的螯合基团连接至所述长尾。这样的尾可以是聚合物例如多聚赖氨酸、多糖或其它具有侧基的衍生多聚物或可衍生链，所述侧基可结合已知可用于此用途的螯合基团，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、 多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟(polyoxime)等。可将螯合剂直接连接至抗体或肽，例如如第4，824，659号美国专利(其通过引用并入本文)中公开的。特别有用的金属-螯合剂组合包括与在60至4，OOOkeV的一般能量范围内的用于放射性成像(radioimaging)的诊断同位素(例如125I、mI、123I、124I、ffiCu、64Cu,18F^111In,67Ga,68Ga,99mTc,94mTc,nC,13N,150 , 76Br) 一起使用的 2-苄基-DTPA 及其单甲基和环己基类似物。当与非放射性金属例如锰、铁和钆络合时，相同螯合剂可用于MRI。大环螯合剂，如ΝΟΤΑ、DOTA和ΤΕΤΑ，可用于多种金属和射电金属，特别是分别用于镓、钇和铜放射性核素。通过根据目标金属调节环的大小，可使此类金属-螯合剂络合物非常稳定。可包括其它环类型的螯合剂，例如大环聚酯，其被关注用于稳定地结合核素例如223Ra(对于 RAIT)。最近，已公开了用于PET扫描技术的18F-标记的方法，例如通过F-18与金属或其它原子例如铝的反应来进行。可将18F-Al缀合物与螯合基团例如D0TA、N0TA或NETA络合， 所述螯合基被直接连接至抗体或在预靶向方法中被用于标记可靶向的构建体。这样的F-18 标记技术公开于第7，563，433美国专利中，将其实施例部分通过引用并入本文。治疗剂在可选择的实施方案中，可使用治疗剂，将其缀合至本发明的DNL复合物，或在抗体施用之前、同时或之后分开地施用其，所述治疗剂是例如细胞毒素剂、抗-血管生成剂、 促细胞凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前体药物、毒素、酶或其它试剂。 使用的药物可具有选自抗有丝分裂剂、抗激酶、烷化剂、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗-血管生成剂、促细胞凋亡剂和其组合的药物特性。使用的示例性药物可包括5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、 苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素1、白消安、加利车霉素、喜树碱、卡钼、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺钼(CDDP)、C0X-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、 SN-38、卡钼、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、2- 二氢吡咯多柔比星(2P-D0X)、氰基-吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、雌莫司汀、表鬼白毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3'，5' -0-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转化酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天门冬酰胺酶、来那度胺、亚叶酸钙、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴胼、 紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星(str印tozocin)、他莫昔芬、泰素、 替莫唑胺(DTIC的含水形式)、反钼(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)， 例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素Α、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。使用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIPl-α、MIPl-β和 ΙΡ-10。在某些实施方案中，可使用抗-血管生成剂例如血管生长抑素(angiostatin)、 baculostatin、血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、抗VEGF抗体、抗-PlGF 肽和抗体、抗-血管生长因子抗体、抗Flk-I抗体、抗Flt-I抗体和肽、抗-Kras抗体、 抗-cMET抗体、抗-MIF(巨噬细胞迁移-抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧酰胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素α、除莠霉素 A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide (利诺胺)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、 ΤΝΡ-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、 AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和其组合。特别有用的是淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白细胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素例如干扰素-α、-β或-Y以及干细胞生长因子例如命名为“Si因子”的干细胞生长因子。细胞因子中包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素； 甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β ；苗勒抑制物质(mullerian inhibiting substance)；鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如 TGF-α和TGF-β ；胰岛素样生长因子_1和-II ；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、_β和-γ ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)例如 IL-I、IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12 ；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL_25、LIF、kit 配体或 FLT-3、血管生长抑素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。使用的放射性核素包括但不限于111^K177Liu2i2BL213BL211AI62Ciu67Ciu9°Y、125I、 131I、32P、33P、47SC、mAg、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、16fiH0、186Re、188Re、189Re、212Pb 严Ra、225Ac、 59Fe J5Se J7As,89Sr,^o,105Rh,109Pd,143Pr,149Pm,169Er,194Ir,198Au,199Au 和 211Pb0 治疗性放射性核素优选具有在60至6，OOOkeV范围内的衰变能，俄歇发射体的衰变能优选为60 至200keV范围内，β发射体的衰变能优选为100_2，500keV，α发射体的衰变能优选为 4, 000-6, OOOkeV0有用的β粒子辐射核素的最大衰变能优选为20_5，OOOkeV，更优选地为 100-4, OOOkeV，最优选地为500-2，500keV。基本上通过辐射俄歇粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。例如，Co-58、Ga-67、Br_80m、Tc_99m、Rh_103m、Pt-109、In-Ill、Sb-119、 l-125、Ho-161、0s-189m和Ir-192。有用的β粒子辐射核素的衰变能优选为< 1，OOOkeV， 更优选地为< IOOkeV,最优选地为< 70keV。基本上通过产生α粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、foi-219、 Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213 和 Fm-255。有用的 α 粒子辐射的放射性核素的衰变能优选为2，000-10, OOOkeV,更优选地为3，000-8, OOOkeV,最优选地为 4，000-7，OOOkeV。使用的其它潜在放射性同位素包括"(:、13Ν、15θ/5Βι·、198Αιι、224Α(3、126Ι、133Ι、 77Br、113mh、95RU、97RU、10l 严Κυ、10、、203^、121ηιΤθ、1221θ、125ηιΤθ、165 ιι、167 ιι、168Τπι、197Ρ 、109Ρ(1、 舰他、14^、14^、161!^、16^)、19、、57^)、58^)、51^·、59!^、7^、2。1!!、22^、 !·、165^ 等。某些有用的诊断核素可包括呷、52!^、62^!、64^!、67^!、6^!、，^、89^·、94!^、94"^、99"^ 或 mh。治疗剂可包括光敏剂或染料。已使用荧光组合物例如荧光染料和其它发色团或染料(例如对可见敏感的卟啉)来检测和治疗病变，即用合适的光照射病变部位。在治疗中，这被称为光辐射、光疗或光动力疗法。参见Jori等人(编)，PH0T0DYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985) ；van den Bergh, Chem. Britain (1986)，22:430。此外，已将单克隆抗体与光敏染料偶联，用于进行光疗。参见 Mew 等人，J. Immunol. (1983)，130 :1473 ；idem.，Cancer Res. (1985)，45 :4380 ；Oseroff 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) ,83 8744 ；idem. ， Photochem. Photobiol. (1987) ,46 83 ；Hasan 等)κ, Prog. Clin. Biol. Res. (1989)，288 471 ；Tatsuta 等)κ, Lasers Surg. Med. (1989)，9 422 ；Pelegrin 等人，Cancer (1991), 67 :2529。其它有用的治疗剂可包括寡核苷酸，特别是优选导向抗癌基因和癌基因产物例如 bcl-2或p53的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优选形式为siRNA。诊断剂诊断剂优选选自放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记物、化学发光标记物、超声造影剂和光敏试剂。此类诊断剂是公知的并且可使用任何此类已知的诊断齐U。诊断剂的非限定性实例可包括放射性核素例如11IrK111IrKmLiu 18F、5￥e、62CU、64CU、OTCU、
67λλ 68ΛΛ 86v 90v 89v 94mrp 94^ 99mrp 120T 123T 124T 125T 131T 154—158广 j 32n Il0 13Λτ I5r\ 186r)
Ga λ Ga、 Y、 Y、 Zr λ Ic、 Ic、 Ic、丄、丄、丄、丄、 丄、 Gd、 P、 C、 N、 0、 Re、
188Re、51Mn、52mMn、55C0、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr 或其它、、β 或正电子发射体。使用的顺磁离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、铷(III)、钐(III)、 镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。超声造影剂可包括脂质体例如气体填充的脂质体。不透射线的诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。许多种荧光标记物在本领域是已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。使用的化学发光标记物可包括鲁米诺、 异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。治疗性治疗的方法不同的实施方案涉及治疗受试者例如哺乳动物(包括人、驯养或伴侣宠物例如狗和猫)的癌症的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的双特异性免疫细胞因子DNL构建体。在一个实施方案中，可利用本发明的DNL构建体治疗的免疫疾病可包括例如关节疾病例如强直性脊柱炎、幼年型类风湿关节炎、类风湿关节炎；神经疾病例如多发性硬化和重症肌无力；胰腺疾病例如糖尿病，特别是青少年型糖尿病；胃肠道疾病例如慢性活动型肝炎、乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、恶性贫血；皮肤病例如银屑病或硬皮病；变应性疾病例如哮喘和移植相关病症例如移植物抗宿主病和同种异体移植物排斥。可通过同时或相继地施用治疗有效量的另一种抗体(所述抗体结合靶细胞表面上的另一种抗原或与所述抗原反应)来补充双特异性免疫细胞因子DNL构建体的施用。 优选的其它MAb包含至少一种人源化MAb、嵌合MAb或人MAb，其选自与如下物质反应的 MAb :CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、 CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、 CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA, EGP-U EGP-2、碳酸酐酶 IX、PAM4 抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、la、MIF、HMl. 24、HLA-DR、生腱蛋白、 Flt-3、VEGFR、PlGF, ILGF、IL-6、IL-25、生腱蛋白、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、补体因子 C5、癌基因产物或其组合。使用的不同抗体例如抗-CD19、抗-CD20和抗-CD22抗体对于本领域技术人员来说是已知的。参见，例如，Ghetie等人，Cancer Res. 48 :2610 (1988) ；Hekman等人’ Cancer Immunol. Immunother. 32 :364(1991) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 :353(1996), 第 5，798，554 ；6，187，287 ；6，306，393 ；6，676，924 ；7，109，304 ；7，151，164 ；7，230，084 ； 7，230，085 ；7，238，785 ；7，238，786 ；7，282，567 ；7，300，655 ；7，312，318 号美国专禾Ij ；和第 20080131363 ；20080089838 ；20070172920 ；20060193865 ；20060210475 ；20080138333 和 20080146784号美国专利申请公布，将上述每一篇的实施例部分通过引用并入本文。还可通过同时或相继地施用至少一种治疗剂来进一步补充DNL构建体疗法。例如“CVB” (1. 5g/m2环磷酰胺，200-400mg/m2依托泊苷和150_200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非-何杰金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur J. Haematol. 51 18 (1993)。其它适当的联合化学治疗方案对于本领域技术人员来说是公知的。参见，例如，Freedman等人，“Non-Hodgkin' s lymphomas, “ in CANCER MEDICINE，第 2 卷，第 3 版，Holland 等人(编)，第2(^8-2068页(Lea&Febiger 1993)。作为举例说明，用于治疗中度非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴胼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)。有用的第二代化学治疗方案是 m-BAC0D(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸)，而适当的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸)。其它有用的药物包括苯基丁酸盐、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。可按已知方法配制本发明的DNL构建体以制备药学上有用的组合物，由将DNL构建体与药学上适宜的赋形剂组合在混合物中。无菌的磷酸盐缓冲液即为药学上适宜的赋形剂的一个实例。其它适当的赋形剂对本领域技术人员为公知。参见，例如，Ansel等人， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (药物剂型和药物递送系统)， 第 5 版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro (编)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版本。可将本发明的DNL构建体配制用于静脉内施用，通过例如推注注射或连续输注。 优选，在短于约4小时的时期内，更优选短于约3小时的时期内输注DNL构建体。例如， 可在30分钟内，优选甚至15分钟内输注前25-50mg，在随后的2_3小时内输注剩余部分。 注射用制剂可呈单位剂型，例如装在安瓿中，或者装在多剂量容器中并且添加防腐剂。组合物可采用例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配方剂 (formulatory agents)例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，活性成分可呈粉剂形式，用于在使用前用适当的媒介物(例如无菌无热原水)配制。可将其它制药方法用于控制DNL构建体的作用持续时间。控释制剂可通过使用生物相容性聚合物络合或者吸附DNL构建体来实现。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/ Technology 10:1446(1992)。从此基质上释放的速率取决于该DNL构建体的分子量、基质内的DNL构建体的量和分散粒子的大小。Saltzman等人，Biophys. J. 55 163 (1989)； Sierwood等人，同上。其它固体剂型描述于Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (药物剂型和药物递送系统)，第 5 版(Lea&Febiger 1990)， 和 Gennaro (编)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES (雷明顿氏药物科学)，第 18 版 (Mack Publishing Company 1990)，及其修订版本。
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还可将DNL构建体皮下或甚至通过其它胃肠外途径施用至哺乳动物。此外，可通过连续输注或通过单次或多次推注进行施用。优选，在短于约4小时的时期内，更优选在短于约3小时的时期内输注DNL构建体。更常见，用于人的DNL构建体的施用剂量取决于诸如患者年龄、体重、身高、性别、 总体健康状况和先前的治疗历史等因素而变化。可能需要向受者提供约lmg/kg至25mg/ kg范围内的DNL构建体的剂量作为单次静脉内输注，但是也可根据情况需要施用更低或更高的剂量。对于70kg患者按l_20mg/kg施用的剂量例如为70-1，400mg，或对于1. 7米的患者，剂量为41-82%ig/m2。可按需要重复此剂量，例如，每周一次，持续4-10周，或每周一次， 持续8周或每周一次，持续4周。还可以更低的频率给药，例如每隔一周一次，持续数月，或每月一次或每季度一次，持续多月，如维持疗法中所需的。可选择地，以每2或3周一个剂量施用DNL构建体，重复总共至少3个剂量。或者，每周两次施用所述构建体，持续4-6周。如果将剂量减少至约200-300mg/m2 (每个剂量 340mg (对于1. 7米的患者)或4. 9mg/kg (对于70kg的患者)，可每周施用一次或甚至二次， 持续4至10周。可选择地，可减少疗程剂量，即每2或3周一次，持续2-3个月。然而，已确定甚至可以通过缓慢的静脉内输注施用更高的剂量(例如每周一次或每2-3周一次20mg/ kg)，进行重复的给药循环。可以任选地以其它间隔重复给药方案，并且可通过不同胃肠外途径(对剂量和治疗方案进行适当的调整)提供剂量。在优选的实施方案中，DNL构建体用于癌症的治疗。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病、骨髓瘤或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancies)。下文中指出此类癌症的更具体的实例，包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤、Wilms瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌(gastric cancer)或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、肝细胞癌、神经内分泌瘤、 甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、分化的甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌症或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、 肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞还未迁移至除了原始恶性肿瘤或肿瘤的位置外的受试者的身体的位置的恶性细胞或肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，通过恶性细胞或肿瘤细胞至与原始肿瘤的位置不同的继发性位置的转移、迁移产生的恶性细胞或肿瘤)。适合于本发明的治疗方法的癌症包括表达、 过表达或异常表达IGF-IR的细胞。癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于儿童急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphocytic Leukemia)、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓样白血病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非-何杰金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关恶性肿瘤、 直肠癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管的癌症、原发性中枢神经系统淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、脑星形细胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴母细胞白血病(Childhood Acute LymphoblasticLeukemia)、儿童急性髓样白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤(Childhood Cerebellar Astrocytoma)、儿童小脑星形细胞瘤 Childhood Cerebral Astrocytoma) > 儿童颅外生殖细胞肿瘤(Childhood Extracranial Germ Cell Tumors)、儿童何杰金氏病(Childhood Hodgkin' s Disease)、儿童何杰金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童淋巴细胞白血病(Childhood Lymphoblastic Leukemia)、儿童髓母细胞瘤 (Childhood Medulloblastoma)、儿童非-何杰金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌症、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、 卢页夕卜胚细胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺夕卜胚细胞瘤(Extragonadal Germ Cell Tumor)、肝外胆管癌、眼癌、雌性乳腺癌、高歇氏病(Gaucher' s Disease)、胆囊癌、 胃癌、胃肠道类癌(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃肠瘤(Gastrointestinal Tumors)、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症(Hypergammaglobulinemia)、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增殖性疾病(Lymphoproliferative Disorders)、巨球蛋白血症、雄性乳腺癌、恶性间皮瘤 (Maiignant Mesothelioma)、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发性鳞状颈癌(Metastatic Occult Primary Squamous Neck Cancer)、转移性原发性鳞状颈癌 (Metastatic Primary Squamous Neck Cancer)、$f,t生.! (Metastatic Squamous Neck Cancer)、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓性白血病(Myelogenous Leukemia)、髓样白血病(Myeloid Leukemia)、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(Occult Primary Metastatic Squamous Neck Cancer)、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮性癌、卵巢生殖细胞肿瘤、 卵巢低度恶性潜能肿瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、胰腺癌、副蛋白血症(Paraproteinemias)、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary Central Nervous System Lymphoma)、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌(Renal Pelvis and Ureter Cancer)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉状瘤病肉瘤、赛扎里氏综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌(Squamous Neck Cancer)、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional Cell Cancer of the Renal Pelvis and Ureter)、肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional Ren al Pelvis and Ureter Cancer)、滋养细胞月中瘤(Trophoblastic Tumors)、输尿管和肾盂细胞癌(teeter and Renal Pelvis Cell Cancer)、尿道癌、子宫癌、 子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、肾母细胞瘤和任何其它过度增殖性疾病，除新生物形成外，都位于上面所列的器官系统中。
本文中描述的和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶化前状态以及用于阻止至瘤形成状态(neoplastic state)或恶性状态(包括但不限于上述那些障碍)的进展。此类用途适用于已知或怀疑进行至瘤形成或癌症，特别是其中由超常增生、化生 (metaplasia)或最特别地发育不良组成的非瘤形成细胞生长已发生的疾病(关于此类异常生长条件的综述，参见Robbins和Angell,Basic Pathology，第 2版，W. B. Saunders Co.， Philadelphia, pp. 68-79(1976))的进展的状态。发育不良通常是癌症的先兆，并且主要见于上皮中。其为非瘤形成细胞生长的最紊乱形式，包括个体细胞一致性和细胞的构造朝向(architectural orientation) 的损失。当存在慢性刺激或炎症时，发育不良特征性地发生。可被治疗的发育不良障碍包括但不限于无汗性外胚层发育不良(anhidrotic ectodermal dysplasia)、异侧发育不良(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良 (atriodigital dysplasia)、支气管月市发育不良、脑发育不良(cerebral dysplasia)、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不全、先天性外胚叶发育不良、颅骨骨
胃胃胃(craniodiaphysial dysplasia) λΜΙΙεΚ^^^^^ (craniocarpotarsal dysplasia)、卢页骨干飯端发育不全(craniometaphysial dysplasia)、牙本质发育异常(dentin dysplasia)、骨干发育不全(diaphysial dysplasia)、夕卜胚层发育不良(ectodermal dysplasia)、禾由质发育不全(enamel dysplasia)、脑f生目艮球发育不全 (encephalo-ophthalmic dysplasia) λ {β {R!j ^ IS ^ W ^ 良(dysplasia epiphysialis hemimelia)、多发性骨飯发育不良(dysplasia epiphysialis multiplex)、点状骨飯发胃f 良(dysplasia epiphysialis punctata)^ (epithelial dysplasia) Λ
面-指(趾)-生殖器发育不良(faciodigitogenital dysplasia)、家族性颌骨纤维性发育异常(familial fibrous dysplasia of jaws)、家族性白色鮍璧发育异常(familial white folded dysplasia)、肌纤维发育不良(fibromuscular dysplasia)、骨纤维异常增殖症 (fibrous dysplasia of bone)、日王盛骨f生发育不良(florid osseous dysplasia)、j^传f生肾脏-视网膜发育不良(hereditary renal-retinal dysplasia)、出汗性外胚层发育不良 (hidrotic ectodermal dysplasia)、少汗性夕卜胚层发育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia)、淋巴细胞减少性胸腺发育不全(lymphopenic thymic dysplasia)、乳房发育不良(mammary dysplasia)、下颌面发育不良(mandibulofacial dysplasia)、干骨后端发育不良(metaphysial dysplasia)、蒙底尼发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性发育不良(monostotic fibrous dysplasia)、粘膜上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨飯发育不良(multiple epiphysial dysplasia)、目艮-耳-脊椎综合征(oculoauriculovertebral dysplasia)、目艮一牙一才旨(Klh)发育不良(oculodentodigital dysplasia)、目艮椎骨发育不全(oculovertebral dysplasia)、牙体发育异常(odontogenic dysplasia)、opthalmomandibulomelic dysplasia、根尖周牙骨质结构不良(periapical cemental dysplasia)、多骨纤维发育不良(polyostotic fibrous dysplasia)、假性软骨发育不全性脊椎骨飯发育不良(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育不良(retinal dysplasia)、隔-视神经发育不良(s印to-optic dysplasia)、脊椎骨飯发育不全(spondyloepiphysial dysplasia)禾口 ventriculoradial可被治疗的另外的肿瘤前障碍包括但不限于良性过度增生性障碍(例如，良性肿瘤、纤维囊性状态、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道发育不良)、白斑、角化病、鲍温病、农
32民皮肤病(Farmer' s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症特别是上文所列的那些癌症的生长、进展和/或转移。其它过度增殖性疾病、障碍和/或状态包括但不限于恶性肿瘤和相关障碍的进展和/或转移，所述恶性肿瘤和相关障碍是例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞白血病和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌症例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、 结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤(h印atoma)、 胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤((Wilm' s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。表达载体其它实施方案可涉及包含编码DNL构建体的抗体、抗体片段、细胞因子或组成融合蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包括连接至例如AD或DDD部分的抗体或片段或细胞因子。各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。所述载体可包含编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区以及铰链区的序列，可将该序列与嵌合、人源化或人可变区序列连接。所述载体可额外地包含在所选择的宿主细胞中表达编码的蛋白质的启动子、增强子和信号序列或前导序列。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区及铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地将同种异型位置上的氨基酸的至少一个改变成在不同IgGl同种异型中发现的氨基酸，并且其中任选地可用丙氨酸替代基于EU 编号系统的EU的重链的氨基酸253。参见Edelman等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 63 78-85(1969)。在其它实施方案中，可将IgGl序列转变成IgG4序列。本领域技术人员将会了解，基因工程改造表达载体和插入宿主细胞以表达工程蛋白质的方法在本领域是公知的并且只不过是常规实验。已在例如第7，531，327号和第 7，537，930号美国专利(其各自的实施例部分通过引用并入本文)中描述了用于表达克隆的抗体或片段的宿主细胞和方法。试剂盒各种实施方案可涉及含有适合用于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。 示例性试剂盒可包含一种或多种本文中描述的DNL构建体。如果包含施用组分的组合物未制成通过消化道(如通过口服递送)递送，则试剂盒还可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的设备。一种用于施用例如肠胃外递送的设备类型为注射器，其用于将所述组合物注射到受试者体内。也可使用吸入设备。在某些实施方案中，可以以装有无菌液体制剂或冻干制剂的预装注射器或自动注射笔(autoinjection pen)的形式提供治疗剂。所述试剂盒组分可包装在一起或者分开包装在两个或更多个容器中。在某些实施方案中，所述容器可以是包含适合重建(reconstitution)的组合物的无菌、冻干制剂的管形瓶。试剂盒还可包含适用于重建和/或稀释其它试剂的一种或多种缓冲液。其它可使用的容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装并保存在所述容器中。可包括的另一组成部分为给使用试剂盒的人员的使用说明。
实施例下列实施例被提供用以举例说明，但不限定本发明的权利要求。实施例1.用于产生模块Fab亚单位的一般策略Fab模块可制备成包含DDD或AD序列的融合蛋白。为每个Fab融合蛋白开发独立的转基因细胞系。当制备时，如果需要，模块可进行纯化或保存在细胞培养物的上清液中。 制备之后，任何DD&模块与任何AD模块之间可任意组合，以产生三价DNL构建体。质粒载体pdHL2已用于产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等人，J Immunol Methods (1989)，125 :191-202 ；Losman 等人，Cancer (Phila) (1997) ,80 :2660_6。 双顺反子哺乳动物表达载体介导IgG重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列绝大部分都是相同的，仅在可变区(VH和VL)序列存在差异。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化为Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，重链的铰链区、CH2和CH3结构域的编码序列替换为编码所述铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser连接体和人RII α的前44个残基的序列(称为DDD1)。 为了产生Fab-AD表达载体，IgG的铰链区、CH2和CH3结构域的序列替换为编码所述铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser连接体和名为AKAP-IS的17个残基的合成AD的序列 (称为ADl)，该序列系使用生物信息学和肽阵列技术产生，并显示非常高的与RII α 二聚体结合的亲和力(0. 4ηΜ)。参见Alto 等人Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A (2003)，100 4445-50 设计了两个穿梭载体，以利于将IgG_pdHL2载体转化为Fab-DDDl或Fab-ADl表达载体，如下所述。CHl的制备 CHl结构域系使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增获得。左侧PCR引物由 CHl结构域的上游(5’ )和McII限制性核酸内切酶位点(即CHl编码序列的5’ )组成。 右侧引物由编码铰链的前4个残基以及短连接体(最后两个密码子包含Bam HI限制性酶切位点)的序列组成。CHl左侧引物的5’5，GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3，(SEQ ID NO 63)CHl+G^S-Bam 右侧5 ‘ GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3‘ (SEQ ID N0: 64)将410bp PCR扩增引物克隆入pGemT PCR克隆载体(ftOmega，Inc.)，然后筛选克隆以获得T7(5’ )方向的插入物。(G4S)2DDDl 的构建
使用Sigma Genosys (Haverhill,UK)合成双链体寡核苷酸(命名为(QS)2DDDl)， 以编码DDDl的氨基酸序列，所述DDDl前面有连接肽的11个残基，其中前两个密码子包含 Bam HI限制性酶切位点。终止密码予和fegl限制性酶切位点位于3’端。编码的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTFLLQGYTVFVLRQQPPDLVFFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :65)合成两个寡核苷酸(命名为RIIA1-44上和RIIA1-44下，它们的3，端有30个碱基对的重叠)(Sigma Genosys)，并将它们组合在一起以包含174bp DDDl序列的1 个居中碱基对。对寡核苷酸进行退火，然后使用Taq聚合酶进行引物延伸反应。RIIA1-44 上5’ GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGG CTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3，(SEQ ID NO 66)RIIA1-44 下5 ’ GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTC GCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3，(SEQ ID NO 67)引物延伸之后，使用以下引物对所述双链体进行扩增G4S Bam-左5，-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQ ID NO 68)1-44 终 lh Eag 右5，-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3，(SEQ ID NO 69)将此扩增引物克隆入pGemT，然后筛选T7(5’ )方向的插入物。(G4S)2-ADl 的构建合成双链体寡核苷酸(命名为(QS)2-ADl) (Sigma Genosys)，以编码ADl的氨基酸序列，所述ADl前面有连接肽的11个残基，其中前两个密码子包含Bam HI限制性酶切位点。终止密码子和fegl限制性酶切位点位于3’端。编码的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :70)合成两个互补并有重叠的寡核苷酸(命名为AKAP-IS上和AKAP-IS下)。AKAP-IS 上5’ GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGG ACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3’ (SEQ ID NO 71)AKAP-IS 下5’ CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCA CCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3，(SEQ ID NO 72)使用下列引物对所述双链体进行PCR扩增G4S Bam-左5，-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQ ID NO 73)AKAP-IS 终止 Eag 右5，-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3，(SEQ ID NO 74)将此扩增引物克隆至pGemT载体，然后筛选T7 (5’ )方向的插入物。连接DDDl 和 CHl
35
使用BamHI和NotI限制性内切酶将编码DDDl序列的190bp片段从pGemT上切下， 然后将该片段连接至CHl-pGemT的相同位点，以产生穿梭载体CHl-DDDl-pGemT。连接ADl 和 CHl使用BamHI和NotI将含有ADl序列的IlObp片段从pGemT上切下，然后将该片段连接至CHl-pGemT的相同位点，以产生穿梭载体CHl-ADl-pGemT。将CHl-DDDl或CH1-AD1克隆入基于pdHL2的载体使用此模块化设计，CHl-DDDl或CHl-ADl均可包含于pdHL2载体中的任何IgG构建体。通过去除pdHL2的McII/fegl限制性片段(CH1-CH3)，并将其替换为从相应pGemT 穿梭载体上切下的CHl-DDDl或CHl-ADl的McII/fegl片段，整个重链恒定区即替换为上述构建体之一。N-末端DDD结构域DDD或AD的位置并不限于CHl的羧基末端。已改造了其中DDDl序列连接至VH结构域的氨基末端的构建体。实施例2 表达载体h679-Fd-ADl-pdHL2 的构建h679-Fd-ADl-pdHL2是用于产生h679Fab的表达载体，其中ADl通过由14个氨基酸残基组成的柔性Gly/Ser肽间隔区偶联至Fd的CHl结构域的羧基末端。将包含h679的可变区的基于pdHL2的载体的McII/fegl片段替换为CHl-ADl片段(由SacII和fegl从 CH1-AD1-SV3穿梭载体上切下)，该载体即转化为h679-Fd-ADl-pdHL2。C-DDDl-Fd-hMN-14_pdHL2 的构建C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 是用于产生融合蛋白 C_DDDl-Fab-hMN_14 的表达载体， 在所述融合蛋白中，DDDl通过柔性肽间隔区连接至hMN-14 Fab的CHl羧基末端。质粒载体hMN14(I)-pdHL2(已用于产生hMN_14 IgG)通过用SacII和fegl限制性核酸内切酶消化以去除CH1-CH3结构域，然后插入CHl-DDDl片段(由SacII和fegl从CH1-DDD1-SV3穿梭载体上切下)，即转化为C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2。N-DDDl-Fd-hMN-14_pdHL2 的构建N-DDDl-Fd-hMN-14_pdHL2是用于产生包含两个拷贝的融合蛋白 N-DDDl-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体，在所述融合蛋白中，DDDl通过柔性肽间隔区连接至hMN-14Fab的VH的氨基末端。如下对所述表达载体进行改造。使用下面所示的两个引物对DDDl结构域进行PCR扩增。DDDl Nco 左5，CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3，(SEQ ID NO 75)DDDl-G1S Bam 右5’ GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTG-3’ (SEQ ID NO 76)作为PCR的结果，NcoI限制性酶切位点和连接体中包含BamHI限制性酶切位点的部分的编码序列即分别连接至5’和3’末端。将170bp PCR扩增引物克隆至pGemT载体， 然后筛选克隆以获得T7 (5’ )方向的插入物。194bp插入物由NcoI和MlI限制性内切酶从所述PGemT载体上切下，并克隆入所述SV3穿梭载体(使用相同的酶消化制备而成)，以生成中间载体DDDl-SV3。使用下面所示的寡核苷酸引物对hMN_14Fd序列进行PCR扩增。hMN~14VH 左 G4S Bam5，-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3，(SEQ ID NO 77)CHl-C 终丨h Eag5，-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3，(SEQ ID NO 78)作为PCR的结果，BamHI限制性酶切位点和连接体的部分的编码序列即连接到扩增引物的5’端。终止密码子和EagI限制性酶切位点则连接至3’端。将该1043bp扩增引物克隆入pGemT。使用BamHI和EagI限制性内切酶将h丽-14_Fd插入物从pGemT上切下，然后将该插入物连接至DDD1-SV3载体(使用相同的酶消化制备而成)，以产生构建体 N-DDDl-hMN-14Fd-SV3。使用XhoI和EagI限制性内切酶将N-DDDl-hMN_14Fd序列切下，然后将该1. 28kb 插入片段连接至经相同酶消化C-hMN-14-pdHL2制备的载体片段。最终的表达载体即为 N-DDD1-Fd-hMN-14_pDHL2。实施例3. h679-Fab-ADl的产生和纯化679抗体结合HSG靶抗原并且可利用亲和层析进行纯化。h679-Fd_ADl-pdHL2载体用Sail限制性核酸内切酶消化而被线性化，然后通过电穿孔方法转染Sp/EEE骨髓瘤细胞。该双顺反子表达载体介导h679 κ轻链和h679Fd-ADl两者的合成和分泌，它们结合形成h679Fab-ADl。电穿孔之后，用所述细胞涂布96孔组织培养板，并用0. 05 μ M甲氨蝶呤 (MTX)选择转染克隆。使用涂布BSA-IMP-260(HSG)缀合物的微量滴定板通过ELISA筛选克隆的蛋白质表达，并使用缀合HRP的山羊抗人Fab进行检测。将使用HSG(IMP-239)传感器芯片的BIAcore分析用于通过测量获自注射的稀释培养基样品的初始斜率来确定产率。产量最高的克隆具有约为30mg/L的初始产率。使用单步IMP-291亲和层析，从4. 5升转瓶培养物中纯化出总计230mg h679-Fab-ADl。在加至IMP_291_affigel柱之前，培养基用超滤方法浓缩了约10倍。使用PBS将该柱洗脱至基线，然后使用IM咪唑、ImM EDTA、0. IM NaAc, PH 4. 5洗脱h679-Fab-ADl。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存在保留时间(9. 63分钟)对应于50kDa蛋白(未显示)的单一锐峰。在还原SDS-PAGE分析中，仅有代表h679-ADl的多肽组分的两个条带可见(未显示)。实施例4. N-DDD 1-Fab-hMN-14 和 C_DDDl-Fab-hMN_14 的产生和纯化C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 和 N-DDDl-Fd_hMN-14-pdHL2 载体通过电穿孔转染入Sp2/0衍生的骨髓瘤细胞。C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2为双顺反子表达载体，其介导 hMN-14 κ轻链和hMN-14 Fd-DDDl两者的合成和分泌，它们组合形成C-DDDl_hMN_14Fab。 N-DDDl-hMN-14-pdHL2为双顺反子表达载体，其介导hMN-14 κ轻链和N-DDDl-Fd-hMN-14两者的合成和分泌，它们组合形成N-DDDl-Fab-hMN-14。每个融合蛋白均通过DDDl结构域的相互作用形成稳定的同型二聚体。电穿孔之后，用所述细胞涂布96孔组织培养板，并用0. 05 μ M甲氨蝶呤(MTX)选择转染克隆。使用涂布WI2(针对hMN-14的大鼠抗id单克隆抗体)的微量滴定板通过 ELISA筛选克隆的蛋白质表达，并使用缀合HRP的山羊抗人Fab进行检测。产量最高的 C-DDDl-Fab-hMN14 Fab 和 N-DDDl_Fab_hMN14 Fab 克隆的初始产率分别为 60mg/L 和 6mg/L。使用ADl-Affigel 亲和纯化 N-DDD 1-hMN-14 和 C-DDDl_hMN_14使用DDD/AD相互作用对包含DDDl的构建体进行亲和纯化。ADl-C是通过合成制备的由ADI序列和羧基末端半胱氨酸残基组成的肽，所述半胱氨酸残基用于将该肽偶联至Affigel (根据巯基与氯乙酸酐的反应)。包含DDD的a2结构在中性pH下特异性结合 ADl-C-Affigel树脂，并可在低pH(例如，pH 2. 5)下洗脱。使用单步ADl-C亲和层析，从1. 2升转瓶培养物中纯化出总计Slmg C-DDDl-Fab-hMN-14。在加至ADl-C-affigel柱之前，培养基用超滤方法浓缩了约10倍。使用PBS将该柱洗脱至基线，然后使用0. IM甘氨酸、pH 2. 5洗脱C-DDDI-Fab_hMN_14。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存在保留时间(8. 7分钟)与107kDa蛋白(未显示)一致的单一蛋白峰。纯度还经还原SDS-PAGE分析确认，仅显示预期为C-DDD 1-Fab-hMN-14的两个多肽组分的分子大小的两个条带(未显示)。如上所述，使用单步ADI-C亲和层析，从1. 2升转瓶培养物中纯化出总计IOmg N-DDDl-hMN-14。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存在类似于C-DDDl_Fab_hMN-14的保留时间(8. 77分钟)并与107kDa蛋白(未显示)一致的单一蛋白峰。还原SDS-PAGE分析仅显示对应于N-DDD 1-Fab-hMN-14的多肽组分的两个条带(未显示)。 C-DDDl-Fab-hMN-14的结合活性通过样品的SE-HPLC分析确定，在所述样品中，该试验品与不同量的WI2混合。WI2 Fab和C-DDD 1-Fab-hMN-14按0. 75 1的摩尔比混合制成的样品显示三个峰，对应于未结合的C-DDDl-Fab-hMN14(8. 71分钟)、结合一个WI2 Fab 的 C-DDD 1-Fab-hMN-14 (7. 95 分钟)和结合两个 WI2 Fab 的 C-DDDl_Fab_hMN14 (7. 37 分钟) (未显示)。当分析的样品包含的WI2 Fab和C-DDD 1-Fab-hMN-14的摩尔比为4时，仅观察到7. 36分钟的单峰(未显示)。这些结果证明，hMN14-Fab-DDDl为二聚体，并且有两个活性结合位点。使用N-DDDl-Fab-hMN-14重复此实验，得到的结果非常相似。竞争性ELISA 证明，C_DDDl-Fab-hMN_14 和 N_DDDl-Fab-hMN_14 均以和 hMN-14 IgG相似的亲和力与CEA结合，并且亲和力显著强于单价hMN-14 Fab (未显示)。使用包含 hMN-14特异的CEA表位(A3B3)的融合蛋白涂布ELISA平板。实施例5. a2b复合物的形成a2b复合体形成的证据是由包含等摩尔的C-DDDl-Fab-hMN-14 (作为a2)和 h679-Fab-ADl (作为b)的混合物的SE-HPLC分析首先提供的。对此样品进行分析时，观察到保留时间为8. 40分钟的单一峰，这与形成了大于任何单独的h679-Fab-ADl (9. 55分钟)或 C-DDDl-Fab-hMN-14 (8. 73 分钟)的新蛋白一致(未显示)。当 hMN_14F (ab，)2 与h679-Fab-ADl混合，或者C-DDDl-Fab-hMN-14与679_Fab_NEM混合时，均未观察到此高磁场位移，证明相互作用明确地通过DDDl和ADl结构域介导。使用h679-Fab-ADl和 N-DDD 1-Fab-hMN-14获得非常相似的结果(未显示)。使用BIAcore进一步证明和鉴定了 DD1与AD1融合蛋白之间的特异性相互作用。此实验过程如下首先将h679-Fab-ADl或679_Fab_NEM结合到高密度的HSG偶联的 (IMP239)传感器芯片的表面，然后注射C-DDDl-Fab-hMN-14或hMN-14F(ab，)2来进行实验。 如所预期的，当注射后者时，仅有h679-Fab-ADl和C-DDDl-Fab-hMN-14组合造成响应单元的进一步增加(未显示)。使用h679-Fab-ADl与C-DDDl-Fab-hMN-14得到了相似的结果(未显示)ο进行平衡SE-HPLC实验以测定存在于各融合蛋白中的ADl与DDDl之间的特异性相互作用的结合亲和力。发现h679-Fab-ADl与C-DDD 1-Fab_hMN_14、N-DDD 1-hMN-14和重组人RII α的商业样品的结合的解离常数(Kd)分别为15ηΜ、8ηΜ和30ηΜ。实施例6. DDD或AD融合蛋白的亲和纯化通过产生具有更低亲和力停靠的DDD或AD蛋白来开发通用亲和层析系统。由RI α 二聚体形成的DDD以与RII α相比较1/500的亲和力(225ηΜ)结合AKAP-IS (ADl)。因此， 可产生从前44个氨基酸残基形成的RI α 二聚体并且将其偶联至树脂以产生用于纯化任何含ADl的融合蛋白的亲和基质。自然界存在许多较低亲和力(0. 1 μ Μ) AKAP锚定结构域。如果需要，可引入高度可预测的氨基酸替代以进一步降低所述结合亲和力。低亲和力AD可通过合成或生物学方法制备，并可偶联至树脂以用于任何DDDl融合蛋白的亲和纯化。实施例7.用于产生二硫键稳定结构的载体N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2N-DDD2-hMN-14-pdHL2 是用于产生 N-DDD2_Fab-hMN_14 的表达载体，其拥有与 Fd 的氨基末端连接的DDD2的二聚化和停靠结构域序列。DDD2通过15个氨基酸残基的Gly/ Ser肽连接体偶联至Vh结构域。DDD2具有与DDDl的序列相同的二聚化序列和停靠序列， 但是在它们之前具有半胱氨酸残基。如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含DDD2的1_13位残基的重叠的互补寡核苷酸(DDD2上和DDD2下)。将所述寡核苷酸退火，并用T4多核苷酸激酶 (PNK)磷酸化，以在5’和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶NcoI和PstI消化的 DNA连接的悬突。DDD2 上5，CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3，(SEQ ID NO 79)DDD2 下5，GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3，(SEQ ID NO 80)所述双链体DNA与载体片段DDDl_hMN14 Fd_SV3(通过用NcoI和PstI消化制备)连接，以生成中间构建体DDD2-hMN14 Fd_SV3。使用XhoI和EagI限制性核酸内切酶，将包含DDD2-hMN14 Fd编码序列的1. 28kb插入片段从所述中间构建体上切下，然后将该片段连接至使用相同酶消化制备的hMN14-pdHL2载体DNA。最终的表达载体即为 N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。C-DDD2-Fd-hMN-14_pdHL2C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 是用于产生 C-DDD2_Fab-hMN_14 的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体连接至Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和停靠结构域序列。如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含连接体肽的部分的编码序列(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO 81)和DDD2的1_13位残基的重叠的互补寡核苷酸。将所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，以在5’和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶 BamHI和PstI消化的DNA连接的悬突。G4S-DDD2 上
5’ GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCT GCTGCA-3，(SEQ ID NO 82)G4S-DDD2 下5’ GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3 ，(SEQ ID NO 83)所述双链DNA与穿梭载体CHl-DDDl-pGemT (逦过用BamHI和PstI消化制备)连接，以生成穿梭载体CHl-DDD2-pGemT。使用SacII和EagI将507bp片段从 CHl-DDD2-pGemT上切下，然后将该片段连接至使用SacII和EagI消化制备的IgG表达载体 hMN14(I)-pdHL2。最终的表达构建体即为 C-DDD2-Fd-hMN_14-pdHL2。h679-Fd-AD2-pdHL2h679-Fd-AD2_pdHL2是用于产生h679-Fab_AD2的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体连接至CHl的羧基末端的AD2的锚定结构域序列。AD2在ADl 锚定结构域序列的前后各有一个半胱氨酸残基。如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含AD2的编码序列和部分连接体序列的重叠的互补寡核苷酸(AD2上和AD2下)。将所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，在5’和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的
悬天οAD2 上5’ GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAA CGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3’ (SEQ ID NO 84)AD2 下5’ TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACA TCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’ (SEQ ID NO 85)所述双链体DNA与穿梭载体CHl-ADl-pGemT (通过用BamHI和Spel消化制备)连接，以生成穿梭载体CHl-AD2-pGemT。使用SacII和EagI限制性内切酶将包含CHl和AD2 编码序列的429碱基对片段从所述穿梭载体上切下，然后将该片段连接至使用相同酶消化制备的h679-pdHL2载体。最终的表达载体即为h679-Fd_AD2-pdHL2。实施例8. TFl的产生如下进行三价DNL构建体(称为TFl)的大规模制备。首先按照大致的化学计量浓度将 N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白 L-纯化的)与 h679_Fab_AD2 (IMP-291-纯化的)在 ImM EDTA, PBS, pH 7. 4中混合。加入TCEP之前，SE-HPLC未显示出a2b形成的任何证据(未显示)。而是具有代表a4(7. 97 分钟；200kDa)、a2(8. 91 分钟；IOOkDa)和B(10. 01 分钟；50kDa) 的峰。加入5mM TCEP快速导致a2b复合物的形成，与150kDa蛋白一致的、在8. 43分钟的新峰证明了这一点(未显示)。该实验中显然有过量的B，因为对应于h679-Fab-AD2 (9. 72 分钟)的峰仍是明显的，但是对应于a2或a4则未见明显的峰。还原反应1小时后，针对几次更换的PBS进行透析过夜，除去TCEP。所得溶液加入10% DMSO并在室温下保存过夜。当用SE-HPLC分析时，代表a2b的峰明显变尖，保留时间稍微降低了 0. 1分钟，变为8. 31分钟(未显示)，根据我们先前的发现，这表示结合亲和性的提高。该复合物通过 IMP-291亲和层析进一步纯化以除去κ链杂质。如所预期的，过量h679-AD2—起被纯化出
40来，然后用制备型SE-HPLC除去(未显示)。TFl是高度稳定的复合物。当测定TFl与HSG(IMP_239)传感器芯片结合时，在样品注射结束之后所观察的响应未见明显降低，相比之下，当在相似条件下测定含有等摩尔混合物的C-DDD 1-Fab-hMN-14和h679_Fab_ADl的溶液时，在样品注射期间和刚注射完后， 所观察到的响应单元的增加伴随着可检测的下降，表明开始形成的a2b结构不稳定。此外， 尽管随后注射WI2在针对TFl的响应单元中引起大幅度的增加，但是对于C-DDD1/AD1混合物来说没有明显增加。因WI2与固定在传感器芯片上的TFl结合而导致的响应单元的额外增加，对应于两个完整的功能性结合位点，其各自是由N-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基引起的。TFl与 WI2的两个Fab片段的结合能力证实了这一点(未显示)。在含有h679-AD2和N-DDDl-hMN14 的混合物被正确还原和氧化成为TFl后，当用BIAcore分析时，WI2几乎没有额外结合(未显示)，表明二硫键稳定的a2b复合物(例如TFl)仅通过DDD2与AD2的相互作用而形成。对该过程进行了两个改进，以减少过程的时间和效率。首先，以a4/a2结构混合物形式存在的稍微摩尔过量的N-DDD2-Fab-hMN-14与h679_Fab_AD2反应，使得没有游离的 h679-Fab-AD2存在，而未束缚至h679_Fab_AD2的任何a4/a2结构以及轻链，都用IMP-291 亲和层析除去。第二，疏水作用层析(HIC)代替透析或渗滤，在还原反应后用于除去TCEP， 这不仅缩短过程时间，而且还增加了潜在病毒的去除步骤。将N-DDD2-Fab-hMN-14与 679-Fab-AD2混合，用5mM TCEP在室温下还原1小时。向溶液加入0. 75M硫酸铵，然后上样到Butyl FF HIC柱上。用含0. 75M硫酸铵、5mM EDTA的PBS洗柱，以除去TCEP。用PBS 从HIC柱上洗脱还原蛋白，加入10% DMS0。在室温下孵育过夜后，用IMP-291亲和层析分离出高度纯化的TFl (图22)。无需额外的纯化步骤，例如凝胶过滤。实施例9. TF2的产生成功产生TF 1之后，将C-DDD2-Fab-hMN-14与h679_Fab_AD2反应，也得到一种类似物，称为TF2。如下产生具有超过90%的收率的试验批量的TF2。将蛋白L-纯化的 C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与 h679-Fab-AD2(60mg)以 1. 4 1 的摩尔比混合。在含有 ImM EDTA的PBS中，总蛋白质浓度为1. 5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC层析、DMSO 氧化和IMP-291亲和层析，都与针对TFl所述的相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未显示出 a2b形成的任何证据(未显示)。而是存在对应于a4(8. 40分钟；215kDa)、a2(9. 32分钟； 107kDa)和b (10. 33分钟；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速导致a2b复合物的形成，正如在8. 77分钟的新峰所证明的那样(未显示)，该峰与二元结构所预期的157kDa蛋白是一致的。用IMP-291亲和层析将TF2纯化至接近均质(未显示)。对IMP-291未结合级分进行的SE-HPLC分析证明从产物中除去了 a4、a2和游离κ链(未显示)。按照对于TFl所述的利用BIAC0RE测定TF2的功能。将TF2、 C-DDDl-hMN-14+h679-ADl (用作非共价a2b复合物的对照样品)或 C-DDD2-hMN-14+h679-AD2 (用作非还原a2和b组分的对照样品)稀释至1 μ g/ml (总蛋白质)并且通过固定了 HSG的传感器芯片。对TF2的响应是两个对照样品反应的约2倍，表明对照样品中仅有h679-Fab-AD组分与传感器芯片结合并保留在其上。随后注射WI2IgG， 证明仅有TF2具有与h679-Fab-AD紧密结合的DDD-Fab-hMN_14组分，正如额外的信号响应所示。因WI2与固定在传感器芯片上的TF2结合而导致的响应单元增加，也对应于两个完整的功能性结合位点，每个都是由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基引起。TF2与WI2的两个 Fab片段的结合能力证实了这一点(未显示)。通过竞争性ELISA测定TF2的相对CEA-结合亲合力。用含有CEA的A3B3结构域的融合蛋白包被各板(0. 5 μ g/孔)，所述蛋白被hMN-14识别。连续稀释TFl、TF2和 hMN-14IgG，一式四份，在含有缀合HRP的hMN-14IgG(lnM)的孔中温育。数据显示TF2以与 IgG的亲合力至少相等的亲合力结合CEA，比TFl强2倍(未显示)。实施例10. TFl和TF2的血清稳定性将TFl和TF2设计成可用于体内的稳定束缚结构，其中在血液和组织中会发生大量稀释。用BIAC0RE评估人血清中TF2的稳定性。将TF2用新鲜人血清(是从4个供体合并而获得的)稀释至0. lmg/ml并在5% C02、37°C温育7天。每天样品按1 25进行稀释， 然后通过BIAC0RE进行分析，使用IMP-239HSG传感器芯片。注射WI2IgG，用于定量测定完整而完全活性的TF2的量。将血清样品与直接从原液稀释的对照样品相比较。TF2在血清中高度稳定，7天后保持98%的其双特异性结合活性(未显示)。在人或小鼠血清中对于 TFl观察到相似的结果(未显示)。实施例11. C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体的产生pdHL2哺乳动物表达载体已被用于介导许多重组IgG的表达(Qu等人， Methods 2005,36:84-95)。产生质粒穿梭载体以利于将任何IgG_pdHL2载体转化为 C-H-AD2-IgG-pdHL2载体。使用pdHL2载体作为模板以及寡核苷酸Fc BglII左和Fc Bam-EcoRI右作为引物扩增Fc (CH2和CH3结构域)的基因。Fc BrIII 左5，-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3，(SEQ ID NO 86)Fc Bam-EcoRI 右5，-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3，(SEQ ID NO 87)将扩增引物克隆入pGemT PCR克隆载体。使用XbaI和BamHI限制性内切酶从 PGemT切下Fc插入物片段，然后将其连接至用XbaI和BamHI消化h679-Fab_AD2-pdHL2而制备的AD2-pdHL2载体，以产生穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。为了将任何IgG_pdHL2表达载体转化成C-H-AD2_IgG-pdHL2表达载体，从前者切下861bp BsrGI/Ndel限制性片段，将其替换为从Fc_AD2-pdHL2载体切下的952bp BsrGI/ NdeI限制性片段。BsrGI在CH3结构域内切割并且NdeI在表达盒的下游(3，)切割。实施例12. C-H-AD2-hLL2 IgG 的产生依帕珠单抗(或hLL2 IgG)是人源化抗-人⑶22 MAb。如实施例11中所述的， 从hLL2 IgG-pdHL2产生C_H-AD2_hLL2 IgG的表达载体，通过电穿孔将其用于转染Sp2/0 骨髓瘤细胞。转染后，用所述细胞涂布96孔板，在含有甲氨蝶呤的培养基中选择转基因克隆。通过使用涂布hLL2-特异性抗-独特型MAb的微量滴定板的夹心ELISA以及缀合过氧化物酶的抗-人IgG的检测筛选克隆的C-H-AD2-hLL2 IgG产率。将克隆扩增至转瓶以制备蛋白质，并在使用蛋白质-A亲和层析的单步骤中从耗尽的培养基纯化C-H-AD2-hLL2 IgG。SE-HPLC分析对两个蛋白峰进行解析(未显示)。慢洗脱峰的保留时间(8. 63分钟) 与hLL2 IgG相似。快洗脱峰的保留时间(7. 75分钟)对应于约300kDa蛋白质。后来确定此峰代表C-H-AD2-hLL2-IgG的二硫键连接二聚体。此二聚体在DNL反应中被还原为单体形式。SDS-PAGE分析表明，纯化的C-H-AD2-hLL2-IgG由模块的两种单体和二硫键连接的二聚体形式组成(未显示)。代表这两种形式的蛋白质条带在非还原性条件下的SDS-PAGE中清晰可见，但是在还原条件下，所有形式均被还原为代表组成性多肽(重链-AD2和κ链) 的两个条带(未显示)。未检测到其它污染条带。实施例13. C-H-AD2-hA20IgG 的产生hA20IgG为人源化抗人CD20MAb。按实施例27所述，从hA20IgG_pDHL2产生 C-H-AD2-hA20 IgG的表达载体，然后将该载体通过电穿孔转染Sp2/0骨髓瘤细胞。转染之后，用所述细胞涂布96孔板，并在包含甲氨蝶呤的培养基上筛选转基因克隆。通过使用涂布hA20特异性抗独特型MAb的96孔微量滴定板的夹心ELISA以及使用缀合过氧化物酶的抗人IgG的检测筛选克隆的C-H-AD2-hA20 IgG产率。将克隆扩增至转瓶以制备蛋白质，并在使用蛋白质-A亲和层析的单步骤中从耗尽的培养基纯化C-H-AD2-hA20 IgG, SE-HPLC和 SDS-PAGE分析得到的结果与实施例28中获得的C_H-AD2_hLL2 IgG的结果非常相似。实施例14. AD-和DDD-连接的来自多个抗体的Fab与IgG融合蛋白的产生通过使用前述实施例中描述的技术，构建下列IgG或Fab融合蛋白，并将其整合入 DNL构建体。所述融合蛋白保持亲代抗体的抗原结合特征并且DNL构建体显示被整合的抗体或抗体片段的抗原结合活性。表2.包含IgG或Fab部分的融合蛋白
融合蛋白结合特异性
C-AD1-Fab-h679HSG
C-AD2-Fab-h679HSG
C-(AD2)2-Fab-H679 HSG C-AD2-IgG-h734铟-DTPA
C-AD2-IgG-hA20CD20
C-AD2-IgG-hA20LCD20
C-AD2-IgG-h L243 HLA-DR C-AD2-IgG-hLL2CD22
N-AD2-IgG-hLL2CD22
C-AD2-IgG-hMN-14 CEA C-AD2-IgG-hRlIGF-IR
C-AD2-IgG-hRS7EGP-I
4权利要求
1.一种包含3种不同效应物部分的DNL (停靠和加锁)构建体，其中所述效应物部分被连接至两个来自蛋白激酶A(PKA)的DDD (二聚化和停靠结构域)部分和一个来自AKAP蛋白的AD (锚定结构域)部分，以及其中所述两个DDD部分形成二聚体并且与AD部分结合以形成DNL构建体。
2.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述DDD部分具有来自人RIα、RI β、RII α或 RII β PKA的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述效应物部分包含第一抗体或抗体片段、第二抗体或抗体片段以及一个或多个拷贝的细胞因子。
4.权利要求3所述的DNL构建体，其中所述第一抗体或抗体片段和第二抗体或抗体片段结合两种不同的抗原。
5.权利要求4所述的DNL构建体，其中所述第一和第二抗体或抗体片段结合抗原，所述抗原选自碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、 CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、 CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、 CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的 ED-B、因子 H、FHL-I、Flt_3、叶酸受体、GROB、HMGB-I、缺氧诱导因子(HIF)、HM1. 24、胰岛素样生长因子-I(ILGF-I)、IFN-γ、IFN-α、IFN_3、IL_2、 IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、 IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP-lA、MIP-lB、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、NCA-95、NCA-90、la、HMl. 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、TlOl、 TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL 受体(Rl 和 R2)、 VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子 C3、C3a、C3b、C5a、C5 和癌基因产物。
6.权利要求5所述的DNL构建体，其中所述第一和第二抗体或抗体片段选自 hRl (抗-IGF-1R)、hPAM4 (抗-粘蛋白)、hA20 (抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、 hIMMU31 (抗-AFP)、hLLl(抗-CD74)、hLL2 (抗-CD22)、hMu_9 (抗-CSAp)、 hL243 (抗-HLA-DR)、hMN-14 (抗-CEACAM5)、hMN-15 (抗-CEACAM6)、hRS7 (抗-EGP-1)禾口 hMN-3(抗-CEACAM6)。
7.权利要求4所述的DNL构建体，其中所述细胞因子选自人MIF(巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-I (高迁移率族框蛋白 1)、TNF-α、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6, IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15, IL-16、IL-17, IL-18, IL-19、IL-23、IL-24、 CCL19、CCL21、IL-8、MCP-l、RANTES、MIP-lA、MIP-lB、ENA-78、MCP-l、IP-10、Gro-3、嗜酸细胞活化趋化因子、干扰素-α、-β、_λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、 因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。
8.权利要求4所述的DNL构建体，其中所述第一抗体或抗体片段是veltuzumab，所述第二抗体或抗体片段是hLM3，并且所述细胞因子是人干扰素-α 2b。
9.权利要求8所述的DNL构建体，其中所述hL243抗体或抗体片段包含重链 CDR 序列 CDRl (NYGMN, SEQ ID NO 1)、CDR2 (WINTYTREPTYADDFKG，SEQ ID NO 2)禾口 CDR3 (DITAVVPTGFDY，SEQ ID NO 3)以及轻链 CDR 序列 CDRl (RASENIYSNLA, SEQ ID NO 4)、CDR2 (AASNLAD, SEQ ID NO 5)和 CDR3(QHFWTTPWA, SEQ ID NO 6)。
10.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述3种效应物部分是融合蛋白，每一种融合蛋白包含AD或DDD部分。
11.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述效应物部分选自蛋白质、肽、抗体、抗原结合抗体、免疫调节剂、细胞因子、激素、酶、反义寡核苷酸、siRNA、毒素、核糖核酸酶、异源抗原、聚乙二醇(PEG)、抗-血管生成剂、细胞毒素剂和促细胞凋亡剂。
12.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述DDD部分具有SEQID NO :13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO :18 的氨基酸序列、SEQ ID NO :20 的前 44 个氨基酸、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22 或 SEQ ID NO :59 的前 44 个氨基酸。
13.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述AD部分具有SEQID NO 15, SEQ ID N0: 16、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、 SEQ ID NO 39,SEQ ID NO40,SEQ ID N0:41、SEQ ID NO 42,SEQ ID NO43,SEQ ID N0: 44,SEQ ID NO 45,SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO :48、M SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO 58 的氨基酸序列。
14.一种给受试者施用细胞因子的方法，包括给受试者施用根据权利要求4的DNL复合物。
15.权利要求14所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段结合抗原，所述抗原选自碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CDl、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDllA、CD14、 CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、 CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、 CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5, CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-I、Flt_3、叶酸受体、GROB、HMGB-I、缺氧诱导因子(HIF)、HMl. 24、胰岛素样生长因子-1 (ILGF-I)、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、 IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、 IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、 NCA-9 5、NCA-90、I a、HM1 · 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL 受体(Rl 和 R2)、VEGFR、 EGFR、P1GF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
16.权利要求15所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段选自 hRl (抗-IGF-1R) hPAM4(抗-粘蛋白)、hA20 (抗-CD20)、hA19(抗-CD19), hIMMU31 (抗-AFP)、hLLl(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、hMu_9 (抗-CSAp)、 hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEA)、hMN-15 (抗-CEA)、hRS7 (抗-EGP-1)禾口 hMN-3(抗-CEA)。
17.权利要求14所述的方法，其中所述细胞因子选自人MIF(巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-I (高迁移率族框蛋白 1)、TNF-α、IL-U IL-2, IL-3、IL-4、IL-5、IL-6, IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15, IL-16、IL-17, IL-18, IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-l、RANTES、MIP-lA、MIP-lB、ENA-78、MCP-l、IP-10、Gro-3、嗜酸细胞活化趋化因子、干扰素-α、-β、_λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、 因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。
18.权利要求14所述的方法，其中所述第一抗体或抗体片段是veltuzumab，所述第二抗体或抗体片段是hLM3，并且所述细胞因子是人干扰素-α 2b。
19.一种治疗选自癌症、免疫功能失调和自身免疫性疾病的疾病的方法，包括给患有所述疾病的受试者施用根据权利要求1的DNL构建体。
20.权利要求19所述的方法，其中所述癌症选自非何杰金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B 细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、急性淋巴样白血病、慢性淋巴样白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、多毛细胞白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、口腔癌、胃肠道癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌症、宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌和睾丸癌。
21.权利要求19所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后的肾炎、结节性红斑、高安(氏)动脉炎、艾迪生病、类风湿性关节炎、多发性硬化、 结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊椎炎、古德帕斯丘综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、 甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病或纤维性肺泡炎。
22.权利要求19所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段结合抗原，所述抗原选自碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CDl、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDllA、CD14、 CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、 CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、 CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA, CEACAM5, CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-I、Flt_3、叶酸受体、GROB、HMGB-I、缺氧诱导因子(HIF)、HMl. 24、胰岛素样生长因子-1 (ILGF-I)、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、 IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、 IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、 NCA-9 5、NCA-90、I a、HM1 · 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TNF- α、TRAIL 受体(Rl 和 R2)、VEGFR、 EGFR、P1GF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
23.权利要求19所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段选自 hRl (抗-IGF-1R) hPAM4(抗-粘蛋白)、hA20 (抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、 hIMMU31 (抗-AFP)、hLLl(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、hMu_9 (抗-CSAp)、 hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEA)、hMN-15 (抗-CEA)、hRS7 (抗-EGP-1)禾口hMN-3(抗-CEA)。
24.权利要求19所述的方法，其中所述细胞因子选自人MIF(巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-I (高迁移率族框蛋白 1)、TNF-α、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、 CCL19、CCL21、IL-8、MCP-l、RANTES、MIP-lA、MIP-lB、ENA-78、MCP-l、IP-10、Gro-3、嗜酸细胞活化趋化因子、干扰素-α、-β、_λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、 因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。
25.权利要求19所述的方法，其中第一抗体或抗体片段是veltuzumab，所述第二抗体或抗体片段是hLM3，并且所述细胞因子是人干扰素-α 2b。
全文摘要
本发明涉及使用停靠-和-加锁技术形成细胞因子-抗体复合物的方法和组合物。在优选的实施方案中，双特异性免疫细胞因子DNL构建体包含连接至Fab抗体片段和细胞因子的IgG抗体，其中IgG和Fab结合可在相同靶细胞上表达的不同靶抗原。双特异性免疫细胞因子DNL构建体与单独的细胞因子、单独的抗体、未缀合的细胞因子+抗体或甚至其它类型的细胞因子-抗体DNL构建体相比较显示提高的药代动力学、具有更长的血清半衰期和显著更强的效力。在最优选的实施方案中，所述构建体包含缀合至抗HLA-DR Fab和IFNα2b的抗CD20 IgG抗体，虽然抗体、抗体片段和细胞因子的其它组合可用于形成所述本发明的DNL复合物。
文档编号A61K39/00GK102481348SQ201080038548
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月27日 优先权日2009年8月31日
发明者C-H·张, D·M·戈登堡 申请人:Ibc药品公司