通过施用针对降钙素基因相关肽的拮抗性抗体来治疗内脏痛的方法

专利名称：通过施用针对降钙素基因相关肽的拮抗性抗体来治疗内脏痛的方法
技术领域：
本发明涉及使用抗CGRP抗体来治疗和/或预防内脏痛和/或内脏痛症状的方法，并涉及用于预防和/或治疗内脏痛和/或内脏痛症状的抗CGRP抗体。
背景技术：
内脏痛是患者就诊的主要原因，但对内脏痛的有效治疗十分有限。内脏痛在临床上很难处理，经常需要使用麻醉药。尽管麻醉药被广泛使用，但其严重的剂量限制性不良反应常常导致其功效降低。此外，麻醉药还具有被滥用和成瘾性的危险，并可引起便秘和其他不良反应，这些情况对于很多病例而言是禁忌并可降低生活质量。内脏痛是与内脏相关的疼痛，内脏是指肌体的内部器官，这些器官包括，例如，心脏、肺、生殖器官、膀胱、子宮、消化器官、肝脏、胰腺、脾和肾脏。可以出现内脏痛的情况多种多祥，例如，胰腺炎、分娩(labor)、与肠梗阻有关的腹部手术、膀胱炎、月经期或痛经。类似地，肾脏痛、上腹痛、胸膜痛、胆绞痛以及阑尾炎痛均可以认为是内脏痛。早期心肌梗死的胸骨后疼痛和压榨感也是内脏痛。胃、十二指肠或结肠的疾病可引起内脏痛。引起内脏痛的常见胃肠道(GI)疾病包括功能性肠紊乱(FBD)和炎性肠病(IBD)。这些GI疾病包括目前尚不能完全控制的多种疾病状态，就FBD而言，包括胃食管反流、消化不良、肠易激综合征(IBS)和功能性腹痛综合征(FAPS)，就IBD而言，包括克罗恩病、回肠炎和溃疡性结肠炎，它们均经常引起内脏痛。全世界的成人和青少年中有10-20 %有IBS(Longstreth et al. ,2006,Gastroenterology 130(5) :1480-91)。这些患者就诊的首要原因是慢性内脏痛,其原因被认为是内脏敏感性增强(Aziz, 2006, Gastroenterology 131(2) :661-4)。已经发现IBS患者对结直肠扩张具有较低的内脏感觉阈值，而这与内脏痛症状高度相关(Delafoyet al，2006，Gut 55(7) :940-5)。对以三硝基苯磺酸(TNBS)诱导结肠炎的大鼠进行结直肠扩张是许多研究者在探讨内脏过度敏感机制时所使用的动物模型(Gay et al，2006，Neuroimmunomodulation 23 ； 13 (2) :114-121 ；Delafoy et al, 2006 ；Adam et al. ,2006,Pain 123(1-2) :179-86)。
间质性膀胱炎(Interstitial cystitis, IC)是ー种痛性膀胱综合征，临床特征为尿急、尿频和慢性盆腔痛。临床研究表明，这涉及内脏感觉传入神经过度敏感，患者在膀胱充盈度低于正常体积时便有膀胱充盈感，说明膀胱粘膜下神经密度増加，并有神经性炎症，膀胱的充盈产生疼痛感。IC的组织学检查提示内脏传入神经的參与。内脏痛的产生可以是对例如炎症、扩张或压カ增加的反应。它并不总是由内脏损伤引起。此外，内脏痛是弥漫性的，可以有其他部位的牵涉痛；并可以与其他自主性或运动反射相关联(例如，恶心、肾绞痛引起的腰背部肌肉紧张)(Lancet 1999，353，2145-48)。CGRP (降钙素基因相关肽)是37个氨基酸的神经肽，属于包括降钙素、肾上腺髓质素和糊精等在内的肽家族。在人类，存在两种形式的CGRP (a-CGRP和0-CGRP)，它们具有相似的活性。它们之间有3个氨基酸不同，并具有不同的分布。至少有两种CGRP受体亚型，这也可能是不同活性的原因。CGRP是中枢神经系统的神经递质，在外周发现其是强效的血管舒张剂，其中含CGRP的神经兀过程(CGRP-containing neuronal processes)与血管密切相关。CGRP介导的血管舒张还与神经性炎症相关，是导致血浆外渗和微血管舒张的级联事件中的一部分，并且也见于偏头痛。
已经发现，可采用椎管内施用小分子选择性CGRP拮抗剂来治疗神经性和伤害性疼痛病症(Adwanikar et al, Pain, 2007,132 (1-2) :53-66)，这提示去除脊髓中的内源性CGRP信号途径具有镇痛效应。一些报道发现，阻断CGRP信号途径对于通过全身注射CGRP8-37——ー种CGRP受体拮抗剂——来逆转内脏过度敏感(VH)是有效的(Delafoy et al.，2006 ；Plourde et al.,1997,Am J Physiol. 273(I Pt I) :G191_6 ;Julia and Bueno,1997,Am J Physiol. 272 (IPt I) :G141_6)。不过，CGRP 8-37的体内半衰期很短，因此不会是ー种有用的治疗剂。因此，临床上亟需鉴定到用于治疗和预防内脏痛的新的治疗剂。本申请中引用了多种出版物(包括专利和专利申请)。通过引用将这些出版物的全部内容并入本申请。

发明内容
本发明提供预防和/或治疗个体的内脏痛和/或内脏痛症状的方法，所述方法包括给患有内脏痛或具有发生内脏痛的风险的个体施用治疗有效量的抗CGRP拮抗性抗体。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体在外周施用。在其他实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体通过ロ服、舌下、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、关节内、关节周围、局部和/或肌肉内施用。在一些实施方式中，所述内脏痛与功能性肠紊乱(FBD)相关。FBD可以是胃食管反流、消化不良、肠易激综合征(IBS)和功能性腹痛综合征(FAPS)。在一些实施方式中，所述内脏痛与炎性肠病(IBD)相关。IBD可以是克罗恩病、回肠炎或溃疡性结肠炎。在ー些实施方式中，所述内脏痛与肾绞痛、痛经、膀胱炎、月经期、分娩、绝经期、前列腺炎或胰腺炎相关。在一些实施方式中，所述内脏痛与间质性膀胱炎(IC)相关。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体结合CGRP ;阻断CGRP与其受体结合；阻断或降低CGRP受体活化；抑制、阻断、阻抑或降低CGRP的生物学活性；增加CGRP的清除；和/或抑制CGRP的合成、产生或释放。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体能以50nM或更低的KD结合CGRP (通过表面等离子共振在37°C测定和/或具有至少7天的体内半衰期)。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体特异性结合CGRP的C端区域。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体特异性识别序列GSKAF(SEQ ID NO 39)所限定的表位。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含VH结构域，该VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO 1或19具有至少90%的相同性。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含VL结构域，该VL结构域的氨基酸序列与具有至少90%的相同性SEQ ID NO :2或20。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体还包含VH结构域，该VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :1或19具有至少90%的相同性。在其他实施方式中，所述抗CGRP抗体包含至少ー种⑶R，所述⑶R选自以下ー组 (a) SEQ ID NO :3、21、33、34、36 或 37 所示的 CDR Hl ； (b) SEQ ID NO :4、22、35 或 38 所示的CDR H2 ； (c) SEQ ID NO 5 或 23 所示的 CDR H3 ； (d) SEQ ID NO 6 或 24 所示的 CDR LI ； (e)SEQ ID NO 7 或 25 所示的 CDR L2 ； (f) SEQ ID NO 8 或 26 所示的 CDR L3 ;和(g)Ll、L2 和H2的变体。在一些实施方式中，所述抗CGRP抗体包含SEQ ID NO : 11所示的抗体Gl重链全抗体氨基酸序列，具有或不具有C端赖氨酸。在一些实施方式中，所述抗CGRP抗体包含SEQID NO 12所示的抗体Gl轻链全抗体氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗CGRP抗体包含SEQ ID NO : 11所示的抗体Gl重链全抗体氨基酸序列，具有或不具有C端赖氨酸；和SEQID NO 12所示的抗体Gl轻链全抗体氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗CGRP抗体包含SEQ ID NO : 29所示的抗体G2重链全抗体氨基酸序列，具有或不具有C端赖氨酸。在一些实施方式中，所述抗CGRP抗体包含SEQID NO 30所示的抗体G2轻链全抗体氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗CGRP抗体包含SEQ ID NO :29所示的抗体G2重链全抗体氨基酸序列和SEQ ID NO :30所示的抗体G2轻链全抗体氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO 1具有至少90%的相同性，该VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :2具有至少90%的相同性。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含由ATCC登记号为PTA-6867的表达载体产生的重链。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含由ATCC登记号为PTA-6866的表达载体产生的轻链。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体由ATCC登记号为PTA-6867和PTA-6866的表达载体产生。在一些实施方式中，所述抗CGRP通过皮下或静脉每月施用I、2、3或4次。在ー些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体的施用浓度在5至100mg/ml之间。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体的施用浓度在I至100mg/kg体重之间。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体不引起运动协调或注意力的CNS损害。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体不通过中枢、椎管内或气管内施用。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体不是中枢、椎管内或气管内穿透分子。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体与一或多种其他药理学活性化合物相组合地分开、依次或同时施用。在一些实施方式中，所述ー或多种其他药理学活性化合物选自阿片类镇痛药，例如吗啡、海洛因、氢吗啡酮、羟吗啡酮、左啡诺、左洛啡烷、美沙酮、哌替啶、芬太尼、可卡因、可待因、双氢可待因、羟考酮、氢可酮、丙氧芬、纳美芬、烯丙吗啡、纳洛酮、纳曲酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡或喷他佐辛；非留体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸、地夫美多、依托度酸、芬布芬、非诺洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀或佐美酸、或它们的药用可接受的盐；巴比妥酸盐镇静药，例如异戊巴比妥、阿普比妥、仲丁巴比妥、布他比妥(butabital)、甲苯比妥、美沙比妥、美索比妥、戊巴比妥、苯巴比通(phenobartital)、司可巴比妥、他布比妥、theamylal或硫喷妥钠或它们的药用可接受的盐；具有镇静作用的苯ニ氮卓类，例如氯氮卓、氯拉卓酸、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮或三唑仑或它们的药用可接受的盐；具有镇静作用的Hl拮抗剂，例如苯海拉明、吡拉明、异丙嗪、氯苯那敏或氯环利嗪或它们的药用可接受的盐；镇静剂例如苯こ哌啶酮、甲丙氨酷、甲喹酮或氯醛比林或它们的药用可接受的盐；骨骼肌松弛药，例如巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、环苯扎林、美索巴莫或orphrenadine或它们的药用可接受的盐；NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬((+)-3-羟基-N-甲基吗啡)或其代谢 物右非烧((+)-3-轻基-N-甲基吗非)、氯胺酮、美金刚、卩比咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone)或顺_4_(膦酰基甲基)-2_哌啶羧酸或它们的药用可接受的盐；a _肾上腺素能药物，例如多沙唑嗪、坦洛新、可乐定或4-amino_6, 7_dimethoxy-2-(5-methanesulfonamido-1,2,3,4-tetrahydroisoquinol-2-yl)-5-(2-pyridyl)quinazoline ;三环 in 忧郁药，例如地昔帕明、丙咪嗪、amytriptiline或去甲替林；抗惊厥药，例如卡马西平或丙戊酸盐；速激肽(NK)拮抗剂，特别是NK-3、NK-2或NK-I拮抗剂，例如(a R，9R) _7_[3，5-bis(trifluoromethy丄ノ benzyl]_8，9，10，Il_tetrahydro_9_methyl_5_(4-methylphenyI)-7H-[I,4]diazocino[2,1-g][I,7]naphthridine-6-13-dione (TAK-637)、5_[[(2R,3S)-2-[(IR)-I-[3,5-bis(trifluoromethyI)phenyl]ethoxy-3-(4-fluorophenyI)-4_morpholinyl]methyl]-I, 2-dihydro-3H_l, 2,4-triazol-3_one (MK-869)、拉奈匹坦、达匹坦或3-[[2-methoxy-5-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]-2-phenyl-piperidine(2S,3S);毒蕈碱拮抗剂,例如oxybutin、托特罗定、丙哌维林、tropsium chloride或达非那新；C0X-2抑制剂，例如塞来昔布、罗非昔布或伐地考昔；非选择性COX抑制剂(优选地具有GI保护作用)，例如硝基氟卩比洛芬(HCT-1026);煤焦油止痛剂(coal-tar analgesic),特别是扑热息痛；精神安定药例如氟哌利多；辣椒素受体激动剂(例如resinferatoxin)或拮抗剂(例如辣椒素受体阻断剂)；P -肾上腺素能药物例如普萘洛尔；局麻药，例如美西律；皮质类固醇，例如地塞米松；血清素受体激动剂或拮抗剂；胆碱能(烟碱)止痛剂；曲马多(Tramadol ) ；PDEV抑制剂,例如西地那非、伐地那非或taladafil ； a -2- 6配体例如加巴喷丁或普瑞巴林；以及大麻素(canabinoid)。本发明还提供抗CGRP拮抗性抗体在制备用于预防和/或治疗内脏痛和/或内脏痛症状的药物中的用途。在一些实施方式中，所述药物被制备为用于外周施用。在ー些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体施用后在外周起作用。本发明还提供治疗和/或预防个体的内脏痛和/或内脏痛症状的药物组合物，其包含抗CGRP拮抗性抗体和药用可接受的载体。在一些实施方式中，所述组合物被制备为用于外周施用。
本发明还提供试剂盒，其包含用于治疗和/或预防个体的内脏痛和/或内脏痛症状药物组合物，以及用于给个体外周施用治疗有效量的所述药物组合物以治疗和/或预防内脏痛和/或内脏痛症状的说明书。附图简述图IA和图IB显示的是内脏痛模型。(A)动物在进行剖腹术后注射三硝基苯磺酸(TNBS)，再给这些动物静脉施用抗体4901( “4901”)或PBS对照(“载体”)。采用球囊扩张法测试动物的内脏痛阈值。痛阈以mm Hg显示(y轴)。假处理(Sham)代表剖腹术后注射对照物(30%乙醇)溶液而非TNBS的动物。(B)给剖腹术后以TNBS处理的动物静脉施用CGRP受体拮抗剂CGRP 8-37或PBS对照(“载体”)。与(A) —样，采用球囊扩张法测试动物的内脏痛阈值，痛阈以mm Hg显示(y轴)。
图2显示的是内脏痛模型。给动物静脉施用抗体4901 (“4901”)或PBS对照(“载体”)。在松节油诱导膀胱炎后I小时、3小时和5小时测试膀胱的运动性，以收缩次数(y轴)来测量。发明详述本发明提供通过给个体施用治疗有效量的抗CGRP拮抗性抗体来治疗和/或预防个体的内脏痛的方法。本发明还提供抗CGRP拮抗性抗体和衍生自W02007/054809表6所示的Gl或其变体的多肽，通过引用将W02007/054809的全部内容并入本申请。本发明还提供制备和使用这些抗体和多肽的方法。通用技术除非另有说明，本发明的实施可使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都是本领域人员已知的。此类技术在文献中有完善的解释，例如参见Molecular Cloning A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al. ,1989)Cold Spring Harbor Press ；01igonucleotideSynthesis(M. J. Gait, ed. ,1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology A Laboratory Notebook(J.E.Cellis, ed. , 1998)Academic Press ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed. ,1987) ；Introduction to Cell and TissueCulture (J. P. Mather and P.E. Roberts,1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A.Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. ,1993-1998)J. Wiley and Sons ;Methodsin Enzymology(Academic Press, Inc.) ；Handbook ofExperimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwell,eds.) ；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J. M. Miller and M. P. Calos, eds. ,1987) ；Current Protocolsin Molecular Biology(F. M. Ausubel et al. , eds. ,1987) ；PCR The Polymerase ChainReaction,(Mullis et al. ,eds. ,1994) ；Current Protocols in Immunology(J. E. Coliganet al. , eds. ,1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology (C.A.Janeway and P.Travers,1997) ；Antibodies (P.Finch,1997)；Antibodies a practical approach(D. Catty. , ed. , IRL Press,1988-1989) ；Monoclonalantibodies a practical approach(P. Shepherd and C. Dean, eds. , Oxford UniversityPress,2000) ；Using antibodies a Laboratory manual(E. Harlow and D. Lane(ColdSpring Harbor Laboratory Press,1999) ；The Antibodies(M. Zanetti and J. D. Capra,eds. , Harwood Academic Publishers,1995)。定义“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于其可变区内的至少一个抗原识别位点而特异性结合靶，例如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等等。在本申请中，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，也涵盖它们的片段(例如Fab, Fab，，F(ab，)2，Fv)、单链(ScFv)、突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如结构域抗体)、以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体包括任何类型的抗体，例如IgG，IgA或IgM(或它们的亚型)，且抗体不必是任何特殊的类型。基于抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类型。有五种主要类型的免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，它们中的一些可进一步分为若干亚型(同种型)，例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、Y和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是已知的。 在本申请中，"单克隆抗体"指的是从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能有少量天然发生的突变之外，组成该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度的特异性，针对的是单一的抗原性位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每一单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。定语"单克隆"表示抗体是从基本上均质的抗体群体中获得的这一特征，而不能理解为要求所述抗体是通过任何特殊的方法产生的。例如，本发明所述的单克隆抗体可以是通过Kohler和Milstein，1975，Nature, 256 :495首先描述的杂交瘤方法制备的，或者可以是通过例如美国专利4，816，567所述的重组DNA方法制备的。单克隆抗体还可以是从采用例如McCafferty et al. , 1990, Nature, 348 :552-554所述的技术所产生的卩遼菌体文库中分离的。在本申请中，"人源化"抗体指的是非人(例如鼠的)抗体，它们是特异性的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab'，F(ab' )2或抗体的其他抗原结合亚序列)，它们含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。对于绝大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和生物学活性的来自非人物种抗体(供者抗体)的CDR残基置换，所述非人物种例如为小鼠、大鼠或兔。在一些情况中，人免疫球蛋白Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含既不存在于受者抗体也不存在于输入的CDR或构架序列中的残基，这些残基被纳入的目的是进一步改善和优化抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上全部的至少一种、但通常两种可变结构域(例如，重链可变结构域和轻链可变结构域)，其中全部或基本上全部CDR区相应于非人免疫球蛋白的CDR区，而全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体理想地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fe)，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域(Fe)。可按照WO 99/58572所述对抗体的Fe区进行修饰。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体被改变的一或多种⑶R(l、2、3、4、5、6种)，这也称为“来源于”原始抗体的一或多种⑶R的一或多种⑶R。在本申请中，“人抗体”是指这样的抗体，其具有相应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或是以本领域已知的或本申请公开的任何用于制备人抗体的技术所制备的抗体。人抗体的定义包括那些包含至少一种人重链多肽或至少一种人轻链多肽的抗体。一个这样的实例是包含鼠轻链多肽和人重链多肽的抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。在一个实施方式中，所述人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al. , 1996, Nature Biotechnology, 14 :309-314 ；Sheets et al.，1998，PNAS, (USA)95 :6157-6162 ；Hoogenboom and Winter,1991, J.Mol. Biol.，227 :381 ；Marks et al.，1991，J. Mol. Biol.，222 :581)。也可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物中而制备人抗体，所述动物例如为内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠。这种方法可参见美国专利 5，545，807,5, 545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425和5，661，016。或者可以通过使得产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化而制备人抗体(此类B淋巴细胞可从个体收集或已经在体外进行免疫)。参见，例如，Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss,p. 77,1985 ；Boerner et al.,1991，J. Immunol.，147(1) :86-95 ;和美国专利 5，750，373。在本申请中，术语“降钙素基因相关肽”和“CGRP”指的是任何形式的降钙素基因相关肽及其保留了 CGRP的至少一部分活性的变体。例如，CGRP可以是a -CGRP或β -CGRP。在本申请中，CGRP包括所有哺乳动物物种的天然序列的CGRP，所述哺乳动物例如为人、犬、 猫、马和牛。在本申请中，“抗CGRP拮抗性抗体”(与"抗CGRP抗体"可互换使用)指的是这样的抗体，其能够结合CGRP并抑制CGRP的生物学活性和/或由CGRP信号途径介导的下游途径。抗CGRP拮抗性抗体涵盖那些阻断、拮抗、阻抑或降低(包括明显降低)CGRP的生物学活性，CGRP的生物学活性包括由CGRP信号途径介导的下游途径，例如受体结合和/或由CGRP引发的细胞应答。在本发明中，术语“抗CGRP拮抗性抗体”应明确理解为涵盖使得CGRP本身、CGRP的生物学活性(包括但不限于其介导内脏痛的任何方面的能力)或所述生物学活性的结果以任何有意义的程度被明显失效、降低或被中和的所有以往鉴定的术语、标题和功能状态和特征。在一些实施方式中，抗CGRP拮抗性抗体结合CGRP并防止CGRP结合于CGRP受体。在其他实施方式中，抗CGRP抗体结合CGRP并防止CGRP受体活化。本申请提供了抗CGRP拮抗性抗体的实例。在本申请中，术语“G1”和“抗体G1”可互换使用，指的是由保藏号为ATCC-PTA-6867和ATCC-PTA-6866的表达载体所产生的抗体。重链和轻链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO :1和2。抗体Gl的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)显示于W02007/054809的图5，通过引用将W02007/054809的全部内容并入本申请。编码所述重链和轻链可变区的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO :9和10。W02007/054809的实施例对抗体Gl进行了表征。在本申请中，术语“G2”和“抗体G2’可互换使用,指的是Wong HC et al. Hybridoma12 =93-106,1993所述的抗大鼠CGRP的小鼠单克隆抗体。所述重链和轻链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO 19和20。编码所述重链和轻链可变区的多核苷酸序列显示于SEQID NO 27 和 28。SEQ ID NO 21 至 26 给出了抗体 G2 的 CDR 部分。术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本申请中可互换使用，指的是任何长度的氨基酸链，优选地为相对短的氨基酸链(例如，10-100个氨基酸)。链可以是线性的或分叉的，其可以包含修饰的氨基酸，和/或可被非氨基酸中断。该术语也涵盖天然修饰的或通过干预而修饰的氨基酸链；例如，形成二硫键、糖基化、脂质化(Iipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记成分缀合。还定义还包括，例如，含有一或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及其他本领域已知的修饰的多肽。要理解所述多肽可以是单链或结合链的形式。本领域已知，“多核苷酸”或“核酸”在本申请中可互换使用，指的是任何长度的核苷酸链，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或能够被DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在修饰，那么对核苷酸结构的修饰可以在链组装之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。可以在聚合后对多核苷酸做进一步修饰，例如与标记成分缀合。其他类型的修饰包括，例如，“加冒”；以类似物置换一或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的连键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、phosphoamidates、氨基甲酸酯等等)和具有带电荷的连键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)，含有悬垂(pendant)部分,例如,蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等等)，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等等)，含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等等)，含有烷化剂，具有修饰的连键(例 如，α异头核酸等等)；以及非修饰形式的多核苷酸。此外，可以置换糖中正常存在的任何羟基，例如，通过膦酸酯基团、磷酸酯基团、通过标准保护基保护或活化以便为额外的核苷酸准备额外的连键，或者可以缀合于固相支持物。5’端和3’端OH可以被磷酸化或以胺或1-20个碳原子的有机加冒基团部分取代。还可以将其他羟基衍生化为标准的保护基。多核苷酸还可含有本领域熟知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括，例如，2’ -O-甲基-、2’-0_烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮-核糖,碳环糖类似物(carbocyclic sugar analogs),α -或β -异头糖，差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物(acyclic analogs)和脱碱基核苷酸类似物例如甲基核苷。可用替代性连接基团置换一或多种磷酸二酯键。这些替代性连接基团包括，但不限于以下情况，将磷酸酯置换为 P (0) S ( “硫代”)、P (S) S ( “二硫代”)、(0) NR2 ( “酰胺” )、P (0) R、P (0) 0R，、CO 或CH2 ( “formacetal”)，其中每一 R或R’独立地是H或取代的或非取代的烃基(1-20C)，且任选地含有醚(-0-)连键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。多核苷酸中的连键不必全部相同。以上描述适用于本申请中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。抗体“可变区”指的是抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，可以是单独的或相组合。重链和轻链可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)连接的四个构架区(FR)组成，⑶R也称为高变区。每一链中的⑶R通过FR保持为紧密靠近在一起，并与另一链的⑶R一起，形成抗体的抗原结合位点。至少有两种技术用于确定CDR: (I)基于物种间序列变异性的方法(即，Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5thed. , 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD));和(2)基于抗原抗体复合物晶体学研究的方法(Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273 :927-948))。在本申请中，CDR可以指通过任一方法或两种方法的组合而定义的CDR。抗体的“恒定区”指的是抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，可以是单独的或
相组合。在本申请中，抗体的"免疫特异性"结合指的是抗体的抗原结合位点与该抗体识别的特定抗原之间的抗原特异性结合相互作用(即，抗体与蛋白质在ELISA或其他免疫测定法中反应，而不与无关的蛋白质发生可检测的反应)。与抗体或多肽“优先结合”或“特异性结合”(在本申请中可互换使用)的表位是本领域熟知的术语，且确定此类特异性或优先结合的方法也是本领域熟知的。如果一种分子与一种特定细胞或物质的反应或结合较其与其他细胞或物质的反应或结合更加频繁、持续更长时间和/或具有更好的亲和力，则称该分子表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体与靶的结合较其与其他物质的结合具有更高的亲和力、亲和性、更容易和/或持续更长的时间，则抗体与所述靶“特异性结合”或“优先结合”。例如，特异性结合或优先结合CGRP表位的抗体是这样的抗体，其与该表位的结合相对于其与其他CGRP表位或非CGRP表位的结合而言具有更高的亲和力、亲和性、更容易和/或持续更长的时间。还要理解，根据该定义，例如，特异性或优先结合第一靶的抗体(或部分或表位)可以特异性或优先结合第二靶，也可以不特异性或优先结合第二靶。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(尽管可以包括)排他性结合。通常，结合指的是优先结合，但也不是必需如此。在本申请中，“基本上纯的”指的是材料至少是50%纯的(即，不含污染物)，更优 选地是至少90 %纯的，更优选地是至少95 %纯的，更优选地是至少98 %纯的，更优选地是至少99%纯的。“宿主细胞”包括单个的细胞或细胞培养物，其可以是或者已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，由于天然的、偶然或人为的突变，所述子代不一定与原始的亲代细胞(在形态学上或在基因组DNA上)完全相同。宿主细胞包括以本发明的多核苷酸转染的细胞。术语"Fe区"定义的是免疫球蛋白重链的C端区域。"Fe区"可以是天然序列的Fe区或变体Fe区。尽管免疫球蛋白重链Fe区的边界可以不同，但人IgG重链Fe区通常从重链的Cys226或Pro230氨基酸残基开始延伸至重链的羧基端。Fe区内的残基编号是 Kabat 中 EU 指数的编号。Kabat et al. , Sequences of Proteins of ImunologicalInterest，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991。免疫球蛋白的Fe区通常包含两个恒定结构域，即CH2和CH3。在本申请中，"Fe受体"和“FcR”指的是结合抗体Fe区的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR( Y受体)，并包括Fe Y RI、Fe Y RII和Fe Y RIII亚型的受体，包括这些受体的等位基因变体和替代剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("活化受体")和FcyRIIB("抑制受体")，它们具有相似的氨基酸序列，主要在胞衆结构域存在不同。有关FcR的综述见Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev.Tmmunol · ,9 :457-92 ；Capel et al. , 1994, Immunomethods, 4 :25_34 ;和 de Haas et al.,1995，J. Lab. Clin. Med.，126 :330-41。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体的IgG转运给胎儿(Guyer et al. , 1976, J. Tmmunol · , 117 587 JPIKim et al. , 1994, J. Tmmunol.，24 :249)。“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指的是在存在补体的情况下裂解靶。补体活化途径由补体系统的第一种补体(Clq)结合与相关抗原相复合的分子(例如抗体)而起始。为了评估补体活化，可进行⑶C测定,例如参见Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol.Methods,202 :163(1996)。
“功能性Fe区”具有天然序列的Fe区的至少一种效应物功能。示例性的“效应物功能”包括结合Clq ;补体依赖性细胞毒性(CDC) ;Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒反应(ADCC);吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等等。此类效应物功能通常需要Fe区与一结合结构域(例如抗体可变结构域)相组合，并能够采用多种本领域人员已知的用于评价此类抗体效应物功能的测定法进行分析。“天然序列的Fe区”包含的氨基酸序列与天然存在的Fe区的氨基酸序列相同。“变体Fe区”包含的氨基酸序列与天然序列的Fe区的氨基酸序列的不同之处在于具有至少一种氨基酸修饰，但保留天然序列的Fe区的至少一种效应物功能。优选地，与天然序列的Fe区或亲代多肽的Fe区相比，变体Fe区具有至少一个氨基酸的取代，例如，在天然序列的Fe区或亲代多肽的Fe区中有大约I至大约10个氨基酸取代，优选地大约I至大约5个氨基酸取代。本申请中的变体Fe区与天然序列的Fe区和/或与亲代多肽的Fe区优选地将具有至少大约80%序列相同性，且最优选地与之具有至少大约90%序列相同性，更优选地阈值具有至少大约95 %、至少大约96 %、至少大约97 %、至少大约98 %、至少大约99 %序列相同性。 在本申请中，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒反应”和“ADCC”指的是细胞介导的反应，其中表达Fe受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后导致靶细胞裂解。可通过体外ADCC测定法分析感兴趣的分子的ADCC活性，例如参见美国专利5，500，362或5，821，337。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和NK细胞。或者，或额外地，可在体内分析感兴趣的分子的ADCC活性，例如，在动物模型中分析，例如参见Clynes et al.，1998，PNAS(USA)，95 :652-656。在本申请中，“治疗”是获得有益的或所需的临床结果的过程。就本发明的目的而言，有益的或所需的临床结果包括，但不限于，以下情况中的一或多种改善内脏痛的任何方面，包括减轻严重程度、缓和疼痛强度和其他相关症状、降低复发频率、提高内脏痛患者的生活质量、和降低治疗内脏痛所需的其他药物的剂量。其他相关症状包括，但不限于，痛性痉挛、疼痛、弥漫性疼痛、压力、胀感、挤压感、恶心、呕吐、和对光、声和/或运动的敏感性。“降低内脏痛的发生率”是指降低严重程度(这可包括降低(例如，暴露于)通常用于这种情况是其他药物和/或治疗(例如，麻醉药(例如，羟考酮，吗啡，布托啡诺，纳布啡等等))的需求和/或量)、持续时间和/或频率中的任一种。本领域人员理解，个体对治疗的反应可以不同，因此，例如，“降低个体内脏痛的发生率的方法”反映的是基于给该特定个体施用抗CGRP拮抗性抗体很可能会使得所述发生率降低这一合理预期而施用抗CGRP拮抗性抗体。“减轻”内脏痛和/或与内脏痛相关的症状是指与不施用抗CGRP拮抗性抗体相比，一或多种内脏痛症状和/或与内脏痛相关的症状得以变轻或改善。“减轻”也包括缩短或减少症状的持续时间。“缓解”内脏痛和/或与内脏痛相关的症状是指使用本发明的抗CGRP拮抗性抗体治疗的个体或群体的一或多种内脏痛的不利临床表现的程度变轻。在本申请中，"控制内脏痛"指的是与治疗前的水平相比，保持或降低了一或多种内脏痛症状的严重程度或持续时间或内脏痛频率。例如，与治疗前的水平相比，个体的内脏痛持续时间或严重程度或内脏痛的频率可以被降低至少大约10 %、20 %、30 %、40 %、50%、60%或 70%。在本申请中，“延缓”内脏痛的发生指的是延迟、阻碍、减慢、减缓、稳定和/或推迟内脏痛的进展。依病史和/或所治疗的个体，这种延迟可以是不同长度的时间。本领域人员明了，足够的或明显的延迟实际上可包括预防，即个体不发生内脏痛。“延迟”症状发生的方法是这样的方法，与不使用该方法相比，其在给定时间范围内降低症状发生的可能性和/或在给定时间范围内减轻症状的程度。此类比较通常是基于使用足够显示出治疗对象和非治疗对象之间的统计学显著性差异的数目的对象的临床研究。内脏痛的“发生”或“进展”指的是疾病的初始表现和/或随后的进展。内脏痛的发生可以是可检测到的，并可采用本领域熟知的标准临床技术来评估。不过，发生还可以指不可检测到的进展。就本发明的目的而言，发生或进展指的是症状的生物学过程。“发生”包括出现、复发和发作。在本申请中，内脏痛的“发作”或“出现”包括初始发作和/或出现。 “生物学样品”涵盖获自个体的可用于诊断或监测分析的各种样品类型。该定义涵盖生物学来源的血液和其他液体样品，固体组织样品例如活检标本或由此而来的组织培养物或细胞及其子代。该定义还包括在获得之后以各种方式进行处理过的样品，例如以试剂处理、增溶、或富集某些成分(例如蛋白质或多核苷酸)，或包埋于半固体或固体基材中以便切片。术语“生物学样品”涵盖临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物学液体和组织样品。在本申请中，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益的或所需的结果的量。就预防性应用而言，有益的或所需的结果包括这样的结果，例如消除或降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度、或延迟疾病的发作，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和疾病发生过程中的中间病理学表型。就治疗性应用而言，有益的或所需的结果包括这样的结果，例如降低疼痛强度、内脏痛发作的持续时间或频率，减少内脏痛引起的一或多种症状(生化、组织学和/或行为症状)，包括其并发症和疼痛发生过程中的中间病理学表型，提高疼痛患者的生活质量，减少治疗疼痛所需的其他药物的剂量，增强其他药物的效果，和/或延迟患者疼痛的进展。可以通过一或多次施用而施用有效剂量。就本发明的目的而言，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。临床上可以理解，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以与或不与其他药物、化合物或药物组合物相组合而实现。因此，可以根据施用一或多种治疗剂来考虑“有效剂量”，且在与一或多种其他药物组合时，可以考虑以有效量给予单一药物是否能够实现所需结果。“个体”或"对象"是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物还包括，但不限于，牲畜、竞赛动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在本申请中，"载体(vector)"指的是一种构建体，其能够将一或多种感兴趣的基因或序列转运至宿主细胞并优选地表达所述基因或序列。载体的实例包括，但不限于，病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体、与阳离子凝聚剂结合的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。在本申请中，"表达控制序列"指的是指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子、或增强子。表达控制序列可操纵地连接于待转录的核酸序列。在本申请中，"药用可接受的载体"或"药用可接受的赋形剂"包括任何这样的材料，当其与活性成分组合时，使得所述成分保持生物学活性，且不与对象的免疫系统发生反应。实例包括，但不限于，任何标准的药用载体例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、以及各种类型的湿润剂。用于气溶胶或胃肠外施用的优选稀释剂是磷酸缓冲盐水或生理盐水(O. 9% )。可使用本领域熟知的常规方法配制包含此类载体的组合物(参见，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed. , MackPublishing Co. ,Easton,PA, 1990 ;和Remington,The Science and Practice of Pharmacy20th Ed. Mack Publishing,2000)。在本申请中，术语"k。/用于指抗体与抗原结合的速率常数。在本申请中，术语"I^ff"用于指抗体从抗体/抗原复合物解离的速率常数。在本申请中，术语"Kd"用于指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。预防或治疗内脏痛的方法本发明提供用于预防和/或治疗内脏痛和/或内脏痛症状的方法和用于预防和/或治疗个体的内脏痛和/或一或多种内脏痛症状的药物。在一些实施方式中，本发明提供用于预防和/或治疗个体的内脏痛和/或一或多种内脏痛症状的方法，包括给所述个体外周施用有效量的抗CGRP拮抗性抗体。在其他实施方式中，本发明提供用于减轻、控制个体的内脏痛和/或一或多种内脏痛症状或降低其发生率或延迟其发生或进展的方法，包括给所述个体外周施用有效量的抗CGRP拮抗性抗体。 在一些实施方式中，本发明提供抗CGRP拮抗性抗体在制备用于预防和/或治疗内脏痛和/或一或多种内脏痛症状的药物中的用途，其中所述药物被制备为用于外周施用，或其中所述药物被外周施用。在其他实施方式中，本发明提供用于预防和/或治疗内脏痛和/或内脏痛症状的抗CGRP拮抗性抗体，其中所述抗体被制备为用于外周施用，或其中所述抗体被外周施用。在其他实施方式中，本发明提供抗CGRP拮抗性抗体在制备用于减轻、控制内脏痛和/或内脏痛症状或降低其发生率或延迟其发生或进展的药物中的用途，其中所述药物被制备为用于外周施用，或其中所述药物被外周施用。在一些实施方式中，所述个体优选地是哺乳动物，例如宠物，例如马、猫或狗，或牲畜，例如羊、牛或猪。最优选地，所述哺乳动物是人。在一些实施方式中，所述药物和/或抗CGRP拮抗性抗体被制备为用于口服、舌下、含服、局部、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、心内、骨内、皮内、腹腔内、经粘膜、经阴道、玻璃体内、关节内、关节周围、中枢、局部或上角质层(epicutaneous)施用。在一些实施方式中，所述药物被制备为在内脏痛发生之前和/或过程中和/或之后外周施用。
在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体施用后在外周起作用。在一个实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体不以中枢内、椎管内或鞘内形式施用。在一些实施方式中，所述内脏痛与疾病相关和/或由疾病引起,所述疾病例如,功能性肠紊乱(FBD)或炎性肠病(IBD)。在内脏痛与FBD相关的实施方式中，FBD可以是，例如但不限于，胃食管反流、消化不良、肠易激综合征(IBS)或功能性腹痛综合征(FAPS)。最优选地，疾病是IBS。在内脏痛与IBD相关的实施方式中，IBD可以是，例如但不限于，克罗恩病、回肠炎或溃疡性结肠炎。其他类型的内脏痛包括与以下情况相关的疼痛，例如，癌症、肾绞痛、痛经、膀胱炎包括间质性膀胱炎(IC)、与肠梗阻相关的手术、月经期、分娩、绝经期、骨折、憩室炎、腹膜炎、心包炎、肝炎、目尾炎、结肠炎、胆囊炎、子宫内膜异位症、慢性和/或急性胰腺炎、心肌梗死、肾绞痛、胸膜炎、前列腺炎、骨盆痛和器官创伤。在一些实施方式中，本发明的方法或用途可用于减轻患有FBD、IBD或IC的个体内脏痛和/或一或多种与内脏痛相关的症状。内脏痛的诊断或评估是本领域熟知的。可基于本领域已知的测量法进行评估，例如采用多种疼痛评级表的患者疼痛表征。参见，例如，Katz et al, Surg Clin North Am.,1999,79(2) :231-52 ；Caraceni et al. J Pain Symptom Manage,2002,23(3) :239_55。例如，可以采用语言描述符评级表(verbal descriptor scale, VDS)、视觉模拟评级表(visual analog scale, VAS)、Prince Henry Hospital 疼痛评级表(PHHPS)、数值评定量 表(numeric rating scale, NRS)和Faces疼痛评级表以及它们的各种变化来评估疼痛并评价对治疗的应答。还有一些通常用于测量疾病状态的评级表，例如功能性肠紊乱严重程度指数(FBDSI) (Drossman et al. , 1995, Digestive Diseases and Sciences 40(5)986-995)和 IBS 严重程度评分系统(Francis et al. , 1997, Aliment Pharmacol Ther.，11(2) :395-402)。此类评级表可用于评价治疗反应。在一些实施方式中，通过FBDSI、VDS、VAS、PHHPS、NRS和Faces疼痛评级表的一或多种来测量减轻、控制FBD疼痛的发生或进展和/或FBD疼痛的症状或降低其发生率或延迟其发生或进展的情况。在另一实施方式中，通过IBS严重程度评分系统、VDS、VAS、PHHPS、NRS和Faces疼痛评级表的一或多种来测量减轻、控制IBS疼痛的发生或进展和/或IBS疼痛的症状或降低其发生率或延迟其发生或进展的情况。在一些实施方式中，通过VDS、VAS、PHHPS、NRS和Faces疼痛评级表的一或多种来测量减轻、控制IC疼痛的发生或进展和/或IC疼痛的症状或降低其发生率或延迟其发生或进展的情况。抗CGRP拮抗件抗体在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体结合CGRP。优选地，抗CGRP拮抗性抗体结合CGRP并抑制CGRP结合CGRP受体的能力。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体结合人和啮齿动物的CGRP，优选地人和大鼠的CGRP。更优选地，抗体结合人CGRP。在优选的实施方式中，抗CGRP拮抗性抗体结合人a -CGRP或结合人a -CGRP和/或β -CGRP。最优选地，抗CGRP拮抗性抗体是表现出以下功能特征中的任何一或多种功能特征的抗体(a)结合CGRP ； (b)阻断CGRP与其受体结合；(c)阻断或降低CGRP受体活化，包括cAMP活化；(d)抑制、阻断、阻抑或降低CGRP生物学活性，包括CGRP途径介导的下游途径，例如受体结合和/或引发对CGRP的细胞应答；(e)预防、减轻或治疗内脏痛的任一方面；(f)增加CGRP的清除；和(g)抑制(降低)CGRP的合成、产生或释放。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体结合CGRP的片段，更优选地结合CGRP的片段并结合全长CGRP。优选地，抗CGRP拮抗性抗体结合CGRP的C端区域或片段。CGRP的C端区域或片段优选地包含CGRP的氨基酸19-37或25-37或29-37，或者氨基酸30-37，或者氨基酸31-37。在另一个实施方式中，CGRP的C端区域或片段优选地包含氨基酸32-37，最优选地CGRP的氨基酸33-37。优选地，CGRP是a -CGRP或β -CGRP,进一步优选地是人或啮齿动物的，进一步优选地人或大鼠的，更优选地人的，进一步优选地人a-CGRP或β-CGRP，最优选地人a -CGRP。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体特异性结合氨基酸序列GSKAF (SEQ IDNO :39)。优选地，CGRP的序列GSKAF (SEQ ID NO 39)是抗CGRP拮抗性抗体所结合的表位。在一些实施方式中，提供了抗CGRP拮抗性抗体，其特异性结合CGRP的氨基酸G33至F37所限定的表位。抗CGRP拮抗性抗体可特异性结合氨基酸序列GSKAF (SEQ ID NO 39)所限定的表位。在一些实施方式中，本发明提供这种抗体在本发明各方面所定义的用途和方法中的用途。
在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体抑制或防止CGRP受体的活化。优选地，抗CGRP抗体的IC5tl为大约O. 0001 (O. InM)至大约500 μ Μ。在一些优选的实施方式中，如体外结合测定法所测量的那样，IC50为大约O. 0001 μ M以及大约250 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ、I μ Μ、500ηΜ、250ηΜ、ΙΟΟηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、IOnM,5ηΜ、InM 或 O. 5ηΜ 中的任一值。在一些进一步优选的实施方式中，如体外结合测定法所测量的那样，IC50低于大约500ρΜ、或大约ΙΟΟρΜ、或大约50pM中的任一值。在一个进一步更加优选的实施方式中，IC50为大约
I.2nM 或 31nM。在一些实施方式中，所使用的抗CGRP拮抗性抗体能够与本申请中所述的上述抗体竞争结合CGRP或CGRP的片段，或竞争结合CGRP的片段以及全长CGRP，优选地竞争结合CGRP的C端区域或片段。在优选的实施方式中，CGRP的C端区域或片段包含CGRP的氨基酸19-37、25-37、29-37、30-37或31-37。在另一个实施方式中，CGRP的C端区域或片段优选地包含CGRP的氨基酸32-37，最优选地为CGRP的氨基酸33-37。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体结合CGRP、CGRP的区域或CGRP的片段，且其结合亲和力(Kd)为大约O. 00001 μ M(O. OlnM)至大约500 μ Μ。在一些实施方式中，如体外结合测定法所测量的那样，所述结合亲和力(Kd)为大约O. 00001 μ M和大约250 μ Μ、100 μ Μ、50μ Μ、10 μ Μ、I μ Μ、500ηΜ、250ηΜ、100ηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、1ηΜ、0· 5ηΜ、1ηΜ、0. 05ηΜ或O. OlnM中的任一值。在一些实施方式中，如体外结合测定法所测量的那样，所述结合亲和力(Kd)低于大约500ρΜ或100ρΜ、50ρΜ或IOpM中的任一值。在进一步更加优选的实施方式中，结合亲和力(Kd)是大约O. 04ηΜ或16ηΜ。本发明所使用的抗CGRP拮抗性抗体可选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv、Fe、ScFv等等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异源缀合物(heteroconjugate)抗体、单链(ScFv)抗体、它们的突变体、包含抗体部分的融合蛋白(例如，结构域抗体)、人源化抗体、以及免疫球蛋白分子包含具有所需特异性的抗原识别位点的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体、和共价修饰的抗体。抗CGRP拮抗性抗体可以来源于鼠、大鼠、人或是任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体可以是人源化的，但更优选地是人的。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体是分离的。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体是基本上纯的。在抗CGRP拮抗性抗体是抗体片段的情况下，所述片段优选地保留原始抗体的功能特征，即前面功能特征部分所述的对CGRP的结合和/或拮抗活性。抗CGRP拮抗性抗体的实例是本领域已知的。因此，根据本发明的优选实施方式，本发明所使用的抗CGRP拮抗性抗体优选地是以下任一所宽泛或具体公开的抗CGRP抗体(i)W02007/054809, (ii)W02007/076336，(iii)Tan et al. ,Clin. Sci. (Lond) · 89 :565-73,1995, (iv)Sigma(Missouri, US),产品号 C7113(clone #4901), (v)Plourde et al.,Peptides 14 :1225-1229，1993，或所述抗CGRP抗体包含或由以下任一组成(a)所述抗体的片段(例如，Fab, Fab' ,F (ah' ) 2, Fv, Fe, ScFv 等等)，(b)所述抗体的轻链，(C)所述抗体的重链，(d)来自所述抗体的轻链和/或重链的一或多个可变区， (e)所述抗体的一或多个CDR(1、2、3、4、5或6个CDR)，(f)来自所述抗体的重链的⑶R H3，(g)来自所述抗体的轻链的⑶R L3，(h)来自所述抗体的轻链的3个⑶R，⑴来自所述抗体的重链的3个⑶R，(j)来自所述抗体的轻链的3个⑶R和来自所述抗体的重链的3个⑶R，(k) (a)至(j)中的任何一或多种。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体是抗体G2或抗体Gl。根据本发明的最优选的实施方式，所使用的抗CGRP拮抗性抗体是PCT专利申请公开文本W02007/054809具体公开的抗CGRP抗体Gl或包含W02007/054809表6中所示的其变体，也包括Gl的功能性等价抗体，即包含保守性氨基酸残基的取代或一或多个氨基酸的缺失或添加而不明显影响他们的功能特征，如与CGRP结合或CGRP拮抗活性，以及具有增强的或降低的活性和/或结合的变体。在本申请中，术语“G1 ”和“抗体Gl ”可互换使用，指的是W02007/054809中所公开的保藏号为ATCC PTA-6867和ATCC PTA-6866的表达载体所产生的抗体。申请日均为2009 年 3 月 3 日的 PCT 申请 PCT/IB2009/050849 和 PCT/IB2009/050852 公开了抗体 Gl 的功能特征，通过引用将上述申请的全部内容并入本申请。根据本发明进一步的实施方式，抗CGRP拮抗性抗体包含选自以下一组中的多肽或由所述多肽组成(a)抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体；(b)抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的片段或区域；(c)抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的轻链；(d)抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的重链；(e)来自抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的轻链和/或重链的一或多个可变区；(f)来自抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的一或多个CDR(1、
2、3、4、5或6个CDR) ； (g)来自抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的重链的⑶R H3 ； (h)来自抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的轻链的⑶R L3 ；
(i)来自抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的轻链的3个⑶R ; (j)来自抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的重链的3个⑶R ; (k)来自抗体Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的轻链的3个CDR和来自所述抗体或所述变体的重链的3个CDR;和⑴包含(b)至(k)中任一项的抗体。本发明还提供多肽，其包含上述的任何一或多种。在一些实施方式中，所述至少1、2、3、4、5或6个CDR与Gl或W02007/054809的表6中所示的其变体的至少1、2、3、4、5或6个⑶R具有至少大约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的相同性。本领域人员能够容易地确定⑶R区。要理解的是，在一些实施方式中，⑶R可以是Kabat和Chothia⑶R的组合。在一些实施方式中，所述⑶R是Kabat⑶R。在其他实施方式中，所述⑶R是ChothiaCDR。抗CGRP拮抗性抗体优选地包含抗体Gl或W02007/054809的表6中所示其变体的片段或区域(例如，Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv、Fe、ScFv等等)或由所述片段或区域组成。优选地，所述片段或区域具有抗CGRP拮抗性抗体的功能特征，例如，CGRP结合活性和/或拮抗活性，并包含以下一或多种或由以下一或多种组成(i)抗体Gl的轻链、(ii)抗体Gl的重链、(iii)含有来自抗体Gl的轻链和/或重链的一或多个可变区的抗体、和(iv)来自抗体Gl的轻链和/或重链的一或多个⑶R。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含轻链可变区(LCVR)和/或重链可变区(HCVR)，所述LCVR包含具有选自W02007/076336中的SEQ ID NO :28-32的序列的 肽，所述HCVR包含具有选自W02007/076336中的SEQ ID NO 34-38的序列的肽。进一步优选地，抗CGRP拮抗性抗体包含具有W02007/076336表I所示的一个SEQID NO的LCVR多肽，并进一步包含具有W02007/076336表I所示的一个SEQ ID NO的HCVR多肽。根据本发明进一步的实施方式，所使用的抗CGRP拮抗性抗体包含轻链CDR(CDRL)和 / 或重链 CDR (CDRH)，所述 CDRL 选自 W02007/076336 的 SEQ ID NO :8-13，所述 CDRH 选自W02007/076336 的 SEQ ID NO : 14-22。W02007/076336公开了制备和分离W02007/076336的抗CGRP拮抗性抗体的方法以及证明该抗体结合CGRP及其拮抗剂特征的数据。 在一些实施方式中，用于本发明的所述抗CGRP拮抗性抗体包含VH结构域，其与本申请给出的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :19具有至少大约85%、至少大约86%、至少大约87%、至少大约88%、至少大约89%、至少大约90%、至少大约91 %、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或100%的氨基酸序列相同性。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含VL结构域，其与本申请给出的SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :20具有至少大约85%、至少大约86%、至少大约87%、至少大约88%、至少大约89%、至少大约90%、至少大约91%、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或100%的氨基酸序列相同性。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含VH结构域和VL结构域，它们分别与本申请给出的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2或分别与SEQ ID N0:19和SEQ ID NO 20具有至少大约85%、至少大约86%、至少大约87%、至少大约88%、至少大约89%、至少大约90%、至少大约91%、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%或100%的氨基酸序列相同性。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含VH结构域和VL结构域，该VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO 1具有至少90%的相同性，该VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :2具有至少90%的相同性。或者，所述抗CGRP拮抗性抗体可包含与SEQ ID NO 19具有至少90%氨基酸序列相同性的VH结构域和与SEQ ID NO 20具有至少90%氨基酸序列相同性的VL结构域。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含选自以下一组中的至少一个CDR (a) SEQ ID NO :3、21、33、34、36 或 37 所示的 CDR Hl ； (b) SEQ ID NO :4、22、35 或 38所示的 CDR H2 ； (c) SEQ ID NO 5 或 23 所示的 CDR H3 ； (d) SEQ ID NO 6 或 24 所示的 CDRLI ； (e) SEQ ID NO :7 或 25 所示的 CDR L2 ； (f) SEQ ID NO 8 或 26 所示的 CDR L3 ;和(g)W02007/054809 的表 6 中所示的 CDR LI、CDR L2 和 CDR H2 的变体。
在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体的重链恒定区可来自任何类型的恒定区，例如IgG、IgM、IgD、IgA和IgE ;以及任何同种型，例如IgGI、lgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含由ATCC登记号为PTA-6867的表达载体产生的重链。进一步优选地，抗CGRP拮抗性抗体包含由ATCC登记号为PTA-6866的表达载体产生的轻链。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含抗体Gl的重链全抗体氨基酸序列(包括本申请中所述的修饰的IgG2)，见SEQ ID NO: 11，具有或不具有C端赖氨酸。抗CGRP拮抗性抗体还包括重链缺乏末端赖氨酸的抗体，因为在制备过程中一部分抗体通常丢失末端赖氨酸。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含SEQ ID NO 12所示的抗体Gl轻链全抗体氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含SEQ ID NO 29所示的抗体G2重链全抗体氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含SEQ ID NO 30所示的抗体G2轻链全抗体氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体由ATCC登记号为PTA-6867和PTA-6866的表达载体产生。在一些实施方式中，用于本发明的所述抗CGRP拮抗性抗体是在此定义的抗体Gl或抗体G2。在优选的实施方式中，用于本发明的抗CGRP拮抗性抗体是抗体Gl或其抗原结合片段。根据本发明的进一步的实施方式，抗CGRP拮抗性抗体包含修饰的恒定区，例如如TO2007/054809所述。优选地，修饰的恒定区是免疫学无活性的，包括部分免疫学无活性的，这样就不会触发补体介导的裂解作用，不会激发抗体依赖型细胞介导的细胞毒反应(ADCC)，不会活化小神经胶质细胞。优选地，修饰的恒定区的一或多种这些活性是降低的。最优选地，按照以下文献修饰恒定区Eur. J. Immunol.，1999,29 :2613-2624 ；PCT申请PCT/GB99/01441 ;和/或UK专利申请9809951. 8。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体包含人重链IgG2恒定区，所述恒定区包含以下突变A330，P331至S330，S331 (氨基酸编号参照野生型 IgG2 序列)。Eur. J. Immunol.，1999,29 :2613_2624。 W02007/054809公开了制备和分离W02007/054809的抗CGRP拮抗性抗体的方法以及证明该抗体结合CGRP及其拮抗剂特征的数据。该申请中的SEQ ID NO :1至14分别为本申请的SEQ ID NO :1至14。剂量和施用在一些实施方式中，外周施用所述抗CGRP拮抗性抗体，例如，每周大约一次至大约 次，进一步优选地每月大约一次至大约4次，进一步优选地每6个月大约一次至大约6次，进一步优选地每年大约一次至大约12次。优选地，按照以下时间外周施用抗CGRP拮抗性抗体大约每日一次，每2、3、4、5或6天一次，每周一次，每两周一次,每三周一次,每月一次，每两个月一次，每三个月一次，每四个月一次，每五个月一次，每六个月一次，每七个月一次，每八个月一次，每九个月一次，每十个月一次，每十一个月一次或每年一次。根据优选的实施方式，通过一或多种选自以下的途径施用抗CGRP拮抗性抗体口服、舌下、含服、局部、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内或肌肉内、心内、骨内、皮内、腹腔内、经粘膜、经阴道、玻璃体内、上角质层、关节内、关节周围、或局部施用。根据本发明进一步的实施方式，药物被制备为用于外周施用，每周大约一次至大约7次，进一步优选地每月大约一次至大约4次，进一步优选地每6个月大约一次至大约6次，进一步优选地每年大约一次至大约12次。优选地，药物被制备为用于按照以下时间外周施用大约每日一次，每2、3、4、5或6天一次，每周一次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次，每四个月一次，每五个月一次，每六个月一次，每七个月一次，每八个月一次，每九个月一次，每十个月一次，每十一个月一次或每年一次。根据优选的实施方式，通过一或多种选自以下的途径施用药物口服、舌下、含服、局部、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内或肌肉内、心内、骨内、皮内、腹腔内、经粘膜、经阴道、玻璃体内、上角质层、关节内、关节周围、或局部施用。
根据本发明进一步的实施方式，抗体浓度为大约O. I至大约200mg/ml ;优选地为以下任一浓度:大约 O. 5、1、5、10、1520、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/ml+/_10 %误差，最优选地为大约 50mg/ml。根据本发明进一步的实施方式，药物被制备为用于外周施用，其中抗体浓度为O. I至 200mg/kg 体重;优选地为以下任一浓度大约 O. 5、1、5、10、1520、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/kg体重+/-10%误差,最优选地为大约10mg/kg。根据本发明的优选实施方式，抗CGRP拮抗性抗体的体内半衰期超过以下任一时间大约 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、62、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208 或 210 天+/-I天，进一步优选地超过以下任一时间大约7、8、9、10、11或12个月。优选地,抗CGRP拮抗性抗体的体内半衰期超过6天。根据本发明的进一步优选的实施方式，药物和/或抗CGRP拮抗性抗体不产生中枢神经系统效应和/或认知损害。优选地，所述药物和/或抗CGRP拮抗性抗体不诱导任何一或多种以下效应健忘、意识模糊、人格解体、感觉减退、异常思维、牙关紧闭、眩晕、静坐不能、淡漠、共济失调、口周感觉异常、CNS刺激、情绪不稳定、欣快、幻觉、敌意、感觉过敏、运动过度、张力过低、动作失调、性欲增加、躁狂反应、肌阵挛、神经痛、神经病、精神病、痉挛、言语异常、木僵、自杀观念；头晕、嗜睡、失眠症、焦虑、颤抖、抑郁或感觉异常。最优选地，所述药物和/或抗CGRP拮抗性抗体不诱导运动协同性或注意力的损害。根据本发明进一步的实施方式，药物和/或抗CGRP拮抗性抗体不产生呼吸系统、肝、肾或胃肠道损害。
根据本发明进一步的实施方式，药物和/或抗CGRP拮抗性抗体不产生身体的和/或心理的依赖性。优选地，所述药物和/或抗CGRP拮抗性抗体对鸦片剂、苯二氮卓类、苯环己哌啶(PCP)或 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体或CNS刺激物不表现出亲和力或不产生任何镇静或欣快效应。在一些实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体在施用后可减轻、控制中枢疼痛感的发生或进展、降低其发生率或延迟其发生或进展。在其他实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体的效应等同于和/或优于NSAIDS和/或麻醉药在相同的内脏痛模型中的效应。在一个实施方式中，所述抗CGRP拮抗性抗体可有效治疗难治性疼痛群体。根据本发明进一步的实施方式，提供了本发明任何其他方面的用途或方法，其中抗CGRP拮抗性抗体与一或多种其他药用活性化合物或药物(优选地为可用于治疗内脏痛的药物)相组合而分开、依次或同时施用。优选地，额外的药物选自以下一或多种⑴阿片类镇痛药，例如吗啡、海洛因、氢吗啡酮、羟吗啡酮、左啡诺、左洛啡烷、美沙酮、哌替啶、芬太尼、可卡因、可待因、双氢可待因、羟考酮、氢可酮、丙氧芬、纳美芬、烯丙吗啡、纳洛酮、纳曲酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡或喷他佐辛；(ii)非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸、地夫美多、依托度酸、芬布芬、非诺洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀或佐美酸、环加氧酶-2(C0X-2)抑制剂、塞来昔布；罗非昔布；美洛昔康JTE-522 ;L_745，337 ；NS398 ;或它们的药用可接受的盐；(iii)巴比妥酸盐镇静药，例如异戊巴比妥、阿普比妥、仲丁巴比妥、布他比妥(butabital)、甲苯比妥、美沙比妥、美索比妥、戍巴比妥、苯巴比通(phenobartital)、司可巴比妥、他布比妥、theamylal或硫喷妥钠或它们的药用可接受的盐；(iv)具有镇静作用的苯二氮卓类，例如氯氮卓、氯拉卓酸、地西泮、氟西泮、劳拉西泮、奥沙西泮、替马西泮或三唑仑或它们的药用可接受的盐；(V)具有镇静作用的Hl拮抗剂，例如苯海拉明、吡拉明、异丙嗪、氯苯那敏或氯环利嗪或它们的药用可接受的盐；(vi)镇静剂例如苯乙哌啶酮、甲丙氨酯、甲喹酮或氯醛比林或它们的药用可接受的盐；(vii)骨骼肌松弛药，例如巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、环苯扎林、美索巴莫或orphrenadine或它们的药用可接受的盐；(viii)NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬((+)_3_羟基-N-甲基吗啡)或其代谢产物右啡烧((+)-3-轻基-N-甲基吗啡)、氯胺酮、美金刚、卩比咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone)或顺_4_(膦酰基甲基)_2_哌唳羧酸或它们的药用可接受的盐；(ix) α -肾上腺素能药物，例如多沙唑嗪、坦洛新、可乐定或4-amino_6, 7-dimethoxy-2-(5-methanesulfonamido-l,2,3,4-tetrahydroisoquinol-2-yl)_5_(2-pyridyl)quinazoline ；(X)三环抗忧郁药,例如地昔帕明、丙咪嗪、amytriptiline或去甲替林；(xi)抗惊厥药，例如卡马西平或丙戊酸盐；
(xii)速激肽(NK)拮抗剂，特别是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂，例如(a R，9R)-7-[3，5-bis(trifluoromethyI)benzyl]-8,9，10，Il-tetrahydro-9-methyl-5-(4_methylphenyI)_7H_[I，4]diazocino[2，l_g][I，7]naphthridine-6-13_dione (TAK-637)、5-[[(2R,3S)-2-[(IR)-I-[3,5-bis(trifluoromethyI)phenyl]ethoxy-3-(4-fluorophenyI) -4-morpholinyl]methyl]-I, 2-dihydro-3H-l, 2,4-triazol-3-one (MK-869)、拉奈匹坦、达匹坦或 3-[ [2-methoxy-5- (trifluoromethoxy) phenyl]methylamino] -2-phenyl-piperidine(2S，3S)；(xiii)毒蕈碱拮抗剂,例如oxybutin、托特罗定、丙哌维林、tropsium chloride或达非那新；(xiv) C0X-2抑制剂，例如塞来昔布、罗非昔布或伐地考昔；
(XV)非选择性COX抑制剂(优选地具有GI保护作用)，例如硝基氟吡洛芬(HCT-1026)；(xvi)煤焦油止痛剂，特别是扑热息痛；(xvii)精神安定药例如氟哌利多；(xviii)辣椒素受体激动剂(MfI^nresinferatoxin)或拮抗剂(例如辣椒素受体阻断剂)；(xix) β -肾上腺素能药物例如普萘洛尔；(XX)局麻药，例如美西律；(xxi)皮质类固醇，例如地塞米松；(xxii)血清素受体激动剂或拮抗剂；(xxiii)胆碱能(烟碱)止痛剂；(xxiv)曲马多；(XXv)F1DEV抑制剂,例如西地那非、伐地那非或taladafil ；(xxvi) α -2- δ配体例如加巴喷丁或普瑞巴林；(xxvii)大麻素(canabinoid);和(xxviii)抗抑郁剂,例如阿米替林(Elavil )、曲唑酮(Desyrel )和丙咪嗪(Tofranil )或抗惊厥药例如苯妥英(Dilantin )或卡马西平(Tegretol )。根据本发明的另一方面，提供了用于预防和/或治疗内脏痛和/或内脏痛症状或用于减轻、控制个体的内脏痛和/或内脏痛症状、降低其发生率或延迟其发生或进展的药物组合物，其包含抗CGRP拮抗性抗体和药用可接受的载体和/或赋形剂，其中所述组合物被制备为用于外周施用。试剂盒根据本发明的另一方面，提供了试剂盒，其包含上述定义的药物组合物和给个体外周施用有效量的所述药物组合物的说明，用于预防和/或治疗内脏痛和/或内脏痛症状或用于减轻、控制内脏痛和/或内脏痛症状、降低其发生率或延迟其发生或进展。试剂盒可包括一或多个容器，其中含有抗CGRP拮抗性抗体或本申请所述的多肽以及根据本发明的方法或用途进行使用的说明。试剂盒可进一步包含基于鉴定是否个体患有内脏痛或处于发生内脏痛的风险中而选择适合于治疗的个体的说明。对外周施用药物组合物的说明可包括有关要进行的治疗的剂量、用药方案和施用途径的信息。
本发明的各方面的优选的特征经必要修改等同适用于其他方面。
实施例以下实施例仅用于演示的目的，其无意于以任何形式限制本发明的范围。实际上，根据前面的描述，对在此所给出和描述的本发明实施方式以外的各种改变对本领域人员而言将是显而易见的，且因此它们也落入所附权利要求书的范围内。实施例I :内脏痛模型本实施例以内脏痛模型阐述抗CGRP拮抗性抗体治疗的效果。已经发现IBS患者对结直肠扩张具有较低的内脏感觉阈值，而这与内脏痛症状高度相关(Delafoy et al，2006)。在TNBS诱导大鼠结肠炎之后进行结直肠扩张是许多研究者探讨内脏过度敏感的机制时所使用的动物模型(Gay et al, 2006,Delafoy et al，2006，Adam et al.，2006)。在本实施例中使用大鼠TNBS结肠炎模型测试CGRP的功能阻断性抗体的效应。在该模型中，与人类IBS研究一样，通过对结肠的球囊扩张的反应来测量内脏痛
禁食过夜后，以氯胺酮(80mg/ml)/甲苯噻嗪(12mg/ml)麻醉大鼠，齐Li量为Iml/kg ο进行剖腹术并以TNBS溶液(50mg，以I. 5ml/kg溶于30%的乙醇中，“TNBS处理组”)或30%的乙醇溶液(“假处理组”)注射至距盲肠远端Icm处的近端结肠。假处理组作为非结肠炎对照。手术后第5天，将TNBS处理组分为两组。一组接受抗CGRP拮抗性单克隆抗体4901(购自 Sigma(Missouri,US),产品号 C7113,clone #4901), 10mg/kg 静脉注射。另一组接受载体(PBS，0.01%吐温20)作为阴性对照。手术后第7天，第二次禁食过夜后，以球囊扩张测试体重下降不超过11%的经TNBS处理的大鼠的内脏痛阈值。将连接于导管的5cm乳胶球囊插入远端结肠，球囊的基底距肛门5cm。用带子将导管固定于尾部以防止球囊运动。30分钟的适应期之后，以30秒为间隔给球囊顺序充气，从5mmHg达到80mmHg。在引发定型啮齿动物内脏痛体位(stereotypical rodent visceral pain posture)所需的压力处停止球囊扩张，该体位称为α位置(反复的斜肌收缩波并且后肢内旋)，将其记录为内脏痛阈值。在手术后第7天，经受假处理的大鼠的阈值为36. 8+/-2. 6 (N = 5，平均值+/-se)(

图1A)。在第5天接受抗体4901 (IOmgAg)的TNBS处理大鼠在第7天的阈值为
32.3+/-4. I (N = 9)，与在第5天接受载体的TNBS处理大鼠在第7天的阈值(21. 0+/-3. O, N=10)存在具有统计学显著意义的差异(单变量ANOVA+Dunnet多重比较，试验后)(图1A)。4901的效果与CGRP受体拮抗剂CGRP 8-37相当(图1B)。这一结果证实，抗CGRP拮抗性抗体在内脏痛模型中有效地使得内脏痛阈值向假处理组的阈值显著偏移，即逆转疼痛。实施例2 :相互作用分析和结合测定在装备有包被了抗生蛋白链菌素(SA)的传感器芯片的Biacore 3000 系统(Biacore AB, Uppsala, Sweden)上使用标准 Biacore 电泳缓冲液(HBS-P 或 HBS-EP)在25°C和37°C进行相互作用分析。N-LC-生物素化的人和大鼠的α-和β-CGRP被低水平(典型地100个反应单位)捕获于单个的流动细胞上以提供反应表面,而未修饰的流动细胞作为参比通道。产生抗体Gl和G2的纯化Fab片段。典型地，以两倍系列稀释法制备Fab，以0. 5 μ M作为最高浓度，以100 μ 1/min注射I分钟，解离时间至多达2小时。以50% v/V 乙醇+25mM NaOH 的混合物为 GlFab 再生表面，以 2 : I v/v Pierce Gentle ElutionBuffer/4M NaCl为G2 Fab再生表面。Fab注射物一式两份，以证明该测定法的可重复性。使用BiaEvaluation V. 4. O软件对结合应答进行双重参照并整体拟合成简单模型。根据动力学速率常数的商推导出亲和力(KD = koff/kon)。以下表I给出了抗体Gl的结果。抗体Gl以相似的高亲和力结合人α-和β-CGRP(当在同一芯片上在37°C并列分析且解离时间为20分钟时，Kd分别为163和155pM)。人和食蟹猴(cynomolgus monkey)具有相同的序列；因此人的数据也适用于食蟹猴。Gl也结合大鼠的CGRP，但在α-与β-同种型之间有差异(Kd分别为等于2. 57ηΜ和< 150pM,37°C )。表I :在25°C和37°C测定的Gl抗体对人和大鼠CGRP的Kd
芯片上的 N-生物素温度(°C) Jcon(IZMs) koff(l/s) T1/2 (h) Kd (ηΜ)
_CGRP______
α-人/食蟹猴__25 1.86 χ IO5 7.80 χ IO'6 24.68 0.042
α-人/食蟹猴__37 5.87 χ IO5 3.63 χ IO'5 5.30 0.063
β-人/食蟹猴__37 4.51 χ IO5 <6.98 χ IO'5 2.76 <0.155
_α-大鼠__25 5.08 x IO4 6.18 x IQ'5 3.12 1.22
_cx-大鼠__37 1.55 χ IO5 3.99x 10-4 0.48 2.57
_β-大鼠__37 5.16 χ IO5 <7·85χ1(Γ5 2.45 <0.152GlFab从α -人、β -人和β -人-CGRP的解离发生的很慢。因此，除非对解离期进行很长时间的观察，无法精确测定否则解离速率(k。^)。作为通用的经验法则，结合应答在允许报告精确的解离速率的解离时间内衰减至少5%。不过，基线漂移妨碍在Biacore上监测长解离时间，对于以动力学分析所需的低表面能力进行工作时，这尤其具有挑战性。在本研究中，对a-CGRP的解离期观察了两个小时，而对β-CGRP仅为20分钟。结果，β-CGRP的解离速率无法象a-CGRP的解离速率那样得到精确的解析。不过，当在同一芯片上在相同条件下使用20分钟的解离时间进行并列分析时，Gl对α -人/食蟹猴、β -人/食蟹猴和β -大鼠CGRP具有基本上相同的结合动力学(KD = 150pM，37°C )。表2给出了抗体G2的结果。抗体G2对α -大鼠CGRP的结合亲和力(Kd = O. 9ηΜ，25°C )高于对α -和β -人CGRP的结合亲和力(Kd分别为19ηΜ和20nM，25°C )。在这一测定格式中没有检测G2结合β-大鼠CGRP，但在反向定位测定格式中发现其对1和0-人CGRP显示出相当的结合特征(数据未显示)。表2 :在25°C和37°C测定的G2抗体对人和大鼠CGRP的Kd
权利要求
1.治疗个体的内脏痛和/或一或多种内脏痛症状的方法，包括给患有内脏痛或具有发 >生内脏痛的风险的个体施用治疗有效量的抗CGRP拮抗性抗体。
2.权利要求I的方法，其中所述内脏痛与功能性肠紊乱(FBD)相关。
3.权利要求2的方法，其中所述FBD选自胃食管反流、消化不良、肠易激综合征(IBS)和功能性腹痛综合征(FAPS)。
4.权利要求I的方法，其中所述内脏痛与炎性肠病(IBD)相关。
5.权利要求4的方法，其中所述IBD选自克罗恩病、回肠炎和溃疡性结肠炎。
6.权利要求I的方法，其中所述内脏痛与肾绞痛、痛经、膀胱炎、月经期、分娩、绝经期、前列腺炎或胰腺炎相关。
7.权利要求6的方法，其中所述内脏痛与间质性膀胱炎(IC)相关。
8.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP拮抗性抗体以50nM或更低的Kd(通过表面等离子共振在37°C測定)结合CGRP ;和/或具有至少7天的体内半衰期。
9.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP拮抗性抗体特异性结合CGRP的C端区域。
10.权利要求9的方法，其中所述抗CGRP拮抗性抗体特异性识别序列GSKAF(SEQ IDNO 39)所限定的表位。
11.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP抗体包含VH结构域，所述VH结构域具有SEQID NO :1或19所示的氨基酸序列。
12.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP抗体包含VL结构域，所述VL结构域具有SEQID NO :2或20所示的氨基酸序列。
13.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP抗体包含至少ー种⑶R，所述⑶R选自以下一组(a)SEQ ID NO :3、21、33、34、36 或 37 所示的 CDR Hl;(b)SEQID NO :4、22、35 或 38 所示的 CDR H2 ；(c)SEQ ID NO :5 或 23 所示的 CDR H3 ；(d)SEQ ID NO 6 或 24 所示的 CDR LI ；(e)SEQ ID NO :7 或 25 所示的 CDR L2 ;和(f)SEQ ID NO 8 或 26 所示的 CDR L3。
14.权利要求I的方法,其中所述抗CGRP抗体包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，所述VL结构域具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
15.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP抗体由ATCC登记号为PTA-6867和/或PTA-6866的表达载体产生。
16.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP抗体包含 SEQ ID NO 11所示的抗体Gl重链全抗体氨基酸序列，具有或不具有C端赖氨酸；和 SEQ ID NO 12所示的抗体Gl轻链全抗体氨基酸序列。
17.权利要求I的方法，其中所述抗CGRP抗体包含 SEQ ID NO 29所示的抗体G2重链全抗体氨基酸序列；和 SEQ ID NO 30所示的抗体G2轻链全抗体氨基酸序列。
18.用于治疗和/或预防个体的内脏痛和/或内脏痛症状的药物组合物，其包含抗CGRP拮抗性抗体和药用可 接受的载体，其中所述组合物被制备为用于外周施用。
全文摘要
本发明涉及用于通过施用抗CGRP拮抗性抗体来预防或治疗内脏痛的方法，所述内脏痛包括与功能性肠紊乱、炎性肠病和间质性膀胱炎相关的疼痛。
文档编号A61K39/395GK102740884SQ201080038586
公开日2012年10月17日 申请日期2010年8月23日 优先权日2009年8月28日
发明者A·A·皮奥斯, D·L·谢尔顿, J·泽勒, K·T·波尔森 申请人:瑞纳神经科学公司