专利名称：具有抗炎和抗凝活性的肝素辅因子ii片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质，即肝素辅因子II(HCII)的新型多肽及其在治疗和预防炎症和/或过度凝固中的用途。具体而言，本发明提供了用于医学，例如用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的多肽，所述多肽包含SEQ ID N0:1至3的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或，由SEQ ID N0:1至3的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成。
背景技术：
传染病和炎性疾病每年在全世界造成数百万例死亡，而且招致巨大的健康护理成本。疾病谱较宽，并且包括与给定病原体具有直接关联的急性疾病，诸如丹毒、败血症、肺炎和许多其它感染，及慢性疾病，其中微生物经常引起长时间的炎性状态。败血症是一种感染诱导的以全身性炎性状态为特征的综合征，并且代表手术患者中的、免疫受损患者中的、或与烧伤有关的常见并发症。重度败血症是一种常见的、昂贵的且经常是致命的状况，每年全世界记录180万例发生，但是此数目受到许多国家的低诊断率和追踪败血症的困难的混淆。估计发生率为3/1000，每年的实际病例数目达到1800万，并且死亡率为几乎30%，它变为全世界死亡的主要原因。败血症平均花费为每名患者22000美元，并且因此其治疗对医院的财政资源具有极大的影响，仅美国每年就花费167亿美元。治疗患有败血症的ICU患者的成本比治疗没有败血症的患者的成本大6倍。在其它背景中，有害的炎性级联由与细菌性不同的机制，诸如在创伤期间、手术、体外循环、缺血、烧伤、药物反应、失血性休克、中毒性表皮坏死松解症、输血反应启动，导致ARDS或SIRS。慢性阻塞性肺病症(COPD)指一批以对肺毛细管的气流的不可逆的且进行性的下降为特征的气道慢性病症。虽然几种因素促成coro的形成，但是吸烟和复发性感染是最重要的原因。coro主要在长期吸烟者中从他们快40岁(late-30s)时形成，并且逐渐以不可逆的方式形成。根据WHO在2007年估计，目前存在着2. 10亿COPD患者，并且300万人在2005年死于COPD。WHO还预测COPD到2030年会变为全世界死亡的第四位原因。预期几项因素促成这种增长，包括增加的诊断率、缺乏逆转炎性疾病进展的治疗、及全球老龄化人口负担。微生物引起和/或加剧疾病谱，包括细菌性结膜炎和角膜炎、耳炎、术后和烧伤创面感染、慢性腿溃疡、肺炎、和囊性纤维化。因此，需要解决感染的新药剂，并且对AMP作为新治疗形式的潜在用途具有重大的兴趣(Marr, A. K. , ff. J. Gooderham 等(2006). CurrOpin Pharmaco16 (5) : 468-472)。考虑针对常规抗生素的抗性问题增加，抗微生物肽最近已经作为潜在的治疗候选物出现。AMP提供了针对几乎所有生物体中的侵入性微生物的第一线防御(Tossi，A.，L.Sandri 等(2000) · Biopolymers 55(I) : 4-30 ；Lehrer, R. I. and T. Ganz(2002).CurrOpin Hematol 9(I):18-22 ；Zasloff, Μ. (2002). Nature 415 (6870):389-95 ；Yount, N.Y. , A. S. Bayer 等(2OO6) · Biopolymers 84:435-458 ；Harder, J. , R. Glaser 等(2OOT7)-JEndotoxin Res 13 (6) : 317—38)。理想地，AMP应当展现出高的杀菌性效力，而针对(人)真核细胞则展现低毒性。目前采用各种策略，诸如使用组合文库方法(Blondelle，S.E.和 K. Lohner (2000). Biopolymers 55 (I) : 74-87)、由 D-氨基酸组成的立体异构体(Sajjan, U. S.，L. T. Tran 等(2001) · Antimicrob Agents Chemother 45(12):3437-44)或环形 D, L-α -妝(Fernandez-Lopez, S. , H. S. Kim 等(2001). Nature 412(6845):452-5)、基于高通量的筛选测定法(HiIpert, K.，R. Volkmer-Engert 等(2005) · Nat Biotechnol23(8) :1008-12 ;Taboureau, O.，O. H. Olsen等(2006). Chem Biol Drug Des 68 ⑴48-57)、定量结构-活性关系(QSAR)方法(Hilpert, K. , R. Volkmer-Engert 等(2005). NatBiotechnol 23(8):1008-12 ;Marr，A. K.，W. J. Gooderham 等(2006) · Curr Opin Pharmacol6 (5) : 468-472 Jenssen, H. , T. Lejon 等(2007) · Chem Biol Drug Des 70(2) :134-42 ；Pasupuleti, Μ. , B. Walse 等(2008). Biochemistry 47 (35):9057-70)、及鉴定内源妝(Papareddy,P.，V.Rydengard 等 PLoS Pathog 6 (4):el000857 ；Nordahl, E. A. , V.Rydengard 等(2005). J Biol Chem 280 (41) : 34832-9 ；Malmsten, Μ. , M. Davoudi 等(2006).Matrix Biol 25(5):294-300 ；Malmsten, M. , M. Davoudi 等(2007)·Growth Factors25(1) :60-70 ;Pasupuleti，M.，B. Walse 等(2007) · J Biol Chem 282(4) :2520-8)来鉴定选择性且治疗上感兴趣的 AMP(Hancock，R. E.和 H. G. Sahl (2006). Nat Biotechnol24 (12):1551-7 ;Marr,A.K.，W.J.Gooderham 等(2006) · Curr Opin PharmacoI6(5) :468-472)。尽管这些方法有潜力，但是考虑低免疫原性及固有的其它生物学功能，天然存在的肽表位在治疗背景中可以显示优点。凝固级联也代表响应损伤和感染而激活的基础系统(Davie, E. ff. andJ.D.Kulman, Semin Thromb Hemost, 2006. 32 增刊 I:ρ· 3-15 ;Bode, W.，Semin ThrombHemost, 2006. 32增刊I:p. 16-31)。经由一系列级联样蛋白酶激活步骤,形成凝血酶,导致血纤蛋白原降解和凝块形成。凝固级联受多种调节蛋白，诸如肝素辅因子II (HCII)、抗凝血酶III (ATIII)(即两种丝氨酸蛋白酶抑制剂，serpins)、蛋白C抑制剂、和组织因子蛋白酶抑制剂(TFPI)控制。此外，富含组氨酸的糖蛋白可以通过与血纤蛋白原及血纤维蛋白溶酶原相互作用而调控凝固。肝素辅因子II是一种以约80ug/ml存在于血浆中的66. 5kDa，480个氨基酸的糖蛋白。然而，虽然HCII阻断游离的和凝块结合的凝血酶，但是其确切的生理学作用没有得到完全了解。与抗凝血酶III相似，HCII对凝血酶的抑制被糖胺聚糖诸如肝素加速(Tollefsen, 1995Thromb Haemost. 74 (5) : 1209-14.)。虽然 ATIII 缺乏明显与血检形成关联，但是HCII纯合缺陷小鼠在正常条件下没有血栓形成倾向(thrombophilia)。HCII的血浆浓度在炎症和感染期间显著降低(Noda等(2002)，Clin. Appl. Thromb.Hemost.，8 (3): 265-271)。实际上，最近的证据提示了 HCII的主要生理学功能是抑制凝血酶的非止血作用，诸如在动脉粥样硬化的形成中(Rau, J. C.，L. M. Beaulieu等(2007) ·J Thromb Haemost 5增刊1:102-15)。还已经显不了 HCII可以发挥血管外凝血酶抑制剂的功能，并且可以在调节伤口愈合中发挥作用(Hoffman, Loh等2003)，此外，已经在对HCII 的蛋白水解后描述了趋化性产物(Hoffman, M.，C. W. Pratt 等(1990). J Leukoc Biol48(2) :156-62)，这进一步说明了这种抗蛋白酶的潜在隐性生物学活性。关于HCII的结构 研究已经揭示了该分子经历不寻常的构象变化，称作压缩至松弛(S至R)转变。发明人已经意想不到地发现，源自HCII的一系列肽具有抗炎和抗凝功能，如此，代表HCII衍生肽的先前未知的特性。
本发明寻求提供用于医学，例如用于治疗或预防炎症和/或血液过度凝固的源自肝素辅因子II的新多肽剂。发明概沭本发明的第一方面提供了用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的多肽，所述多肽包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质，即肝素辅因子II的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由该氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成，其中所述片段、变体、融合物或衍生物展现出抗炎和/或抗凝活性。本发明源自发明人意想不到的发现，即调控血液凝固的天然存在的蛋白质(诸如肝素辅因子II)在其内部区域内包含展现出抗炎活性的“隐蔽肽”。认为此类肽可以通过响应伤口和其它生理学考验而切割亲本抗蛋白酶全蛋白质来“释放”或者它们代表全蛋白质中在蛋白水解和R形式形成期间活化的活性表位。如此，本发明的多肽构成一种新颖的且先前未披露的宿主防御肽(HDP)类别，其具有针对与炎症有关的病症和状况的治疗潜力。“调控血液凝固的天然存在的蛋白质”包括所有调控血液凝固的天然存在的蛋白质，其或是正向或是负向调控血液凝固过程。此类调控活性可以通过本领域中公知的方法，例如使用活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测试、凝血酶原时间(PT)测试、或凝血酶凝结时间(TCT)测试来测定。此外，可以实施前激肽释放酶活化或因子X和其它凝固因子活性的具体测量。本领域技术人员应当领会，天然存在的蛋白质可以直接或间接调控血液凝固。“源自”调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列意指氨基酸序列存在于天然存在的蛋白质的氨基酸序列内。例如，在一个实施方案中，氨基酸序列可以来自天然存在的蛋白质中调控血液凝固的区域。“抗炎活性”意指降低或预防与炎性事件有关的一种或多种生物学过程的能力。可以使用本领域中公知的方法，例如通过测量LPS诱导的促炎性细胞因子自巨噬细胞的释放(例如TNF a、IL-6、IF_ Y )，或嗜中性粒细胞的释放来测定多肽的此类抗炎活性(见下文实施例)。其它相关测定法包括脂磷壁酸质、酵母聚糖、DNA、RNA、鞭毛蛋白或肽聚糖在上述系统中的效果及在转录水平测定调节(例如基因阵列、qPCR等)。此外，也可以使用树突细胞活化或凝血细胞活化作为抗炎活性的量度。“抗凝活性”意指延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶凝结时间(TCT)和/或活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的能力。或者，可以通过与或不与肽和组织因子一起的大肠杆菌(E. coli)LPS刺激外周血单个核细胞(PBMNC)，并且可以测量在添加人血浆后接着的凝块形成，或者全血的凝结时间。本领域技术人员应当领会，本发明涵盖包含源自肝素辅因子II (其调控血液凝固)的氨基酸序列及保留抗炎活性的此类氨基酸序列的片段、变体、融合物和衍生物，或由该氨基酸序列及保留抗炎活性的此类氨基酸序列的片段、变体、融合物和衍生物组成的多肽。然而，优选地，多肽不是天然存在的蛋白质，例如全蛋白质(尽管当然应当领会，多肽可以构成天然存在的蛋白质的不完全部分或片段)。 在本发明的多肽的一个实施方案中，多肽包含肝素结合域。“肝素结合域”意指多肽内能够在生理学条件下结合肝素的氨基酸序列。此类序列经常包含XBBXB和XBBBXXB (其中B=碱性残基，且X=亲水性或不带电荷的残基)，或碱性氨基酸的簇(XBX，XBBX, XBBBX)。以非碱性残基间隔此类簇(ΒΧΒ,ΒΧΧΒ)也可以存在。另外，碱性氨基酸间约20人的距离构成肝素结合的前提。本领域技术人员应当领会，肝素辅因子II可以来自人或非人来源。例如，肝素辅因子II可以源自(直接或间接)非人哺乳动物，诸如猿(例如，黑猩猩、倭黑猩猩(bonobo)、大猩猩、长臂猿和猩猩)、猴(例如，猕猴、狒狒和疣猴)、啮齿类(例如小鼠、大鼠)或有蹄动物(例如，猪、马和母牛)。在一个优选的实施方案中，肝素辅因子II是人肝素辅因子II (例如，见SwissPort 登录号 P05546)。例如，所述多肽可以包含如下SEQ ID N0S:1至3中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SE Q ID N0S:1至3中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成“KYE28” KYEITTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLR [SEQ ID NO: I] “KYE21”KYEITTIHNLFRKLTHRLFRR [SEQ ID NO :2] “NLF20”:NLFRKLTHRLFRRNFGYTLR [SEQ ID NO :3]所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQ ID N0S: I至3中任一项的抗炎和/或抗凝活性。本领域技术人员应当领会，如本文中所使用的，术语“氨基酸”包括标准的20种遗传编码的氨基酸及其相应的“D”形式的立体异构体(与天然的“L”形式相比)、Ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规的氨基酸(例如，α，α-双取代氨基酸、N-烃基氨基酸等)和经化学衍生化的氨基酸(见下文)。在明确列举氨基酸，诸如“丙氨酸”或“Ala”或“Α”时，术语指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者，除非另有明确规定。其它非常规的氨基酸也可以是适合于本发明多肽的组分，只要多肽保留期望的功能性特性。对于显示的肽，每个编码的氨基酸残基(在适当的情况中)由对应于常规氨基酸俗名的单字母名称代表。在一个实施方案中，本发明的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。在多肽包含依照参照序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO: I至3)情况中，它可以包含超出参照序列的在其N和/或C端的额外氨基酸，例如多肽可以包含在其N端的额外氨基酸。同样地，在多肽包含依照参照序列的氨基酸序列的片段、变体或衍生物的情况中，它可以包含在其N和/或C端的额外氨基酸。在又一个实施方案中，多肽包含依照参照序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO: I至3)的片段或由该片段组成。如此，多肽可以包含所述参照序列的至少5个连续氨基酸或由所述参照序列的至少5个连续氨基酸组成，例如，例如SEQ ID NO: I的至少6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26 或 27 个连续氨基酸。在一个实施方案中，多肽片段以选自下组的氨基酸残基开始SEQ ID N0:1的氨基酸残基 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22 和 23。或者 / 另夕卜，多肽片段可以以选自下组的氨基酸残基终止SEQ ID NO: I的氨基酸残基5，6，7，8，9，IO, 11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26 或 27。例如，多肽片段可以包含SEQ ID NO: I的氨基酸9至28或由SEQ ID NO: I的氨基酸9至28组成。
本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以包含依照参照序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO: I至3)的变体或所述变体的片段或由所述变体或所述变体的片段组成。此类变体可以是非天然存在的。多肽的“变体”包括插入、缺失和取代，其或是保守的或是非保守的。例如，保守取代指将相同通用类别(例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸)内的氨基酸用相同类别内的另一种氨基酸的取代。如此，保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的意义是本领域中 公知的。特别地，包括展现出抗炎活性的多肽的变体。在又一个实施方案中，变体具有与依照参照序列的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO: I至3)或其片段具有至少50%同一性，例如至少55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或至少99%同一性的氨基酸序列。可以使用合适的计算机程序,例如威斯康辛大学(University of Wisconsin)Genetic Computing Group的GAP程序来测定两种多肽间的百分比序列同一'丨生,并且应当领会，相对于其序列已经得到最佳比对的多肽计算百分比同一性。或者，可以使用Clustal W程序来实施比对(如记载于Thompson等，1994，Nuc.Acid Res. 22:4673-4680的，通过提及而将其收入本文)。所使用的参数可以如下快速成对比对参数K-元组(字)大小1，窗大小5，缺口罚分3，顶部对角线的数目5。得分方法χ百分比。多比对参数缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0. 05。得分矩阵BL0SUM。或者，可以使用BESTFIT程序来测定局部序列比对。在一个实施方案中，可以将来自上述参照序列的氨基酸突变以降低对多肽的蛋白水解降解，例如通过I，F至W修饰来进行(见Stromstedt等,Antimicrobial AgentsChemother 2009,53,593)。可以使用重组多核苷酸使用本领域中公知的蛋白质工程和定点诱变的方法来生成变体(见例如，见 Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第 3 版，Sambrook &Russell, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press,通过提及而将其收入本文)。在一个实施方案中，多肽包含作为上述氨基酸序列(例如SEQ ID N0S: I至3)之任一的物种同源物的氨基酸或由该氨基酸组成。“物种同源物”包括多肽对应于来自非人物种的等同蛋白质内的相同氨基酸序列，即所述多肽与SEQ ID N0S: I至3之任一展现出最大序列同一性(例如，如通过GAP或BLAST序列比较所测量的)。通常，物种同源物多肽会与人参照序列(即，SEQ ID N0S: I至3)具有相同长度。 在又一个实施方案中，多肽包含融合蛋白或由融合蛋白组成。多肽的“融合物”包括对应于与任何其它多肽融合的参照序列(例如SEQ ID NO: I至3，或其片段或变体)的氨基酸序列。例如，所述多肽可以与多肽诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A融合以便于纯化所述多肽。此类融合物的例子是本领域技术人员公知的。类似地，所述多肽可以与寡组氨酸标签诸如His6或被抗体识别的表位诸如公知的Myc标签表位融合。另外，可以使用包含疏水性寡肽末端标签的融合物。本发明的范围中还包括与所述多肽的任何变体或衍生物的融合物。应当领会，保留期望特征，诸如抗炎活性的融合物(或其变体或衍生物)是优选的。
融合物可以包含对本发明的所述多肽赋予期望特征的别的部分；例如，所述部分可用于检测或分离多肽，或促进多肽的细胞摄取。所述部分可以例如是生物素模块、链霉亲合素模块、放射性模块、荧光模块，例如小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团，如本领域技术人员公知的。模块可以是免疫原性标签，例如Myc标签，如本领域技术人员已知的，或者可以是能够促进多肽的细胞摄取的亲脂性分子或多肽域，如本领域技术人员已知的。本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以包含一个或多个例如通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的氨基酸。如本领域中领会的，PEG化的蛋白质可以展现出降低的肾清除和蛋白水解、降低的毒性、降低的免疫原性和升高的溶解度[Veronese, F. M.和J. M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4) :p. 453-6. , Chapman, A. P. , Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4) :p. 531-45.]。已经对几种基于蛋白质的药物，包括第一种PEG化的分子天冬酰胺酶和腺苷脱氨酶采用PEG化[Veronese, F. Μ.和 J. M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4) :p. 453-6. ,Veronese,F. M. and G. Pasut, Drug Discov Today, 2005. 10 (21) :p. 1451-8.]。为了获得具有最大延长的半衰期和保留的生物学活性的成功PEG化的蛋白质，可以影响后果的几项参数是重要的，并且应当进行考虑。PEG分子可以存在不同，并且已经用于蛋白质PEG化的PEG变体包括PEG及单甲氧基-PEG。另外，它们可以或是线性的或是分支的[Wang, Y. S.等，Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4) :p. 547-70] 所使用 PEG 分子的大小可以存在变化，并且已经将大小范围为l_40kDa的PEG模块与蛋白质连接[Wang，Y.
S.等，Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54 (4) :p. 547-70., Sato, H. , Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4) :ρ· 487-504, Bowen, S.等,Exp HematoI, 1999. 27 (3) :ρ· 425-32，Chapman, A. P.等，NatBiotechnol, 1999. 17(8) :p. 780-3]。另外，附接于蛋白质的PEG模块的数目可以存在变化，并且已经报告了 1-6个PEG单元附接于蛋白质的例子[Wang, Y. S.等，Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4) :ρ· 547-70. , Bowen, S.等，Exp HematoI, 1999. 27(3) :ρ· 425-32]。此外，已经利用了供缀合用的各种反应基团以及PEG间接头的存在或缺乏。如此，PEG可以与N端氨基连接，或者与具有反应性氨基或羟基基团的氨基酸残基(Lys，His，Ser，Thr和Tyr)直接连接或者通过使用Y-氨基丁酸作为接头来连接。另外，PEG可以与羧基(Asp，Glu，C端)或巯基(Cys)基团偶联。最后，可以使用酶转谷氨酰胺酶来特异地将Gln残基PEG化，并且已经描述了 PEG 的烃基胺衍生物[Sato, H.，Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4) :ρ· 487-504]。已经显示了提高PEG化的程度导致体内半衰期延长。然而，本领域技术人员应当领会，PEG化过程会需要以个体为基础对特定蛋白质进行优化。PEG可以在天然存在的二硫键处偶联，如记载于WO 2005/007197的。可以经由添加不损害蛋白质的三级结构的化学桥来稳定二硫键。这允许利用构成二硫键的两个硫的缀合硫醇选择性来创建用于对PEG进行位点特异性附接的桥。由此，避开了需要将残基工程化改造到肽中以附接于靶分子。也可以共价缀合多种备选的嵌段共聚物，如记载于WO 2003/059973的。治疗性聚合缀合物可以展现出改善的热特性、结晶、粘着、膨胀、涂层、PH依赖性构象和生物分布。此夕卜，它们可以实现延长的循环、在通过胞饮对缀合物细胞摄取后在次级溶酶体的蛋白水解和酸性环境中释放生物活性物及由于大分子的特征所致的更有利的物理化学特性(例如在生物学流体中药物溶解度增加)。嵌段共聚物(包括亲水性和疏水性嵌段物)在溶液中形成聚合微团。在微团解离后，个别的嵌段共聚物分子被安全地排泄。也可以通过与功能性侧基的反应来实现一种或多种氨基酸的化学衍生物。此类衍生化的分子包括例如那些其中的游离氨基基团已经被衍生化以形成胺氢氯化物、对甲苯磺酰基基团、羧基苯甲酸基基团、叔-丁基氧羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团的分子。 可以将游离的羧基基团衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯和酰肼。可以将游离的羟基基团衍生化以形成O-酰基或O-烃基衍生物。作为化学衍生物还包括那些含有20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如可以用4-羟基脯氨酸取代脯氨酸；可以用5-羟基赖氨酸取代赖氨酸；可以用3-甲基组氨酸取代组氨酸；可以用高丝氨酸取代丝氨酸，及用鸟氨酸取代赖氨酸。衍生物还包括含有一处或多处添加或缺失的肽，只要必需的活性得到保留。其它包括的修饰是酰胺化、氨基端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨水或甲胺进行)等末端修饰。本领域技术人员应当进一步领会，肽模拟化合物也可以是有用的。如此，“多肽”包括具有抗炎活性的肽模拟化合物。术语“肽模拟物”指模拟作为治疗剂的特定肽的构象和期望的特征的化合物。例如，本发明的多肽不仅包括其中的氨基酸残基通过肽(-C0-NH-)连接相连的分子，而且还包括其中的肽键反转的分子。此类反-逆(retro-inverso)肽模拟物可以使用本领域中已知的方法，例如诸如那些记载于Meziere等(1997) J. Immunol. 159, 3230-3237 (通过提及而将其收入本文)的方法来生成。此方法牵涉生成含有涉及主链而非侧链取向的变化的假肽。反-逆肽(其含有NH-CO键代替CO-NH肽键)对蛋白水解的抗性多得多。或者，本发明的多肽可以是肽模拟化合物，其中一个或多个氨基酸残基通过—I (CH2NH)-键代替常规酰胺连接来连接。在又一个备选中，可以将肽键一起分配，只要使用保留氨基酸残基的碳原子间的间隔的合适接头模块；接头模块与肽键具有基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性可能是有利的。应当领会，多肽可以在其N或C端区处方便地封闭，从而帮助降低对外切蛋白水解消化的易感性。也已经使用多种未编码的或经修饰的氨基酸诸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸来修饰哺乳动物肽。另外，可以通过共价修饰，诸如环化或者通过掺入内酰胺或其它类型的桥来稳定假设的生物活性构象，例如见Veber等，1978，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636和Thursell 等,1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166,通过提及而将其收入本文。许多合成策略间的共同主题是将一些环形模块导入基于肽的框架中。环形模块限制肽结构的构型空间，并且这经常导致肽对特定生物学受体的特异性升高。此策略的附加优点在于对肽导入环形模块也可以生成具有对细胞肽酶的敏感性降低的肽。如此，本发明的例示性多肽包含末端半胱氨酸氨基酸。此类多肽可以以通过末端半胱氨酸氨基酸中的硫醇(mercaptide)基团的二硫键形成得到的杂环形式(heterodeticcyclic form)或者以通过末端氨基酸间的酰胺肽键形成得到的纯形式(homodetic form)存在。如上文所指示的，经由N和C端区半胱氨酸间的二硫键或酰胺键环化小肽可以通过降低蛋白水解，而且还提高结构的刚性(这可以产生特异性更高的化合物)来避开有时在线性肽情况下观察到的特异性和半衰期的问题。通过二硫键环化的多肽具有游离的氨基和羧基端，其仍可能易感蛋白水解降解，而通过N端胺和C端羧基间的酰胺键形成环化的肽因此不再含有游离的氨基或羧基端。如此，本发明的肽可以或是通过C-N连接或是通过二硫化物连接相连。本 发明不以任何方式受限于肽环化方法，而是涵盖可以通过任何合适的合成方法实现其环形结构的肽。如此，杂连接可以包括但不限于经由二硫化物、亚烃基(alkylene)或硫化物桥的形成。合成纯环肽和杂环肽(包括二硫化物、硫化物和亚烃基桥)的方法披露于US 5，643，872，通过提及而将其收入本文。环化方法的其它例子包括经由点击化学(click chemistry)、环氧化物、醒-胺反应的环化，以及US 6，008，058 (通过提及而将其收入本文)中披露的方法。合成环形稳定化肽模拟化合物的别的方法是闭环复分解(ring-closingmetathesis, RCM)。此方法牵涉如下的步骤，即合成肽前体，并使其接触RCM催化剂以生成构象约束肽(conformationalIy restricted peptide)。合适的肽前体可以含有两个或更多个不饱和C-C键。可以使用固相-肽-合成技术来实施所述方法。在此实施方案中，使锚定于固体支持物的前体接触RCM催化剂，然后，自固体支持物切割产物以生成构象约束肽。由 D. H. Rich 于 Protease Inhibitors, Barrett 和 Selveson 编，Elsevier (1986)(通过提及而将其收入本文)披露的另一种方法已经经由应用酶抑制剂设计中的过渡态类似物概念来设计肽模拟物。例如，已知staline的仲醇模拟胃蛋白酶底物的易切断酰胺键的四面体过渡态。总之，如公知的，末端修饰可用于降低蛋白酶消化的易感性，并且因此延长肽在溶液中，特别在可存在蛋白酶的生物学流体中的半衰期。由于通过环化形成的稳定结构及考虑到对环肽观察到的生物学活性，多肽环化也是一种有用的修饰。如此，在一个实施方案中，本发明的第一方面的多肽是线性的。然而，在一个备选的实施方案中，多肽是环形的。本领域技术人员应当领会，本发明的多肽可以具有各种长度。然而，通常，多肽的长度为10-200个氨基酸，例如长度为10-150、15-100、15-50、15-30、17-30、或17-28个氨基酸。例如，多肽的长度可以是至少20个氨基酸。如开始时所述，抗炎活性是本发明多肽共同的特征。在一个实施方案中，多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞，诸如单核细胞衍生的巨噬细胞的释放，包括巨噬细胞抑制因子、TNF-α、HMGBl、C5a、IL-17, IL_8、MCP-I、IFN- y ,11-6、IL-lb、IL-12。抗炎性IL-10可以不受影响或者瞬时升高。其它标志物也可能受到影响这些包括单核细胞和内皮细胞上的组织因子、原降钙素、CRP、活性氧类别、缓激肽、一氧化氮、PGE1、血小板活化因子、花生四烯酸代谢物、MAP
激酶活化。特别地，所述多肽在下列一种或多种模型中可以展现出抗炎活性⑴使用LPS、LTA、酵母聚糖、鞭毛蛋白、尘螨、病毒或细菌DNA或RNA、或肽聚糖作为刺激物的体外巨噬细胞模型；(ii)内毒素休克的体内小鼠模型；和/或(iii)或是与抗微生物疗法组合或是单独给予的体内感染模型。
在本发明的又一个实施方案中，多肽展现出抗凝活性。“抗凝活性”意指降低或预防凝固(即血液凝结)或相关信号或效应的能力。此类活性可以通过本领域中公知的方法，例如使用活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测试、凝血酶原时间(PT)测试、或凝血酶凝结时间(TCT)测试来测定。此外，可以实施前激肽释放酶活化或因子X和其它凝固因子活性的具体测量。本领域技术人员应当领会，多肽可以抑制外因性凝血途径和/或内因性凝血途径。然而，在一个优选的实施方案中，多肽(至少部分)抑制内因性凝血途径。在本发明的又一个实施方案中，多肽展现出Toll样受体(TLR)阻断活性。此类受体阻断活性可以使用本领域中公知的方法，例如通过分析合适的下游效应物，诸如iNOS、核因子K B和细胞因子来测量。由于拥有抗炎活性，本发明的第一方面的多肽意图用于治疗或预防炎症。“治疗或预防炎症”意指本发明的多肽能够(至少部分)预防或抑制一种或多种构成炎症或与炎症有关的症状、信号或效应。本领域技术人员应当领会，对炎症的抑制可以为全部或部分。在一个优选的实施方案中，与尚未暴露于多肽的细胞或个体相比，多肽能够将一种或多种炎症标志物抑制20%或更多，例如至少30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%或更多。有利地，本发明的多肽能够选择性治疗或预防炎症。“选择性”意指多肽以比其调控其它生物学功能更大的程度抑制或预防炎症。优选地，多肽或其片段、变体、融合物或衍生物仅抑制或预防炎症。然而，在又一个实施方案中，多肽还(或备选地)抑制或预防血液凝固。如上文，本领域技术人员应当领会，对凝固的抑制可以为全部或部分。在一个优选的实施方案中，与尚未暴露于多肽的细胞或个体相比，多肽能够将一种或多种凝固的量度和或标志物抑制20% 或更多，例如至少 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 或更多。在一个实施方案中，多肽用于治疗或预防与感染有关的炎症(即由感染引起的或仅与感染共呈现的)。在本发明的优选的但非限制性的实施方案中，多肽用于治疗或预防选自下组的疾病、状况或适应症i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克。其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎；ii)慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、coro和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症。 iii)术后炎症,炎性和凝固性病症,包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用。此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘。iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固。
v)与抗微生物治疗组合的过度炎症。使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内(iv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内(intratechal)、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用。药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。例如，多肽可以用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、创伤、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和/或弥散性血管内凝固(DIC)。在一个实施方案中，多肽展现出抗炎和抗凝活性两者，并且可以在伴随治疗或预防炎症和凝血中使用。此类多肽可特别适合于治疗和预防期望炎性和促凝过程两 者受到组合抑制的状况，诸如败血症、慢性阻塞性肺病症(COPD)、血栓形成、DIC和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。此外，其它与过度炎症和凝固变化有关的疾病可以受益于通过多肽的治疗，诸如囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎。在又一个实施方案中，本发明的多肽与一种或多种别的治疗剂组合使用。例如，本发明的多肽可以与抗生剂(antibiotic agent)、抗炎剂、免疫抑制剂和/或防腐剂以及血管活性剂和/或受体阻断剂或受体激动剂组合施用。使用的抗微生物剂可以iv、Sc、im、鞘内、口服、或表面(topically)应用。药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。例如，本发明的肽可以充当防腐处理的佐剂，例如对伤口的银/PHMB处理以淬灭LPS效应。如此，本发明的肽可以充当佐剂(用于阻断炎症)以补充对内部或外部感染(诸如丹毒、肺感染，包括真菌性感染、败血症、C0PD、伤口、和其它上皮感染)的抗生素、防腐剂和/或抗真菌处理。同样地，本发明的肽可以充当防腐处理的佐剂，例如对伤口的银/PHMB处理以淬灭LPS效应。在一个实施方案中，本发明的多肽与类固醇，例如糖皮质激素(诸如地塞米松(dexamethasone))组合使用。本发明的第二个相关方面提供了一种分离的多肽，其包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质，即肝素辅因子II的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物，或由源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质，即肝素辅因子II的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成，该多肽展现出抗炎和/或抗微生物和/或抗凝活性，但须该多肽不是天然存在的蛋白质(例如全蛋白质)。“天然存在的蛋白质”在此上下文中指从头(de novo)合成的多肽。然而，不排除体内生成的此类天然存在的全蛋白质的片段。本领域技术人员应当领会，术语诸如片段、变体、融合物或衍生物应当如上文所讨论的涉及本发明的第一方面解释。在一个实施方案中，多肽包含选自SEQ ID N0S: I至3的氨基酸序列，或所述序列的片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由选自SEQ IDNOS: I至3的氨基酸序列，或所述序列片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成。例如，多肽可以包括选自SEQ ID N0S:1至3的氨基酸序列或由选自SEQ ID N0S: I至3的氨基酸序列组成。本领域技术人员应当领会，与本发明的第一方面的多肽有关的上文所讨论的任选特征也与本发明的第二方面的相关多肽相关。例如，在一个优选的实施方案中，多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞的释放(诸如IL-6，IFN- Y，TNF- α，IL-12, IL-I和/或IL-18)。在另一个优选的实施方案中，多肽展现出抗凝活性。本发明还包括上文所描述的多肽的药学可接受酸或碱加成盐。用于制备可用于本发明的上述碱化合物的药学可接受酸加成盐的酸是形成无毒性酸加成盐，即含有 药理学可接受阴离子的盐的酸，诸如氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、蔗糖盐(saccharate)、苯甲酸盐(benzoate)、甲横酸盐(methanesulphonate)、乙横酸盐(ethanesulphonate)、苯横酸盐(benzenesulphonate)、对甲苯横酸盐(p-toIuenesulphonate)和扑酸盐(pamoate)[即，1，I’ -亚甲基-二-(2-羟基-3萘甲酸盐)]盐等。也可以使用药学可接受碱加成盐来生成多肽的药学可接受盐形式。可以作为试剂用于制备自然界中为酸性的本化合物的药学可接受碱式盐的化学碱是那些与此类化合物形成无毒碱式盐的。此类无毒碱式盐包括但不限于那些源自此类药理学可接受阳离子，诸如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的盐、铵或水溶性胺加成盐诸如N-甲基葡糖胺_(甲葡胺)、及低级烷醇铵和药学可接受有机胺的其它碱式盐等。应当领会，可以为了贮存而冻干本发明的多肽，并在使用前在合适的载体中重建，例如经由冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却，或者经由使用超临界二氧化碳的颗粒形成(沉淀)来进行。可以采用任何合适的冻干方法(例如冷冻-干燥、喷雾干燥、饼干燥)和/或重建技术。本领域技术人员应当领会，冻干和重建可以导致不同程度的活性损失，而且可能必须向上调节使用水平来补偿。优选地，冻干的(冷冻干燥的)多肽在再水合时丧失不超过约1%的其活性(冻干前)，或者在再水合时丧失不超过约5%，10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%,或不超过约50%的其活性(冻干前)。用于生成本发明的多肽的方法是本领域中公知的。便利地，多肽是或包含重组多肽。适合于生成此类重组多肽的方法是本领域中公知的，诸如在原核或真核宿主细胞中表达(例如见Sambrook和Russell, 2000, MolecularCloning, A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor, New York,在此通过提及而收录该文件的相关公开内容)。也可以使用商品化的体外翻译系统，诸如兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽裂解物(获自Promega)来生成本发明的多肽。优选地，翻译系统是兔网织红细胞裂解物。便利地，翻译系统可以与转录系统偶联，诸如TNT转录-翻译系统(Promega)。此系统具有在与翻译相同的反应中自编码DNA多核苷酸生成合适的mRNA转录物的优点。本领域技术人员应当领会，可以例如替代性地使用公知的液相或固相合成技术(诸如t-Boc或Fmoc固相肽合成)来人工合成本发明的多肽。如此，本发明范围内包括下列各项(a)本发明的第三方面提供了编码依照本发明的第二方面的多肽的分离的核酸分子;(b)本发明的第四方面提供了包含依照本发明的第三方面的核酸分子的载体(诸如表达载体)；(C)本发明的第五方面提供了包含依照本发明的第三方面的核酸分子或依照本发明的第四方面的载体的宿主细胞；及(d)本发明的第六方面提供了生成依照本发明的第二方面的多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下培养依照本发明的第五方面的宿主细胞群体，并自其分离所述多 肽。本发明的第七方面提供了包含依照本发明的第一方面的多肽及药学可接受赋形齐U、稀释剂或载体的药物组合物。如本文中所使用的，“药物组合物”意指用于治疗或预防与炎症有关的病症和状况的治疗有效的配制剂。如本文中所使用的，“药物组合物”意指用于治疗或预防与炎症有关的病症和状况的治疗有效的配制剂。药物组合物中也可以包含其它化合物，诸如其它肽、低分子量免疫调节剂、受体激动剂和拮抗剂、和抗微生物剂。其它例子包括螯合剂诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。可以以本领域中已知的方式来制备药物组合物，其是贮存时足够稳定的，并且适合于对人和动物施用。可以例如经由冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却，或者经由使用来自超临界颗粒形成的颗粒形成来冻干药物组合物。“药学可接受的”意指不降低活性成分，即抗炎多肽的生物学活性的效率的无毒性材料。此类药学可接受缓冲液、载体或赋形剂是本领域中公知的(见Remington’ sPharmaceutical Sciences,第 18 版，A. R Gennaro 编，Mack Publishing Company (1990)及 handbook of Pharmaceutical Excipients,第 3 版,A. Kibbe 编,PharmaceuticalPress (2000)。术语“缓冲液”意图指以稳定pH为目的的含有酸-碱混合物的水溶液。缓冲液的例子是 Trizma、Bicine, Tricine, MOPS、M0PS0, MOBS、Tris、H印es、HEPBS, MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES, ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD, AMPSO, BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES, DIPSO、EPPS,乙醇胺、甘氨酸、HEPPS0、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE, P0PS0、TAPS、TABS、TAPSO 和 TES。术语“稀释剂”意图指以在药用制剂中稀释肽为目的的水或非水溶液。稀释剂可以是下列一种或多种盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花籽油、玉米油、花生油、棉杆油或之麻油)。术语“佐剂”意图指对配制剂添加以提高肽的生物学效果的任何化合物。佐剂可以是一种或多种胶体银、或具有不同阴离子的锌、铜或银盐，例如但不限于不同酰基组成的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐、和乙酸盐。佐剂也可以是阳离子聚合物诸如PHMB、阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物诸如聚(乙烯基咪唑)、和阳离子多肽诸如多组氨酸、多赖氨酸、多精氨酸、和含有这些氨基酸的肽。赋形剂可以是下列一种或多种碳水化合物、聚合物、脂质和矿物。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露醇、和环状糊精，其被添加至组合物，例如以便于冻干。聚合物的例子是不同程度水解的淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、丙基纤维素、藻酸盐(alginates)、角叉菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚环氧 丙烷共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或具有各种组成的其共聚物、及聚乙烯吡咯烷酮(它们都具有不同分子量)，其被添加至组合物，例如以控制粘性，实现生物粘着，或保护活性成分(也适用于A-C)免于化学和蛋白水解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单、二和三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(均具有不同酰基链长度和饱和度)、卵卵磷脂(egg lecithin)、大豆卵磷脂、氢化的卵和大豆卵磷脂，其出于与聚合物相似的原因被添加至组合物。矿物的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其被添加至组合物以获得诸如降低液体积累或有利的色素特性等益处。药物组合物也可以含有一种或多种单糖或二糖，诸如木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、乳糖醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、麦芽糖醇或木糖苷、和/或单酰甘油，诸如甘油一月桂酸酯(monoIauriη)。载体的特征取决于施用路径。一种施用路径是表面施用。例如，对于表面施用，一种优选的载体是含有活性肽的乳化乳剂，但是可以使用其它常见的载体诸如某些基于矿脂(petrolatum)/矿物的和基于植物的软膏剂，以及聚合物凝胶、液体晶相和微乳。应当领会，药物组合物可以含有本发明的一种或多种多肽，例如1、2、3、或4种不同肽。通过使用不同肽的组合，可以提高抗炎效果。如上文所讨论的，多肽可以以盐，例如与无机酸，诸如氢氯酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸、高氯酸、硫氰酸、硼酸等，或与有机酸诸如甲酸、乙酸、卤代乙酸、丙酸、乙醇酸(glycolic acid)、朽1檬酸、酒石酸、琥拍酸、葡糖酸、乳酸、丙二酸、延胡索酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸(sulfanilic acid)等的酸加合物提供。可以添加无机盐诸如单价钠、钾或二价锌、镁、铜、钙(都具有相应的阴离子)以改善抗微生物组合物的生物学活性。本发明的药物组合物也可以为脂质体形式，其中在其它药学可接受载体外，组合多肽与以聚集形式作为微团、不溶性单层和液态晶体存在的两亲剂(amphipathic agent)诸如脂质。适合于脂质体配制剂的脂质包括但不限于甘油一酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。合适的脂质还包括为了延长血流循环时间而在极性首基中通过聚(乙二醇)修饰的上述脂质。此类脂质体配制剂的制备可参见例如US4，235，871。本发明的药物组合物也可以为生物可降解微球形式。已经在微球的生成中广泛使用脂肪族聚酯诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯(carprolactone)) (PCL)、和聚酸酐作为生物可降解聚合物。此类微球的制备可参见 US 5，851，451 和 EP 213 303。
也可以用通过表面活性剂和嵌段共聚物，优选地那些含有用于延长血流循环时间的聚(氧化乙烯)模块的嵌段共聚物形成的微团系统配制本发明的药物组合物。本发明的药物组合物也可以为聚合物凝胶形式，其中使用聚合物诸如不同程度水解的淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、丙基纤维素、藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚环氧丙烷共聚物、聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯和聚乙烯吡咯烷酮来增稠含有肽的溶液。聚合物也可以包含明胶或胶原。或者，可以将本发明的多肽在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花籽油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液中溶解。药物组合物还可以包含用于增强抗炎多肽作用的离子和限定的pH。本发明的组合物可以进行常规的药学操作诸如灭菌和/或可以含有常规的佐剂诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等，例如如本文中别处公开的。本领域技术人员应当领会，可以局部或系统施用本发明的药物组合物。施用路径包括表面、眼、鼻、肺、含服、胃肠外(静脉内、皮下、和肌肉内)、口服、阴道和直肠。自植入物的施用也是有可能的。合适的制剂形式是例如颗粒剂、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓齐U、糖浆剂、乳剂、微乳(其定义为由水、油和表面活性剂组成的光学上各向同性的热力学稳定性体系)、液晶相(其定义为以长程有序但短程无序为特征的体系(例子包括薄片状、六边形和立方体相，或是水或是油连续的)、或其分散的对应物、凝胶、软膏剂、分散体、悬浮液、乳膏、气雾剂、微滴或安瓿形式的可注射溶液，而且还有具有活性化合物的延长释放的制剂，在该制剂中，通常使用赋形剂、稀释剂、佐剂或载体，如上文所描述的。药物组合物也可以在绷带、石膏或缝合线等中提供。在优选的实施方案中，药物组合物适合于胃肠外施用或表面施用。在备选的优选实施方案中，药物组合物适合于肺施用或鼻施用。例如，可以鼻内或通过吸入来施用本发明的药物组合物，并且方便地以干粉末吸入剂或气雾剂喷雾形式投递，所述气雾剂喷雾通过使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烧、二氯氟_甲烧、二氯四氟_乙烧、氢氟代烧诸如1，I, I, 2-四氟乙烧(HFA 134A3或1，1，1，2，3，3，3_七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其它合适的气体自加压容器、泵、喷雾或喷雾器提供。在加压气雾剂的情况中，可以通过提供阀来决定剂量单位以投递计量的剂量。加压容器、泵、喷雾或喷雾器可以含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂混合物作为溶剂，其可以另外含有滑润剂，例如，山梨聚糖三油酸酯。吸入器或吹入器中使用的胶囊和筒(例如由明胶制成)可以配制成含有本发明多肽和合适的粉末基底诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。优选地，气雾剂或干粉末配制剂排布为使得每个计量的剂量或每“喷(puff) ”含有对患者投递的至少O. Img本发明的多肽。应当领会，用气雾剂的总体每日剂量会在患者间存在变化，并且可以以单剂或者更通常，在一整天中以分开的剂量施用。药物组合物会以药学有效剂量对患者施用。“药学有效剂量”意指就其施用所针对的状况而言足以产生期望的效果的剂量。精确的剂量取决于化合物的活性、施用方式、病症的性质和严重性、患者的年龄和体重，可能需要不同剂量。可以通过以个别剂量单位(否贝U，几个更小的剂量单位)形式的单次施用和还通过特定时间间隔的细分剂量的多次施用来实施剂量施用。本发明的药物组合物可以单独地或与其它治疗剂组合施用，所述其它治疗剂诸如别的抗生素、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂和/或防腐剂(诸如抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂、和抗寄生物剂)。合适的抗生剂的例子包括青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。同样地，药物组合物也可以含有其它抗炎药，诸如类固醇和大环内酰胺(macrolactam)衍生物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物与类固醇，例如糖皮质激素(诸如地塞米松(dexamethasone))组合施用。本领域技术人员应当领会，其它治疗剂可以作为相同药物组合物的一部分掺入或者可以分开施用。在本发明的第七方面的一个实施方案中，药物组合物与要在医学中使用(或是外部或是内部)的装置或材料“结合”。“与…结合”包括用/与本发明的药物组合物(或其多肽)包被、充满、共价结合或以其它方式混合的装置或材料。例如，可以将组合物包被于装置表面，所述装置接触人体或其组分(例如血液)，诸如旁路手术、体外循环、伤口护理和/或透析中使用的装置。如此，可以将组合物包被(coat)、涂刷(paint)、喷雾或以其它方式应用于或混合缝合线、假体、植入物、伤口敷料、导管、镜片、皮肤移植物、皮肤替代物、血纤蛋白胶或绷带等。这样做时，组合物可以对装置或材料赋予改善的抗炎和/或抗凝特性。优选地，用本发明的药物组合物(或其多肽组分)包被装置或材料。“包被”意指将药物组合物应用于装置或材料的表面。如此，可以用包含本发明的药物组合物(或其多肽)的溶液涂刷或喷雾装置或材料。或者，可以将装置或材料浸入包含本发明多肽的溶液的贮液器中。有利地，将装置或材料充满本发明的药物组合物(或其多肽)。“充满”意指将药物组合物掺入装置或材料或以其它方式与装置或材料混合，从而使其遍及分布。例如，可以将装置或材料在包含本发明多肽的溶液中于4° C温育过夜。或者，可以通过蒸发或者通过于室温温育来将本发明的药物组合物(或其多肽)在装置或材料表面上固定化。在一个备选的实施方案中，本发明的多肽与装置或材料(例如在装置或材料的外部表面上)共价连接。如此，多肽上合适的官能团与装置或材料上的官能团间形成共价键。例如，用于将多肽与聚合物支持物的共价键合的方法包括经由重氮中间体的共价连接、通过肽连接的形成、通过结合蛋白上的酚、胺和巯基基团的烷基化、通过使用多官能性中间体来进行，例如戊二醛，及其它各种各样的方法，例如使用硅烷基化玻璃或石英进行，其中玻璃表面的二和三烷氧基硅烷的反应容许具有许多不同官能团的玻璃表面的衍生化。关于详情，见 Enzyme immobilisation by Griffin, Μ. , Hammonds, Ε. J. and Leach, C. K. (1993)In Technological Applications of Biocatalysts(BI0T0L SERIES)，pp. 75-118，Butterworth-Heinemann。还可见综述文章，题目为 iBiomaterials in Tissue Engineering’，Hubbell1J. A. (1995)Science 13:565-576。在一个优选的实施方案中，装置或材料包含聚合物或由聚合物组成。聚合物可以选自下组聚酯(例如聚乳酸、聚乙醇酸或各种组成的聚乳酸-乙醇酸共聚物)、聚原酸酯(polyorthoester)、聚缩醒(polyacetal)、聚脲、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚酰胺)和多糖材料(例如，交联的藻酸盐、透明质酸、角叉菜胶、明胶、淀粉、纤维素衍生物)。或者/另外，装置或材料可以包含金属(例如，钛、不锈钢、金、钛)、金属氧化物 (二氧化硅、氧化钛)和/或陶瓷(磷灰石、羟磷灰石)或者由金属(例如，钛、不锈钢、金、钛)、金属氧化物(二氧化硅、氧化钛)和/或陶瓷(磷灰石、羟磷灰石)组成。此类材料可以为宏观的固体/整料(monolith)形式，作为化学或物理化学交联的凝胶，作为多孔材料，或作为颗粒。如此，本发明另外提供了要在医学中使用的装置和材料，已经对所述装置和材料应用了本发明的多肽或包含本发明的多肽的药物组合物。可以使用本领域中公知的方法来生成此类装置和材料。本发明的第八方面提供了医学中使用的依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物。 在优选的实施方案中，依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物用于(a)治疗和/预防急性和/或慢性炎症；(b)治疗和/预防微生物感染(例如细菌性感染)；(c)调控血液凝固；和/或(d)治疗伤口。在优选的实施方案中，依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物用于治疗和/预防选自下组的疾病、状况或适应症i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克。其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎；ii)慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、coro和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症。iii)术后炎症,炎性和凝固性病症,包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用。此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘。iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固。V)与抗微生物治疗组合的过度炎症。使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内(iv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内(intratechal)、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用。药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。例如，多肽可以用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、创伤、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和/或弥散性血管内凝固(DIC)。例如，包含SEQ ID NO: I或2的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由SEQ ID NO: I或2的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成的多肽可以用于治疗和/或预防急性和/或慢性炎症。在又一个例子中，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由SEQ ID N0:3的氨基酸序列，或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成的多肽可以用于治疗和/ 或预防微生物感染(例如，细菌性感染)。本发明的相关第九方面提供了依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物在制备用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的药物中的用途(如上文所描述的)。本发明的第十方面提供了用于治疗或预防患者中的炎症和/或过度凝固的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的依照本发明的第二方面的多肽或依照本发明的第七方面的药物组合物(如上文所描述的)。在优选的但非限制性的实施方案中，所述方法用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和/或弥散性血管内凝固(DIC)。本领域技术人员应当进一步领会，本发明的用途和方法在医学和兽医领域两者中具有效用。如此，可以在治疗人和非人动物(诸如马、犬和猫)两者中使用多肽药物。然而，有利地，患者是人。本发明的优选方面参照附图在以下非限制性例子中描述图I :TFPI的C端肽的NO阻断效果。用10ng/ml大肠杆菌LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞，并且添加10yiUiGGL27、LIK17和TKR22。使用格里斯(Griess)试剂来测量NO。图2 :肝素辅因子II的肽的NO阻断效果。用10ng/ml大肠杆菌LPS刺激RAW巨噬细胞，并且以指示的剂量添加肽KYE28、NLF20、和KYE21。LL-37呈现为阳性对照。使用格里斯试剂来测量NO。图3 :肝素辅因子II的肽的抗炎效果。KYE28、KYE21和NLF20阻断用各种微生物产物刺激的RAW264. 7巨噬细胞的NO生成。使细胞受到指定浓度的大肠杆菌LPS、脂磷壁酸质(LTA)和肽聚糖(PGN)(来自金黄色葡萄球菌(S. aureus))及来自酿酒酵母(Saccharosmyces cerevisiae)的酵母聚糖A处理。通过使用格里斯试剂来测定具有或没有10 μ M GKY25情况中的NO生成。图4 =TFPI的C端肽阻断凝固。
(A)TFPI的C端肽GGL27、LIK17、及TKR22损害正常人血浆中的固有凝固途径。这通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)来测定。GGL27和LIK17也影响监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)。凝血酶凝结时间(TCT)(其测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成)未受到肽显著影响，(B)GGL-27以剂量依赖性方式损害凝固，其通过测量正常人血浆中的aPTT、PT和TCT来监测。图5 :肝素辅因子II的肽阻断凝固。KYE28和NLF20损害正常人血浆中的固有凝固途径，其通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)来测定。KYE21仅显示对aPTT的微小阻断。凝固系统的其它部分未受显著影响，如通过监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)和测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成的凝血酶凝结时间(TCT)来判断的 。图6 :例示TFPI结构的草图。标示了酶的切割点。图7 =TFPI衍生肽的抗微生物活性。选定肽(为RDA中的100 μ Μ)针对指定微生物的抗微生物活性。对于测定抗微生物活性，将大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213隔离群(4x IO6个cfu)或近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)ATCC 90018 (IxlO5个cfu)接种在O. 1%TSB琼脂糖凝胶中。用6μ I肽加载每个4mm直径的孔。干净区域对应于于37° C温育18-24小时后的每种肽的抑制效果(呈现了均值，n=3)。图8 =TFPI衍生肽的抗细菌效果。活菌计数测定法中TFPI衍生肽和LL-37针对大肠杆菌的效果。将2xl06个cfu/ml细菌在 50 μ I 中与在 IOmM Tris (pH 7. 4)缓冲液(Tris)中，或在 O. 15mNaCl，IOmM Tris (pH7. 4)(其含有正常的或热灭活的20%人血浆)中指定浓度的肽一起温育(n=3，标示出SD)。图9:动力学分析。通过使用大肠杆菌的活菌计数测定法来分析O. 15m NaCl, IOmM Tris (pH7. 4)(其含有20%血浆)中的TFPI衍生肽(为6和30 μ M)的细菌杀灭的时间依赖性。
图10 :对细菌膜的影响。(A)肽对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和大肠杆菌的透化效果。(A)将细菌与指定的肽一起温育，并使用不渗透的探针FITC来评估透化。(B)电子显微术分析。将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细菌于37° C与30 μ M GKY25和LL-37 —起温育2小时，并用电子显微术分析。比例尺条代表I μ m。对照缓冲液对照。图11 =TFPI 肽 LIK17 的结构。在存在带负电荷的脂质体(D0PE/D0PG)的情况中的TFPI衍生的C端肽的螺旋含量。LIK17结构很大程度上不受脂质体添加的影响。图12 =Tris缓冲液中及在存在LPS的情况中的LIK17的⑶谱。对于对照，还呈现了仅缓冲液和LPS的⑶谱。图13 :指定肽对脂质体泄漏的影响。通过测量羧基荧光素自D0PE/D0PG (带负电荷的)脂质体的荧光释放来记录膜透化效果。在没有和存在O. 15M NaCl的情况中在IOmM Tris缓冲液中实施实验。数值代表一式三份样品的均值。
图14 :对真核细胞的活性指定肽的溶血效果。将细胞与不同浓度的肽一起温育，2%TritonX-100 (Sigma-Aldrich)充当阳性对照。血红蛋白释放的吸光度以λ 540nm测量,并且表示为％Triton X-100诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。显示了 LL-37的效果以进行比较。图15 :将HaCaT角质形成细胞受到指定的TFPI肽以及LL-37。通过基于LDH的T0X-7试剂盒来测量细胞透化效果。于λ 490nm监测自细胞的LDH释放，并绘图为％总LDH释放。图16 :使用MTT测定法来测量存在指定肽(为60 μ M)的情况中HaCaT角质形成细胞的存活力。在该测定法中，通过与代谢活性有关的酶将MTT修饰为染料，即蓝色甲月替(formazan)。于λ 550nm测量染料的吸光度。图17 :肝素辅因子II衍生肽的抗微生物活性。针对指定微生物的RDA中选定肽(SlOOyM)的抗微生物活性。对于测定抗微生物活性，将大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213隔离群(4xl06个cfu)或近平滑假丝酵母ATCC 90018 (IxlO5个cfu)接种在O. 1%TSB琼脂糖凝胶中。用6μ1肽加载每个4_直径孔。干净区域对应于于37° C温育18-24小时后的每种肽的抑制效果(呈现了均值，η=3)。图18 :(上部)在活菌计数测定法中肝素辅因子II衍生肽和LL-37针对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗细菌效果。将2χ106个cfu/ml细菌在50 μ I中与在 IOmM Tris (pH 7.4)缓冲液(Tris)中，或在 O. 15m NaCl，IOmMTris (pH 7.4)(其含有 20%人血浆)中指定浓度的肽一起温育(n=3，标示了 SD)。(下部)通过使用大肠杆菌的活菌计数测定法来分析O. 15m NaCl，IOmM Tris (pH 7. 4)(其含有20%血浆)中的GKR22 (为6和30 μ M)的细菌杀灭的时间依赖性。使用LL-37 (30 μ Μ)来比较。图19 :对细菌膜的影响。(A)肽对铜绿假单胞菌和大肠杆菌的透化效果。㈧将细菌与指定的肽一起温育，并使用不渗透的探针FITC来评估透化。(B)电子显微术分析。将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细菌于37° C与30 μ M NLF20和LL-37 —起温育2小时，并用电子显微术分析。比例尺条代表I μ m。对照缓冲液对照。图20 :结构和对脂质体的影响。(A)在存在带负电荷的脂质体(D0PE/D0PG)的情况中的肝素辅因子II衍生的C端肽的螺旋含量。LIK17结构很大程度上不受脂质体添加的影响。(B)Tris缓冲液中及在存在LPS的情况中的NLF20的⑶谱。对于对照，还呈现了仅缓冲液和LPS的⑶谱。(C)NLF20对脂质体泄漏的影响。通过测量羧基荧光素自D0PE/D0PG(带负电荷的)脂质体的荧光释放来记录膜透化效果。在没有和存在O. 15M NaCl的情况中在IOmM Tris缓冲液中实施实验。数值代表一式三份样品的均值。图21 NLF20在铜绿假单胞菌败血症的动物模型中的效果。凝血酶HCII肽NLF20显著提高存活。给小鼠i. p.注射铜绿假单胞菌细菌，I小时后接着皮下注射NLF20或仅缓冲液，然后接下去三天以24小时的时间间隔注射。用肽的处
理显著提高存活。图22 :对真核细胞的活性
(A)指定肽的溶血效果。将细胞与不同浓度的肽一起温育，2%Tritonx-100 (Sigma-Aldrich)充当阳性对照。血红蛋白释放的吸光度以λ 540nm测量,并且表示S%Triton X-IOO诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。显示了 LL-37的效果以进行比较。
(B)将HaCaT角质形成细胞受到指定的HCII肽以及LL-37。通过基于LDH的TOX-7试剂盒来测量细胞透化效果。于λ 490nm监测自细胞的LDH释放，并绘图为％总LDH释放。(C)使用MTT测定法来测量存在指定肽(为60 μ M)的情况中HaCaT角质形成细胞的存活力。在该测定法中，通过与代谢活性有关的酶将MTT修饰为染料，即蓝色甲月替(formazan)。于λ 550nm测量染料的吸光度。右侧小图显示了在存在20%血浆(溶血)或20%血清(LDH和MTT)情况中的结果。图23 :抗凝血酶III衍生肽FFF21阻断凝固。FFF21损害正常人血浆中的固有凝固途径，其通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)来测定。凝固系统的其它部分未受显著影响，如通过监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)和测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成的凝血酶凝结时间(TCT)判断的。 图24 HCII 的结构草图显示了 HCII，其中标示出KYE28。图25 =HCII衍生肽的抗微生物活性。(A) KYE28、KYE21、和LL-37针对指定微生物的抗微生物活性(使用RDA进行)。对于测定抗微生物活性，将大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213或枯草芽孢杆菌ATCC 6633隔离群(4xl06个cfu)或白念珠菌(C. albicans)ATCC 90028和近平滑假丝酵母ATCC90018 (lx IO5个cfu)接种在O. 1%TSB琼脂糖凝胶中。用6 μ I肽(为100 μ M)加载每个4mm直径孔。干净区域对应于于37° C温育18-24小时后的每种肽的抑制效果(呈现了均值，n=3)。(B)活菌计数测定法中KYE28、KYE21和LL-37针对大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、和金黄色葡萄球菌ATCC29213的抗细菌效果。将2x IO6个cfu/ml细菌在50 μ I中与在IOmM Tris, O. 15MNaCl, pH 7.4(缓冲液)中，或在O. 15m NaCl，IOmM Tris (pH 7.4)(其含有20%人柠檬酸盐血浆(CP))中指定浓度的肽一起温育(n=3，标示了 SD)，并测定cfu。(C)通过使用指定细菌的活菌计数测定法来分析 O. 15m NaCl，IOmM Tris (ρΗ7· 4)(其含有 20% 血浆)中的 KYE29 和 KYE21 (为 30 μ M)的细菌杀灭的时间依赖性。图26 :对细菌膜的效果。肽对大肠杆菌的透化效果。将细菌与ΚΥΕ21 —起温育，并使用不渗透的探针FITC来评估透化。图27 :结构和对脂质体的影响。(A)在存在带负电荷的脂质体(D0PE/D0PG)的情况中的ΚΥΕ21的螺旋含量。螺旋含量在脂质体添加后增加。(B)在Tris缓冲液中及在存在LPS的情况中的ΚΥΕ21的CD谱。显示了用脂质体的结果来进行比较。对于对照，还呈现了仅缓冲液和LPS的⑶谱。(ΟΚΥΕ21对脂质体泄漏的影响。通过测量羧基荧光素自D0PE/D0PG(带负电荷的)脂质体的荧光释放来记录膜透化效果。在IOmM Tris缓冲液中实施实验。数值代表一式三份样品的均值。图28:对真核细胞的活性(A)指定肽的溶血效果。将细胞与不同浓度的肽一起温育，2%TritonX-100 (Sigma-Aldrich)充当阳性对照。血红蛋白释放的吸光度以λ 540nm测量,并且表示S%Triton X-100诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。显示了 LL-37的效果以进行比较。(B)将HaCaT角质形成细胞受到KYE28、KYE21、或LL-37。(上部小图)通过基于LDH的T0X-7试剂盒来测量细胞透化效果。于λ 490nm监测自细胞的LDH释放，并绘图为％总LDH释放。(下部小图)使用MTT测定法来测量存在NLF20或LL-37 (为60 μ M)的情况中HaCaT角质形成细胞的存活力。在该测定法中，通过与代谢活性有关的酶将MTT修饰为染料，即蓝色甲月替。于λ 550ηπι测量染料的吸光度。(C)如上述的那样溶血，但是在用PBS稀释的50%人血液中实施。(D)在存在20%人血清的情况中使用HaCaT角质形成细胞的LDH释放(上部小图)和MTT(下部小图)。图29 =HCII衍生肽在体外调控对LPS的细胞因子响应。(Α)ΚΥΕ28和ΚΥΕ21显著阻断亚硝酸盐生成。与指定浓度的两种肽组合用10ng/ml大肠杆菌LPS刺激RAW 264. 7巨噬细胞。(B)与上文类似，但是使用铜绿假单胞菌LPS，(C)巨噬细胞中KYE28诱导的TNF- α生成、MCP-I和IL-IO生成。用10ng/ml 大肠杆菌LPS刺激RAW 264. 7细胞，并在细胞上清液中分析细胞因子。图30 =HCII衍生肽的体内抗炎效果通过腹膜内注射18mg/kg大肠杆菌LPS诱导C57BL6小鼠中的败血症性休克。60分钟后，施用KYE28和KYE21 (O. 2和O. 5mg ;在PBS中)或仅缓冲液。㈧与对照小鼠(对照；n=，GKY25 ；n=, HVF ；η=(ρ<0. 001))相比，肽处理在LPS诱导的休克中导致显著增加的存活。(B)对重量追踪7天，并且显示经处理小鼠的完全恢复。(C)肽处理在LPS诱导的休克模型中影响血小板的数目。(D)在不同实验中，给小鼠注射LPS，接着施用O. 5mg KYE28或KYE21，或缓冲液。在8小时、20小时时或7天后处死动物，并使用VetScanSystem来对血液中的血小板数目计数。(D)与对照小鼠相比，KYE28和KYE21 (O. 5mg)的施用显著减弱细胞因子应答。在来自LPS注射后8或20小时时处死的动物的血液中测量细胞因子。(E)KYE28在铜绿假单胞菌LPS诱导的败血症性休克中降低细胞因子水平。给C57BL6i.p.注射36mg/kg LPS，接着是O. 5mg KYE28。在20小时后，处死小鼠，并测定血液中的细胞因子水平。(KYE28 ;n=10)。所有数据代表两次独立的实验。图31 KYE28和KYE21在体内阻止LPS模型中的器官损伤。在用苏木精-曙红染色后通过光学显微术来分析肺，或者在LPS注射i. p.，接着用指定的肽(0.5mg)或缓冲液处理后20小时通过扫描电子显微术来分析肺。用肽KYE28和KYE21的处理阻断蛋白质和红细胞的泄漏(在两组中n=3，并且显示了代表性的肺切片)。图32 :在小鼠中的铜绿假单胞菌感染的动力学和对细胞因子的影响。用铜绿假单胞菌接种小鼠，并在感染后I小时sc施用KYE28(0. 5mg)。(A)在4、8、和12小时的时段后分析指定器官中的细菌计数。(B)平行地，在血液中分析指定的细胞因子。图33 KYE28在铜绿假单胞菌败血症中的治疗功效用铜绿假单胞菌腹膜内接种小鼠，并在用细菌接种后I小时，或I和7小时sc施用KYE28。(A)在12小时的时段后分析指定器官中的细菌计数。⑶显示了对血小板、淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的影响。(C)平行地，在血液中分析指定的细胞因子。(D)用铜绿假单胞菌接种小鼠，并在用细菌接种后I小时或I和7小时sc施用KYE28，并登记动物存活。施用KYE28两次(在感染后I和7小时)显著降低死亡率。图34 NLF20的抗微生物活性
(A) NLF20针对指定的微生物的抗微生物活性(使用RDA进行)。对于测定抗微生物活性，将大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213或枯草芽孢杆菌ATCC 6633隔离群(4xl06个cfu)或白念珠菌ATCC 90028和近平滑假丝酵母ATCC 90018 (IxlO5个cfu)接种在O. 1%TSB琼脂糖凝胶中。用6 μ I肽(为100 μ M)加载每个4mm直径孔。干净区域对应于于37° C温育18-24小时后的每种肽的抑制效果(呈现了均值，n=3)。显示了 LL-37以进行比较。(B)活菌计数测定法中NLF20和LL-37针对大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、和金黄色葡萄球菌ATCC 29213的抗细菌效果。将 2xl06 个 cfu/ml 细菌在 50 μ I 中与在 IOmM Tris, O. 15Μ NaCl, ρΗ7. 4 (缓冲液)中，或在O. 15m NaCl, IOmM Tris (pH 7. 4)(其含有20%人柠檬酸盐血浆(CP))中指定浓度的肽一起温育(n=3，标示出SD)，并测定cfu。(C)通过使用指定细菌的活菌计数测定法来分析O. 15m NaCl，IOmM Tris (pH 7. 4)(其含有20%血浆)中的NLF2O (为30 μ M)的细菌杀灭的时间依赖性。图35:对细菌膜的效果。(A)肽对大肠杆菌的透化效果。将细菌与NLF20 —起温育，并使用不渗透的探针 FITC来评估透化。(B)电子显微术分析。将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细菌于37° C与30 μ M NLF20 一起温育2小时，并通过负染色显现。显示了 LL-37来进行比较。比例尺条代表I μ m。对照缓冲液对照。图36 :结构和对脂质体的影响。(A)在存在带负电荷的脂质体(D0PE/D0PG)的情况中的NLF20的螺旋含量。螺旋含量在脂质体添加后增加。(B)在Tris缓冲液中及在存在LPS的情况中的NLF20的CD谱。显示了用脂质体的结果来进行比较。对于对照，还呈现了仅缓冲液和LPS的⑶谱。(C)指定肽对脂质体泄漏的影响。通过测量羧基荧光素自D0PE/D0PG(带负电荷的)脂质体的荧光释放来记录膜透化效果。在IOmM Tris缓冲液中实施实验。数值代表一式三份样品的均值。图37 :对真核细胞的活性(A)指定肽的溶血效果。将细胞与不同浓度的肽一起温育，2%TritonX-100 (Sigma-Aldrich)充当阳性对照。血红蛋白释放的吸光度以λ 540ηηι测量，并且表示为％Triton X-100诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。显示了 LL-37的效果以进行比较。(B)将HaCaT角质形成细胞受到NLF20或LL-37处理。通过基于LDH的T0X-7试剂盒来测量细胞透化效果。于λ 490nm监测自细胞的LDH释放，并绘图为％总LDH释放。
(C)使用MTT测定法来测量存在NLF20或LL-37 (为60 μ M)的情况中HaCaT角质形成细胞的存活力。在该测定法中，通过与代谢活性有关的酶将MTT修饰为染料，即蓝色甲月替。于λ 550nm测量染料的吸光度。图38 NLF20在被细菌感染的人血液中的活性。(A)呈现了 NLF20在人血液中(在PBS中以50%生成)中存在指定的细菌的情况中的抗细菌效果。将指定的微生物(2x IO8个cfu/ml)添加至50%柠檬酸盐血液，接着添加30、60或120 μ M的肽。在I小时温育期后测定cfu的数目。(B)在相同设置中，研究溶血效果。将细菌添加至50%柠檬酸盐血液，接着添加肽。在I小时后评估溶血。血红蛋白释放的吸光度以λ 540ηπι测量，并且表示为％Triton X-100诱导的溶血(注意y轴的比例尺)。最右侧的小图显示了与血液一起温育的仅NLF20的效果。图39 :用NLF20处理侵入性铜绿假单胞菌感染(A)将铜绿假单胞菌15159细菌(在PBS中，约2xl04或2xl08个cfu/ml)在冰上保持，直至注射。将100微升细菌悬浮液腹膜内(ip)注射入C57/B16小鼠中。在细菌注射后约IOmin时，将O. 5mg NLF20或仅PBS ip注射入小鼠中。将肝、脾和肾收获，并在冰上放置，均质化，并在感染后12小时测定菌落形成单位(cfu)。(B)在类似的感染模型(2xl08个cfu/ml铜绿假单胞菌)中，将在30分钟后的腹膜内(ip)施用与在I小时后的皮下注射(sc)比较。使用O. 5mg NLF20。(C)NLF20在铜绿假单胞菌败血症期间显著延长存活。如上述，给小鼠腹膜内注射铜绿假单胞菌，接着ip或sc施用NLF20 (500 μ g)。对存活追踪7天。虽然sc施用延长存活，但是ip施用显著降低死亡率(η=对于对照，η=对于经处理的动物，Ρ〈0· 0001 (对于ip施用))。(D)在血液中分析NLF20对TNF-α和IL-10的影响。(E)在血液中分析凝血细胞。用NLF20的处理(ip和sc)提高凝血细胞水平。图40 NLF20的体外和体内抗炎和抗凝效果(A)NLF20显著阻断亚硝酸盐生成。与指定浓度NLF20组合用10ng/ml大肠杆菌或铜绿假单胞菌LPS刺激RAW 264. 7巨噬细胞。(B) (B)NLF20在体外显著延长活化部分凝血酶时间(aPTT)。在没有(对照)或具有20 μ M肽的情况中测定凝结时间。通过将指定浓度的肽在柠檬酸化的人血浆中温育I分钟，接着于37° C添加100 μ I aPTT试剂(aPTTAutomate, Diagnostica Stago)达60秒来测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。通过添加CaCl2溶液来启动凝结。还呈现了例示凝血酶原时间测定法(PT)和凝血酶凝结时间(TCT)的结果。(C)通过腹膜内注射18mg/kg大肠杆菌LPS来诱导C57BL6小鼠中的败血症性休克。施用NLF20(10mM Tris, pH 7. 4中的O. 2或O. 5mg)或仅缓冲液。在与对照小鼠相比时，NLF20处理显著延长存活(分别为p〈0. 001和O. 003)。(E)对重量追踪7天。(D)肽处理在LPS诱导的休克模型中显著增加血小板的数目。在不同实验中，给小鼠注射LPS，接着施用O. 5mg NLF20,或缓冲液。在8小时、20小时时处死动物，并在7天后处死存活者，并使用VetScanSystem来对血液中的血小板数目计数。(F)与对照小鼠相比，NLF20 (O. 5mg)的施用选择性调控细胞因子应答。在来自LPS注射后8或20小时时处死的动物的血液中测量细胞因子。(G)NLF消除肺中的炎症。在用苏木精-曙红染色后通过光学显微术来分析肺，或者在LPS注射i. p.，接着用NLF20 (O. 5mg)或缓冲液处理后20小时通过扫描电子显微术来分析肺。用肽的处理阻断蛋白质和红细胞的泄漏(在两组中n=3，并且显示了代表性的肺切片)。图41 :肝素辅因子II的肽阻断凝固KYE28和NLF20损害正常人血浆中的固有凝固途径，其通过测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定。KYE21仅显示对aPTT的微小阻断。凝固系统的其它部分未受显著影响，如通过监测外在凝固途径的凝血酶原时间(PT)和测量凝血酶诱导的血纤蛋白网络形成的凝血酶凝结时间(TCT)判断的。实施例实施例A呈直
肝素辅因子II
Serpins是一组具有相似结构的蛋白质,其第一次被鉴定为一组能够抑制蛋白酶的蛋白质。因为许多serpins抑制胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)，所以最初造出首字母缩写词serpin。要专门研究的serpin超家族的第一个成员是人血楽；蛋白质抗凝血酶和抗胰蛋白酶，它们分别在控制血液凝固和炎症中发挥关键作用。
关于serpins的结构研究已经揭示了，家族的抑制性成员经历罕见的构象变化，称作压缩至松弛(S至R)转变。serpins的此构象活动性提供了与静态锁匙式(lock-and-key)蛋白酶抑制剂相比的关键优点。特别地，可以容易地通过特异性辅因子如肝素来控制抑制性serpins的功能。此情况的原型例子是抗凝血酶，其在血衆中以相对无活性的状态循环。结合长链肝素内的高亲和力肝素戊糖序列后，抗凝血酶经历构象变化，暴露对于机制重要的关键残基。如此，抗凝血酶的肝素戊糖结合形式是凝血酶和因子Xa的一种更有效的抑制剂。此外，这两种凝固蛋白酶都含有肝素结合位点(称作外位点(exosite))。因此，肝素也充当结合蛋白酶和serpin两者的模板，这进一步显著加速两方间的相互作用。初始相互作用后，形成最终的serpin复合物，并且释放肝素模块。 与这些蛋白质中的肝素结合位点对应的肽拥有抗细菌、抗炎和抗凝特性。组织因子途径抑制剂(TFPI)组织因子途径抑制剂(或TFPI)是一种Kunitz型蛋白酶抑制剂，其以因子X(FX)依赖性方式可逆地抑制组织因子-因子VII (TF-VII)复合物，导致对FX和FIX活化两者的抑制。TFPI由高度带负电荷的氨基端、三个串联的Kunitz型域、和高度带正电荷的羧基端组成。在血浆中，TFPI以全长和可变C端截短形式两者存在[28]。第一和第二 Kunitz域分别牵涉结合和抑制TF-VII复合物和因子Xa[29]。第三Kunitz域可以经由其阳离子残基(包括C端末端的氨基酸序列)与肝素相互作用[30]。此C端区域也已经牵涉与血浆脂蛋白、血小板反应蛋白-I、清除受体([31])、脂多糖[32]相互作用，并且可以抑制细胞生长[33]及血液凝固[34]，[35]。因为体内存在各种C端截短形式，所以已经暗示C端的蛋白水解的潜在作用，并且数据指示可以通过多种蛋白酶诸如凝血酶[36]、纤溶酶[37]、和基质金属蛋白酶-8[38]切割TFPI，释放C端片段。TFPI表达的上调物包括内毒素、IL-UTNF-α、血小板衍生的生长因子、肝素、和碱性成纤维细胞生长因子，所有生理学机制牵涉感染、炎症、和生长[31]。上述报告的TFPI的多功能性及暴露的阳离子和肝素结合C端的存在使我们提出TFPI的C端区域是否可以施加直接的抗微生物活性的问题。我们在这里显示了 C端TFPI肽确实可以直接杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者和真菌。此外，呈现了如下的证据，即肽也可以施加抗凝和抗炎效果。材料和方法肝素和LPS的放射性碘化。实施肝素(来自猪肠粘膜，Sigma-Aldrich)的放射性碘化，如先前所描述的[59]。实施LPS碘化，如由UleVitch[60]所描述的。将Img大肠杆菌0111:B4LPS在硼酸盐缓冲液，pH 8中的50mM对-OH苯甲亚胺酸酯中于4° C温育过夜，然后针对PBS，pH 7. 4透析。然后，使用氯胺T法用125I放射性标记LPS，然后通过透析除去未标记的125I。肝素和LPS结合测定法。使用狭缝印迹(slot-blot)装置来将100μ I PBSρΗ7. 4中的1、2和5μ g合成妝应用于硝酸纤维素膜(Hybond-C, Amersham Biosciences)上。用PBS pH 7.4中的2%牛血清清蛋白将膜于室温封闭I小时，然后于室温在PBS，pH
7.4中与放射性标记的LPS (约40 μ g · ml/1, O. 13 X106cpm · μ g_1)或放射性标记的肝素(约10 μ g · mL—1，O. 4X IO6Cpm · μ g—1) —起温育I小时。添加未标记的肝素(6mg/ml)以竞争结合。将膜在PBS，pH 7.4中清洗三次。使用Bas 2000放射性成像系统(FujiFilm, Tokyo, Japan)来显现放射性。细胞培养。将鼠巨噬细胞细胞系RAW 264. 7 (由H BjGrkbacka博士友情提供)在补充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbeccos改良Eagle培养基(DMEM) (Gibco)中培养。在无血清条件下实施所有实验。RAff巨噬细胞中的一氧化氮诱导。将汇合细胞收获，并转移至96孔板(3. 5x IO5/孔)。在用无酚红DMEM(Gibco)清洗粘着细胞后，将大肠杆菌LPS(100ng/ml)、LL-37 (2或10 μ Μ)或HRG(2or 10 μ Μ)于37° C预温育30分钟，然后转移至细胞。对于抑制NO诱导， 使用5 μ g/ml抗小鼠TLR4抗体、10或100 μ MGHH25或100 μ g/ml肝素。将细胞刺激24小时，并使用格里斯化学方法[61]来测定一氧化氮。自人巨卩遼细胞的TNF-α释放。使用Lymphoprep (Axi s-Shield PoC AS)密度梯度自获自健康供体血液的外周血单个核细胞(PBMC)获得人单核细胞衍生的巨噬细胞(hMDM)。将PBMC以3 X IO6个细胞/孔的浓度接种入24孔板中，并在补充有10%热灭活的自体人血衆、2mM L-谷氨酰胺、和50 μ 1/ml抗生素-杀真菌药(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)的RPMI1640培养基中在5%C02的湿润气氛中培养。在24小时后，除去非粘着细胞，并将粘着的单核细胞分化成巨噬细胞达10天，其中每两天换成新鲜培养基。在无血清条件下在具有或没有HRG (2 μ Μ)和GHH25 (100 μ Μ)的情况中用10ng/ml LPS刺激细胞达24小时。在刺激后，吸出上清液，并使用TNF-α人ELISA试剂盒(Invitrogen)来测量TNF-α。动物实验。将最初的敲除小鼠129作6-!11^__31与C57BL/6小鼠(Taconic)杂交14代以获得一致的遗传背景。遵循ILAR(实验室动物来源研究所(Institute of LaboratoryAnimal Resources))规则，这些HRG缺陷型小鼠系称作B6_HRGtnilwjal。将野生型C57BL/6对照小鼠和 CSTBIVeHrgv^jHK (8-12 周，27+/_4g)在兰德大学(Lund University)的动物房中培育。CSYBL/eHrg+缺乏Hrg基因的外显子I的翻译起始点[54]。将动物在光照和温度的标准条件下收容，并且自由获得标准的实验室食物和水。为了诱导败血症，将18μ g/g大肠杆菌0111:B4LPS腹膜内注射C57BL/6或C57BL/6Hrg-/_小鼠中，分成重量和性别匹配组。在7天期间追踪存活和状态。对于用GHH25肽处理，在LPS考验后30分钟腹膜内注射Img肽(在lOmMTris，pH
7.4中稀释)或仅缓冲液，然后追踪存活和状态。TFPI和肝素辅因子II肽。除了 LL-37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES[SEQ ID NO:4])(其也获自 Innovagen AB, Lund, Sweden)外，TFPI 和 HCII 衍生妝由 Biopeptide Co. , SanDiego, USA合成。通过质谱分析(MALDI-ToF Voyager)来确认这些肽的纯度(>95%)。微生物。细菌隔离群大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、枯草芽孢杆菌ATCC 6633、白念珠菌ATCC 90028和近平滑念珠菌ATCC90018获自兰德大学医院细菌学部门。活菌计数分析。将大肠杆菌ATCC 25922细菌在Todd-Hewitt (TH)培养基中培养至中间对数生长期。将细菌清洗，并在含有5mM葡萄糖的IOmM Tris, pH 7. 4中稀释。将大肠杆菌ATCC 25922 (50 μ I ；2x IO6个cfu/ml)于37° C与指定浓度的肽一起温育2小时。在正常的或热灭活的20%柠檬酸盐血浆(PP)的情况中，在IOmM Tris, pH 7.4(其还含有O. 15M NaCl)中实施用TFPI-肽和LL-37的其它实验。将温育混合物的连续稀释液在TH琼脂上铺板，接着于37° C温育过夜并进行cfu测定。放射状扩散测定法(Radial diffusion assay)。基本上如较早所描述的[62，63],将细菌在 IOml 全强度(3%w/v)胰胨豆胨培养液(trypticase soy broth, TSB)(Becton-Dickinson)中培养至中间对数生长期。然后,用IOmM Tris, pH 7. 4将微生物清洗一次。随后，将4xl06个cfu添加至15ml垫物琼脂糖凝胶,其由O. 03%(w/v) TSB> 1%(w/v)低内电渗型(EEO)琼脂糖(Sigma-Aldrich)和 O. 02%(v/v) Tween 20 (Sigma-Aldrich)组成。将垫物倒入0 144 mm培养皿中。在琼脂糖固化后，将4mm直径孔冲孔，并将6 μ I需要浓度的肽溶液添加至每孔。将板于37° C温育3小时以容许肽扩散。然后，用15ml熔融的覆盖物(蒸馏水中的6%TSB和l%Low-EE0琼脂糖)覆盖垫物凝胶。肽的抗微生物活性显现为于37° C温育18-24小时后每孔周围的干净区域。荧光显微术。使用不渗透的探针FITC(Sigma_Aldrich，St. Louis，USA)来监测细菌膜透化。将金黄色葡萄球菌ATCC 29213细菌在TSB培养基中培养至中间对数生长期。将细菌清洗，并在缓冲液(IOmM Tris, pH 7. 4, O. 15M NaCl，5mM葡萄糖)中重悬以产生IxlO7个CFU/ml的悬浮液。将100 μ I细菌悬浮液于30° C与30 μ M相应的肽一起温育30分钟。然后，将微生物在经聚(L-赖氨酸)包被的玻璃载玻片上固定化，其通过于30° C温育45分钟，接着将缓冲液中的200 μ I FITC出μ g/ml)添加至载玻片上，最终于30° C温育30分钟来进行。将载玻片清洗，并通过温育(首先在冰上持续15分钟，然后于室温在4%低聚甲醛中持续45分钟)来固定细菌。随后，使用Prolong金抗褪色试剂封固介质(Gold antifadereagent mounting medium) (Invitrogen, Eugene, USA)将玻璃载玻片在载玻片上安放。使用装备有 Hamamatsu C4742-95 冷却型 CCD 照相机(Hamamatsu, Bridgewater, USA)和平场复消色差(Plan Apochromat) X 100 物镜(Olympus, Orangeburg, USA)的 Nikon EclipseTE300 (Nikon, Melville, USA)倒置荧光显微镜来显现细菌。使用微分干涉相差(Nomarski)成像来显现微生物自身。溶血测定法。将EDTA-血液以800g离心10分钟，此后除去血浆和暗黄覆盖层(buffy coat)。将红细胞清洗三次，并在PBS，pH 7. 4中重悬以得到5%悬浮液。然后，将细胞在颠倒旋转情况下于37° C在存在肽(60 μ Μ)的情况中温育60分钟。2%TritonX-100 (Sigma-Aldrich)充当阳性对照。然后，将样品以800g离心10分钟，并将上清液转移至96孔微量滴定板。于λ 540ηπι测量血红蛋白释放的吸光度，并且在表示为％TritonX-100诱导的溶血的图中。乳酸脱氢酶(LDH)测定法。将HaCaT角质形成细胞在96孔板(3000个细胞/孔)中在补充有牛垂体提取物和重组EGF (BPE-rEGF) (Invitrogen, Eugene, USA)的无血清角质形成细胞培养基(SFM)中培养至汇合。然后，除去培养基，并添加100 μ I调查的肽(为60 μ Μ，在SFM/BPE-rEGF中或在补充有20%人血清的角质形成细胞-SFM中稀释)。使用基于LDH的T0X-7试剂盒(Sigma-Aldrich，St. Louis, USA)来量化自细胞的LDH释放。结果代表来自一式三份测量的均值，并且以与由l%Triton X-100组成的阳性对照(产生100%LDH、释放)相比的分数LDH释放给出。狭缝印迹测定法。通过狭缝印迹测定法检查肽的LPS结合能力。通过真空将肽(2和5 μ g)结合预先浸于PBS中的硝酸纤维素膜(Hybond-C，GE HealthcareBioSciences’UK)。然后，通过PBS, pH 7. 4中的2wt%BSA于RT将膜封闭I小时，随后，于RT在 IOmM Tris (pH 7. 4) ,0. 15M NaCl、或 IOmM MES (pH 5. 5) ,0. 15M NaCl 中与经 125I-标记的LPS (40 μ g/mL ；0. 13 X IQ6Cpm/ μ g)或经125I-标记的肝素(Sigma) 一起温育I小时。在LPS结合后，将膜在上述缓冲液中清洗3次，每次10分钟，并在Bas 2000放射性成像系统(Fuji, Japan)上显现放射性。脂质体制备和泄漏测定法。调查的脂质体是阴离子(D0PE/D0PG 75/25m0l/m0l)。DOPG(1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油，单钠盐)和DOPE (I, 2- 二油酰-sn_甘油-3-磷酸乙醇胺)均来自Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA),并且具有大于99%纯度。由于这些磷脂的长的、对称的且不饱和的酰基链，实现几项方法学上的优点。特别地，膜内聚力良 好，这促成非常稳定的、单层的、且很大程度上没有缺点的脂质体(自冷冻-TEM观察的)和明确限定的支持性脂双层(通过椭圆光度法和AFM观察的)，容许获得关于泄漏和吸附密度的详细数值。将脂质混合物在氯仿中溶解，此后在真空过夜下通过蒸发来除去溶剂。随后，与 O. IM 羧基荧光素(CF) (Sigma, St. Louis, USA) 一起添加 IOmM Tris 缓冲液，pH 7. 4。在水合后，将脂质混合物进行8个冷冻-融化循环，其由液氮中的冷冻和加热至60° C组成。通过于22° C多次挤压流过在LipoFast微型挤压器(Avestin, Ottawa, Canada)中安放的聚碳酸酯滤膜(孔径IOOnm)来生成约014Omn的单层脂质体。通过于22° C用Tris缓冲液作为洗脱剂的两个随后的凝胶过滤(Sephadex G-50, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)来除去未捕获的CF。通过监测来自脂质体分散体(在IOmM Tris (pH 7.4)中的IOmM脂质)的于520nm的发射突光来测定来自脂质体的CF释放。在每项实验结束时经由添加0. 8mM Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)通过破坏脂质体来获得绝对泄漏量表(scale)。在Tris缓冲液中在没有和存在脂质体中在上文所描述的条件下对脂质体泄漏测定法使用 SPEX-Fluorolog 16500. 22_m 双分光计(SPEX Industries, Edison, USA)。于37° C—式三份实施测量。CD-分光术。在 Jasco J-810 分光偏振计(Spectropolarimeter) (Jasco, U. K.)上测量溶液中的肽的CD谱。于37° C在IOmm石英小杯(cuvet)中在搅拌下实施测量，并且肽浓度是10 μ M0在范围200-250nm中监测对100 μ M脂质浓度的脂质体的肽二级结构的影响。在调查的条件下观察到的唯一肽构象是α-螺旋和无规卷曲。α-螺旋构象的肽的分数X α如下计算Xa= (A-Ac)/(Aa-Ac)其中A是于225nm记录的CD信号，且Aa和A。是分别为100%a -螺旋和100%无规卷曲构象的参照肽的于225nm的CD信号。从分别在0. IM NaOH和0. IM HCl中的0. 133mM(单体浓度)多聚-L-赖氨酸获得100% α -螺旋和100%无规卷曲参照物[64，65]。为了测定脂多糖对肽结构的影响，在Tris缓冲液中和在存在大肠杆菌脂多糖(0. 02wt%)(大肠杆菌0111 :B4，高度纯化的，小于1%蛋白质/RNA, Sigma, UK)的情况中在10 μ M的肽浓度监测肽二级结构。为了解决测量间的仪器差异，扣除背景数值(于250nm检测，其中不存在肽信号)。也校正来自本体溶液的信号。
多种微生物产物对巨噬细胞的体外影响和HCII和TFPI的多种肽的抗炎效果。将
3.5 X IO5个细胞在96孔组织培养板(Nunc, 167008)中接种在补充有10%FBS和抗生素的无酚红DMEM(Gibco)中。在温育6小时以容许粘着后，在有和没有指定剂量的肽(见图例和图)的情况中用10ng/mL大肠杆菌(0111 :B4)LPS(Sigma)、脂磷壁酸质、肽聚糖、或酵母聚糖刺激细胞。使用Griess反应在距离刺激24小时后测定培养上清液中的NO水平[66]。简言之，通过混合50 μ I培养上清液与相同体积的格里斯试剂(Sigma，G4410)，并在15分钟后于550nm读取吸光度来测量亚硝酸盐，即NO降解的一种稳定产物。使用具有FBS和抗生素的无酚红DMEM作为空白。使用ddH20中的0-80 μ M亚硝酸钠溶液来制备标准曲线。凝结测定法。使用Amelung凝血计来测量所有凝结时间。通过将指定浓度的在无菌水中稀释的肽与100 μ L柠檬酸化的人血浆一起温育I分钟，接着于37° C添加100 μ LaPTT试剂(aPTT Automate, Diagnostica Stago)达60秒来测量活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。通过添加100 μ L 25-mM CaCl2溶液来启动凝结。在凝血酶原时间测定法(PT)中，通过添加100 μ L具有I丐的Thrombomax(PT试剂；Sigma-AIdrich)来启动凝结。对于测量凝血酶凝结时间(TCT)，通过添加IOOyL Accuclot凝血酶时间试剂(TCT试剂； Sigma-Aldrich)来启动凝结。结果和结论总之，上文报告的与serpin诸如HCII、ATIII和TFPI中的隐蔽肝素结合位点对应的肽拥有抗细菌、抗炎和抗凝特性(图1-8，19-23)。特别重要的是如下的发现，即HCII肽阻断TLR介导的LPS应答及内在凝固途径。此外，TFPI肽显示独特的且先前未披露的对固有及外在凝固途径两者的抑制活性。如此，结果表明所述肽不仅减弱牵涉干扰巨噬细胞活化的细菌性感染和相关炎性应答，而且重要的是，干扰凝固，并且因此显示针对败血症、CCffD和其它多因子疾病(其牵涉致病性步骤，包括炎症和凝固)的显著的治疗潜力。参考文献I. Lehrer, R. I. and T. Ganz, Cathelicidins:a family of endogenousantimicrobial peptides. Curr Opin Hematol, 2002. 9(1):p. 18-22.2 . Harder, J . , R. Glaser, and J . M . Schroder, Review: Humanantimicrobialproteins effectors of innate immunity.J EndotoxinRes, 2007. 13(6) :p. 317-38.3. Zasloff, M. , Antimicrobial peptides of multicellular organisms.Nature, 2002. 415(6870) :p. 389-95.4. Tossi, A. , L. Sandri, and A. Giangaspero, Amphipathic, alpha-helicalantimicrobial peptides. Biopolymers, 2000. 55(I):p. 4-30.5. Yount, N. Y. , et al·，Advances in antimicrobial peptide immunobiology.Biopolymers, 2006.6.Zanetti,M.,Cathelicidins, multifunctional peptides of the innateimmunity. J Leukoc Biol, 2004. 75(1) :p. 39-48.7.Elsbach, P. , What is the real role of antimicrobial polypeptidesthat can mediate several other inflammatory responses J ClinInvest, 2003. 111(11) :p. 1643-5.
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適要背景肝素辅因子II是ー种抑制例如凝血酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂。然而，人HCII缺陷中的血栓形成倾向缺乏提示此serpin的其它作用。考虑HCII的D-螺旋中存在阳离子、肝素结合、和两亲性区域，即ー种表征许多宿主防御肽的特征，因此，我们检查了 HCII的此区域的肽是否可以施加宿主防御功能。方法和主要发现HCII的肝素结合肽有效地杀死革兰氏阴性细菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌，及真菌白念珠菌。与肽对脂质体影响的分析配对的经肽处理的细菌的荧光和电子显微术研究显示了肽施加与用“经典的”人抗微生物肽LL-37处理后看到的那些效果相似的膜破裂效果。与LL-37类似，在存在带负电荷的(模拟细菌的)脂质体及脂多糖的情况中对HCII肽检出明显的螺旋诱导。肽消除了体外和体内内毒素效应，而且显示了降低侵入性铜绿假单胞菌感染期间的死亡率，即显示为依赖于炎症调控和减弱的效果。结论结果第一次表明HCII的新型宿主防御肽，其显示治疗内毒素介导的休克及铜绿假单胞菌的潜力。 概沭传染病毎年在全世界造成数百万例死亡，而且招致巨大的健康护理成本。疾病谱较宽，并且包括与给定病原体具有直接关联的急性疾病，诸如丹毒、败血症、肺炎和许多其它感染，及慢性疾病，其中微生物经常引起长时间的炎性状态。人病原体铜绿假单胞菌引起和/或加剧疾病谱，包括细菌性結膜炎和角膜炎、耳炎、术后和烧伤创面感染、慢性腿溃疡、肺炎、和囊性纤维化。因此，需要针对铜绿假单胞菌有力的新型杀菌剂，并且对AMP作为新治疗形式的潜在用途具有重大的兴趣(Marr，Gooderham等2006)。考虑针对常规抗生素的抗性问题增加，抗微生物肽最近已经作为潜在的治疗候选物出现。AMP提供了针对几乎所有生物体中的侵入性微生物的第一线防御(Tossi, Sandri等2000 ;Lehrer and Ganz 2002 ；Zasloff 2002 ;Yount, Bayer 等 2006 ;Harder, Glaser 等 2007)。在最近数年期间，变得越来越明显的是，许多阳离子和两亲性抗微生物肽(AMP)，诸如防御素和cathelicidin是多功能的，也介导免疫调控作用和血管发生(Elsbach 2003 ；Ganz 2003 ；Zanetti 2004)，如此为先天性免疫系统的这些成员促成最近的且更宽的定义宿主防御肽(HDP)。AMP应当展现出高的杀菌性效力，而针对(人)真核细胞展现出低毒性。目前采用各种策略，诸如使用组合文库方法(Blondelle and Lohner 2000)、由D-氨基酸组成的立体异构体(Saj jan, Tran等2001)或环形D, L-a -肽(Fernandez-Lopez, Kim等2001)、基于高通量的筛选测定法(Hilpert, Volkmer-Engert 等 2005 ；Taboureau, Olsen 等 2006)、定量结构-活性关系(QSAR)方法(Hilpert, Volkmer-Engert 等 2005 ；Marr, Gooderham 等 2006 ；Jenssen, Lejon等 2007 ；Pasupuleti, Walse 等 2008)、及鉴定内源妝(Papareddy, Rydengard 等；Nordahl, Rydengard 等 2004 ；Nordahl, Rydengard 等 2005 ；Malmsten, Davoudi 等 2006 ；Malmsten, Davoudi等2007 ；Pasupuleti, Walse等2007)来鉴定选择性且治疗上感兴趣的AMP (Hancock and Sahl 2006 ;Marr，Gooderham 等 2006)。尽管这些方法有潜力，但是考虑低免疫原性及固有的其它生物学功能诸如免疫调控活性，天然存在的肽表位在治疗背景中可以显示ー些优点。肝素辅因子II是ー种以约80ug/ml存在于血浆中的66. 5kDa，480个氨基酸的糖蛋白。然而，虽然HCII阻断游离的和凝块结合的凝血酶，但是其确切的生理学作用没有得到完全了解。与抗凝血酶III相似，HCII对凝血酶的抑制被糖胺聚糖诸如肝素加速(Tollefsen, 1995)。虽然ATIII缺乏明显与血栓形成关联，但是HCII纯合缺陷小鼠在正常条件下未患有血栓形成倾向(thrombophilia)。HCII的血衆浓度在炎症和感染期间显著降低(REF)。实际上，最近的证据提示了 HCII的主要生理学功能是抑制凝血酶的非止血作用，诸如在动脉粥样硬化的形成中(Rau，Beaulieu等2007)。还已经显示了 HCII可以发挥血管外凝血酶抑制剂的功能，并且可以在调节伤ロ愈合中发挥作用(Hoffman，Loh等2003)，此夕卜，已经在对HCII的蛋白水解后描述了趋化性产物(Hoffman, Pratt等1990),这进ー步例示了这种抗蛋白酶的潜在隐性生物学活性。关于HCII的结构研究已经掲示了该分子经历罕见的构象变化，称作压缩至松弛(S至R)转变。先前的工作已经鉴定出HCII在处于R状态时施加有力的抗微生物活性。我们在这里报告了具有有力的抗细菌和抗炎活性的源自HCII D-螺旋的新型宿主防御肽的鉴定。
材料和方法肽KYE28 和 KYE21 肽(分别为 NH2-KYEITTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTL R-C00H [SEQ IDNO:I]和 NH2-KYEITTIHNLFRKLTHRLFRR-⑶OH, [SEQ ID NO:2])由 Biop印tide Co. , SanDiego, USA 合成，而 LL-37 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES [SEQ ID NO: 4])获自Innovagen AB, Lund, Sweden。通过质谱分析(MALDI-ToF Voyager)来确认这些肽的纯度(>95%)。微生物细菌隔离群大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、枯草芽孢杆菌ATCC 6633、白念珠菌ATCC 90028和近平滑念珠菌ATCC 90018获自兰德大学医院细菌学部门。放射状扩散测定法基本上如较早所描述的(Lehrer,Rosenman 等 1991 ；Andersson, Rydeilgard等2004)，将细菌在IOml全强度(ful 1-strength) (3%w/v)胰胨豆胨培养液(TSB)(Becton-Dickinson)中培养至中间对数生长期。然后,用IOmM Tris, pH 7. 4将微生物清洗一次。随后，将4xl06个cfu添加至15ml垫物琼脂糖凝胶,其由0. 03%(w/v)TSB> 1%(w/v)低内电渗型(EEO)琼脂糖(Sigma-Aldrich)和 0. 02%(v/v) Tween 20 (Sigma-Aldrich)组成。将垫物倒入0 144 mm培养皿中。在琼脂糖固化后，将4_直径孔冲孔，并将6 yl需要浓度的肽溶液添加至每孔。将板于37° C温育3小时以容许肽扩散。然后，用15ml熔融的覆盖物(蒸馏水中的6%TSB和l%Low-EE0琼脂糖)覆盖垫物凝胶。肽的抗微生物活性显现为于37° C温育18-24小时后每孔周围的干净区域。活菌计数分析。将大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌15159、或金黄色葡萄球菌ATCC29213细菌在 Todd-Hewitt (TH)培养基(Becton and Dickinson, Maryland, USA)中培养至中间对数生长期。然后，将微生物清洗，并在含有5mM葡萄糖的IOmM Tris, pH 7. 4中稀释。此后，在有或没有20%人柠檬酸盐-血浆的情况中，将细菌(50 ill ;2xl06个cfu/ml)于37° C与 IOmM Tris, 0. 15M NaCl 中的 KYE28、KYE21 或 LL-37 (为 0. 03,0. 06,0. 3,0. 6、3、6、30、60 u M) 一起温育2小吋。为了量化杀菌活性，将温育混合物的连续稀释液在TH琼脂上铺板，接着于37° C温育过夜，并测定菌落形成単位的数目。100%存活定义为在没有肽的情况中在相同缓冲液中及在相同条件下的细菌总体存活。使用统计学软件SigmaStat (SPSSInc. , Chicago, IL, USA)来测定显著性。最小抑制浓度(MIC)测定通过微量滴定肉汤(broth)稀释方法来实施MIC测定法，如先前记载于NCSLA准则(ffiegand, I. , Hilpert, K. & Hancock, R. E. Agar and broth dilution methodsto determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobialsubstances. Nat Protoc 3, 163-175 (2008))的。简言之，将新鲜的过夜菌落以0. 5个单位的池度悬浮，并在Mueller-Hinton肉汤(Becton Dickinson)中进一步稀释。对于测定MIC,将肽以比通过自储备溶液的连续稀释液得到的需要范围高10倍的浓度在水中溶解。将每个浓度的10 ii I添加至96孔微量滴定板(polypropylene, Costar Corp.)的姆个相应孔， 并添加MH培养基中的90 ill细菌(IxlO5)。将板于37° C温育16-18小吋。采用MIC作为最低浓度，其中检测不到能看到的细菌生长。突光显微术。使用不渗透的探针FITC (Sigma-Aldrich，St. Louis, USA)来监测细菌膜透化。将金黄色葡萄球菌ATCC 29213细菌在TSB培养基中培养至中间对数生长期。将细菌清洗，并在缓冲液(IOmM Tris, pH 7. 4，0. 15M NaCl, 5mM葡萄糖)中重悬以产生IxlO7个CFU/ml的悬浮液。将IOOiU细菌悬浮液于30° C与30 ii M各种肽一起温育30分钟。然后，将微生物在经聚(L-赖氨酸)包被的玻璃载玻片上固定化，其通过于30° C温育45分钟，接着将缓冲液中的200 ill FITC(6iig/ml)添加至载玻片上，最终于30° C温育30分钟来进行。将载玻片清洗，并通过温育(首先在冰上持续15分钟，然后于室温在4%低聚甲醛中持续45分钟)来固定细菌。随后，使用Prolong金抗褪色试剂封固介质(Invitrogen, Eugene, USA)将玻璃载玻片在载玻片上安放。使用装备有Hamamatsu C4742-95冷却型CCD照相机(Hamamatsu, Bridgewater, USA)和平场复消色差(PlanApochromat)X100 物镜(Olympus, Orangeburg, USA)的Nikon Eclipse TE300 (Nikon, Melville, USA)倒置突光显微镜来显现细菌。使用微分干涉相差(Nomarski)成像来显现微生物自身。溶血測定法将EDTA-血液以800g离心10分钟，此后除去血浆和暗黄覆盖层(buffy coat)。将红细胞清洗三次，并在PBS，pH 7. 4中重悬以得到5%悬浮液。然后，将细胞在颠倒旋转情况下于37° C在存在肽(60iiM)的情况中温育60分钟。2%Triton X-IOO(Sigma-Aldrich)充当阳性对照。然后，将样品以800g离心10分钟，并将上清液转移至96孔微量滴定板。乳酸脱氢酶(LDH)测定法将HaCaT角质形成细胞在96孔板(3000个细胞/孔)中在补充有牛垂体提取物和重组EGF(BPE-rEGF) (Invitrogen, Eugene, USA)的无血清角质形成细胞培养基(SFM)中培养至汇合。然后，除去培养基，并添加100 u I调查的肽(为60 ii M，在SFM/BPE-rEGF中或在补充有20%人血清的角质形成细胞-SFM中稀释)。使用基于LDH的T0X-7试剂盒(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)来量化LDH自细胞的释放。结果代表来自一式三份测量的均值，并且以与由l%Triton X-100组成的阳性对照(产生100%LDH释放)相比的分数LDH释放给出。MTT测定法将无菌过滤的MTT(3_(4，5_ ニ甲基噻唑基)-2，5_ ニ苯基-溴化四唑；Sigma-Aldrich)溶液(PBS中的5mg/ml)于-20° C避光贮存，直至使用。将HaCaT角质形成细胞(3000个细胞/孔)接种于96孔板中，并在无血清角质形成细胞-SFM/BPE-rEGF培养基中培养至汇合。然后，以60 ii M和120 ii M添加调查的肽。在温育过夜后，将20 ill MTT溶液添加至每孔，并将板在CO2中于37° C温育I小吋。然后，通过吸出来除去含有MTT的培养基。通过每孔添加100iai00%DMS0来溶解生成的蓝色甲月替产物。然后，将板于室温温和漩涡振荡10分钟以溶解沉淀物。于550nm监测吸光度，并且给出的结果代表来自一式三份测量的均值。LPS在体外对巨噬细胞的影响 将3. 5 X IO5个细胞接种在96孔组织培养板(Nunc, 167008)中在补充有10%FBS和抗生素的无酚红DMEM(Gibco)中。在温育6小时以容许粘着后，在有和没有多个剂量的肽的情况中用10ng/mL大肠杆菌LPS(0111 :B4)刺激细胞。使用Griess反应在距离刺激24小时后测定培养上清液中的NO水平(Pollock, Forstermann等1991)。简言之,通过混合50 u I培养上清液与相同体积的格里斯试剂(Sigma，G4410)，并在15分钟后于550nm读取吸光度来测量亚硝酸盐，即NO降解的ー种稳定产物。使用具有FBS和抗生素的无酚红DMEM作为空白。使用ddH20中的0-80 u M亚硝酸钠溶液来制备标准曲线。脂质体制备和泄漏测定法调查的脂质体是两性离子(D0PC/胆固醇60/40mol/mol或没有胆固醇的D0PC)或阴离子(D0PE/D0PG 75/25mol/mol)。DOPG (1，2-ニ油酰-sn_ 甘油-3-磷酸甘油，单钠盐)、DOPCd, 2- ニ油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和DOPE (I，2- ニ油酰-sn_甘油-3-磷酸こ醇胺)均来自Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA),并且具有大于99%纯度,而胆固醇(大于99%纯度)来自Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)。由于这些磷脂的长的、对称的且不饱和的酰基链，实现几项方法学上的优点。特别地，膜内聚カ良好，这促成非常稳定的、单层的、且很大程度上没有缺点的脂质体(自冷冻-TEM观察的)和明确限定的支持性脂双层(通过椭圆光度法和AFM观察的)，容许获得关于泄漏和吸附密度的详细数值。将脂质混合物在氯仿中溶解，此后在真空过夜下通过蒸发来除去溶剤。随后，与0. IM羧基荧光素(CF) (Sigma,St. Louis,USA) 一起添加IOmM Tris缓冲液，pH 7.4。在水合后，将脂质混合物进行8个冷冻-融化循环，其由液氮中的冷冻和加热至60° C组成。通过于22° C多次挤压流过在LipoFast微型挤压器(Avestin, Ottawa, Canada)中安放的聚碳酸酯滤膜(孔径IOOnm)来生成约014Onm的单层脂质体。通过于22° C用Tris缓冲液作为洗脱剂的两个随后的凝胶过滤(Sephadex G_50,GE Healthcare, Uppsala, Sweden)来除去未捕获的 CF。通过监测来自脂质体分散体(在IOmM Tris (pH 7.4)中的IOmM脂质)的于520nm的发射荧光来測定来自脂质体的CF释放。在姆项实验结束时经由添加0. 8mM Triton X-100 (Sigma-Aldrich,St. Louis, USA)通过破坏脂质体来获得绝对泄漏量表。在Tris缓冲液中在没有和存在脂质体中在上文所描述的条件下对脂质体泄漏测定法使用SPEX-Fluorolog 1650 0. 22_m双分光计(SPEX Industries, Edison, USA)。于 37° C—式三份实施测量。CD-分光术
在JascO J-810分光偏振计(Jasc0，U. K.)上测量溶液中的肽的CD谱。于37° C在IOmm石英小杯中在搅拌下实施测量，并且肽浓度是10 u M0在范围200_250nm中监测对IOOii M脂质浓度的脂质体的肽ニ级结构的影响。在调查的条件下观察到的唯一肽构象是a-螺旋和无规卷曲。a-螺旋构象的肽的分数自225nm的⑶信号计算。100% a -螺旋和100%无规卷曲构象參照物分别获自0. IM NaOH和0. IM HCl中的0. 133mM(单体浓度)多聚-L-赖氨酸。为了測定脂多糖对肽结构的影响，在Tris缓冲液中和在存在大肠杆菌脂多糖(0.02 wt% )(大肠杆菌0111 :B4，高度纯化的，小于1%蛋白质/RNA，Sigma，UK)的情况中在IOyM的肽浓度监测肽ニ级结构。为了解决测量间的仪器差异，扣除背景数值(于250nm检测，其中不存在肽信号)。也校正来自本体溶液的信号。于37° C—式三份实施测量。临床參数 通过心脏穿刺来采集小鼠血液(用EDTA抗凝)，并用VetScan HM5系统(TRI0LAB)分析。检测白细胞的数目、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血小板的百分比。细胞因子測定法使用细胞计量珠测定法；小鼠炎性试剂盒(Becton Dickinson AB)依照制造商的指令在来自RAW264. 7细胞的细胞培养上清液和来自注射LPS或铜绿假单胞菌(用或不用肽处理)的小鼠的血浆中测量细胞因子IL-6、IL-10、MCP-1、INF-y、和TNF-a。将所有血浆样品在分析前于-20° C贮存。LPS体内模型给雄性C57BL/6小鼠(8-10周，22+/_5g)腹膜内注射18mg大肠杆菌0111:B4LPS (Sigma) /kg体重。LPS注射后30分钟，将0. 5mg KYE28、KYE21或仅缓冲液腹膜内注射入小鼠中。在7天期间追踪存活和状态。对于血液收集和组织化学，在LPS考验后20小时处死小鼠，并将肺取出并固定。这些实验得到马尔默(Maiiri6)/兰德实验室动物伦理委员会批准。铜绿假单胞菌感染模型将动物在光照和温度的标准条件下收容，并且自由获得标准的实验室食物和水。将铜绿假单胞菌15159细菌培养至对数生长期(OD62tl约0. 5)，收获，在PBS中清洗，在相同缓冲液中稀释至2xl08cfu/ml，并在冰上保持，直至注射。100微升细菌悬浮液腹膜内(ip)注射入雌性bl6中。在细菌注射后I小时或I和7小时，将0. 5mg KYE28或仅缓冲液sc注射入小鼠中。为了研究对靶器官的细菌传播，将脾、肝和肾收获，在冰上放置，均质化，并测定菌落形成単位。使用Mann-Whitney U-检验来测定P-值。合并来自三次独立实验的数据。组织化学将LPS注射后20小时收集的器官在4%低聚甲醛中立即固定，之后将它们包埋于石腊中，并制成切片。用Mayers苏木精(Hematoxilin) (Histolab AB)将切片染色10分钟，并用曙红(Merck)染色7分钟。在Histocenter, Gothenburg, Sweden完成切片和染色。扫描电子显微术对于扫描电子显微术，在LPS注射后20小时采集肺。将样品在0. 15M ニ甲胂酸钠缓冲液(pH 7. 4)中的2. 5%戊ニ醛中于室温固定过夜。将标本用卡可基酸盐(cacodylate)缓冲液清洗，并用50%(v/v)至无水こ醇的逐渐上升的こ醇系列脱水。然后，用无水こ醇作为中间溶剂将标本在ニ氧化碳中进行临界点干燥，安放在铝支架上，用30nm钯/金喷射，并在JEOL JSM-350扫描电子显微镜中检查。MS为了阐明源自HCII的肝素结合表位(图24)的KYE28和KYE21是否施加抗微生物活性，我们调查了在放射状扩散测定法(RDA)中针对革兰氏阴性大肠杆菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌，及真菌白念珠菌和近平滑念珠菌的效果(图25A)。值得注意的是，活性与对“经典的”人cathelicidin LL-37观察的那些活性相似。上述的抗细菌结果得到无基 质活菌计数測定法进ー步证实。来自利用大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的这些剂量-响应实验的结果确认两种HCII衍生肽，且特别地较长形式的KYE28在含有0. 15M NaCl的缓冲液中及在存在人血浆的情况中展现出显著的抗细菌活性(图25B)。特别地对于KYE28，动力学研究表明在5_20分钟内发生在存在人血浆的情况中评估的细菌杀灭，指示与许多抗微生物肽兼容的快速直接作用(图25C)。采用不渗透探针FITC的研究显示KYE21 (本文作为代表肝素结合螺旋表位的模式肽使用)透化大肠杆菌的细菌膜(图26)。值得注意的是，此表位在结合脂质体后展现出螺旋含量的显著増加(图27A)和与大肠杆菌LPS —起的显著构象变化(图27B)。KYE21还引起CF释放(图27C)，如此指示对脂质膜的直接影响。动力学分析显示了在5-10分钟内发生最大释放的约80%，与用LL-37获得的结果相当(未显示)。杀死细菌的AMP也可以展现出针对真核细胞的溶血和膜透化活性。结果显示了特别地，KYE28在较高剂量(30-60 PM)时施加显著的溶血活性(图28A)。然而，肽就HaCaT细胞(图28B)，及对存活力的影响(图28B)而言与KYE21和LL-37展现出相似的透化活性。为了探索对于随后的体内研究重要的生理学条件下的溶血和细胞毒性效果，将肽添加至人血液(在PBS中以50%生成)，并在存在人血清的情况中对HaCaT细胞研究。总体上，结果显示了肽在这些条件中产生很少的透化效果(图28C和D)。KYE28的MIC水平(依照标准的NCSLA方案得到)与对LL-37和omiganan观察到的MIC水平相当(表I)。因为后ー种是ー种目前在III期临床研究中的高度活性的且广谱设计的抗微生物肽，所以关于KYE28的数据也暗示此肽的ー种可能的治疗作用。总之，这些结果表明KYE28构成先前未披露的抗微生物HCII结构，其具有膜破裂性能，而且在生理学条件下在体外施加显著的抗微生物活性。如上文所提及的，最近的证据显示了抗微生物肽触发ー批免疫调控应答。KYE21的LPS结合的观察结果(图27B)促使我们调查KYE28和KYE21的可能的内毒素中和效果。在小鼠巨噬细胞模型中，两种肽显著抑制由大肠杆菌或铜绿假单胞菌LPS刺激的巨噬细胞的NO释放(图29A)。KYE28降低TNF- a、MCP_1、及IL-10 (图29)，并且对KYE21观察到相似的发现(未显示)。在LPS诱导的休克的小鼠模型中(图30A)，KYE28和KYE21两者都展现出对存活的显著改善(图30A)。经处理的动物还显示重量的完全恢复(图30B)。对8和20小时后血小板计数的分析显示了特别地，KYE28在20小时后提高血小板水平，提示在此特定的LPS模型中的消耗降低(图30C)。所述水平在存活者中是完全标准化的(图30C)。LPS注射后8和20小时对细胞因子的分析显示了促炎性IL-6、IFN- y , TNF-a、和MCP-I的显著降低，而在8小时后对这两种肽都观察到IL-10增加(图30D)。注意KYE28特别有效地降低IL-6,TNF-a及MCP_1水平。在使用铜绿假单胞菌LPS的类似休克(chock)模型中看到在用KYE28处理后的类似降低，提示了就KYE28效果而言在革兰氏阴性细菌间有限的菌株可变性。相应地，虽然对来自经LPS处理的动物的肺的组织学和SEM分析表明蛋白质和红细胞的肺泄漏(图31)，但是与那些经LPS处理的动物相反，经KYE28和KYE21处理的动物的肺显示这些LPS诱导的效果的明显降低。如此，结果表明特别是KYE28和KYE21在LPS休克的此动物模型中的显著抗炎效果。为了进一歩探索后一种肽在细菌性败血症中的潜在治疗效果，使用采用铜绿假单胞菌的模型。初始研究显示了细菌水平在分析器官(脾、肾、和肝)中在4-12小时间升高。用肽的处理没有显著降低细菌水平，尽管观察到经肽处理的动物间的细菌减少趋势(图32A)。然而，值得注意的是，观察到细胞因子水平的伴随降低，特别地在12小时后，且显著地对于促炎性IL-6、IFN- y , TNF-a、和MCP-1。对于IL-10，12小时后的增加不受肽显著 调控。(图32B)。基于这些初始结果，在铜绿假单胞菌败血症模型中评估GKY25的一次对两次施用的效果。如图30A中看到的，用一剂的处理没有显著降低细菌cfu，然而，重复处理在评估的器官中产生了 cfu数目的中等降低。显著地，观察到血小板的略微的，但是显著的増加(图33B)。这与血液中细胞因子的明显的且高度显著的降低平行(图33C)。用一剂KYE28的处理没有延长存活。然而，如上述的两剂方案导致败血病症状的显著延迟及延迟的死亡率，及最终还有存活的延长(图33D)。表I :KYE28和KYE21针对各种细菌物种和隔离群的最小抑制浓度(MIC)。使用LL-37和omiganan作为阳性对照。
权利要求
1.用于治疗或预防炎症和/或血液过度凝固的多肽，所述多肽包含源自肝素辅因子II的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物，或由源自肝素辅因子II的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成， 其中所述片段、变体、融合物或衍生物展现出抗炎和/或抗凝活性。
2.依照权利要求I的多肽，其中所述多肽不是天然存在的蛋白质。
3.依照权利要求I或2的多肽，其中所述肝素辅因子II是人肝素辅因子II。
4.依照权利要求3的多肽，其中所述肝素辅因子II是SwissPort登录号P05546。
5.依照前述权利要求中任一项的多肽，其包含如下SEQID NOS: I至3中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物，或由如下SEQ ID N0S:1至3中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成 “KYE28”KYEITTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLR [SEQ ID NO:I] “KYE21”KYEITTIHNLFRKLTHRLFRR[SEQ ID NO:2] “NLF20”NLFRKLTHRLFRRNFGYTLR[SEQ ID NO :3] 所述其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQID N0S: I至3中任一项的抗炎活性。
6.依照权利要求5的多肽，其包含SEQID NOSil至3中任一项的氨基酸序列或由SEQID N0S: I至3中任一项的氨基酸序列组成。
7.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
8.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含一个或多个经修饰或衍生化的氨基酸。
9.依照权利要求8的多肽，其中所述一个或多个氨基酸是通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的。
10.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQID N0:3的氨基酸序列的片段或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段组成。
11.依照权利要求10的多肽，其中所述片段包含SEQID NO: 3的至少5个连续氨基酸，例如至少 6，7,8,9, 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20,21,22，23，24，25，26 或 27 个连续氨基酸，或由SEQ ID NO:3的至少5个连续氨基酸，例如至少6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26 或 27 个连续氨基酸组成。
12.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包括SEQID NO: I至3中任一项的氨基酸序列的变体或由SEQ ID N0:1至3中任一项的氨基酸序列的变体组成。
13.依照权利要求12的多肽，其中所述变体与SEQID N0S: I至3中任一项的氨基酸序列具有至少 50% 同一性，例如至少 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或至少99%同一性。
14.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽的长度是10-200个氨基酸，例如长度为 10-150、15-100、15-50、15-30、17-30、或 17-28 个氨基酸。
15.依照权利要求14的多肽，其中所述多肽的长度是至少20个氨基酸。
16.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是线性的。
17.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是重组多肽。
18.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞的释放。
19.依照权利要求18的多肽，其中所述促炎性细胞因子选自下组巨噬细胞抑制因子、TNF-a、HMGBl、C5a、 IL-17、IL_8、MCP_1、IFN-γ、11-6, IL_lb、IL-12。
20.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽能够阻断血小板活化。
21.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽能够干扰白细胞、上皮细胞(包括角质形成细胞)和/或间充质细胞(包括成纤维细胞)中的Toll样受体(TLR)信号传导。
22.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽在下列一种或多种模型中展现出抗炎活性 (a)使用LPS、LTA、酵母聚糖、鞭毛蛋白、尘螨、病毒或细菌DNA或RNA、或肽聚糖作为刺激物的体外巨噬细胞模型；和/或 (b)内毒素休克的体内小鼠模型； (c)或是与抗微生物疗法组合或是单独给予的体内感染模型。
23.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽展现出抗凝活性。
24.依照权利要求23的多肽，其用于伴随治疗或预防炎症和凝固。
25.依照前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽展现出Toll样受体(TLR)阻断活性。
26.依照前述权利要求中任一项的多肽，其用于治疗或预防与感染有关的炎症。
27.依照前述权利要求中任一项的多肽，其用于治疗或预防选自下列的疾病、状况或适应症 i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克，其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎； )慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、coro和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症； iii)术后炎症，炎性和凝固性病症，包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用，此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘； iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固； V)与抗微生物治疗组合的过度炎症，使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内Qv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内(intratechal)、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用，药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮，防腐剂包括碘、银、铜、氯己定(chlorhexidine)、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。
28.依照前述权利要求中任一项的多肽，其用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和弥散性血管内凝固(DIC)。
29.依照权利要求28的多肽，其用于治疗或预防败血症。
30.依照权利要求28的多肽，其用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD )。
31.依照前述权利要求中任一项的多肽，其与一种或多种别的治疗剂组合使用。
32.依照权利要求31的多肽，其中所述别的治疗剂选自下组抗生剂、抗真菌剂、防腐剂、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂、受体阻断剂、受体激动剂和防腐剂。
33.依照权利要求32的多肽，其中所述抗生剂选自下组抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂和抗寄生物剂。
34.一种分离的多肽，其包含源自肝素辅因子II的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物，或由源自肝素辅因子II的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成，所述多肽展现出抗炎和/或抗微生物和/或抗凝活性，但须所述多肽不是天然存在的蛋白质。
35.依照权利要求34的多肽，其中所述肝素辅因子II是人肝素辅因子II。
36.依照权利要求34至35中任一项的多肽，其中所述肝素辅因子II(HCII)对应于Swiss-Prot 登录号 P05546。
37.依照权利要求34至36中任一项的多肽，所述多肽包含如下SEQID NOS: I至3中任一项的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由如下SEQ ID N0S:1至3中任一项的氨基酸、或其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成 “KYE28”KYEITTIHNLFRKLTHRLFRRNFGYTLR [SEQ ID NO:I] “KYE21”KYEITTIHNLFRKLTHRLFRR[SEQ ID NO:2] “NLF20”NLFRKLTHRLFRRNFGYTLR[SEQ ID NO :3] 所述其片段、变体、融合物或衍生物、或所述其片段、变体或衍生物的融合物保留SEQID N0S: I至3中任一项的抗炎和/或抗微生物和/或抗凝活性。
38.依照权利要求37的多肽，其包含SEQID NOSil至3中任一项的氨基酸序列或由SEQ ID N0S:1至3中任一项的氨基酸序列组成。
39.依照权利要求34至38中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
40.依照权利要求34至39中任一项的多肽，其中所述多肽、或其片段、变体、融合物或衍生物包含一个或多个经修饰或衍生化的氨基酸。
41.依照权利要求40的多肽，其中所述一个或多个氨基酸是通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰或衍生化的。
42.依照权利要求34至41中任一项的多肽，其中所述多肽的长度是10-200个氨基酸，例如长度为 10-150、15-100、15-50、15-30、17-30、或 17-28 个氨基酸。
43.依照权利要求42的多肽，其中所述多肽的长度是至少20个氨基酸。
44.依照权利要求34至43中任一项的多肽，其中所述多肽是线性的。
45.依照权利要求34至44中任一项的多肽，其中所述多肽是重组多肽。
46.依照权利要求30至42中任一项的多肽，其中所述多肽能够抑制一种或多种促炎性细胞因子自人单核细胞衍生的巨噬细胞的释放。
47.依照权利要求46的多肽，其中所述促炎细胞因子选自下组巨噬细胞抑制因子、TNF-a、HMGBl、C5a、IL-17, IL_8、MCP_1、IFN-γ、11-6, IL_lb、IL-12。
48.依照权利要求34至47中任一项的多肽，其中所述多肽能够阻断血小板活化。
49.依照权利要求34至48中任一项的多肽，其中所述多肽能够干扰白细胞、上皮细胞(包括角质形成细胞)和/或间充质细胞(包括成纤维细胞)中的Toll样受体(TLR)信号传导。
50.依照权利要求30至46中任一项的多肽，其中所述多肽在下列一种或多种模型中展现出抗炎活性 (a)使用LPS、LTA、酵母聚糖、鞭毛蛋白、尘螨、病毒或细菌DNA或RNA、或肽聚糖作为刺激物的体外巨噬细胞模型；和/或 (b)内毒素休克的体内小鼠模型； (c)或是与抗微生物疗法组合或是单独给予的体内感染模型。
51.依照权利要求34至50中任一项的多肽，其中所述多肽展现出抗凝活性。
52.依照权利要求34至51中任一项的多肽，其中所述多肽展现出Toll样受体(TLR)阻断活性。
53.一种分离的核酸分子，其编码依照权利要求34至52中任一项的多肽。
54.—种载体,其包含依照权利要求53的核酸分子。
55.依照权利要求54的载体,其中所述载体是表达载体。
56.—种宿主细胞,其包含依照权利要求53的核酸分子或依照权利要求54或55的载体。
57.一种生成依照权利要求34至52中任一项的多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下培养依照权利要求56的宿主细胞的群体，并自其分离所述多肽。
58.—种生成依照权利要求34至52中任一项的多肽的方法，包括多肽的液相或固相合成。
59.一种药物组合物，其包含依照权利要求34至52中任一项的多肽以及药学可接受赋形剂、稀释剂、载体、缓冲液或佐剂。
60.依照权利要求59的药物组合物，其适合于经由选自下组的路径施用表面、眼、鼻、肺、含服、胃肠外(静脉内、皮下、鞘内和肌肉内)、口服、阴道和直肠。
61.依照权利要求59的药物组合物，其适合于经由植入物施用。
62.依照权利要求60至61中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物与要在医学中使用的装置或材料结合。
63.依照权利要求62的药物组合物，其中所述装置在旁路手术、体外循环、伤口护理和/或透析中使用。
64.依照权利要求62或63的药物组合物，其中所述药物组合物是包被、涂覆、喷雾或以其它方式应用于缝合线、假体、植入物、伤口敷料、导管、镜片、皮肤移植物、皮肤替代物、纤维蛋白胶或绷带的。
65.依照权利要求62至64的药物组合物，其中所述装置或材料包含聚合物、金属、金属氧化物和/或陶瓷或由聚合物、金属、金属氧化物和/或陶瓷组成。
66.依照权利要求34至52中任一项的多肽，其在医学中使用。
67.依照权利要求66的多肽，其用于治疗或预防炎症和/或过度凝固。
68.依照权利要求66或67的多肽，其用于治疗和/预防急性和/或慢性炎症。
69.依照权利要求66的多肽，其用于治疗和/预防微生物感染(例如细菌性感染)。
70.依照权利要求66的多肽，其用于调控血液凝固。
71.依照权利要求66的多肽。其用于治疗伤口。
72.依照权利要求66或71中任一项的多肽，其用于治疗或预防选自下组的疾病、状况或适应症 i)伴有或没有感染性成分的急性系统性炎性疾病，诸如系统性炎性应答综合征(SIRS)、ARDS、败血症、重度败血症、和感染性休克，其它全身性或局部侵入性传染性和炎性疾病，包括丹毒、脑膜炎、关节炎、毒性休克综合征、憩室炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎、结肠炎、蜂窝织炎、烧伤创面感染、肺炎、尿路感染、术后感染、和腹膜炎； )慢性炎性和或传染性疾病，包括囊性纤维化、coro和其它肺部疾病、胃肠疾病，包括慢性皮肤和胃溃疡、其它上皮炎性和或传染性疾病诸如特应性皮炎、口腔溃疡(口疮性溃疡)、生殖器溃疡和炎性变化、牙周炎、眼部炎症，包括结膜炎和角膜炎，外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器炎症； iii)术后炎症，炎性和凝固性病症，包括血栓形成、DIC、术后凝固病症、和与接触外来物质有关的凝固病症，包括体外循环、及生物材料的使用，此外，血管炎相关炎性疾病，及变态反应，包括变应性鼻炎和哮喘。
iv)与中风有关，但不限于中风的过度接触活化和/或凝固。
V)与抗微生物治疗组合的过度炎症。使用的抗微生物剂可以通过多种路径；静脉内(iv)、动脉内、玻璃体内、皮下(sc)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)、膀胱内、鞘内、硬膜外、肠内(包括口服、直肠、胃、和其它肠内路径)、或表面(包括皮肤、鼻应用、眼或耳中的应用，例如通过滴剂，及肺吸入)来施用。药剂的例子是青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单酰胺菌素、氨基糖苷类、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内酯、和氟喹诺酮。防腐剂包括碘、银、铜、氯己定、聚己缩胍和其它双胍、壳聚糖、乙酸、和过氧化氢。
73.依照权利要求34至52中任一项的多肽在制备用于治疗或预防炎症和/或过度凝固的药物中的用途。
74.依照权利要求73的用途，其中所述药物用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮肤和系统性血管炎、血栓形成和弥散性血管内凝固(DIC)。
75.依照权利要求74的用途，其中所述药物用于治疗或预防败血症。
76.依照权利要求74的用途，其中所述药物用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)。
77.依照权利要求73至76中任一项的用途，其中所述药物与一种或多种别的治疗剂组合使用。
78.依照权利要求77的用途，其中所述别的治疗剂选自下组抗生剂、抗真菌剂、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂和防腐剂。
79.依照权利要求78的用途，其中所述抗生剂选自下组抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂和抗寄生物剂。
80.依照权利要求78的用途，其中所述别的治疗剂是类固醇。
81.一种用于治疗或预防患者中的炎症的方法，该方法包括对所述患者施用治疗有效量的依照权利要求I至52中任一项的多肽或依照权利要求59或65中任一项的药物组合物。
82.依照权利要求81的方法，其中所述患者是人。
83.依照权利要求95或96的方法，其用于治疗或预防急性炎症、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化、哮喘、变应性和其它类型的鼻炎、皮 肤和系统性血管炎、血栓形成和弥散性血管内凝固(DIC)。
84.依照权利要求83的方法，其用于治疗或预防败血症。
85.依照权利要求83的方法，其用于治疗或预防慢性阻塞性肺病(COPD)。
86.依照权利要求81至85中任一项的方法，其中所述方法对所述患者进一步施用一种或多种别的治疗剂。
87.依照权利要求86的方法，其中所述别的治疗剂选自下组抗生剂、抗炎剂、免疫抑制剂、血管活性剂、受体阻断剂、受体激动剂和防腐剂。
88.依照权利要求87的方法，其中所述抗生剂选自下组抗细菌剂、抗杀真菌剂、抗病毒剂和抗寄生物剂。
89.依照权利要求87的方法，其中所述别的治疗剂是类固醇。
90.一种基本上如本文中参照说明书和附图所描述的多肽。
91.一种基本上如本文中参照说明书和附图所描述的药物组合物。
92.一种医学移植物或装置，或其中使用的生物材料，基本上如本文中参照说明书和附图所描述的。
93.多肽的用途，基本上如本文中参照说明书和附图所描述的。
94.一种用于治疗或预防炎症的方法，基本上如本文中参照说明书和附图所描述的。
全文摘要
本发明提供了用于治疗或预防炎症和/或血液过度凝固的多肽，所述多肽包含源自调控血液凝固的天然存在的蛋白质的氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物，或由该氨基酸序列、或其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成。本发明的相关方面提供了包含SEQ ID NOS:1至3的氨基酸序列、或其展现出抗炎活性的片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物或由SEQ ID NOS:1至3的氨基酸序列、或展现出抗炎活性的其片段、变体、融合物或衍生物，或所述其片段、变体或衍生物的融合物组成的分离的多肽，以及用于制备它们的分离的核酸分子、载体和宿主细胞。另外，提供了包含本发明的多肽的药物组合物，及使用其治疗和/或预防炎症和/或过度凝固的方法。
文档编号A61K38/10GK102655874SQ201080052695
公开日2012年9月5日 申请日期2010年9月21日 优先权日2009年9月22日
发明者A.施密特肯, B.U.沃尔斯, G.卡塞蒂, M.卡勒, N.M.马尔姆斯腾, P.帕帕雷帝 申请人:X免疫股份公司