纯化聚乙二醇化蛋白质的方法

专利名称：纯化聚乙二醇化蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及通过从含有聚乙二醇化(PEGylated)蛋白质的样品中去除杂质来纯化聚乙二醇化蛋白质(特别是，但不专指维生素K依赖性凝血因子例如因子IX (FIX))的方法，涉及用所述方法纯化的蛋白质，以及涉及所述纯化后的蛋白质在治疗中的用途，特别但并非唯一地涉及所述纯化后的蛋白质在用于治疗由凝血因子减轻的疾病中的用途，所述治疗例如血友病的预防性治疗。
背景技术：
凝血是包括多种血液组分或因子的复杂相互作用的过程，这最终导致血纤蛋白血块。通常，参与被称为凝血“级联”的血液组分为酶原(proenzyme或zymogen),即通过激活剂的作用而被转变为蛋白水解酶的无酶活的蛋白，所述激活剂本身为活化凝血因子。经过所述转变后的凝血因子通常情况下称作“活性因子”，并通过加上小写“a”后缀来命名(例如因子 Vila)。需要活化因子(〃Xa〃)来将凝血酶原转变为凝血酶，其随后将血纤蛋白原转变为血纤蛋白，这作为形成血纤蛋白血块的最后阶段。有两个系统或途径促进因子X的活化。“内源途径”是指通过利用仅存在血浆中的因子而致使凝血酶生成的那些反应。一系列由蛋白酶介导的活化最终生成因子IXa，其与因子VIIa —起将因子X裂解为因子Xa。相同的蛋白水解通过在凝血的“外源途径”中的因子VIIa与其辅因子，组织因子来实现。组织因子为膜结合蛋白，并且通常不在血浆内循环。然而当血管破裂时，在Ca2+与磷脂存在下，其可与因子VIIa复合以催化因子X活化或因子IX活化。两种凝血途径在止血中的相对重要性尚不明确。因子IXa (FIXa)是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其通过生成作为X酶复合物一部分的大多数因子Xa而在止血过程中发挥关键作用，凝血期间需要所述因子Xa来支持凝血酶的正确生成(Hoffman M 和 Monroe D. Μ. , III (2001) A cell-based model ofhemostasis. Thromb Haemost 85, 958-965中的综述)。因子IXa活性的先天性缺乏是X-连锁的出血障碍血友病B的原因，所述血友病B影响约1:100,000的男性。这些血友病患者目前主要通过用重组或血浆-来源的凝血因子IX的替代疗法来治疗。因子IX为维生素K依赖性凝血因子，其在结构上与因子VII、因子X和蛋白C相似。血浆半衰期为约18至30小时的循环的酶原形式由415个氨基酸组成，其可分为4个不同的结构域，所述结构域包括N末端的富含Y-羧基谷氨酸(Gla)结合域，两个EGF结构域，和C末端胰蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶结构域。因子IX的活化通过以下而发生在Arg145-Ala146和Arg18tl-Val181的有限蛋白水解释放35个氨基酸的片段，即所谓的激活肽(Schmidt A. E.和Bajaj S. P. (2003) Structure-function relationships in Factor IX and FactorIXa. Trends Cardiovasc Med 13，39-45)。此激活肽高度糖基化，其包含个N连接和多达4个O连接聚糖。
蛋白质循环半衰期的延长可通过修饰蛋白质天然结构来实现。聚乙二醇化是已建立的一种用于延长蛋白质的循环半衰期的方法。因子IX (FIX)的糖聚乙二醇化(GlycoPEGylation)生成多种聚乙二醇化物质，例如单、二和三-聚乙二醇化物质。如此的组合因而为形成多种单聚乙二醇化和二聚乙二醇化物质提供了可能性。单聚乙二醇化形式已被鉴定为具有期需的药理学概况(profile)，并因而被选为优选的药物候选物。因此，从聚乙二醇化和非聚乙二醇化物质的混合物中分离单聚乙二醇化形式是期需的。除了聚乙二醇化物质彼此分离及其与非聚乙二醇化物质的分离之外，纯化过程还必须提供充分减少的反应中所使用试剂。开发一种保证期需产物质量的方法是必要的，并且将有利的是，开发可提供充分减少的过程相关杂质(例如聚乙二醇化试剂、酶、来自试剂的副产物)以及产物相关杂质(例如非聚乙二醇化物质)的单个步骤纯化。US 2008/207879 (Baxter Int)描述了 rFIX的纯化过程，其包括将产物加入阴离子交换柱，和用超过200 mM的盐浓度洗柱子，以及用包含二价阳离子的洗脱缓冲液洗脱。发明概述 根据本发明的第一方面，提供了纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于，所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。根据本发明的第二方面，提供了纯化的聚乙二醇化因子IX凝血因子，其可通过本文阐述的方法获取。附图
简述
图I展示了用本发明纯化方法所得到的色谱图。发明详述
根据本发明的第一方面，提供了纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于，所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。本发明的纯化方法相较于之前描述的纯化方法拥有众多优势。意想不到地发现，在洗涤期间尽管存在酸性缓冲液，但聚乙二醇化蛋白质(例如FIX)仍然与树脂结合。迄今为止纯化因子(聚乙二醇化蛋白质浓度与杂质浓度之比)意想不到地高。例如在本发明中，所得级分中ST3Gal3的含量显著降低。ST3Gal3为在糖聚乙二醇化过程期间使用的聚乙二醇化酶。在所得级分中存在此酶显然是非期需的，这是因为在接下来的纯化过程中可出现进一步聚乙二醇化。此外，将残余的酶视为杂质，并且在单聚乙二醇化rFIXa的药物制剂中将残余的酶量降到非常低的水平是期需的。本发明的酸性洗涤步骤还提供了灭活样品中可能存在的任何pH敏感病毒的优势。本发明还提供了使单个色谱步骤的纯化得以进行的额外优势。聚乙二醇化蛋白质可通过文献中已知且本领域技术人员已知的方法之一获得。WO2005/055950和WO 2006/127896描述了 FIX的聚乙二醇化方法，其中将PEG基团经酶连接
到糖基上。用本发明方法进行纯化的聚乙二醇反应混合物可经由糖聚乙二醇化或其它已知的聚乙二醇化方法获得。尽管聚乙二醇化蛋白质的纯化构成本发明的特定方面，但所述方法亦可同样应用于与除PEG外的聚合物(例如聚唾液酸)连接的蛋白质纯化。在一个实施方案中，所连接的PEG基团大小在约2至约40 kD之间变化。
在一个实施方案中，通过酸性洗涤步骤去除的杂质为ST3Gal3。在一个实施方案中，杂质去除步骤包括用pH在3. 8至5. O之间(即在下列任一pH 3. 9、4· 0、4· 1、4· 2、4· 3、4· 4、4· 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9 或 5· O)，例如在 4. O 至 4. 5 之间(即在下列任一 pH :4. 0、4. 1、4. 2、4. 3、4. 4或4. 5)，例如在4. 0至4. 4之间，特别为4. I至4. 3之间，更特别为4. 1、4. 2或4. 3的酸性缓冲液洗涤。在低于4. 5的pH下进行杂质去除步骤的优势为由于存在Ca2+结合结构域，聚乙二醇化蛋白质在所述pH下将紧密地结合，因此，酸性洗涤可用于降低等电点高于聚乙二醇化蛋白质的其它杂质浓度。将理解的是，缓冲液包含任何能够降低pH值至约4. 5以下的合适缓冲液，然而，适宜地所述缓冲液将不包含二价阳离子 。在一个实施方案中，酸性缓冲液包含乙酸钠和/或乙酸。在另一实施方案中，酸性缓冲液包含50 mmol乙酸钠和140 mmol乙酸。将理解的是，可使用更低浓度的乙酸钠或乙酸，然而，保持这两个组分的比率恒定是重要的，并且酸性洗涤步骤足够长以将PH降至4. 5以下。将理解的是，酸性洗涤步骤在洗脱之前和上样至阴离子交换柱之后实施。在一个实施方案中，平衡化步骤在上样步骤之前实施。进行平衡化步骤的好处在于未结合的聚乙二醇化蛋白质经过阴离子交换柱洗掉。在另一实施方案中，平衡化步骤包括了在PH 5至7之间的平衡缓冲液的施用。在PH 5至7之间实施平衡化步骤的优势在于在此pH下杂质CAM-NAN意想不到地不与阴离子交换柱结合,因而在穿流液(flowthrough)中被去除。在一个实施方案中，第二平衡化步骤实施于酸性洗涤步骤之前，但将理解的是所述第二平衡化步骤可以被忽略(例如，酸性洗涤步骤可直接在上样步骤之后)。在酸性洗涤步骤之前实施平衡化步骤的优势在于ST3Gal3在从平衡条件(例如pH 5至7之间)和酸性洗涤条件(例如pH 4至4. 5之间)的pH变化或pH梯度下选择性地被洗脱。在又一实施方案中，平衡化步骤包括施用PH 6的平衡缓冲液，例如pH 6的含有组氨酸的缓冲液。在一个实施方案中，所述平衡缓冲液包含乙酸钠和乙酸。在另一实施方案中，所述平衡缓冲液包含10 mM乙酸和90 mM乙酸钠。将理解的是，聚乙二醇化样品在平衡化步骤之后将上样至阴离子交换柱(即在平衡化步骤之后但在酸性洗涤步骤之前)。聚乙二醇化样品也可在PH 4-4. 5的酸性洗涤步骤期间直接上样，然而，尽管这会致使ST3Gal3结合的显著减少，但亦可能的是，阴离子交换柱结合聚乙二醇化样品的能力可被降低。在一个实施方案中，第三平衡化步骤在酸性洗涤之后但在洗脱之前实施。在一个实施方案中，聚乙二醇化蛋白质为维生素K依赖性蛋白质，例如维生素K依赖性凝血因子。在另一实施方案中，所述维生素K依赖性凝血因子包括含半乳糖的凝血因子。在又一实施方案中，所述维生素K依赖性凝血因子选自因子II (FII)、因子VII(FVII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、蛋白S和蛋白C。在又一实施方案中，所述维生素K依赖性凝血因子为因子IX (FIX)或因子VII (FVII)。在又一实施方案中，所述维生素K依赖性凝血因子为因子IX (FIX)。在本发明上述任一方面的实施方案中，所述因子IX选自WO 03/031464、US2005/0106658、WO 2004/099231、US 2004/0132640、US 2005/0100982,US 2004/0137557、US 2006/0030521,US 2004/006391KUS 2006/0040856,WO 2005/055950,WO 2006/127896和TO 2008/119815中公开的非限定因子IX衍生物的任一种。在另一实施方案中，所述因子IX为PEG40k-FIX，如在WO 2008/119815的实施例I中描述的。在一个实施方案中，在凝血因子IX为PEG40k_FIX的情况下，杂质去除步骤中的酸性缓冲液的pH值下限为约pH 3. 7 - 3. 8，这是因为PEG40k-FIX在此pH下洗脱。将理解的是，阴离子交换色谱可依据技术人员所知的方法实施。合适阴离子交换材料的实例包括Q-树脂(Q-resin)、 季胺和DEAE树脂、二乙氨基乙烷(DiEthylAminoEthane)。阴离子交换树脂可市购，例如Mono Q Source 15Q或30Q(GE-health care)> Poros 20HQ 或 50HQ (Applied Biosystems)> Toyopearl Q650S (TosoHaas)以及其它。在一个实施方案中，所述阴离子交换材料包括HQ，例如Poros HQ，例如Poros 50HQ。Poros HQ可从Applied Biosystems获得,其基于产生高容量的季铵化聚乙烯亚胺官能团。根据本发明的第二方面，提供了纯化的聚乙二醇化蛋白质，其可通过本文阐述的方法获取。在一个实施方案中，所述聚乙二醇化蛋白质为维生素K依赖性蛋白质，例如维生素K依赖性凝血因子。在另一实施方案中，所述维生素依赖性K凝血因子包括含半乳糖的凝血因子。在又一实施方案中，所述维生素K依赖性凝血因子选自因子II (FII)、因子VII(FVII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、蛋白S和蛋白C。在又一实施方案中，所述维生素K依赖性凝血因子为因子IX (FIX)或因子VII (FVII)。在又一实施方案中，所述维生素K依赖性凝血因子为因子IX (FIX)。在一个实施方案中，纯化后的蛋白质，例如单聚乙二醇化维生素K依赖性蛋白质基本上不含ST3Gal3。“基本上不含”是指所述单聚乙二醇化维生素K依赖性蛋白质含有少于 100 ng/mL 的 ST3Gal3。在一个实施方案中，纯化后的蛋白质，例如单聚乙二醇化维生素K依赖性蛋白质基本上不含多聚乙二醇化物质。“基本上不含”是指单聚乙二醇化维生素K依赖性蛋白质含有少于20%的多聚乙二醇化物质，例如少于15%，或少于10%或少于5%、少于3%、少于2%或少于1%。根据本发明的另一方面，提供了含有本文阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质(例如纯化的因子IX)的药物组合物。纯化凝血因子和包含凝血因子的药物组合物可用于治疗通过给予凝血因子(例如FIX)而减轻的疾病，所述疾病例如出血障碍(bleeding disorder),例如血友病、血液病、关节积血(hemarthrosis)、血肿、粘膜出血、遗传性血液病、家族性出血障碍、家族性血液病或因子替代疗法。在一个实施方案中，通过给予凝血因子而减轻的疾病为血友病，例如血友病B或克里斯马斯病(Christmas disease)。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种治疗血友病的方法，其包括给予患者如前所述的治疗有效量的纯化凝血因子。亦提供了用于治疗血友病的如前所述的纯化凝血因子。 亦提供了如前所述的纯化凝血因子在制备用于治疗血友病的药物中的用途。亦提供了用于治疗血友病的包含如前所述的纯化凝血因子的药物组合物。需要理解的是,治疗性和预防性(prophylactic)(预防性(preventive))方案代表了本发明的不同方面。特别应理解的是，本发明提供了具有更长血浆半衰期的纯化凝血因子，从而使其适于血友病的预防性治疗。此血友病的预防性治疗构成了本发明的优选实施方案。制剂可进一步包括缓冲液系统、防腐剂、张度剂(tonicity agent)、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物制剂为水性制剂，例如含水的制剂。这样的制剂通常为溶液或混悬液。在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂为水溶液。在一个实施方案中，所述药物制剂为冻干制剂，医生或患者在使用之前向其加入溶剂和/或稀释剂。
在一个实施方案中，所述药物制剂为干燥制剂(例如冻干或喷雾干燥的)，其无需任何溶解即可使用。在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的纯化凝血因子水溶液和缓冲液的药物制剂，其中所述纯化凝血因子以O. 1-100 mg/ml的浓度存在，和其中所述制剂具有约2. O至约10. O的pH。在本发明的一个实施方案中，所述制剂的pH选自包括以下的列表2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2· 4、2· 5、2· 6、2· 7、2· 8、2· 9、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 6、3· 7、3· 8、3· 9、4· 0、4· I、4. 2、4· 3、4· 4、4· 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9、5· 0、5· 1、5· 2、5· 3、5· 4、5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· O、6. I、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9、7. O、7. I、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、
8.O λ 8. 1、8· 2、8· 3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 7、8· 8、8· 9、9· 0、9· 1、9· 2、9· 3、9· 4、9· 5、9· 6、9· 7、9· 8、
9.9 和 10. O0在本发明的一个实施方案中，所述缓冲液选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、2-羟乙基-I-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(Ν-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、2_(Ν_吗啉基)乙磺酸(MES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠，以及三(羟甲基)_氨基甲烧、N-二(轻乙基)甘氨酸(bicine)、曲辛(tricine)、苹果酸、琥拍酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲液的每一种构成了本发明备选实施方案。在本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含活性位点抑制剂。在本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含药学上可接受的防腐剂。在本发明的一个实施方案中，所述防腐剂选自酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇，以及硫柳萊、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲(imidurea)、氯己定(chlorohexidine)、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(3-对-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本发明的一个实施方案中，防腐剂以O. I mg/ml至20 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述防腐剂以O. I mg/ml至5 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述防腐剂以5 mg/ml至10 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述防腐剂以10 mg/ml至20 mg/ml的浓度存在。这些具体防腐剂的每一种组成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中使用防腐剂对技术人员而言是熟知的。为了方便起见可参考 Remington -.The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含等渗剂。在本发明的一个实施方案中，所述等渗剂选自盐类(例如氯化钠)、糖或糖醇(sugar alcohol)、氨基酸(L_甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(alditol)(例如甘油(丙三醇)、I，2-丙二醇(propanediol 或 propyleneglycol) >1,3-丙二醇、I, 3- 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。可使用任何糖类如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖(glucan)、包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖(dextran)、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一个实施方案中糖添加剂为蔗糖。将糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中糖醇添加剂为甘露醇。上面所述的糖或糖醇可单独或组合使用。所用剂量无固定的限制，只要糖或糖醇在液体制剂中可溶，并且不负面地影响使用本发明方法所达到的稳定效果即可。在 一个实施方案中，所述糖或糖醇的浓度在约I mg/ml到约150 mg/ml之间。在本发明的一个实施方案中，所述等渗剂以I mg/ml到50 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述等渗剂以I mg/ml到7 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述等渗剂以8 mg/ml到24 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述等渗剂以25 mg/ml到50 mg/ml的浓度存在。这些具体的等渗剂的每一种组成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中使用等渗剂对技术人员而言是熟知的。为了方便起见可参考Remington The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含鳌合剂。在本发明的一个实施方案中，鳌合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐类及其混合物。在本发明的一个实施方案中，所述鳌合剂以0. I mg/ml到5 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述鳌合剂以0. I mg/ml到2 mg/ml的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，所述鳌合剂以2 mg/ml到5 mg/ml的浓度存在。这些具体的鳌合剂的每一种组成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中使用鳌合剂对技术人员而言是熟知的。为了方便起见可参考Remington -.The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含稳定剂。在药物组合物中使用稳定剂对技术人员而言是熟知的。为了方便起见可参考Remington Science and Practiceof Pharmacy,第 20 版，2000。更具体的说，本发明组合物为稳定的液体药物组合物，其治疗活性组分包括在以液体药物制剂存储期间可能显示聚集体形成的多肽。“聚集体形成”意指多肽分子间的物理相互作用，导致寡聚体的形成，其可保持可溶性，或可为从溶液中沉淀出的可见的大聚集体。“存储期间”意指液体药物组合物或制剂一旦制备好，不是立即给予受试者。而是，制备好后，将其包装用于存储，以液体形式、以冷冻状态，或以干燥形式以便后来重构成液体形式或以其它适合给予受试者的形式。“干燥形式”意指液体药物组合物或制剂通过以下来干燥冻干(即冷冻干燥；参见例如Williams和Polli (1984) J. Parenteral Sci.Technol. 38:48-59)、喷雾干燥(参见 Masters (1991)的 Spray-Drying Handbook (第5 版；Longman Scientific and Technical, Essez, U. K.)、第 491-676 页;Broadhead等(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206;和 Mumenthaler 等(1994) Pharm.Res. 11:12-20),或者风干(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470;和Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)。
在液体药物组合物存储期间多肽导致的聚集体形成可负面地影响该多肽的生物活性，从而导致该药物组合物治疗效果的丧失。此外，聚集体形成可引起其它问题，例如用输注系统给予含有多肽的药物组合物时，管、膜或泵的堵塞。
本发明药物组合物还可包括一定量的氨基酸碱，其足以降低在组合物存储期间多肽导致的聚集体形成。“氨基酸碱”意指氨基酸或氨基酸组合，其中任何给定氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。当使用氨基酸组合时，所有的氨基酸可以其游离碱形式存在、所有氨基酸可以其盐形式存在或者一些可以其游离碱形式存在而其它以其盐形式存在。在一个实施方案中，用于制备本发明组合物的氨基酸为那些携带带电侧链的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即L、D或其混合物)或这些立体异构体的组合，可存在于本发明的药物组合物中，只要特定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在即可。在一个实施方案中使用了 L-立体异构体。本发明组合物也可用这些氨基酸的类似物配制。“氨基酸类似物”意指带来期需作用即降低本发明液体药物组合物存储期间多肽导致的聚集体形成的天然存在氨基酸的衍生物。合适的精氨酸类似物包括，例如，氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，以及合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L-半胱氨酸。和其它氨基酸一样，氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐形式包含在组合物中。在本发明的一个实施方案中，所使用的氨基酸或氨基酸类似物的浓度足以防止或延迟蛋白质聚集体的形成。在本发明的一个实施方案中，当作为治疗剂的多肽为至少包含一个易受下述氧化影响的甲硫氨酸残基的多肽时，可添加甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸类似物)来抑制甲硫氨酸残基氧化至甲硫氨酸亚砜。“抑制”意指甲硫氨酸氧化的物质随时间的最小积累。抑制甲硫氨酸氧化导致更大程度上保持多肽为其正确分子形式。任何甲硫氨酸的立体异构体(L、D或其混合物)或其组合均可使用。添加的量应为足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量，使得甲硫氨酸亚砜的量对于调节剂是可接受的。通常，这意味着组合物包含不超过约10%到约10%的甲硫氨酸亚砜。一般来说，这可以通过添加甲硫氨酸来实现，使得添加到甲硫氨酸残基的甲硫氨酸比率范围为约1:1到约1000:1，例如10:1到约100:1。 在本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。在本发明的一个实施方案中，所述稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基_/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL, HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质例如硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲硫基乙醇和不同的盐(例如氯化钠)。这些具体稳定剂的每一种构成了本发明的备选实施方案。药物组合物还可包含其它的稳定剂，其进一步增加其中治疗活性多肽的稳定性。本发明特别受关注的稳定剂包括，但不仅限于甲硫氨酸和EDTA(其保护多肽免于甲硫氨酸氧化)和非离子表面活性剂，其保护多肽免于与冻融或机械剪切相关的聚集。在本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，所述表面活性剂选自去垢剂、乙氧基化蓖麻油、多糖酵解的(polyglycolyzed)甘油酯、乙酰化单甘油酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(例如泊洛沙姆(poloxamer)例如 Pluronic F68、泊洛沙姆 188 和 407、Triton X-100)、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷化和烷氧基化衍生物(吐温(tween)，例如吐温-20、吐温-40、吐温-80和布里杰(Brij)-35)、其单甘油酯或乙氧基化衍生物、其甘油二酯或聚氧乙烯衍生物、醇类、甘油、凝集素和磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂衍生物(例如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂衍生物(例如棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的I-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)以及溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)_衍生物，例如溶血磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蘧酰衍生物、二棕榈酰磷脂酰胆碱、和极性头部基团的修饰物(modification)，所述极性头部基团即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇以及带正电荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP，溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸、和甘油磷脂(例如脑磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃半乳糖苷)、鞘糖脂(例如神经酰胺、神经节苷脂)、十二基磷酸胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂、夫西地酸的衍生物(例如牛磺二氢夫西地酸钠等)、C6-C12的长链脂肪酸(例如油酸和辛酸)及其盐、酰基肉碱和衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的N°-酰化衍生物，或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸任何组合的二肽的N°-酰化衍生物、包含中性氨基酸和两个带电氨基酸的任何组合的三肽的N°-酰化衍生物、DSS(多库酯钠、CAS登记号[577-11-7])，多库酯钙，CAS登记号[128-49-4])、多库酯钾，CAS登记号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸及其盐和甘氨酸或牛磺酸结合物、熊脱氧胆酸、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、N-十六基-N，N-二甲基-3-铵基(amm0ni0)-l-丙磺酸盐、阴离子(烷基-芳基-磺酸盐)单价表面活性剂、两性离子型表面活性剂(例如N-烷基-N，N-二甲基铵基-I-丙磺酸盐、3-胆酰胺(cholamido)-I-丙基二甲基铵基-I-丙磺酸盐、阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如十六烧基三甲基溴化铵、西批氯铵(cetylpyridinium chloride))、非离子表面活性剂(例如十二烧基β-D-卩比喃葡萄糖苷)、poloxamine (例如Tetronic ’ s),其为源自向乙二胺顺序添加环氧丙烷和环氧乙烷的四功能的嵌段共聚物，或者所述表面活性剂可选自咪唑啉衍生物，或其混合物。这些具体表面活性剂的每一种构成了本发明的备选实施方案。
在药物组合物中使用表面活性剂对技术人员而言是熟知的。为了方便起见可参考Remington .,The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。有可能其它成分可存在于本发明药物制剂中。这样额外的成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、膨胀剂、张度调节剂(tonicity modifier)、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这样额外的成分当然不应负面地影响本发明药物制剂的整体稳定性。包含本发明纯化凝血因子的药物组合物可在需要所述治疗的患者的数个部位给予，所述部位例如局部，例如，皮肤和粘膜部位，在旁路(bypass)吸收的部位,例如,在动脉、在静脉、在心脏给予，以及在涉及吸收的部位，例如，在皮肤、皮下、肌肉或在腹部中给予。本发明药物组合物的给予可通过数个给药途径，例如向需要所述治疗的患者经舌给药、舌下给药、含服给药、经口给药、口腔给药、经胃和肠、鼻、肺给药，例如通过细支气管和肺泡或其组合给药、经表皮、经皮、透皮、阴道、直肠、经眼给药，例如通过结膜、输尿管给药，和胃肠外给药。本发明药物组合物可以数种剂型给予，例如作为溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复合型乳剂、泡沫剂、药膏、糊剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、包衣片剂、洗剂(rinse)、胶囊剂，例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊、栓剂、直肠用胶囊剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、气雾剂、吸入齐IJ、滴眼剂、眼用软膏剂、眼用洗剂(ophthalmic rinse)、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏剂、注射液、原位转换溶液、例如原位凝胶、原位沉降、原位沉淀、原位结晶、输液剂和植入物。本发明组合物还可与药物载体、药物递送系统和改进的药物递送系统配混，或与其连接，例如通过共价、疏水和静电相互作用，以便进一步增强本发明肽的稳定性、提高生物利用度、提高可溶性、降低副作用、达到时间治疗(其为本领域技术人员所熟知)、并且提高患者依从性或其任意组合。载体、药物递送系统和改进的药物递送系统的实例包括，但不仅限于聚合物，例如纤维素和衍生物、多糖，例如葡聚糖和衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和丙烯酸甲酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白，例如白蛋白、凝胶，例如热胶化系统，例如为本领域技术人员所熟知的嵌段共聚物系统，胶束、脂质体、微球体、纳米颗粒、液晶及其分散体、L2相及其分散体(其为脂质-水系统中相特性领域的技术人员熟知)、聚合物胶束、复合型乳剂、自乳化剂、自微乳化剂、环糊精及其衍生物，和树枝状高分子(dendrimer)。本发明组合物可用于制备用于经肺给予本发明肽的固体、半固体、散剂和溶液剂，所述经肺给予使用例如定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，这些装置都为本领域技术人员所熟知。本发明组合物特别可用于制备控释、持续释放、延迟释放、延缓释放和缓释的药物递送系统。更具体地，但不仅限于，组合物可用于制备胃肠外控释和持续释放系统(两个系统均导致给予量减少数倍)，其为本领域技术人员所熟知。甚至更优选皮下给予的控释和持续释放系统。不受限于本发明的范围，有用的控释系统和组合物的实例为水凝胶、油性凝胶、液晶、聚合物胶束、微球体和纳米颗粒。制备可用于本发明组合物的控释系统的方法包括，但不限于，结晶、冷凝(condensat ion)、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压均质化、包封、喷雾干燥、微胶囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以产生微球体、挤压和超临界流体工艺。一般参考可参见Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L. , ed. Marcel Dekker,New York, 2000)和 Pharmaceutical Sciences 第 99 卷Protein Formulation andDelivery (MacNally, E. J. , ed. Marcel Dekker, New York, 2000)。胃肠外给药可通过皮下、肌肉内、腹膜内或使用注射器，任选笔形注射器的静脉内注射来实施。或者，胃肠外给药可通过输注泵来实施。另一选择为这样的组合物其可为溶液剂或混悬剂，以便以鼻或肺喷雾形式给予本发明肽。作为又一选择，包含本发明肽的药物组合物还可适用于透皮给予，例如通过无针注射或通过贴剂，任选离子导入贴剂(iontophoretic patch),或透粘膜例如含服来给予。术语“稳定的组合物”是指具有增强的物理稳定性，增强的化学稳定性或增强的物 理和化学稳定性的组合物。本文使用的术语蛋白质组合物的“物理稳定性”是指由于蛋白质暴露于热-机械应力下和/或与不稳定的界面和表面(例如疏水表面和界面)相互作用而使蛋白质形成无生物活性和/或不溶性蛋白质聚集体的趋势。水性蛋白质组合物的物理稳定性通过在将装入合适容器(例如药筒或小瓶)中的组合物在不同的时间期间内暴露于不同温度下的机械/物理应力(例如搅拌)之后借助目视检查和/或浊度测量来评估。所述组合物的目视检查在具有暗背景的明亮聚焦光下进行。所述组合物的浊度通过对浊度的程度进行目试评分排行来表征，例如等级I到3(表现无浊度的组合物对应目试评分为O，和在日光下表现目试浊度的组合物对应目试评分为3)。当组合物在日光下表现浊度时，则将此组合物归为就蛋白质聚集体而言的物理上不稳定。或者，所述组合物的浊度可通过为技术人员所熟知的简单浊度测量法来评估。水性蛋白质组合物的物理稳定性还可通过使用蛋白质构象状态的光谱试剂或探测物(probe)来评估。所述探测物优选为优先结合蛋白质的非天然构象异构体的小分子。蛋白质结构的小分子光谱探测物的一个实例为硫黄素T。硫黄素T是广泛用于淀粉样原纤维检测的荧光染料。在原纤维的存在下，并且也可能存在其它蛋白质构型的情况下，当硫黄素T结合原纤维蛋白质形式时， 其在约450 nm下产生新的最大激发和在约482 nm下产生增强的发射。在所述波长下未结合的硫黄素T基本上是非荧光的。其它小分子可用作蛋白质结构从天然到非天然态状态变化的探测物。例如优先结合蛋白质暴露的疏水块(hydrophobic patch)的“疏水块”探测物。疏水块在蛋白质天然结构下通常埋在其三级结构中，但当蛋白质开始解折叠或变性时暴露在外。这些小分子的光谱探测物的实例为芳香的疏水染料、例如蒽、吖唳、菲咯啉(phenanthroline)等。其它光谱探测物为金属-氨基酸络合物，例如疏水氨基酸的钴金属络合物，所述疏水氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸等。本文使用的术语蛋白质组合物的“化学稳定性”是指蛋白质结构中化学共价键改变，其导致与天然蛋白质结构相比，生成具有潜在较低生物学效价和/或潜在升高的免疫原性的化学降解产物。根据天然蛋白质的类型和性质及蛋白质所暴露的环境可形成多种化学降解产物。消除化学降解很可能不可完全避免，并且在蛋白质组合物的存储和使用期间往往可看到渐增量的化学降解产物，如本领域技术人员所熟知的。大多数蛋白质倾向于脱酰氨基，即其中谷氨酰基或天冬酰残基的侧链酰胺基水解形成游离羧酸的过程。其它降解途径包括高分子量转变产物的生成，其中两个或多个蛋白质分子通过转酰氨基和/或二硫键相互作用而彼此共价结合，导致共价结合的二聚体、寡聚体和多聚体降解产物的生成{Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., PlenumPress, New York 1992)。氧化(例如甲硫氨酸残基的氧化)也可提及为化学降解的另一变体。蛋白质组合物的化学稳定性可通过暴露于不同环境条件下后在不同时间点测量化学降解产物的量来评估(降解产物的生成通常可通过例如升高温度来实现)。每种单独的降解产物的量通常通过使用多种色谱技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)依据分子大小和/或电荷来分离降解产物而测定。因此，如上所概述的，“稳定的组合物”是指具有增强的物理稳定性，增强的化学稳定性或增强的物理和化学稳定性的组合物。一般来说，组合物必须在使用和存储期间(按照推荐的使用和存储条件)保持稳定直到有效期限为止。在本发明的一个实施方案中，包含本发明纯化蛋白质的药物组合物在6周以上的使用和三年以上的存储中保持稳定。在本发明的另一实施方案中，包含本发明纯化蛋白质的药物组合物在4周以上的使用和三年以上的存储中保持稳定。在本发明的进一步实施方案中，包含本发明纯化蛋白质的药物组合物在4周以上的使用和两年以上的存储中保持稳定。在本发明的更进一步实施方案中，包含本发明纯化蛋白质的药物组合物在2周以上的使用和两年以上的存储中保持稳定。在本发明的更进一步实施方案中，包含本发明纯化蛋白质的药物组合物在I周以上的使用和六个月以上的存储中保持稳定。 现将通过参考以下非限定性实施例来描述本发明。实施例I
聚乙二醇化FIX的纯化 (a)加入溶液
缓冲液交换过的聚乙二醇化FIX具有95%以上纯度。加入物的pH值约为6。FIX的浓度约为I mg/mL。加入星约为5 g产物/L树脂。(b)柱
Poros 50 HQj 15. 7 mL。(C)缓冲液
-平衡缓冲液10 mM乙酸、90 mM乙酸钠，pH 5. 7
-酸性洗漆5个柱体积(CV)的酸性洗漆缓冲液乙酸钠65 mmol/kg、乙酸185 mmol/kg, pH 4· 3 ;5个柱体积
-洗脱5个柱体积的线性梯度，从100%平衡缓冲液到100%洗脱缓冲液(10 mM组氨酸、50 mM NaCl、50 mM CaCl2)
-再生3个柱体积的I M氯化钠 (d)程序
Mt缓麵mm %-洗脱缓冲液
fm 化5
翻
imψ職驗徽3(Bi
mnrm ,性鐵錄缓I1I1Λ3
《-2)
洗^ -I'HIjfS 冲液30%
a attSr'Hft5o' !oo%
Wk部1: 冲液3o%
UiM 24 CV/h : 6,28 ιιι /ηι η 5 T
色谱纯化程序的结果展示在图I中，其描述了用UV280nm信号获得的色谱图。标记为“ I”的峰描述了穿流液其中例如CMP-NAN被去除。标记为“2”的峰描述了对应于ST3Gal3的峰，即其表现了其中ST3Gal3被去除并且标记为“3”的峰描述了产物峰。
图I的结果清楚地展示了产物峰与杂质例如ST3Gal3和CMP-Nan的明显分离，证实了本发明方法提供的有效纯化。实施方案列表
实施方案I :纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括使用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。实施方案2 :实施方案I的方法，其中连接的PEG基团大小在约2到约40KD之间变化。实施方案3 :实施方案I或在实施方案2的方法，其中通过酸性洗涤步骤去除的杂 质为 ST3Gal3。实施方案4 :任何前述实施方案的方法，其中所述杂质去除步骤包括使用3. 8至5. O、3. 9至4. 8或4. O至4. 5之间pH的酸性缓冲液进行洗涤。实施方案5 :实施方案4的方法，其中所述pH为3. 9,4. O或4. I。实施方案6 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 2。实施方案7 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 3。实施方案8 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 4。实施方案9 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 5。实施方案10 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 6。实施方案11 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 7。实施方案12 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 8。实施方案13 :实施方案4的方法，其中所述pH为4. 9。实施方案14 :实施方案4的方法，其中所述pH为5.0。实施方案15 :实施方案4的方法，其中所述pH在4. O至4. 4之间。实施方案16 :实施方案4的方法，其中所述pH在4. I至4. 3之间。实施方案17 :任何前述实施方案的方法，其中所述酸性缓冲液不包含二价阳离子。实施方案18 :任何前述实施方案的方法，其中所述酸性缓冲液包含乙酸钠和/或乙酸。实施方案19 :任何前述实施方案的方法，其中所述酸性缓冲液包含50 mmol乙酸钠和140 mmol乙酸。实施方案20 :任何前述实施方案的方法，其中平衡化步骤实施在上样步骤之前实施。实施方案21 :实施方案20的方法，其中所述平衡化步骤包括了 pH在5至7之间的平衡缓冲液的施用。实施方案22 :实施方案20或实施方案21的方法，其中第二平衡化步骤在酸性洗涤步骤之前实施。实施方案23 :实施方案20到22中任一项的方法，其中所述平衡化步骤包括pH为6的平衡缓冲液的施用。实施方案24 :实施方案23的方法，其中所述平衡缓冲液是pH为6的包含组氨酸的缓冲液。实施方案25 :实施方案21到24中任一项的方法，其中所述平衡缓冲液包含乙酸钠和乙酸。实施方案26 :实施方案21到25中任一项的方法，其中所述平衡缓冲液包含10 mM乙酸和90 mM乙酸钠。实施方案27 :实施方案22到26中任一项的方法，其中所述第三平衡化步骤在酸性洗涤之后但在洗脱之前实施。实施方案28 :前述实施方案中任一项的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质为维生素K依赖性蛋白质。实施方案29 :实施方案28的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质为维生素K依赖性凝血因子。实施方案30 :实施方案28或实施方案29的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质为包含半乳糖的凝血因子。实施方案31 :实施方案28到30中任一项的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质为维生素K依赖性凝血因子，其选自因子II (FII)、因子VII (FVII)、因子IX (FIX)、因子X(FX)、蛋白S和蛋白C。实施方案32 :实施方案28到31中任一项的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质为因子 IX (FIX)或因子 VII (FVII)。实施方案33 :实施方案28到32中任一项的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质为因子 IX (FIX)。实施方案34 :实施方案28到30中任一项的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质为PEG40k-FIXo实施方案35 :前述实施方案中任一项的方法，其中阴离子交换色谱包括Q-树脂、季胺、和DEAE树脂、二乙氨基乙烷。实施方案36 :实施方案35的方法，其中所述阴离子交换树脂为Mono Q Source15Q 或 30Q (GE-health care) > Poros 20HQ 或 50HQ (Applied Biosystems) > ToyopearlQ650S (Toso Haas)。实施方案37 :实施方案36的方法，其中所述阴离子交换材料包括HQ。实施方案38 :实施方案37的方法，其中所述阴离子交换材料包括Poios HQ。实施方案39 :实施方案38的方法，其中所述阴离子交换材料包括Poios 50 HQ。实施方案40 :纯化的聚乙二醇化蛋白质，其可通过前述实施方案中任一项阐述的方法获得。实施方案41 :纯化的聚乙二醇化FIX蛋 白质，其可通过实施方案I至39中任一项阐述的方法获得。实施方案42 :如实施方案40或实施方案41中阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其基本上不含ST3Gal3。实施方案43 :如实施方案40到42中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其含有少于 100 ng/mL 的 ST3Gal3。实施方案44 :实施方案40到43中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其基本上不含多聚乙二醇化物质。实施方案45 :实施方案40到44中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其包含少于20%的多聚乙二醇 化物质。实施方案46 :实施方案40到45中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其包含少于15%的多聚乙二醇化物质。实施方案47 :实施方案40到46中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其包含少于10%的多聚乙二醇化物质。实施方案48 :实施方案40到47中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其包含少于5%的多聚乙二醇化物质。实施方案49 :实施方案40到48中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其包含少于3%的多聚乙二醇化物质。实施方案50 :实施方案40到49中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其包含少于2%的多聚乙二醇化物质。实施方案51 :实施方案40到50中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其包含少于1%的多聚乙二醇化物质。实施方案52 :药物组合物，其包含如实施方案40到51中任一项阐述的如本文阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质。实施方案53 :药物组合物，其包含纯化的聚乙二醇化因子IX蛋白质。实施方案54 :实施方案41到51中任一项阐述的纯化聚乙二醇化蛋白质或实施方案53中阐述的药物组合物，其用于治疗通过给予凝血因子(例如FIX)而减轻的疾病，例如出血障碍,例如血友病、血液病、关节积血、血肿、粘膜出血、遗传性血液病、家族性出血障碍、家族性血液病或因子替代疗法。实施方案55 :实施方案41到51中任一项阐述的纯化聚乙二醇化蛋白质或实施方案53中阐述的药物组合物，其用于治疗血友病。实施方案56 :实施方案41到51中任一项阐述的纯化聚乙二醇化蛋白质或实施方案53中阐述的药物组合物，其用于治疗血友病B或克里斯马斯病。实施方案57 :治疗血友病的方法，其包括给予患者实施方案41到51中阐述的治疗有效量的纯化凝血因子。实施方案58 :实施方案41到51中阐述的纯化凝血因子在制备用于治疗血友病的药物中的用途。本文引用的所有参考，包括出版物、专利申请和专利通过引用以其整体结合到本文中，其程度与逐一并且特别地指明每一参考以通过引用结合以及在本文中以其整体阐述每一参考相同(至法律允许的最大程度)，而与本文其它地方对特定文献的任何单独提供的结合无关。在描述本发明背景下，用语“a”和“an”和“所述”以及相似对象的使用应理解为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指出或明显与上下文相矛盾。例如，短语“所述化合物”应理解为是指本发明的多种“化合物”或描述的特定方面，除非另外指出。除非另外指出，本文提供的所有精确值代表相应的近似值(例如关于特定因子或测量提供的所有示例性精确值可被认为是亦提供了相应的近似测量，在适当的情况下，以“约”来修饰)。 使用用语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”提及某一元素或多个元素的本发明任一方面或方面的本文描述意欲给“由…组成”、“基本上由…组成”，或“基本上包含”该特定元素或多个元素的本发明相似方面或方面提供支持，除非另外说明或明显与上下文相矛盾 (例如本文所描述的包含特定元素的组合物应理解为亦描述了由该元素组成的组合物，除非另外说明或明显与上下文相矛盾)。
权利要求
1.纯化聚乙二醇化蛋白质的方法，其包括用洗脱缓冲液的阴离子交换色谱，其特征在于，所述色谱包括洗脱前的杂质去除步骤，其中所述杂质去除步骤包括用酸性缓冲液对所述阴离子交换柱进行洗涤。
2.权利要求I阐述的方法，其中所述杂质为ST3Gal3。
3.权利要求I或权利要求2阐述的方法，其中所述杂质去除步骤包括使用pH3. 9至4.5、4. O至4. 5或4. O至4. 4之间的酸性缓冲液洗涤。
4.前述权利要求中任一项阐述的方法，其中所述酸性缓冲液包含乙酸钠和/或乙酸，例如50 mmol乙酸纳和140 mmol乙酸。
5.前述权利要求中任一项阐述的方法，其中平衡化步骤在酸性洗涤步骤之前实施。
6.权利要求5阐述的方法，其中所述平衡化步骤包括pH在5至7之间的平衡缓冲液的施用。
7.权利要求5或权利要求6阐述的方法，其中所述平衡缓冲液包含乙酸钠和乙酸，例如10 mM乙酸和90 mM乙酸钠。
8.前述权利要求中任一项阐述的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白质选自因子II(FII)、因子VII (FVII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、蛋白S和蛋白C，例如因子IX (FIX)或因子VII (FVII)，特别是因子IX (FIX)，例如PEG40k-FIX。
9.前述权利要求中任一项阐述的方法,其中所述阴离子交换材料包括HQ，例如Poros HQ，例如 Poros 50 HQ。
10.可通过前述权利要求中任一项阐述的方法获得的纯化的聚乙二醇化蛋白质，例如纯化的因子IX。
11.权利要求10阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其基本上不含ST3Gal3。
12.权利要求10或权利要求11中阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质，其基本上不含CMP-NAN。
13.药物组合物，其包含如权利要求10到12中任一项阐述的纯化的聚乙二醇化蛋白质。
14.治疗血友病的方法，其包括给予患者权利要求10到12中任一项阐述的治疗有效量的单-聚乙二醇化因子IX。
15.权利要求10到12中任一项阐述的纯化的因子IX，其用于治疗血友病。
全文摘要
本发明涉及通过从含有聚乙二醇化蛋白质的样品中去除杂质来纯化聚乙二醇化蛋白质(特别是，但不专指维生素K依赖性凝血因子例如因子IX(FIX))的方法，涉及用所述方法纯化的蛋白质，以及涉及所述纯化后的蛋白质在治疗中的用途，特别但并非唯一地涉及所述纯化后的蛋白质在用于治疗由凝血因子减轻的疾病中的用途，所述治疗例如血友病的预防性治疗。
文档编号A61P7/04GK102639553SQ201080053284
公开日2012年8月15日 申请日期2010年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者A.博格斯内斯, L.塞耶斯加尔德, M.K.D.韦恩达尔 申请人:诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司