专利名称：细环病毒的感染性克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及细环病毒(Torque teno virus) ( “TTV”)的新核苷酸和氨基酸序列，包括其新基因型，所有这些用于制备治疗和预防猪和其他动物的疾病的疫苗。按照本发明 实践提供的疫苗有效对抗多种猪TTV基因型和分离株。诊断和治疗用多克隆和单克隆抗体也是本发明的特征，如在病毒繁殖和疫苗制备中有用的感染性克隆。特别重要的是，其中公开了疫苗，其包含作为抗原的单TTV开放阅读框的表达蛋白质——最特别的是来自ORFl或0RF2，以及还包含全长ORFl和0RF2-编码蛋白质的片段。
背景技术：
细环病毒(“TTV”)也被称为输血传染的病毒，其通常被归于环病毒科(Circoviridae)家族。通常认为，TTV首先分离自人输注患者(例如参见Nishizawa等,Biochem. Biophys. Res. Comm. vol. 241, 1997, pp. 92-97)。后来，TTV 或 TTV-样病毒已经从包括猪在内的其他哺乳动物中得以鉴定，而且很多菌株或分离株已经被公布(例如参加McKeown 等,Vet. Microbiol, vol. 104, 2004,pp 113-117)。后来的工作显示，TTV和TTV-类病毒非常普通；然而，TTV的发病机理以及其对其他疾病状态(例如，由其他病毒和细菌引起的那些)可能产生的作用仍然是不清楚的。例如，TTV感染在人类中包括甚至在健康个体中看起来是普遍的，而且此类感染通常是无症状的，并且保留数年之久。另外，通常不能在细胞培养中繁殖该病毒并且缺乏任何明确的机械论疾病模型，这使得TTV生物学的任何总体表征是困难的。尽管TTV病毒血症在遭受其他病毒病(诸如肝炎或HIV/AIDS)的人类患者中增加，但是也有相当多的医学文献提出TTV实际上是无毒性的，并且期待与已知疾病状态的任何清楚的实际的联系。例如参见Biagini等,Vet. Microbiol, vol. 98, 2004, pp. 95-101。关于猪，情况类似。有相当多的工作提出，TTV感染与很多疾病有关并促进很多疾病，诸如猪环状病毒病(及其各种临床表现，诸如断奶仔猪多系统衰弱综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome)和由于肺损害而复杂化的呼吸系统疾病)和PRRSV-相关疾病(猪呼吸繁殖综合征病毒)。例如参见已公布的国际专利申请WO2008/150275和WO 2008/127279。Krakowka等也报告了猪中一种经常致命的疾病，称为PDNS (猪皮炎及神经病变综合症(porcine dermatitis and neuropathy syndrome)),其被描述为弥漫性血管内凝血的表现形式，并且由血清型ITTV和PRRSV病毒引起的混合感染可能牵涉其中(Am. J. Vet Res, vol69 (12) ,2008，pp. 1615-1622)。PDNS 病也与猪环状病毒病(特别是PCV-2)有关而且也与细菌感染相关。因此，尽管已经完成相当多的工作，但是决定性关联猪TTV感染与具体病理学的工作仍然很少。然而，已经相当清楚的是，TTV感染可加强很多疾病状态。因此，对各类TTV试剂存在需求，诸如高亲和性抗体，以及例如TTV的肽片段或高度免疫的全毒粒，其促进我们对总体TTV生物学的理解以及直接或间接对TTV可能作用的很多疾病状态接种。因此，尽管TTV是猪疾病的主要病因因子这种可能性存在，但是看起来更可能的是，很多猪疾病需要一种以上的病毒存在，或者某些“主要”病原体的主要作用被TTV感染加强。如所述，通过向受侵袭或潜在受侵袭动物施用抗TTV剂，猪的很多疾病可以被治疗或减轻，这种可能性是存在的。尽管对TTV具有广泛接受的兴趣，但是有效的疫苗还没有出现。TTV是由负极性单链环状DNA构成的小的无包膜病毒。基因组包括三个重叠的主要开放阅读框0RF1、0RF2和0RF3，并且ORFl编码衣壳蛋白。(Biagini等，前述)。关于其详述讨论，请参见下面的参考文献，其通过参考并入=Kakkola等，Virology, vol. 382(2008), pp. 182-189 ；Mushahwar 等,Proc. Natl. Acad. Sci, USA, vol 96, (1999)pp. 3177-3182 ；和 T. Kekarainen and J. Segales, “Torque teno virus infection in the pig and itspotential role as a model of human infection，，, The Veterinary Journal, 2007年 12月13日接受，2008发表。尽管基因组相对简单，但是在细胞培养中或通过其他体外方法繁殖病毒通常是非常困难的。本发明涉及重组构建，藉此TTV可以被体外繁殖，包括通过传染性克隆。更具体而言，本发明涉及这样的发现有效的疫苗实际上可以从TTV制备，最特别的是当TTV抗原是单ORF的表达产物或其片段时。在优选的实施方式中，本发明提供ORFl蛋白质疫苗。
发明内容
本发明提供治疗或预防动物中由细环病毒(TTV)感染引起的疾病或病症的方法，包括由TTV直接引起的疾病状态，以及TTV起作用或被其加强的疾病状态。在优选的实例中，所治疗的动物是猪。可被TTV加强而且也可以按照本发明的实践治疗或预防的猪的疾病状态，包括由猪环状病毒(PCV)以及猪呼吸繁殖综合征病毒(PRRS)引起或与之有关的那些疾病状态。本发明也包括施用组合疫苗,所述组合疫苗即抗原的二价或多价组合,其可以包括对抗非TTV病原体的活抗原、修饰活抗原或灭活抗原，并适当选择佐剂。部分基于如本文所公开的独特的TTV氨基酸序列，本发明还提供用于区分用上述TTV疫苗接种的猪类动物与感染TTV野毒株(field strains)的猪类动物之间的诊断试剂盒。本发明的代表性实施方式包括分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列包括选自下述的多核苷酸(al)基因型 2 序列 TTV13 的 DNA(SEQ ID NO: I);基因型 2 序列 TTV10 的 DNA(SEQID NO: 2);或其编码TTV衣壳蛋白或者所述蛋白质片段的片段；(a2)基因型 I 序列的DNA，选自 ttvgl-7(SEQ ID NO: 4)、ttvGTl_17 (SEQ ID NO: 5)、ttvGTl-21(SEQ ID NO: 6) ,ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 3) ,ttvgtl-178 (SEQ ID NO: 7)，或其编码TTV衣壳蛋白或者所述蛋白质片段的片段；(b) (a)中任意序列的互补序列；(C)在严格条件下与(a)或(b)的序列杂交的多核苷酸，所述严格条件定义为在0. 5M NaHP04、7%SDS、ImM EDTA中在65 °C下与滤膜结合DNA杂交，并在68 °C于 0. 1XSSC/0. 1%SDS 中漂洗；(d)与(a)或(b)的多核苷酸至少70%同源的多核苷酸；
(e)与(a)或(b)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸；(f)与(a)或(b)的多核苷酸至少90%同源的多核苷酸；和(g)与(a)或(b)的多核苷酸至少95%同源的多核苷酸。本发明进一步提供为任何此类DNA多核苷酸序列的互补序列的RNA多核苷酸分子，以及表达任何此类RNA或DNA多核苷酸的载体和质粒，和从此类核苷酸序列表达的TTV病毒的载体和质粒，其中所述病毒是活的，或者完全或部分被减毒。本发明还提供DNA疫苗，所述DNA疫苗包括如前所述的多核苷酸序列和用作感染性克隆的相应的核苷酸序列。本发明提供由基因型2TTV13(SEQ ID NO: I)或基因型2TTV10 (SEQ ID NO: 2)多核苷酸的开放阅读框中任一种编码的多肽，或者是与所述多肽或与其片段至少90%同源的多 肽，包括其他另外相同的氨基酸通过保守置换而被置换的选择。本发明还提供由(所有血清型l)ttvgl-7(SEQ ID NO: 10)、ttvGTl-17 (SEQ IDNO: 11), ttvGTl-21(SEQ ID NO: 12), ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 13)和 ttvgtl-178 (SEQ IDNO:9)ORFl多核苷酸的开放阅读框中任一种编码的多肽，或者与该多肽或与其片段至少90%同源的多肽，包括其他另外相同的氨基酸通过保守置换而被置换的选择。尽管如在本领域中所报告提供对抗TTV (或者限制TTV加强其他疾病的能力)的有效疫苗连续失败，但是本发明提供此类有效疫苗，其优选包含由表达单TTV开放阅读框产生的多肽或其混合物。在优选的实施方式中，多肽从ORFl表达，并且优选的混合物包括ORFl和0RF2以及ORFl和0RF3的多肽组合。在进一步优选的实施方式中，并且利用本文公开的大量多肽序列信息，进一步提供多肽疫苗，其中抗原通过下述定义(a)TTV13 (SEQN0:1)或TTVlO (SEQ ID N0:2)衣壳蛋白的前100个N-端氨基酸；或(b)与其至少90%同源的氨基酸序列；或(c)其富含精氨酸区域。
图I (图A和B)显示通过免疫方法对ORFl蛋白质的检测。图2证实经密码子优化的TTVgl ORFl蛋白质在大肠杆菌中的成功表达，利用6XHis标记进行亲和纯化。图3提供Chromos构建物pcTV-TTVl-7 ORFl (伴有酵母转化酶)表达质粒的载体图，(在整合进入CHO细胞中的人工染色体之后)从中表达免疫接种ORFl蛋白质。图4提供各种TTV菌株的系统树，包括百分比同一性的编译。图5 (图A、B和C)提供从各种TTV分离株表达的ORFl蛋白质的相同富含精氨酸区域的鉴定。图6提供所装配的TTVgl-178的载体图。图7显示Chromos表达的glTTV ORFl与攻击对照相比显著减少肺损害以及再次与攻击对照(challenge control)相比降低glTTV病毒血症的程度和持续时间。图8提供含有ttvgl-178菌株全长感染性克隆的pCR2. l+TTVgl-178构建物的载体图。序列表说明
SEQ ID NO: I 提供基因型 gt2TTV 10DNA 序列。SEQ ID NO:2 提供基因型 2gt2TTV 13DNA 序列。SEQ ID NO: 3 提供基因型 lttvgtl_27DNA 序列。SEQ ID NO:4 提供基因型 lttvgtl_7DNA 序列。SEQ ID NO: 5 提供基因型 lttvgtl_17DNA 序列。SEQ ID N0:6 提供基因型 lttvgtl_21DNA 序列。SEQ ID N0:7 提供基因型 lttvgl-178DNA 序列。 SEQ ID NO:8 提供 TTV 菌株 AY8239910RF1 的氨基酸序列。SEQ ID NO:9提供TTV菌株ttvgtl_1780RFl (TTV基因型I)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 10 提供 TTV 菌株 ttvgtl_70RFl 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 11 提供 TTV 菌株 ttvgtl_170RFl 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 12 提供 TTV 菌株 ttvgtl_210RFl 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13 提供 TTV 菌株 ttvgtl_270RFl 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 14提供TTV菌株gt2TTV100RFl (基因型2)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 15 提供 TTV 菌株 gt2TTV130RFl 的氨基酸序列。SEQ ID勵16提供已知菌株々￥823991 (基因型2)的DNA序列。SEQ ID勵17提供已知菌株么￥823990 (基因型I)的DNA序列。SEQ ID NO: 18提供76057-3TTV衣壳编码序列，在其克隆进入pUC57 GenSciipt 载体中时针对大肠杆菌进行密码子优化。SEQ ID NO: 19提供76057-4TTV衣壳编码序列，在其克隆进入Invitrogen pETιο /D- ΤΟΡΟβ表达质粒中时针对大肠杆菌进行密码子优化。SEQ ID NO: 20提供76057-5TTV衣壳编码序列，在其克隆进入pUC57 GenSciipt 载体中时对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行密码子优化。SEQ ID NO: 21提供编码ttvgtl_70RFl的具有酵母转化酶表达标记(YI)的构建物的DNA序列。
SEQ ID NO: 22提供来自ORFl衣壳蛋白对应残基167-185的ttvgtl肽序列(基于相应的AY823990序列进行编号),其以酰胺化形式的C-端AA使用。SEQ ID NO: 23提供来自ORFl衣壳蛋白对应残基459-479的ttvgtl肽序列(基于相应的AY823990序列进行编号)。SEQ ID NO: 24提供来自ORFl衣壳蛋白对应残基612-637的ttvgtl肽序列(基于相应的AY823990序列进行编号)。SEQ ID NO: 25 提供 TTV 菌株 AY8239900RF1 的氨基酸序列。SEQ ID N0S:26_29 定义引物序列。结合序列的描述符，熟悉本领域的技术人员将认识到，很多稍微不同的缩写通常互换用于具体血清型，例如，glTTV、TTVgl、基因型1TTV、血清型lTTV、gtlTTV等。基因型2存在类似的情况。
具体实施例方式下面的定义和介绍性内容适用本说明书。
术语“猪的(porcine)”和“猪(swine)”在本文互换使用并且指的是为猪科(Suidae)家族成员的任意动物，诸如例如猪(pig)。“哺乳动物”包括哺乳动物纲的任何温血脊椎动物，包括人类。
为了本发明的目的，“感染性DNA分子”是编码将病毒复制、转录和翻译到合适的宿主细胞中的功能毒粒中所必需的元件的DNA分子。同样，“分离的多核苷酸分子”是指包含本发明的多核苷酸分子的组合物，所述多核苷酸分子从其天然出现的状态纯化至任何可检测的程度，若有的话。为了本发明的目的，第二多核苷酸分子的核苷酸序列(RNA或DNA)与第一多核苷酸分子的核苷酸序列是“同源的”，或者与所述第一多核苷酸分子具有“同一性”，其中基于遗传密码的简并，第二多核苷酸分子的核苷酸序列编码与第一多核苷酸分子的核苷酸序列相同的多氨基酸，或者当其编码与第一多核苷酸分子的核苷酸序列所编码的多氨基酸充分类似的多氨基酸以便用于实践本发明的情况。同源多核苷酸序列也指有义和反义链，并且在所有情况下是指任意此类链的互补序列。为了本发明的目的，多核苷酸分子用于实践本发明，并因此是同源的或具有同一性，其中，其可以被用作诊断探针，以检测感染猪的流体或组织样品中TTV病毒或病毒多核苷酸的存在，例如通过标准杂交或扩增技术。一般而言，如基于BLASTN算法(美国国家卫生研究院国家生物技术信息中心，另外称为NCBI (Bethesda, Maryland, USA)),如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有至少约70%的核苷酸序列同一'I"生，则其与第一多核苷酸分子的核苷酸序列是同源的。在根据本发明实践的具体计算实例中，参考BLASTP 2. 2. 6[Tatusova TAand TL Madden, “BLAST 2sequences_a new tool for comparing protein and nucleotidesequences.，，(1999)FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.]。简言之，两个氨基酸序列被比对以最优化比对分数，利用下述空位开放罚分10,空位扩展罚分0. I,以及Henikoff andHenikoff 的 “blosum62” 记分矩阵(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915-10919.1992)。百分比同一性然后计算为相同匹配总数XlOO/较长序列的长度+引入到较长序列中以比对两个序列的缺口数目。优选地，同源核苷酸序列具有至少约75%的核苷酸序列同一性，甚至更优选至少约80%、85%、90%和95%的核苷酸序列同一性。因为遗传密码是简并的，因此同源核苷酸序列可以包括任意数目的“静默”碱基变化，即，仍然编码相同氨基酸的核苷酸置换。同源核苷酸序列还可以含有非静默突变，S卩，导致编码的多氨基酸中氨基酸差异的碱基置换、缺失或加成，只要该序列与由第一核苷酸序列编码的多氨基酸保持至少约70%的同一性，或另外对实践本发明有用。在这方面，可以进行一些保守氨基酸置换，其通常被认为不是钝化总体蛋白质功能诸如关于带正电的氨基酸(并且反之亦然)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸；关于带负电的氨基酸(并且反之亦然)，天冬氨酸和谷氨酸；以及关于一些电中性的氨基酸组(并且在所有情况中同样反之亦然)，(I)丙氨酸和丝氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，(6)甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪氨酸，(8)丝氨酸和苏氨酸，O)色氨酸和酪氨酸，(10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。同源核苷酸序列可以通过比较核苷酸序列来测定，例如通过使用上述BLASTN。可选地，同源核苷酸序列可以通过在选择条件下杂交来测定。例如，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列在中等严格条件下与SEQ ID NO: I的互补序列杂交，例如在O. 5M NaHPO4,7%十二烷基硫酸钠(SDS)、ImM EDTA中在65°C与滤膜结合DNA杂交，并在O. 2 X SSC/0. 1%SDS中在 42 °C 漂洗(参见 Ausubel 等编者，Protocols in Molecular Biology, Wiley andSons, 1994，pp. 6. 0. 3-6. 4. 10)，或者在以其他方式导致编码TTV病毒的序列杂交的条件(如下定义)下与SEQ IDN0:1的互补序列杂交，则第二多核苷酸分子的核苷酸序列与SEQIDN0:1 (或任何其他特定多核苷酸序列)同源。杂交条件中的变更可以经验确定或基于探针的鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的长度和百分比精确计算。可以如在SambiOOk等(Eds. ),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9. 47-9. 51 中所述计算杂交条件。在另一实施方式中，如在本领域已知的，如果第二核苷酸序列在高度严格条件下与SEQ ID N0:1的互补序列杂交，例如在O. 5MNaHP04、7%SDS、lmM EDTA中在65°C与滤膜结合DNA杂交，并在O. 1XSSC/0. 1%SDS中在68°C漂洗，则第二核苷酸序列与SEQ IDN0:1(或本发明的任何其他序列)同源。此外应当理解的是，本发明的分离的多核苷酸分子和分离的RNA分子包括合成分子和通过重组技术诸如通过体外克隆和转录获得的分子。本发明的多肽和多核苷酸本发明的典型实施方式包括分离的多核苷酸序列，其包含选自下述的多核苷酸(&1)基因型 2 序列 TTV13 的 DNA(SEQ ID NO: I);基因型 2 序列 TTV10 的 DNA(SEQID NO: 2);或其编码TTV衣壳蛋白或者所述蛋白质片段的片段；(a2)基因型 I 序列的DNA，选自 ttvgl-7(SEQ ID NO: 4)、ttvGTl_17 (SEQ ID NO: 5),ttvGTl-21(SEQ ID NO: 6) ,ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 3) ,ttvgtl-178 (SEQ ID NO: 7)，或其编码TTV衣壳蛋白或者所述蛋白质片段的片段；(b) (a)中任意序列的互补序列；(c)在严格条件下与(a)或(b)的序列杂交的多核苷酸，所述严格条件定义为在0. 5M NaHP04、7%SDS、ImM EDTA中在65 °C与滤膜结合DNA杂交，并在68 V于0. 1XSSC/0. 1%SDS 中漂洗；(d)与(a)或(b)的多核苷酸至少70%同源的多核苷酸；(e)与(a)或(b)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸；(f)与(a)或(b)的多核苷酸至少90%同源的多核苷酸；和(g)与(a)或(b)的多核苷酸至少95%同源的多核苷酸。本发明也提供由基因型2TTV13(SEQ ID NO: I)或基因型2TTV10 (SEQ ID NO: 2)多核苷酸的开放阅读框中任一种编码的多肽，或者与该多肽或与其片段至少90%同源的多肽，包括其他另外相同的氨基酸通过保守置换而被置换的选择。本发明还提供由(所有血清型l)ttvgl-7(SEQ ID NO: 10)、ttvGTl-17 (SEQ IDNO: 11), ttvGTl-21(SEQ ID NO: 12), ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 13)和 ttvgtl-178 (SEQ IDNO:9)ORFl多核苷酸的开放阅读框中任一种编码的多肽，或者与该多肽或与其片段至少90%同源的多肽，包括其他另外相同的氨基酸通过保守置换而被置换的选择。在优选的实施方式中，多肽从ORFl表达，并且优选的混合物包括ORFl和0RF2以及ORFl和0RF3的多肽组合。、
在进一步优选的实施方式中，进一步提供TTV多肽类疫苗，其中抗原通过下述定乂 (a) TTV13(SEQ NO: I)或 TTVlO (SEQ ID NO:2)的 ORFl 衣壳蛋白的前 300 个 N-端氨基酸；或(b)与其至少90%同源的氨基酸序列；(b)TTV13(SEQ NO: I)或 TTVlO (SEQ ID NO: 2)的 ORFl 衣壳蛋白的前 200 个 N-端氨基酸；或(b)与其至少90%同源的氨基酸序列；
(c)TTV13(SEQ NO: I)或 TTVlO (SEQ ID NO: 2)的 ORFl 衣壳蛋白的前 100 个 N-端氨基酸；或(b)与其至少90%同源的氨基酸序列；(d)(所有血清型 l)ttvgl-7(SEQ ID NO: 10)、ttvGTl-17 (SEQ IDNO :11),ttvGTl-21(SEQ ID NO: 12) ,ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 13) ttvgtl-178 (SEQ ID NO:9)中任一种的ORFl衣壳蛋白的前300个N-端氨基酸，或与其至少90%同源的多肽；(e)(所有血清型 l)ttvgl-7(SEQ ID NO: 10)、ttvGTl-17 (SEQ IDNO :11),ttvGTl-21(SEQ ID NO: 12) ,ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 13) ttvgtl-178 (SEQ ID NO:9)中任一种的ORFl衣壳蛋白的前200个N-端氨基酸，或与其至少90%同源的多肽；和(f)(所有血清型 l)ttvgl-7(SEQ ID NO: 10)、ttvGTl-17 (SEQ IDNO:11),ttvGTl-21(SEQ ID NO: 12) ,ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 13) ttvgtl-178 (SEQ ID NO:9)中任一种的ORFl衣壳蛋白的前100个N-端氨基酸，或与其至少90%同源的多肽。更多的遗传操作由本发明提供的DNA和氨基酸序列信息也使得系统分析病毒基因及其编码基因产物的结构和功能成为可能。编码本发明的病毒基因产物的多核苷酸的知识也使得识别并杂交编码本发明多肽的多核苷酸的反义多核苷酸或其片段可用。全长和片段反义多核苷酸在本方面是有用的。本领域技术人员应当理解，本发明的片段反义分子包括(i)特异性识别并杂交特定RNA (如通过编码本发明的病毒多肽的DNA的序列比较所测定)的那些，以及( )识别并杂交编码编码蛋白质的变体的RNA的那些。与编码其他TTV肽的RNA/DNA杂交的反义多核苷酸通过序列比较来鉴定特征或通过分子家族的特征序列也是可鉴定的。此类技术(见实施例8)在研究TTV多肽中的抗原结构域方面也有用，并且还可以用于区分感染环病毒科的远程相关的非TTV成员的宿主动物。实施例4提供关于有效的密码子优化以增强本发明的构建物在酵母和大肠杆菌中的表达的指导。疫苗制剂本发明的疫苗可以按照公认的习惯配制，以包含包括人(如果适用)在内的动物可接受的载体，诸如标准缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且还可以被配制成便于持续释放。稀释剂包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油和类似物。等渗性添加剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖及其他。稳定剂包括白蛋白及其他。其他合适的疫苗媒介物和添加剂，包括配制改进活疫苗特别有用的那些，是本领域技术人员已知的，或者对本领域技术人员而言将是显而易见的。例如参见Remington’s PharmaceuticalScience, 18th ed. , 1990, Mack Publishing,其通过参考并入本文。本发明的疫苗还可以包含一种或多种另外的免疫调节组分，诸如例如佐剂或细胞因子，以及其他。可以用在本发明的疫苗中的佐剂的非限定性实例包括RIBI佐剂体系(Ribi Inc.，Hamilton, MT)、明矾、矿物凝胶诸如氢氧化铝凝胶、水包油乳状液、油包水乳状液诸如例如弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、QS_21 (CambridgeBiotech Inc. , Cambridge MA) > SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、y\jyj3Pi 丨1(___丨iiN” 佐剂、阜苷、Quil A或其他阜苷组分(saponin fraction)、一磷酰脂质A、离子多糖和阿夫立定脂质-胺佐剂。用于本发明疫苗的水包油乳状液的非限定性实例包括改性SEAM62和SEAM1/2 制剂。改性 SEAM62 是含 5%(v/v)角鲨烯(Sigma) U%(v/v)85 去污剂(ICI
Surfactants)、O. 7%(v/v) TWi'Ι ,Ν" 80 去污剂(ICI Surfactants)、2. 5%(ν/ν)乙醇、200 μ gml QuilAUOO μ g/ml胆固醇和0. 5%(v/v)卵磷脂的水包油乳状液。改性SEAM 1/2是含 5% (v/v)角鲨烯、1% (v/v) SPAN'*' 85 去污剂、0. 7% (v/v) Tween 80 去污剂、2. 5% (v/v)乙醇、100 μ gml QuilA和50 μ g/ml胆固醇的水包油乳状液。可以被包括在疫苗中的其他免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞介素、干扰素或其他已知的细胞因子。
另外的佐剂体系允许结合T辅助细胞和B细胞表位，产生一种或多种类型的共价T-B表位连接结构,其可以另外被脂质化(with may be additionally lipdated),诸如在WO 2006/084319、TO2004/014957 和 TO2004/014956 中所述的那些。在本发明优选的实施方式中，ORFI TTV蛋白质或其他TTV蛋白质或其片段用5% AMPI..IKJEN 配制。本发明的疫苗可以任选被配制用于持续释放本发明的病毒、感染性DNA分子、质粒或病毒载体。此类持续释放制剂的实例包括与生物相容性聚合物复合材料结合的病毒、感染性DNA分子、质粒或病毒载体，所述聚合物诸如例如聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。在药物递送媒介物中可降解聚合物的结构、选择和用途已经在数个出版物中进行综述，包括 A. Domb 等，1992，Polymers for Advanced Technologies3:279-292，其通过参考并入本文。选择和应用药物制剂中的聚合物的其他指导可以在本领域已知的教科书中找到，例如 M. Chasin and R. Langer (eds), 1990, “BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems，，in:DruRS and the Pharmaceutical Sciences,Vol. 45, M. Dekker,NY,其也通过参考并入本文。可选地,或另外地,病毒、质粒或病毒载体可以被微囊包埋以改进施用和功效。微囊包埋抗原的方法在本领域是熟知的，并且包括例如在美国专利3，137，631 ;美国专利3，959，457 ;美国专利4，205，060 ;美国专利4，606，940 ；美国专利4，744，933 ;美国专利5，132，117 ;和国际专利公布WO 95/28227中描述的技术，所有这些通过参考并入本文。脂质体也可以用于提供病毒、质粒、病毒蛋白或病毒载体的持续释放。关于如何制备和使用脂质体制剂的详情可在美国专利4，016，100 ;美国专利4，452，747 ;美国专利4，921，706 ;美国专利4，927，637 ;美国专利4，944，948 ;美国专利5，008，050 ;和美国专利5，009, 956以及其他地方找到，所有这些通过参考并入本文。上述疫苗任一种的有效量可以通过常规方法确定，开始于低剂量病毒、病毒蛋白质粒或病毒载体，然后增加剂量同时监控效果。有效量可以在单次施用疫苗之后或者在多次施用疫苗之后获得。当确定最佳剂量/动物时可以考虑已知的因素。这些包括动物的种类、大小、年龄和一般状况，动物中其他药物的存在，及类似因素。实际剂量优选在考虑来自其他动物研究的结果之后来选择(例如参见下面的实施例2和3)。一种检测是否已经达到适当的免疫应答的方法是在接种之后测定动物中的血清转变和抗体滴度(antibody titer )。接种的时间选择和加强的数目-如果存在的话-
优选由医生或兽医基于分析所有相关因素来决定，这些因素中的一些在上面描述。本发明的病毒、蛋白质、感染性DNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以利用已知技术并考虑可由本领域技术人员确定的因 素诸如待被接种的动物的重量来确定。本发明的病毒在本发明疫苗中的剂量优选在约IO1至约IO9Pfu(噬斑形成单位)的范围内，更优选约102至约108pfu，以及最优选约IO3至约107pfu。本发明的质粒在本发明疫苗中的剂量优选在约O. I μ g至约IOOmg的范围内，更优选约Iyg至约IOmg,甚至更优选约10 μ g至约Imgo本发明的感染性DNA分子在本发明疫苗中的剂量优选在约O. I μ g至约IOOmg的范围内，更优选约Iug至约10mg，甚至更优选约IOyg至约lmg。本发明的病毒载体在本发明疫苗中的剂量优选在约IO1Pfu至约109pfu的范围内，更优选约102pfu至约108pfu,甚至更优选约IO3至约107pfu。合适的剂量大小在约O. 5ml至约IOml的范围内，更优选约Iml至约 5ml。按照本发明的实践病毒蛋白或肽疫苗的合适剂量范围通常是I至50微克/剂量或更高的量，这可以通过标准方法确定，其中佐剂的量通过关于每种此类物质的公认的方法确定。在与猪接种相关的本发明的优选实例中，动物的最适宜年龄目标在约I天与21天之间，其在断奶前(at pre-weening)也可以符合其他预定的接种诸如抗猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)。另外,育种母猪的优选接种时间表包括类似的剂量,并安排每年再接种。本发明还考虑抗-TTV抗体(例如，单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化、人、猪和⑶R-嫁接抗体，包括包含特异性识别本发明的TTV多肽的⑶R序列的化合物)。术语“特异性”表示本发明的抗体的可变区专有识别和结合TTV多肽(即，尽管在多肽家族中发现的序列同一性、同源性或相似性，其能区别单TTV多肽与相关多肽)，并且其被允许(任选地)通过与抗体可变区外具体而言Ab分子恒定区中的序列相互作用而与其他蛋白质相互作用(例如，金黄色酿脓葡萄球菌(S. aureus)蛋白质A或ELISA技术中的其他抗体)。测定本发明抗体的结合特异性的筛选试验是熟知的并且在本领域被常规实践。关于此类试验的综合讨论，参见 Harlow 等(Eds), Antibodies A Laboratory Manual; ColdSpring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6。识别并结合本发明TTV多肽的片段的抗体也考虑在内，条件是所述抗体首先并首要对所述片段所源自的本发明的TTV多肽具有特异性，如上定义。为清楚起见，“抗体”是指作为对特异性抗原免疫应答的结果可以与该抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定区”和“可变区”的“轻”和“重”多肽链组成的血清蛋白质，并且基于恒定区的组成被分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。抗体可以以多种形式存在，包括例如Fv、Fab’、F (ab’)2，以及以单链存在，并且包括合成多肽，其含有一个或多个抗体单链多肽序列的全部或部分。诊断试剂盒本发明还提供诊断试剂盒。所述试剂盒对区分自然感染TTV病毒野毒株的猪类动物与用本文所述的任意TTV疫苗接种的猪类动物可以是有价值的。该试剂盒还可以是有价值的，原因在于潜在感染TTV病毒野毒株的动物可以在临床症状存在之前被检测到并从群中移走，或者远离幼稚或接种动物进行隔离。试剂盒包括试剂，用于分析来自猪类动物的样品是否存在指定TTV病毒的特定组分的抗体。本发明的诊断试剂盒可以包括来自0RF1、2或3的肽或多个肽作为组分，其在野毒株中但不是在感兴趣的疫苗中存在，或者反之亦然，并且通过如在说明书实施例I和2中提供的广泛氨基酸测序使得选择此类合适的肽结构域成为可能。如本领域已知的，本发明的试剂盒可以可选地包括经由融合蛋白质提供的肽作为组分。为了本发明的目的，术语“融合肽”或“融合蛋白质”意指由TTV病毒蛋白质，优选0RF1，的至少一部分和异源肽或蛋白质组成的单多肽链。实施例实施例I猪TTV全基因组的克隆A. TTV 基因型 2.
利用DNA血液小试剂盒(blood mini kit) (Qiagen)按照制造商的方案,从猪血清纯化DNA。在50 μ L Tris-EDTA缓冲液中从柱中洗脱出DNA。然后经由随机引物滚环扩增(random primed rolling circle amplification)扩增 DNA。简言之，然后将 5uL 纯化 DNA和 IOOng 随机六聚体(random hexamers) (Invitrogen)加至 71 μ I 水并在 95°C加热 3min且在冰上冷却。然后添加ImM dNTP’ s、100ng随机六聚体(Invitrogen)、I Xphi29聚合酶缓冲液和I μ Lphi29聚合酶，并将反应在30°C温育过夜。将总体积的五分之一用EcoRI消化并在O. 8%E-gel (Invitrogen)上电泳以检测2. 7kB片段的存在。利用Qiagen PCR纯化试剂盒按照制造商的方案纯化EcoRI消化的材料并连接到EcoRI消化的/奸碱性磷酸酶处理的pGem3zf (+)载体(Promega)中。连接DNA用于化学转化感受态大肠杆菌(competent E. coli)DH5a。在LB/amp琼脂平板上选择转化的大肠杆菌。使质粒DNA与转化菌落分离并用EcoRI消化以验证约2. 7kB插入片段存在。选择四个克隆(4、7、10和13)并提交至ACGT，Inc.进行序列测定。序列数据的比对表明，克隆10和13显示与TTV公布序列同源，并且相比基因型I其比对更接近TTV基因型2。这些克隆随后被命名为TTVlO和TTV13。PAH TTV基因型2测序数据分析.TTV13(SEQ ID NO: 2)和 TTVlO (SEQ ID NO: I)与公布的 TTV 基因型 2AY823991DNA序列(SEQ ID NO: 16)的核苷酸比对。AY823991 (I)TCATGACAGGGTTCACCGGAAGGGCTGCAAAA-TTACAGCTAAAACCACATTVI3(I)TAATGACAGGGTTCACCGGAAGGGCTGCAAAA-TTACAGCTAAAACCACATTVIO(I)TAATGACAGGGTTC-CAGGAAGTGCTGCAAAAATTACAGCTAAAACCACAAY82399I (50)AGT-CTAACACAATAAACCACAAAGTATTACAGGAAACTGCAATAAATTTTTV13 (50)AAT-CTAACACAATAAACCACAAAATATTACAGGAAACTGCAATAAATTTTTVlO (50)ACTACTTACACAT—AACCACAAAATATTTCAGGAAACTGCAATAATTTTAY823991 (99) AGAAATAAGTTACACATAACCACCA------------AACCACAGGAAACTTV13 (99) AGAAATAAATTACACATAACCACCA------------AACCACAGGAAACTTVlO (98)CAACACACATTGCACAAAACCACAAGATATCAACATAAACCACAGGAAACAY823991 (137)TGTGCAAAAAAGAGGAAATAAATTTCATTGGCTGGGCCTGAAGTCCTCATTTVI3 (137)TCTGCAAAAAAGAGGAAATAAATTTCATTGGCTGGTCCATAAGTCCTCAT
TTV10(148)TCTGCAAAAAAGAGGAAGTAAATGCTATTGGCTAAATCTGAAGTCTTCAT
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TTV13(187)TAGAATACAAAAAGAACCAATCAGAAACACTTCCTCTTTTAGAGTATATA
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AY823991(287AACAGAGCTGAGTGTCTAACCGCCTGGGCGGGTGCCGGAGCTCCTGAGAG
TTV13(287)AACAGAGCTGAGTGTCTAACCGCCTGGGCGGGTGCCGGAGCTCCTGAGAG
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AY823991(337CGGAGTCAAGGGGCCTATCGGGCAGGCGGTAATCCAGCGGAACCGGGCCC
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AY823991(387CCC-TCGATGGAAGAAAGATGGCTGACGGTAGCGTACTGCGCACACGGAT
TTV13(387)CCCCTCCATGGAAGAAAGATGGCTGACGGTAGCGTACTGCGCCCACGGAT
TTV10(398)CCC-TCCATGGAGGAGAGATGGCTGACGGTAGCGTACGCCGCCCACGGAT
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TTV13(437)TATTCTGCGACTGTAAAGACCCGAAAAAACATCTTGAAAAATGCCTTACA
TTV10(447)TATTCTGCGCCTGCAGTAAGCCCAAAGACCACCTTGAAAAATGCCTTTCC
AY823991(486GACGCTATCGCAGACGCCGAAGAAGACCGACACGGAGATGGAGGCACCGG
TTV13(487)GACGCTATCGCAGACGCCGAAGGAGACCGACAAGAAGATGGAGGCACCGG
TTV10(497)ACCGCTATCGCCGACGCCGAAGGAGACCCACCAGGAGATGGAGGAGAAGG
AY823991(536AGGTGGAGACGCTACTTTCGATATCGGTATCGACGCGCTCCTCGCCGCCG
TTV13(537)AGGTGGAGACGCTACTTTCGATATCGGTATCGACGCGCTCCTCGCCGCCG
TTV10(547)AGGTTCCAGCGCTACTTTCGATATCGGTATAGACGCGCTCCTCGCCGCCG
AY823991(586CCGCACAAAGGTAAGGAGACGGAGGAAAAAAGCTCCGGTCATAC
TTV13(587)CCGCACAAAGGTAAGGAGACGGAGGAGGAAAGCTCCGGTCATAC
TTV10(597)CCGACGCTACAAGGTAAGGAGACGGAGGGTTAAAAAGGCTCCGGTCATTC
AY823991(630AATGGTTCCCTCCTAGCCGGAGAACCTGCCTCATAGAGGGATTTTGGCCG
TTV13(631)AATGGAACCCTCCTAGCCGGAGGACCTGCCTCATAGAGGGGTTCTGGCCG
TTV10(647)AATGGTTCCCCCCAACAGTCAGAAACTGTTTTATCAAGGGAATCTGGCCG
AY823991(680TTGAGCTACGGACACTGGTTCCGTACCTGTCTCCCCTTTAGGCGGTTAAA
TTV13(681)TTGAGCTACGGACACTGGTTCCGTACCTGTCTCCCCTTTAGAAGAAAAAA
TTV10(697)TTGAGCTACGGACACTGGCTCCGTACCTGTCTCCCTATGAGAAAAGAAAA
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TTV13(731)TGGACTAATATTTACGGGAGGAGGTTGTGACTGGACTCAGTGGAGCTTAC
TTV10(747)CGGACTCATATTCCTAGGAGGTGGCATAGACTGGACTGTCTGGAGTTTAC
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TTVlO(897)TAGACACACAACCAGATCCTACGTAGTAACATGGGACCAAGACATACCATAY823991(930)GCAGGCCACTACCTTATCAAAACCTGCATCCACTCCTAATGCTACTAAAATTV13(931)GTAAACCTTTACCATATCAGAACTTACACCCATTATTAATGCTATTAAAATTVlO(947)GTAAACCTTTACCATACACAAATTTACATCCATTTGTAATGCTTCTAAAAAY823991(980)AAACAGCACAAAATTGTACTTTCACAGCAAAACTGTAACCCAAACAGAAATTV13(981)AAACAACACAAATTAGTACTCTCACAACAAAACTGTAACCCTAACAGAAATTVlO(997)AAACATCATAAAGTAGTTCTAAGCAAACAAGACTGTAATCCTAGAAAAATAY823991(1030)ACAAAAACCTGTCACATTAAAATTCAAACCTCCGCCAAAACTAACATCACTTV13(1031)ACAAAAACCTGTAACTTTAAAATTCAGACCGCCACCAAAACTAACTTCACTTVlO(1047)GGACAAACCAGTCACCTTAAAAATAAAGCCACCACCAAAACTCACATCACAY823991(1080)AATGGAGACTAAGTAGAGAATTAGCAAAGATGCCACTAATAAGACTTGGATTV13(1081)AATGGAGACTAAGTAGAGAATTAGCAAAAATGCCACTCATTAGACTAGGATTVlO(1097)AGTGGAGACTAAGCAGAGAATTATCAAAAATACCGCTCTTAAGACTAGGAAY823991(1130)GTAAGCTTTATAGACCTAACAGAACCATGGGTAGAAGGGTGGGGAAATGCTTV13(1131)GTTAGTTTTATAGACTTAACAGAACCGTGGCTAGAAGGTTGGGGAAATGCTTVlO(1147)GTTTCTTTAATAGACTTCAGAGAACCATGGGTTGAAGGTTTTGGAAATGCAY823991(1180)ATTTTATTCCGTGCTAGGATATGAAGCAGTAAAAGACCAAGGACACTGGTTTV13(1181)ATTTTACTCAGTACTAGGATATGAAGCCATAAAAGAACAAGGACACTGGTTTVlO(1197)ATTCTTTAGTACTTTAGGATATGAAGCAGATAAAAGCAATTTAAAAACAAAY823991(1230)CAAACTGGACACAAATAAAATACTATTGGATCTATGACACGGGAGTAGGATTVI3(1231)CAAATTGGTCACAAATTAAATATTACTGGATATATGATACAGGAGTAGGATTVlO(1247)GCGCTTGGTGCCAATGTAAATACTTCTGGATATATGATACCGGAGTAAATAY823991(1280)AATGCAGTATATGTTATACTATTAAAAAAAGACGTTACTGATAATCCAGGTTV13(1281)AATGCTGTATATGTAGTTATGCTAAAACAAGATGTAGACGACAACCCAGGTTVlO(1297)AATCATGTATATGTAGTCATGTTAAACAAAGACGCAGGAGATAATGCAGGAY823991(1330)AAACATGGCAACAACCTTTAAAGCATCAGGAGGACAGCATCCAGATGCAATTVI3(1331)AAAAATGGCATCAACATTTAAAACAACTCAGGGACAACATCCCAATGCTATTVlO (1347)AGACCTAATAACAA------------------------ATCAAAACTCAAAY823991(1380) TAGATCACATTGAATTGATAAACCAAGGATGGCCTTACTGGTTATACTTTTTVI3(1381)TAGATCACATAGAATTAATAAATGAAGGATGGCCGTACTGGTTATACTTTTTVlO(1373)TAGCACACATAGAACAGATAGGAGAAGGTTATCCATACTGGTTATATTTTAY823991(1430)TATGGTAAAAGTGAACAAGACATTAAAAAAGAGGCACAC—AGCGCAGATTVI3(1431)TTTGGTAAAAGTGAACAAGACATAAAAAAGGAAGCACAT—AGCGCTGA
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TTVlO(2057)TCCTCAATGCGTGGGATTATGACTATGATGGAATTGTTAGAAAAGACACTAY82399I(2111)CTCAAAAGACTTCTCGAACTCCCCACAGAGACAGAGGAGGAGGAGAAGGCTTVI3(2121)CTCAAAAGACTTCTCGAACTCCCCACAGAGACAGAGGAGGAGGAGAAGGCTTVlO(2107)CTCAAAAGACTGCTTGCCATCCCCACAGACTC—GGAGGAGGAGAAAGCAY823991(2161)GTACCCACTCCTTGGACAAAAAACAGAGAAAGAGCCATTATCAGACTCCG
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TTV13(2638)GGGCTCCGCCCCCTGCACCCCCGGGAGGGGGGGAAACCCCCCCTCAACCCTTVlO(2570)GGGCTCCGCCCCCTGCACCCCCGGGAGGGGGGGAAACCCCCCCTCAACCCAY823991(2705)CCCGCGGGGGG-CAAGCCCCCCTGCACCCCCC-TTVI3(2688)CCCGCGGGGGG-CAAGCCCCCCTGCACCCCCC-
TTVlO (2620)CCCGCGGGGGGGCAAGCCCCCCTGCACCCCCCC
权利要求
1.分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列包括选自下述的多核苷酸 (B1)基因型 2 序列 TTV13 的 DNA(SEQ ID NO: I);基因型 2 序列 TTVlO 的 DNA(SEQ IDNO: 2);或其编码TTV衣壳蛋白或者所述蛋白质片段的片段；(a2)基因型 I 序列的 DNA，选自 ttvgl-7(SEQ ID NO: 4)、ttvGTl-17 (SEQ ID NO: 5),ttvGTl-21(SEQ ID NO: 6)、ttvgtl_27 (SEQ ID NO: 3)和 ttvgtl-178 (SEQ ID NO: 7)，或其编码TTV衣壳蛋白或者所述蛋白质片段的片段； (b)(a)中任意序列的互补序列； (c)在严格条件下与(a)或(b)的序列杂交的多核苷酸，所述严格条件定义为在O.5MNaHP04、7%SDS、ImM EDTA 中在 65°C与滤膜结合 DNA 杂交，并在 68°C于 O. I X SSC/0. 1%SDS 中漂洗； (d)与(a)或(b)的多核苷酸至少70%同源的多核苷酸； (e)与(a)或(b)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸； (f)与(a)或(b)的多核苷酸至少90%同源的多核苷酸；和 (g)与(a)或(b)的多核苷酸至少95%同源的多核苷酸。
2.RNA多核苷酸分子，所述RNA多核苷酸分子为根据权利要求I所述的任意DNA多核苷酸序列的互补序列。
3.载体或质粒，所述载体或质粒包含根据权利要求I或权利要求2所述的多核苷酸。
4.宿主细胞,所述宿主细胞包含根据权利要求3所述的载体或质粒。
5.病毒，所述病毒从根据权利要求I所述的核苷酸序列表达，其中所述病毒是活的，或者完全或部分被减毒。
6.疫苗，所述疫苗包含根据权利要求5所述的病毒。
7.DNA疫苗，所述DNA疫苗包含权利要求I所述的多核苷酸序列。
8.多肽，所述多肽由TTV13(SEQID NO: I) ^ TTVlO (SEQ ID NO:2)多核苷酸的开放阅读框中任一种编码，或者是与所述多肽或与其片段至少90%同源的多肽。
9.多肽，所述多肽由ttvgl-7(SEQ ID NO: 10)、ttvGTl-17 (SEQ IDNO :11),ttvGTl-21(SEQ ID NO: 12)和 ttvgtl-27 (SEQ ID NO: 13)多核苷酸的开放阅读框中任一种编码，或者是与所述多肽或与其片段至少90%同源的多肽。
10.疫苗，所述疫苗包含根据权利要求8或权利要求9所述的多肽。
11.肽，所述肽包含(a)TTVl3 (SEQ NO: I)或TTVlO (SEQ IDNO: 2)衣壳蛋白的前100个N-端氨基酸；(b)与其至少90%同源的氨基酸序列；或(c)其富含精氨酸区域。
12.疫苗组合物，所述疫苗组合物包含权利要求11所述的肽。
13.单克隆或多克隆抗体组合物，所述单克隆或多克隆抗体组合物特异性地结合权利要求8、9或11所述的蛋白质或肽。
14.疫苗，所述疫苗包含一个或更多个由选自0RF1、0RF2或0RF3的开放阅读框编码的多肽。
全文摘要
本发明涉及细环病毒(“TTV”)的新核苷酸和氨基酸序列，包括其新基因型，所有这些用于制备治疗和预防猪和其他动物的疾病的疫苗。按照本发明的实践提供的疫苗有效对抗多种猪TTV基因型和分离株(isolate)。诊断和治疗用多克隆和单克隆抗体也是本发明的特征，如在病毒繁殖和疫苗制备中有用的感染性克隆。本发明特别重要的方面包括提供TTV ORF1蛋白质或其肽片段作为抗原的疫苗。
文档编号A61K38/16GK102655871SQ201080056676
公开日2012年9月5日 申请日期2010年4月16日 优先权日2009年10月16日
发明者D.S.皮尔斯, D.S.邓亚卡, G.P.尼茨尔, J.G.卡尔弗特, J.G.马克斯, J.R.汤普森, M.I.斯托瓦, N.L.奥伊恩, R.G.安肯鲍尔 申请人:美国辉瑞有限公司