专利名称：包含角豆提取物作为促进水通道蛋白表达活性剂的化妆品和/或药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及化妆品和药物学领域，具体是涉及皮肤病学。本发明涉及化妆品和/或药物组合物，其包含在生理学合适的介质中的角豆(Ceratonia siliqua L.)肽提取物作为促进水通道蛋白表达的活性剂，所述肽提取物含有分子量小于5kDa的肽并且具有的多酚含量小于1%。本发明还涉及角豆肽提取物作为促进水通道 蛋白表达的活性剂在用于改善水合作用以及表皮的屏障功能和促进皮肤再生的化妆品组合物中的用途。所述活性剂可以单独使用或者与其它活性剂组合使用。本发明还涉及这样的新活性剂用于生产药物组合物特别是皮肤病学组合物的用途，所述组合物口服或局部施用，用于对抗和/或促进水通道蛋白活性，并由此治疗包括皮肤或粘膜干燥的病理学病症，例如干燥病或湿疹，以及口腔干燥和眼睛干燥的症状。本发明还涉及旨在预防或对抗皮肤和粘膜干燥以及皮肤老化现象的化妆品治疗方法，其包括在待治疗区域施用所述角豆提取物或含有所述角豆提取物的组合物以促进水通道蛋白表达。
背景技术：
皮肤是包含若干层(真皮、增殖层和角质层)的生命器官，覆盖身体整个表面并且实质上提供针对外部环境的屏障功能。该屏障功能尤其依赖于表皮的质量，而表皮质量特别依赖于角质层状态以及表皮角蛋白细胞增殖和分化之间的平衡。皮肤质量和恰当发挥功能紧密地与表皮的不同层中的水含量相关。因此，在正常表皮中，增殖层含有约70%的水，而角质层仅含有10-15%。角质层的水合作用是以下三种因素的结果来自真皮的水供应，损失至外部环境的水以及角质层结合水分子的能力。水分布的调控是通过激素(醛固酮、性激素)、pH或渗透压改变来进行。虽然存在水通道(其是多种促进水和某些溶质通过的孔)，但是细胞膜是天然疏水的并因此并不高度透水。水通道蛋白是一类转运水和溶液中小分子(如甘油和尿素)的跨膜蛋白，其促进上皮和内皮细胞的水转运。例如在肾中，上皮水通道蛋白参与水或溶质的转运关键作用已经被广泛地研究(Deen等人，1994)。类似地,水通道蛋白在产唾液或产泪液外分泌腺中很快被鉴定。然而，3型水通道蛋白或AQP3在人皮肤，特别是在表皮增殖层角蛋白细胞质膜中的发现(S0UGRATR.等人，J. Invest. Dermatol.，2002)突出显示了进入皮肤的受调控的水流的重要性。AQP3能够转运水和甘油，后者在表面水脂膜的形成和角质层弹性以及感官质量的保持中扮演重要角色。已经在小鼠中证明了 AQP3的重要性。事实上，F基因的失活导致多种皮肤缺陷，例如低水分水平，无效的屏障功能，增加的组织再生时间和降低的弹性(T. Ma等人，J. Mol.Biol.，2002)。已经发现水通道蛋白3在真皮成纤维细胞中表达，其参与在伤口再生期间这些细胞的迁移(Cao C.等人，Biochem J.，2006)。在另一方面，水通道蛋白通过正调节细胞连结的建立以及紧密连接类型的连通参与屏障功能(Kawedia J.等，PNAS 104 (9)，2007)。AQP3水合作用和在角蛋白细胞中的含量紧密联系。因此，皮肤AQP3的增加改善表皮的水合作用(M. Dumas, J. Drugs Dermatol. , June, 2007)。皮肤水损失有若干来源，即遗传性的、获得性的或与环境相关。在非常干燥的环境中，通过从角质层蒸发的水损失是显著的并且可以超过通过跨细胞扩散的补充速率。
在皮肤老化期间，皮肤变得干燥。因此，在老年患者，特别是在那些50岁及以上的患者中，与较低皮脂分泌、激素改变或通过表皮的水流减速相关的干燥病或干燥粘膜常见发生。皮肤然后变得瘙痒和紧绷，这是干燥皮肤的两种特征性症状。导致干燥皮肤的获得性病症的实例包括光-化疗诱导的干燥病和湿疹。导致干燥口腔或口干燥症的获得性病症的实例包括干燥综合征或颈部放射治疗。最后，涉及粘膜干燥的病症的实例包括阴道或眼睛干燥。用于干燥皮肤的第一种替代治疗是施用旨在恢复皮肤屏障的局部产品，例如能够结合水的湿润剂(其实例包括进入NMF(天然润湿因子；丝聚蛋白的蛋白水解衍生物)成分中的尿素和乳酸)，用于保持水的膜形成剂，或能够重建皮肤屏障的物质(角鲨烯、神经酰胺类、脂肪酸类)。然而，这些产品具有表面作用，其并不纠正患有慢性脱水的皮肤的生物学缺陷。在这样的情况下，由于其特别的特性，水通道蛋白是用于改善皮肤水合作用和降低皮肤干燥征象(sign)的潜在的生物学靶。因此，专利FR 2801504描述了通过使用新疆筋骨草(Ajuga turkestanica)植物的提取物增加皮肤中的AQP3并获得改善的皮肤水合作用。也报道石榴提取物作为口服或局部施用活性剂来促进水通道蛋白活性并调控水和甘油在组织中的转运(FR 2 874 502)。第2 905 857号法国专利已描述同时含有蛋白质、碳水化合物和多酚的角豆果肉的总提取物以及其湿润皮肤的用途，但没有提出这样的提取物的作用机制。在另一方面，已经披露了通过水解获得并旨在生产易于被植物同化的肥料的角豆蛋白提取物(J. Parrado等人，Bioresource Technology 99,2008)。所披露的提取物富含低分子量肽，但也富含糖和植物激素。然而，植物激素是调节植物生长的多酚化合物，但被认为在人中是内分泌干扰物，因为它们经常可能影响以下功能例如生长、发育、行为或生产。在旨在用于化妆品或药物学应用的提取物中不期望存在这样的化合物。本发明涉及角豆肽提取物，其含有分子量小于5kDa的肽和非常低的多酚含量(小于1%)并且糖含量小于15%。该化学组成使得所述提取物具有高度的安全性并获得更定向的分子活性。由此本发明人已经发现本发明的提取物促进水通道蛋白，尤其是水通道蛋白3的表达。
发明内容
本发明的第一个目的是提供作为水通道蛋白表达促进剂的角豆肽提取物，其特征在于肽化合物是分子量小于5kDa的肽，且所述肽提取物的多酚含量小于1%。本发明人实际已经发现这样的角豆的肽提取物在施用至皮肤时改善表皮和粘膜的水合作用和屏障功能以及促进皮肤再生。已经通过对皮肤组织的保护以及应答水胁迫时凋亡的减少证明了这些特性。
“能够预防和控制皮肤和粘膜干燥以及皮肤老化现象的活性剂”是指能够改善表皮和粘膜的水合作用和屏障功能或者减少受到水胁迫的细胞或组织中的凋亡的任何物质。“肽提取物”是指主要由肽代表的化合物的稀释混合物，其溶解于大量的水或其它极性溶剂或这样的溶剂的混合物中。“局部施用”是指将本发明的活性剂或含有所述活性剂的组合物涂或敷在皮肤或粘膜表面上的行为。“生理学可接受”是指本发明的活性剂或含有所述活性剂的组合物适于与皮肤或粘膜接触而不导致毒性反应或不耐性。“生物学活性的”是指具有本发明活性剂特征性的体内或体外活性。“肽化合物”是指存在于本发明的肽提取物中的蛋白质片段和肽。
根据本发明的特征性的生物学活性由所述活性剂在体外激活水通道蛋白表达的能力来定义，或者由增加水通道蛋白的蛋白合成(通过直接或间接调节水通道蛋白的基因表达)或通过其他生物学过程例如稳定水通道蛋白或稳定信使RNA转录物来定义。优选地，根据本发明，水通道蛋白是水通道蛋白3或AQP3，其存在于角蛋白细胞的膜中。根据本发明的活性剂能够通过提取植物来源的蛋白，其后通过受控的水解释放所述生物学活性肽化合物来获得。肽提取物，尤其是低分子量肽提取物的使用在化妆品中有很多优势。除了产生原来不存在于起始蛋白混合物中的肽化合物外，水解和纯化使得可能获得更加稳定，更容易标准化以及不导致皮肤化妆品领域中的过敏性反应的混合物。多种植物来源的蛋白可以在其结构内含有生物活性肽。温和水解使得这样的肽化合物被释放。尽管不是实施本发明所必须的，可能或者首先提取，然后水解相关蛋白，或者首先进行粗产物的水解，然后纯化肽化合物。使用角豆(长角豆属(Ceratonia)的植物)种子来进行提取。角豆种植于地中海国家并且其种子的胚乳部分在食品工业中使用，称作“角豆胶(locust bean gum)”。胚芽是种子蛋白最丰富的部分并且可以容易地分离。可以使用本领域技术人员已知的任何提取或纯化方法来制备本发明的提取物。在第一步，碾压种子中所含的胚芽来获得粉末或细粉(flour)。由此获得的粉末可以用纤维素酶预先处理来促进糖特别是不可溶多糖的去除。然后通过常规的修改的方法(Osborne, 1924)从胚芽提取蛋白；角豆种子匀浆悬浮于含有聚乙烯聚吡咯烷酮类(PVPP) (0. 01-20%)不可溶吸附剂的碱性溶液中；实际上已观察到这有利于随后的水解和纯化步骤。尤其是，与蛋白质相互作用的酚类物质的浓度显著降低。然后可以通过改变离子强度或通过介质的酸化沉淀蛋白，这除去了可溶组分和核酸。然后用诸如乙醇或甲醇的有机溶剂洗涤沉淀物，之后通过真空干燥蒸发掉所述溶剂。富含蛋白的沉淀物重新溶解于水或其它溶剂中以获得提取物更加纯化的形式。也可以在中性或酸性介质中在聚乙烯聚吡咯烷酮存在下再次进行提取。在过滤步骤后，然后使用诸如盐(氯化钠、硫酸铵)或有机溶剂(醇、丙酮)的常规沉淀剂进行沉淀步骤。在重新溶解于水或其它溶剂后可以通过透析将获得的沉淀物与所述沉淀剂分离。在离心和过滤步骤后收集含有蛋白、碳水化合物和可能的脂质的可溶部分。然后该粗溶液在温和条件下进行水解来产生可溶的肽。水解定义为包括通过水来裂解分子的化学反应，该反应可以在中性、酸性或碱性介质中发生。根据本发明，水解是通过化学进行和/或有利地通过蛋白水解酶的方法进行，后者的实例包括植物来源的内切蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)。处于上述的相同的理由，也即为了去除多酚物质，可以在该温和水解的阶段向反应混合物添加一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮。所获得的提取物可以进一步纯化以选择低分子量肽化合物。分级可以有利地通过超滤和/或层析类的方法进行。然后是在水或任何含水溶剂混合物中的稀释阶段。由此，本发明的活性剂有利地溶解于一或多种生理学可接受的溶剂中，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环多元醇或这些溶剂的任意混合物。稀释的活性剂然后通过超滤进行灭菌。在此稀释后，获得了肽提取物，其特征为干重2_5g/kg，肽化合物浓度l-10g/l，优 选I. 5-3. 5g/l，糖浓度O. 05-lg/l，优选O. 1-0. 3g/l，以及多酚浓度少于以干重计的1%。使用的溶剂是生理学可接受的并且是技术人员常规使用的，选自甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环多元醇或这些溶剂的任意混合物。使用本领域技术人员熟知的常规技术来定性和定量分析根据本发明所获得的提取物的物理化学特性以及其基于蛋白和肽的化合物含量。所获的提取物包含分子量小于5kDa的肽，并且特征是以干重计糖含量小于15%以及多酚浓度小于1%。本发明的第二个目的是提供组合物，其包含在生理学可接受的介质中的作为水通道蛋白活性促进剂的本发明的角豆肽提取物，所述角豆肽提取物浓度在所述组合物总重量的O. 0001%-20%之间，优选在所述组合物总重量的O. 05%-5%之间。所述活性剂可以被包裹入或掺入化妆品或诸如脂质体的药物学载体或任何其它化妆品领域使用的微囊，或者被吸附在制成粉末的有机聚合物、矿物基质(如滑石粉和皂粘土)上。这些组合物尤其可以水溶液、含水酒精溶液或油性溶液的形式提供，以水包油或油包水乳剂或复合型乳剂的形式提供，并也可以乳膏齐U、悬液、以及粉剂的形式提供，适合于施用至皮肤、粘膜、嘴唇和/或角质附属物。这些组合物可以或多或少是流体的并采取乳膏剂、洗剂、乳、浆液(serum)、软膏剂、凝胶、糊剂或摩丝的形式。它们还可以采取固体形式，例如棒，或者以气溶胶形式施用至皮肤。它们可以用作皮肤护理产品和/或用作皮肤化妆品O这些组合物还包括目的应用领域常用的任何添加剂和对于其配制必需的佐剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、遮光剂、仿晒物质、色素、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、化妆品或药物学活性成分、芳香油类、维生素、必需脂肪酸类、表面活性剂、成膜聚合物等。在所有情况中，本领域技术人员会确保选择这些佐剂及其比例使得不损害本发明的组合的有益特性。例如,这些佐剂可以对应所述组合物总重的O. OI-20% ο当本发明的组合物是乳剂时，脂肪相可以占所述组合物总重的5-80wt. %，优选5-50wt. %。所述组合物中使用的乳化剂和辅助乳化剂将在那些本领域常规使用的之中选择。例如，它们可以以基于所述组合物总重的O. 3-30wt. %的比例使用。根据本发明可用的组合物可以通过任何合适的途径施用，例如口服、肠胃外或局部外部途径，并且所述组合物的配方可以由本领域技术人员进行修改。有利地，本发明的组合物以适于局部施用的形式提供。因此，这些组合物必须含有生理学可接受的介质，即和皮肤及角质附属物相容，并且覆盖所有化妆品和皮肤病学形式。显然本发明一般是针对哺乳动物，尤其是人。应理解本发明的活性剂可以单独使用或与其它活性剂组合使用。因此，本发明的组合物还可以含有多种促进所述肽提取物的作用的活性剂。例如，本发明的组合物可以联合另一种活性剂润湿剂，例如甘油。与单独使用甘油相比，这样的联合尤其有益并提供优化的水合作用效率。
以下成分也可以非限制性地提及愈合剂；抗老化剂；抗皱纹剂；舒缓剂；自由基清除剂；抗^剂；促进皮肤大分子合成或能量代谢的制剂；水合剂；抗细菌剂；抗真菌剂；抗炎剂；麻醉剂；调节分化、色素沉着或皮肤脱色素的制剂；促进指甲或毛发生长的制剂。优选地，将使用具有抗皱纹活性的制剂，例如自由基清除剂或抗氧化剂，或促进皮肤大分子合成的制剂、促进能量代谢的制剂或金属硫蛋白酶抑制剂。例如，可以添加其它具有抗氧化或自由基清除作用的活性成分，其选自维生素C、维生素E、辅酶QlO以及植物多酚提取物即类视色素。本发明的组合物也可以将其它活性成分和本发明的活性成分组合，其促进皮肤大分子(层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白)合成,例如,Vincience的以“Collaxyl "’·推向市场的胶原蛋白肽。本发明的第三个目的是提供药物组合物，其包括在生理学可接受的介质中的用作药物的本发明的肽提取物。本发明的药物组合物将使得可以调节和/或促进水通道蛋白活性。所述药物组合物可以旨在预防或治疗皮肤或粘膜的病理性干燥。所述药物组合物也可以旨在预防或治疗由皮肤和粘膜中的水通道蛋白功能障碍导致的疾病，例如湿疹、干燥病、特应性皮炎，或口腔、目艮睛或阴道干燥。根据本发明的该实施方案，所述组合物适于药物学用途的口服给药。因此，所述组合物可以采取片剂、胶囊、硬明胶胶囊、口香糖、本身可食用或临时与液体混合的粉末、糖浆齐U、凝胶的形式，或任何本领域技术人员已知的形式。这些组合物还包括目的应用领域常用的任何添加剂以及对于其配制必需的佐剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、其它药物学活性成分、精油、维生素、必需脂肪酸类等。本发明的第四个目的是本发明的角豆肽提取物作为润湿、屏障功能改善和再生的活性剂的化妆品用途。因此，根据本发明的该目的，所述角豆肽提取物用在化妆品组合物中以改善皮肤水合作用并预防或控制皮肤和粘膜干燥。根据本发明的该相同目的，所述角豆肽提取物用在化妆品组合物中以改善表皮屏障功能。根据本发明的该实施方案，所述角豆肽提取物还可以用在化妆品组合物中以保护皮肤和粘膜对抗所有类型的外部侵害。“外部侵害”是指可由环境产生的侵害。这些可以包括污染、紫外辐射，或以及促进性产品，例如表面活性剂、防腐剂或香料。污染是指“室外”污染和“室内”污染，室外污染例如由于柴油颗粒、臭氧和重金属的污染，室内污染可以尤其是由于来自涂料、粘合剂、墙纸的溶剂散发(例如甲苯、苯乙烯或苯甲醛)或甚至是香烟烟雾。空气干燥也是皮肤干燥的主要原因。因此，所述角豆肽提取物可以用作化妆品组合物中的活性剂，以预防由于暴露于阳光或干燥环境造成的对皮肤的伤害。皮肤和角质附属物所经受的侵害还可以是由于跨细胞膜的电化学梯度不平衡，其可以导致渗透压的显著变化，而这能够造成渗透压胁迫并因此造成细胞裂解。然而，发明人已经证明本发明的活性剂保护细胞对抗这样的渗透压休克的令人吃惊的事实。皮肤还可以由于例如剃毛的处理而受伤害。有利地，本发明的一个目的涉及本文上述的活性剂在化妆品组合物中的用途，其中所述活性剂或含有所述活性剂的组合物用于 预防或治疗由剃毛而导致的对皮肤的伤害。根据本发明的该实施方案，所述角豆肽提取物也可以用在化妆品组合物中以促进皮肤再生。根据本发明的该实施方案，所述角豆肽提取物也可以用在化妆品组合物中以预防性地和/或治疗性地对抗皮肤老化现象，更具体地，对抗和/或预防光诱导的老化(光老化)。皮肤老化现象是指皮肤或角质附属物的外观由于老化导致的任何改变，例如皱纹和细线、皮肤干枯、皮肤软化、皮肤变薄、缺乏弹性和/或皮肤色调、皮肤晦暗和褪色或皮肤色斑、毛发变白或指甲染色，但也包括皮肤的任何内部修饰，其并不全身性表现为修饰的外观，例如，在暴露于紫外线(UV)后的任何皮肤内部降解。本发明的活性剂或含有所述活性剂的组合物，尤其能有对抗皮肤的弹性和紧密性的丧失。本发明还涉及化妆品治疗方法，其用于改善皮肤外观并预防或对抗皮肤和粘膜干燥，其包括将本发明的组合物施用至待治疗的区域。本发明还涉及化妆品治疗方法，其用于预防和/或对抗皮肤老化和/或光老化征象，其包括将本发明的组合物施用至待治疗的区域。该化妆品治疗方法的具体实施方案根据前面的描述也将是显而易见的。本发明的其它优点和特征根据以非限制的说明方式所给出的实施例将变得显而易见。实施例I制备角豆肽提取物将粉末形式的角豆溶解于70体积的水中并将pH调节至4. 5-5. 5之间。通过纤维素酶进行水解以除去不可溶的糖。为此目的，向反应介质添加2%CelIuclast CL (Novozym)和 2%Polyclar 10 (聚乙烯卩比咯烧酮-PVPP-不可溶)。反应混合物然后在50° C加热2小时，然后在80° C失活I小时。通过过滤步骤除去富含碳水化合物的滤液，仅保留固体残余物。后者的特征为45-50%的蛋白含量和20-30%的糖含量。由此获得的干燥残余物在2%的Polyclar ο存在下溶解于100体积的水中。用2M氢氧化钠水溶液将混合物pH调节为8. 0-8. 5之间。为了改善蛋白提取，使用2% Alcalase (Novozym)进行第一次水解。在55° C搅拌2小时后完成水解。通过将溶液加热至80° C两小时使酶失活。在失活后，过滤反应混合物并收集滤液。后者存在中间角豆蛋白提取物。在制备的该阶段,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(NuPAGE Bis-Tris Pre-castgels, Invitrogen)对该滤液中的肽和蛋白化合物进行表征。为此目的，所述滤液在NuPAGE LDS样品制备缓冲液中在还原和变性条件下在70° C加热10分钟。将抗氧化剂NuPAGE 溶液添加至内槽(负极)来预防被还原的蛋白在电泳中重现氧化。在NuPAGE MES迁移缓冲液中在分子量标准品(SeeBlue Plus2)存在下进行蛋白迁移。使川Coomassie I51ue R-250进行蛋白染色。所获得的蛋白谱显示所述滤液的肽和蛋白化合物的分子量在50-10kDa的范围。中间角豆蛋白提取物然后在2% Polvclar ο存在下溶 解于100体积的水中。使用IM盐酸水溶液将混合物调节至4-5pH单位之间。然后使用内切蛋白酶进行蛋白水解步骤。为此目的，将2%菠萝蛋白酶添加至所述反应介质中。在50° C搅拌2小时后完成水解。通过将溶液加热至80° C两小时来进行酶的失活。随后使用Seitz-Orion滤器板用渐降的孔隙率(降至0. 2 μ m)通过连续过滤对所获得的提取物进行纯化以获得明亮和澄清的溶液。在该系列过滤步骤之后，所述角豆提取物的特征是干重20-25g/kg、蛋白含量10-15g/l、糖水平5-6g/l、氨基酸含量l-2g/l以及总多酹含量0. 5-lg/l蛋白。通过比色方法(Lowry法)测定。该提取物的蛋白谱通过凝胶电泳进行分析。在如上述相同条件下，观察到两个大的蛋白家族第一个小的家族对应于具有25-20kDa之间分子量的蛋白，而第二个大得多的家族对应于具有小于5kDa的分子量的蛋白。然后通过切向流过滤步骤排除分子量大于5kDa的蛋白来纯化该提取物。出于该目的，将所述角豆提取物在压力下泵过装配有30-kDaPeUiCOn 2 Biomax盒的Pellicon :支持架。回收第一次滤液，然后通过另一 5-kDaPellicon 2 Biomax盒再过滤。当纯化完成时，获得橙黄色、明亮和澄清的角豆提取物。其特征为干重8_9g/kg、蛋白含量6-7g/l、糖含量0. 3-0. 5g/l以及总多酚含量少于0. lg/1。然后在水-甘油混合物中进行稀释阶段以获得特征为干重2_5g/kg、肽化合物浓度I. 5-3. 5g/l、糖浓度0. 1-0. 3g/l (即小于15%)以及多酚浓度少于0. lg/Ι的肽提取物。该纯化和稀释的提取物对应于本发明的角豆肽提取物。其特征是，所述肽化合物是具有分子量小于5kDa的肽，以及多酚含量小于1%。然后使用由ChemStation软件驱动的HP 1100设备通过高压液相色谱分子该溶液。在洗脱角豆提取物中使用的柱是Nucleosil MPN 300-5C4(125x4mn)。该柱能够色谱分离具有0. 2-25kDa范围的分子量的蛋白(用合适的梯度溶剂)。在这些色谱条件下，分离了若干肽级分。通过质谱分析这些不同级分以鉴别其分子峰。也已测定了氨基酸组成。其通过酸水解以及通过使用PICT(异硫氰酸苯酯)预旁路的高压液相色谱进行鉴别而获得。实施例2实施例I的活性剂针对渗透压休克的保护性效果评估该研究的目的是测定实施例I的活性剂对于置于山梨醇诱导的渗透压休克的正常人角蛋白细胞的保护效果。然后通过MTT活力测试进行细胞状态的评估。方案:培养中的正常人角蛋白细胞在0. 5%、1%和3%的实施例I的活性剂存在下，在渗透压休克前和期间放置24小时。通过向培养基添加250mM山梨醇实现高渗培养条件，维持24小时。制备未处理的对照。然后通过MTT技术进行细胞活力测试。使用MTT试剂(3_[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5- 二苯基四唑溴化物)来评估细胞活力。在含有O. lmg/mlMTT(3-[4, 5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物)的溶液中孵育角蛋白细胞。该化合物被活细胞吸收，然后由线粒体酶(琥珀酸脱氢酶)代谢为蓝紫色化合物，即甲臜，其是不能溶解在水介质中的紫色晶体形式。甲臜晶体溶解在DMA0，并提供与样品中活细胞数成比例的光密度(OD)。然后对每个研究的样品进行光密度测量(0D在540nm读取)。所述OD与酶活性以及活细胞数成正比例。结果:获得的结果显示，与未处理的细胞相比，当用实施例I的活性剂处理细胞时，受到渗透压休克的细胞活力的剂量依赖的增加。当细胞用3%的实施例I的活性剂处理时，增加的活力大于10%。结论:实施例I的活性剂有效地保护收到渗透压休克的正常人角蛋白细胞。实施例3实施例I的活性剂在诱导的皮肤脱水方面的保护性效果评估 该研究的目的是测定实施例I的活性剂对于受到诱导的皮肤脱水胁迫的离体表皮培养物的保护效果。方案:通过粘带剥离(带剥离)的方法剥离人皮肤活检样品的角质层，然后将所述人皮肤活检样品离体培养来维持，用实施例I的活性剂的1%溶液处理24小时。缺乏角质层诱导严重的脱水。苏木精-伊红(H&E)组织切片和染色使得可以评估皮肤结构的质量。结果:皮肤切片的观察显示，与未处理的皮肤活检样品相比，用实施例的活性剂处理的皮肤活检样品中的细胞胁迫迹象的显著降低以及皮肤结构更好的保护。在另一方面，来自基底层的角蛋白细胞的外观显示实施例I的活性剂的再生效果。结论:实施例I的活性剂有效地保护皮肤免受脱水诱导的胁迫。此外，实施例I的活性剂使得表皮再生。实施例4证明实施例I活性剂对紧密连接蛋白和角蛋白KlO表达的促进效果该研究目的是测定实施例I的活性剂对紧密连接蛋白(claudin)和角蛋白KlO表达的影响。紧密连接蛋白是已知为紧密连接部的胞间附着结构的主要跨膜蛋白，其在细胞交流和表皮粘着中起作用。角蛋白KlO是分化的表皮层(颗粒层)的特定角蛋白，参与皮肤的屏障功能。通过人皮肤切片上的免疫荧光评估蛋白的量。方案:在气/液界面培养人皮肤样品。局部施用实施例I的活性剂的1%的溶液，样品然后孵育24小时。
然后用甲醛固定这些皮肤样品，之后包埋于石蜡中。然后获得2_3μπι的切片。在多个洗涤和孵育这些切片的步骤后进行免疫标记。通过紧密连接蛋白-I特异性抗体(紧密连接蛋白-I抗体兔多克隆，ref :AM15098, Abeam, l/200th稀释)，然后是偶联荧光标记的二抗(Alexa Fluor 488驴抗兔IgG，A21206, Molecular Probes, l/1000th)进行紧密连接蛋白-I的免疫标记。通过角蛋白10特异性抗体(K10抗体:鼠单克隆，ref LHP1, Novocastra, l/50th稀释)，然后是偶联荧光标记的二抗(Alexa Fluor 488驴抗鼠IgG，A21202，MolecularProbes, l/1000th)进行角蛋白10的免疫标记。然后用Epi-荧光显微镜(Nikon Eclipse E600显微镜)检查所述皮肤切片。
结果:对于紧密连接蛋白-I蛋白和角蛋白KlO，显微镜观察均显示出在用1%实施例I的活性剂处理的皮肤中，特别是表皮上层中的更强的荧光。结论:实施例I的活性剂强烈促进紧密连接蛋白表达，特别是在表皮的上层表达。类似地，实施例I的活性剂强烈促进角蛋白KlO表达，更广泛地说促进皮肤屏障功能。实施例5证明实施例I的活性剂对水通道蛋白表达的促进效果该研究的目的是测定实施例I的活性剂对离体皮肤样品中的水通道蛋白3表达的影响。方案:在气/液界面培养人皮肤样品。局部施用实施例I的活性剂的1%的溶液，样品然后孵育24小时或48小时。然后用甲醛固定这些皮肤样品，之后包埋于石蜡中。然后获得2_3μπι的切片。在多个洗涤和孵育这些切片的步骤后进行免疫标记。通过水通道蛋白3特异性抗体(抗-Aquaporin 3(C_18):山羊多克隆，sc-9885, Santa Cruz, l/100th 稀释)，然后是偶联突光标记的二抗(Alexa Fluor 488 驴抗山羊 IgG,Molecular Probes, l/1000th稀释)进行免疫标记然后用Epi-荧光显微镜(Nikon Eclipse E600显微镜)检查所述皮肤切片。显微镜观察显示与未处理的对照相比，用1%实施例I的活性剂处理的皮肤中，特别是表皮较上层中具有更强的荧光。结论:实施例I的活性剂强烈促进水通道蛋白3的表达，特别是在表皮的上层的表达。实施例6证明实施例I的活性剂对成年人表皮的形态学作用该研究的目的是分析成年人表皮的形态学以测定实施例I的活性剂对皮肤结构质量的作用。方案:在气/液界面培养人皮肤活检样品，并用实施例I的活性剂的1%或3%的溶液局部处理24小时。然后将所述皮肤活检样品包埋于石蜡中并制备3μπι厚的组织切片。将切片保存于 Superfrost Plus 载玻片(Menzel GlSser, Thermo Scientif ic)上，然后在二甲苯中脱蜡并在一系列的醇-水溶液中再水化。然后用50%苏木精对切片染色3分钟，漂洗，然后用60%伊红染色3分钟并用水漂洗。然后将切片脱水，在Eukitt设备中固定，并通过光学显微镜进行检查。结果:用活性剂处理的皮肤组织切片显示角质层更厚以及更具粘合性。也能见到更高密度的基底层细胞，其显出更好地沿着垂直轴排列以及更均一。结论: 实施例I的活性剂改善表皮整体的形态学。实施例6组合物的制备I-日霜
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A相
MONTANOV68 |鲸蜡硬脂醇(和)鲸蜡硬脂基葡糖苷5.00
JOJOBA OIL西蒙得木Cteiewsis (Jojoba))种了油 3.00
VASELINE OIL Paraffinum Liquidum ( Γ物iili)2.00
SQUALANE角鲨烷3.00
CERAPHYL 368 乙基己基棕榈酸酯4.00
CERAPHYL41 C12-C15 烷基乳酸酯3.00
RAPITHIX A-60 聚丙烯酸钠(和)氢化聚癸烯(和)十二烷醇聚醚-6 O 30
B相
GLYCERINpfS^OO^
ALLANTOIN尿囊素0.10
去矿质水水(水)qs 100_ C相
ROKONSALMEP 苯氧乙醇(和)尼泊金甲酯(和}尼泊金乙酯(和)尼^050^
_I泊金丙酯_^__
D相
实施例I的活性剂5 %
E相
FRAGRANCE |香料(香味剂)| qs操作方式称量脂肪相的成分并在搅拌下加热至70° C。制备B相并加热至70° C。将A相乳化至B相中。在约50° C下搅拌加入D相。在低于40° C加入活性剂(D相)。加入香料并冷却至室温。2~ 润湿霜 W/0
权利要求
1.用于促进水通道蛋白表达的角豆(Ceratoniasiliqua L.)肽提取物,特征在于所述肽提取物含有的肽化合物是分子量小于5kDa的肽，且所述肽提取物的多酚含量小于1%。
2.权利要求I的肽提取物，特征在于其溶解于一种或多种生理学可接受的溶剂中，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环多元醇或这些溶剂的任意混合物。
3.权利要求I或2的肽提取物，特征在于其含有I.5g/l-3. 5g/l的所述肽化合物。
4.前述权利要求中任一项的肽提取物，特征在于其含有O.lg/1-0. 3g/l的糖。
5.化妆品组合物，其包括在生理学可接受的介质中作为促进水通道蛋白表达活性剂的前述权利要求中任一项的肽提取物，所述肽提取物的浓度为所述组合物总重量的O.0001%-20%，优选所述组合物总重量的O. 05%-5%。
6.权利要求5的组合物，特征在于其以适用于局部施用的形式提供。
7.权利要求5或6的组合物，特征在于其还包括选自以下的至少一种其它活性剂愈合剂；抗老化剂；抗皱纹剂；舒缓剂；自由基清除剂或抗氧化剂；抗^剂；润湿剂；抗细菌剂；抗真菌剂；抗炎剂；麻醉剂；促进皮肤大分子合成或能量代谢的制剂；调节皮肤分化、色素沉着或脱色素的制剂；促进指甲或毛发生长的制剂；或金属硫蛋白酶抑制剂。
8.药物组合物，其包括在生理学可接受的介质中用作药物的权利要求1-4中任一项的肽提取物。
9.权利要求8的药物组合物，其用于预防或治疗皮肤或粘膜的病理性干燥，例如湿疹、干燥病、特应性皮炎或者口腔、眼睛或阴道干燥。
10.权利要求1-4中任一项的角豆肽提取物作为润湿、屏障功能改善和再生的活性剂的化妆品用途。
11.权利要求10的用途，其是在用于改善皮肤水合作用以及预防或治疗皮肤干燥的组合物中的用途。
12.权利要求10的用途，其是在用于改善表皮屏障功能的组合物中的用途。
13.权利要求10的用途，其是在用于保护皮肤和粘膜免受外部侵害的组合物中的用途。
14.用于改善皮肤外观以及预防和/或对抗皮肤和粘膜干燥的化妆品治疗方法，特征在于将权利要求5-7中任一项的组合物局部施用至待治疗的皮肤或粘膜。
15.用于预防和/或对抗皮肤老化和/或光老化征象的化妆品治疗方法，特征在于将权利要求5-7中任一项的组合物局部施用至待治疗的皮肤。
全文摘要
本发明涉及化妆品和/或药物组合物，其包括在生理学可接受的介质中作为促进水通道蛋白表达活性剂的角豆(Ceratonia siliqua L.)肽提取物。本发明还涉及作为促进水通道蛋白表达活性剂的角豆肽提取物在用于改善润湿以及表皮的屏障功能和用于促进皮肤再生的化妆品组合物中的用途。本发明还涉及该新活性剂在制备用于调节和/或促进水通道蛋白活性的药物组合物，特别是皮肤病学组合物中的用途。本发明还涉及用于预防或对抗皮肤和粘膜干燥以及皮肤老化现象的化妆品治疗方法。
文档编号A61K8/97GK102762189SQ201080064285
公开日2012年10月31日 申请日期2010年12月21日 优先权日2009年12月24日
发明者C·达尔法拉, J-M·博托, N·东洛热 申请人:Isp投资公司