专利名称：一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法
技术领域：
本发明属于自体免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种能够有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法。
背景技术：
肿瘤是严重危害人民生活和健康的重大疾病之一。目前，恶性肿瘤是全球第二大导致死亡的疾病，也是中国城乡居民第一位死亡原因，中国每年新发病肿瘤患者总数约200 万人，新增肿瘤患者年均增长率在10%左右。手术、化疗、放疗仍是肿瘤的主要治疗方法，但是，即使根治性手术也只能解决局部问题，不能避免全身转移。化疗、放疗存在的最大问题是其杀伤作用没有针对性，长期的化疗、放疗会损伤机体的免疫系统及各器官组织的功能， 甚至诱发新的癌变。更为重要的是由于肿瘤细胞缺乏特异性的抗原、肿瘤细胞的抗原调变及MHC分子表达异常等因素导致肿瘤免疫逃逸，成为肿瘤治疗的一大难题。由于传统的手术、放化疗的发展已进入平台期，人们把越来越多的目光投到肿瘤的生物治疗上。肿瘤生物治疗(Biotheropy)是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式。生物治疗对放、化疗不敏感及无法耐受放、化疗的老年患者来说是一大福音，可以明显提高患者的生活质量。延长患者的生存期，受到越来越多的重视。在37-39届美国临床肿瘤协会会议(ASCO)和第7届中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会(CSCO)年会上成为最令人嘱目、最鼓舞人心的焦点。自体免疫细胞治疗是生物治疗中过续性细胞治疗的一类，是将自体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能。细胞治疗具有增殖速度快、杀瘤活性高的特点，可直接杀伤患者体内残余肿瘤细胞，解除机体免疫抑制，增强患者的免疫功能，降低复发率和转移率，延长肿瘤患者的生存期并提高其生活质量。包括自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)等。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是从肿瘤组织中或肿瘤患者胸腹水分离出来的淋巴细胞，这种细胞在体外经白细胞介素II刺激后可大量增殖。这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的激活细胞”。TIL治疗除适用于实体瘤患者外，同样适应于各类晚期胸、腹水的癌症患者。因为在这些病灶的表面会脱落大量的肿瘤细胞和淋巴细胞种植到胸、腹腔， 因此癌性患者胸、腹水中通常存在大量的淋巴细胞浸润，作为一种特殊类型的TIL (即胸腹水中获得的TIL)而较实体瘤TIL更易获得。另外，在过继免疫治疗中，这些效应细胞重新又回到原来生存的环境，在抗肿瘤活性方面，TIL显示出主动的、抗原特异的抗肿瘤能力，而且其特异性及细胞杀伤活性已得到临床证实，可有效的控制癌性胸腹水，为过继免疫治疗提供一条更为简便的途径，对晚期癌症患者提供了一种新的治疗手段。目前传统的TIL细胞培养的方法由于受肿瘤大小、肿瘤浸润程度以及胸腹水量的限制，存在细胞增殖速度慢，增殖倍率低的问题；不同患者间培养出的细胞数存在很大的差异，很多患者的细胞经过培养在短期内无法达到临床治疗要求的细胞数；国内外常用的培养方法需要40 50天，临床应用受到很大限制；由于所培养的TIL细胞缺乏特异性，临床疗效仍然受到限制。如何克服上述问题，找到更符合临床需要的TIL细胞，就成为现有技术中亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可以有效刺激和扩增胸腹水或肿瘤组织中浸润淋巴细胞的方法，从而培养出有临床疗效的TIL细胞。本发明的目的通过以下技术方案实现。除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，包括以下步骤
1、抽出的胸腹水或肿瘤组织处理后形成的单细胞悬液，经淋巴细胞分离液分离后取白膜层细胞；
2、白膜层细胞经反复洗涤2次后即为单个核细胞，调节细胞数至1 2X106/ml接种到重组人纤维蛋白RetroNectin和聚类分化群3 (cluster of differentiation，CD3)抗体包被的培养瓶中，同时加胸、腹水上清；
3、24小时后，加入白介素II(IL-2) 1000 1500U/ml,以后每隔2 3天加含IL-2 1000 1500u/ml、胸水上清的无血清培养基扩瓶、传代培养；
4、在培养的第12 13天加入凋亡调节蛋白生存素(Survivin)和粘蛋白-I(Mucl), 进一步激活TIL细胞的杀伤活性，第14天收获细胞。其中，步骤(1)中，在无菌条件下抽取患者胸水、腹水，离心，取上清，沉淀加无血清培养基混勻，用淋巴细胞分离液分离后取白膜层细胞。步骤(1)中，将手术切除的肿瘤组织在无菌环境下，用含庆大霉素100 160IU/ml 的无菌生理盐水冲洗2 3次；在培养皿中加10 20ml培养液，放入一块200目金属网， 将肿瘤组织剪成小块；将肿瘤组织块碾碎，细胞流入到培养皿中；收集培养皿中细胞悬液， 用淋巴细胞分离液分离后取白膜层细胞。相对于现有技术，本发明具有如下优点
1、培养时间14天，较传统培养时间40 50天大大缩短，使患者的住院时间大大缩短， 减轻患者的住院负担。2、解决了细胞增殖速度慢，增殖倍率低的问题，使培养后的细胞数能够达到临床要求。3、培养出的TIL细胞特异性更强，增强了临床疗效。
图1为相同基数细胞两种方法培养后细胞数的比较；
图2为不同效靶比时新方法TIL细胞对K562细胞的杀伤率； 图3为传统TIL和本发明方法TIL对K562细胞总杀伤单位的比较。具体实施方案下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并非是对本发明的限定。实施例1
患者，男，70岁，右肺癌并大量胸水，将800ml胸水移到离心管中，离心1500rpm X8min，取胸水上清，沉淀加无血清培养基混勻，用淋巴细胞分离液分细胞后离心800gX20min。吸出白膜层，离心2000rpmX IOmin后，加无血清培养基，离心 1600rpmX8min，弃上清，得到单个核细胞。调节细胞数至1. 5X 106/ml，用含胸水上清 0. 05ml/ml的无血清培养基接种到用RetroNectin250 μ 1、CD3抗体100 μ 1包被的175cm2 培养瓶中，置于饱和湿度90%、温度37°C、CO2 5. 0%培养箱中培养。培养M小时后，加入 IL-2 1000U/ml，继续于饱和湿度90%、温度37°C、CO2 5. 0%培养箱中培养。第三天，将TIL 细胞用含IL-2 1000 U/ml、胸水上清0.05ml/ml的无血清培养基传代、扩瓶。第六天，继续用含IL-2 1000 U/ml、胸水上清0. 05ml/lml的无血清培养基加传代、扩瓶。第九天，继续传代、扩瓶。第13天添加Survivin和Mucl Iml0第十四天，收集细胞。同时，采用传统的TIL方法进行对比试验，对细胞扩增数和体外细胞毒作用进行比较，详见图1。由图1可以看出，在基础细胞数相同的基础上，通过不同的培养方法获得的细胞数是有区别的，本方法获得的细胞数为传统方法培养细胞数的11. 26倍，是培养前的 182倍，完全达到卫生部第三类技术中细胞治疗所要求的101°数量级的细胞。由图2、图3可以看出本方法培养的TIL细胞有较强的杀伤活性，是传统方法的十余倍，较传统方法培养的TIL细胞对肿瘤细胞的杀伤率更高。充分说明本方法是一种有效的培养TIL细胞的方法。实施例2
患者，男，65岁，左肺癌，取肺部的手术组织置于无菌缸中，用含庆大霉素100 160IU/ ml的无菌生理盐水冲洗肿瘤标本2 3次。在IOcm直径的培养皿中加10_20ml培养基， 放入一块200目金属网，将肿瘤组织剪成小块放在金属网上。用20ML注射器芯将肿瘤组织块碾碎，弃金属网，收集培养皿中的无血清培养基(细胞流入培养基中形成单细胞悬液)，将细胞悬液加入到20ml无血清培养基中，300RPMX;3min。取上清，1500 RPMX 6min,沉淀即为单细胞层。加无血清培养基混勻，用淋巴细胞分离液分细胞后离心800gX20min。吸出白膜层，离心2000rpmX IOmin后，加无血清培养基，离心1600rpmX 8min，弃上清，得到单个核细胞。调节细胞数至IX 106/ml，用无血清培养基接种到用RetrONectin250 μ 1、OT3抗体100 μ 1包被的175cm2培养瓶中，置于饱和湿度90%、温度37°C、0)2 5. 0%培养箱中培养。 培养M小时后，细胞加入IL-2 1000U/ml，继续于饱和湿度90%、温度37°C、C02 5. 0%培养箱中培养。第三天，将TIL细胞用含IL-2 1000 U/ml的无血清培养基传代、扩瓶，第六天， 继续用含IL-2 1000 U/ml的无血清培养基传代、扩瓶，第九天，继续传代、扩瓶。第12天添加Survivin和Mucl lml。第十四天，收集细胞，细胞数为0. 65X 101CI。实施例3
患者，女，68岁，胃腺癌多发骨转移，大量腹水。无菌条件下抽取胸水650ml。将650ml 胸水移到50M1离心管中，离心1800rpm X6min，取胸水上清，沉淀加无血清培养基混勻，用淋巴细胞分离液分细胞后离心800gX22min。吸出白膜层，离心2000rpmX IOmin后，加无血清培养基，离心1500rpmX 8min，弃上清，得到单个核细胞。调节细胞数至2. 0 X 106/ml，用含胸水上清0. 01ml/ml的无血清培养基接种到用RetroNectin250 μ 1、CD3抗体100 μ 1包被的175cm2培养瓶中，置于饱和湿度90%、温度37°C、(X)2 5. 0%培养箱中培养。培养M小时后，细胞加入IL-2 1500U/ml，继续于饱和湿度90%、温度37°C、0)2 5.0%培养箱中培养。第三天，将TIL细胞用含IL-2 1500 U/ml、胸水上清0. Olml/ml的无血清培养基传代、扩瓶。 第六天，继续用含IL-2 1500 U/ml、胸水上清0. Olml/ml的无血清培养基传代、扩瓶。第九天，继续传代、扩瓶。第13天添加Survivin和Mucl Iml0第十四天，收集细胞，细胞数为 1. 08X IO100
权利要求
1.一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，包括以下步骤(1)抽出的胸腹水或肿瘤组织处理后形成的单细胞悬液，经淋巴细胞分离液分离后取白膜层细胞；(2)白膜层细胞经反复洗涤2次后即为单个核细胞，调节细胞数至IXIO6 2X 106/ml 接种到重组人纤维蛋白和聚类分化群3抗体包被的培养瓶中，同时加胸、腹水上清；(3)M小时后，加入白介素II 1000 1500U/ml，以后每隔2 3天加含白介素II 1000 1500u/ml、胸水上清的无血清培养基扩瓶、传代培养；(4)在培养的第12 13天加入凋亡调节蛋白生存素和粘蛋白-1，进一步激活TIL细胞的杀伤活性，第14天收获细胞。
2.根据权利要求1所述的培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于步骤(1)中，在无菌条件下抽取患者胸水、腹水，离心，取上清，沉淀加无血清培养基混勻，用淋巴细胞分离液分离后取白膜层细胞。
3.根据权利要求1所述的培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于步骤(1)中，将手术切除的肿瘤组织在无菌环境下，用含庆大霉素100 160IU/ml的无菌生理盐水冲洗 2 3次；在培养皿中加10 20ml培养液，放入一块200目金属网，将肿瘤组织剪成小块； 将肿瘤组织块碾碎，细胞流入到培养皿中；收集培养皿中细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离后取白膜层细胞。
全文摘要
本发明公开了一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法。从患者胸腹水或肿瘤组织中提取单个核细胞，洗涤后接种到重组人纤维蛋白和聚类分化群3抗体包被的培养瓶中，培养24小时后，加入白介素Ⅱ，之后每隔2-3天用含白介素Ⅱ、胸腹水上清的无血清培养基扩瓶、传代培养，第12～13天加入凋亡调节蛋白生存素和粘蛋白-1激活杀伤活性，第14天收获细胞。该方法大大缩短培养时间(只需14天)，使患者的住院时间大大缩短，减轻患者的住院负担。同时，解决了细胞增殖速度慢，增殖倍率低的问题，使培养后的细胞数能够达到临床要求。培养出的TIL细胞特异性更强，增强了临床疗效。
文档编号A61P35/00GK102174469SQ20111002825
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者宋鑫, 杨金艳 申请人:宋鑫, 杨金艳