专利名称：一种抑制肺癌细胞生长的峨参提取物及其药用用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体说是对肺癌细胞具有明显抑制作用的石油醚峨参部位 提取物，及其制备方法和对肺癌防治方面的用途。
背景技术：
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，按病理类型可分为小细胞肺癌(small cell 1 μ ng cancer SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell 1 μ ng cancer NSCLC)，其中 NSCLC占80%，它严重影响人类生命健康，目前已成为世界上发病率和死亡率最高的恶性肿 瘤之一。肺癌常规治疗方法包括外科治疗、放射治疗、化学治疗、中医药治疗、中西医结合治 疗、靶向治疗等。在我国，传统的中医疗法在肺癌的综合治疗中发挥独特的作用。中医认为 肺癌的病因多为虚、瘀、痰、毒四个方面，其中以虚为本，痰瘀毒邪为标。病位在肺，常累及脾 肾。中医治疗肺癌在缓解临床症状、提高生活质量、延长生存期等方面具有优势，中药配合 现代治疗如放化疗可以发挥减毒增效作用。采用辨证与辨病相结合，从药用植物和中药中提取分离抗癌活性成分或活性部 位，从而研制中药新药、新剂型，是近年来肺癌治疗研究的热点之一。经国家批准的中药新 药、中药复方成药制剂有金复康口服液、肺瘤平膏等国家中药三类新药。从单味中药中提取 有效成分制成可供静脉使用的中药抗癌药有康莱特注射液(从薏苡仁中提取)、榄香烯注 射液(从莪术中提取)、鸦胆子乳剂、吗特灵注射液(从苦参中提取)、威麦宁胶囊(从野荞 麦根中提取)等，临床用于肺癌治疗均显示了一定的疗效。峨参nthriscy s sylvestris(L. )Hoffm.，伞形科峨参属植物，与峨蕊、雪磨芋，历 来被人们认为是峨眉山的三大特产而闻名远近，中医认为峨参有补中益气，祛瘀消肿，补肺 平喘的作用。药理作用研究提示峨参具有增强机体免疫、抗癌、抗病毒、抗炎、抗过敏以及健 脾益气、活血化瘀等作用。有文献报道从峨参根中提取出一种具有抗肿瘤活性的有效成分， 结构研究表明是去氧鬼臼毒素(峨参内酯)，对人体子宫颈腺癌传代细胞系的作用具有生物 活性，而对肺癌的作用尚无文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种峨参部位提取物，要求方法简便合理。本发明的目的还 在于，研究上述提取物的药用活性，为抑制肺癌细胞A549和H460药物提供新的药用来源。本发明的目的是通过如下措施来实现的
峨参提取物通过以下方法制备，将峨参切断，粉碎成细小颗粒，过20目筛，烘干，用8倍 体积量的80%乙醇浸泡M h，利用闪式提取器，对(1)步骤的浸泡体系间断提取间断提取 共3分钟，抽滤，得到滤液，旋转蒸发仪回收溶剂，得到浸膏。再用石油醚萃取，得到石油醚 部位提取物，用旋转蒸发仪回收溶剂。本发明提取物的制备工艺简便合理，可得到一种峨参 部位提取物。本发明的实验中应用MTT比色法观察到峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460的生长具有明显抑制作用，且抑制率与浓度呈明显的效应关系，随着药物浓度的增加， 细胞存活率不断下降。用倒置显微镜观察到，经峨参石油醚提取物处理肺癌细胞A549和 H460后，癌细胞生长受到明显抑制。不同浓度的峨参石油醚提取物作用于A549和H460细 胞，24h后用DAPI染色，荧光下可见细胞核发生明显皱缩和断裂。国内关于峨参化学成分和抗肿瘤作用方面的研究，文献报道较少，尤其是对肺癌 的作用未见报道。本发明所获峨参提取物对肺癌的防治方面的用途。本发明提取物的制备 工艺简便合理，可得到石油醚部位提取物，并可对肺癌细胞A549和H460的生长有明显抑制 作用，通过进一步研究石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460的作用机理，发现其对以上两 种癌细胞凋亡有明显诱导作用。以下的实验和实施方式也表明本发明所述提取物对肺癌细 胞A549和H460癌细胞凋亡有明显诱导作用，该提取物可作为药用活性成分制备对肺癌具 有防治作用的药物。
图1不同浓度峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460生长的抑制作用效果图。图2不同浓度石油醚提取物处理后细胞形态(X400)图。
具体实施例方式
一、峨参提取物的制备
将峨参切断，粉碎成细小颗粒，过20目筛，烘干，用8倍体积量的80%乙醇浸泡Mh， 利用闪式提取器(河南金鼎科技有限公司JHBE-50，额定功率1. 8KW)，在15000r/min转数 下间断提取达3分钟，抽滤，得到滤液，旋转蒸发仪回收溶剂，得到浸膏。再用石油醚萃取， 得到石油醚部位提取物，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到部位提取物浸膏，使用前用RPMI1640 调整至实验所需浓度，DMSO (浓度<0. 05%)助溶备用。二、医学观察 1实验材料
1.1细胞人肺癌细胞株A549和H460购置于四川大学华西国家重点实验室。1.2药品与试剂RPMI 1640和胰蛋白酶均采用Gibco进口分装；MTT购自宝信生 物有限公司。峨参饮片购自于四川省峨眉山市仙山中药饮片公司，经本院宋良科副教授鉴 定为四川峨眉山产伞形科峨参属植物峨参Anthrisc μ s sylvestris (L.)Hoffm的干燥块 根；其余试剂均采用分析纯。1.3主要仪器CO2恒温孵箱(3110型，美国Thermo公司)、细胞培养板、培养瓶(美 国Coster公司)、酶标仪(Elx-800型，美国Bio-Tek公司)、离心机(L420型，长沙湘仪离心 机有限公司)、倒置相差显微镜(日本索尼公司)、荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)、超净工作 台(BSW-880，江苏苏净集团有限公司)、闪式提取器(河南金鼎科技有限公司)、旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)。2实验方法
2. 1 细胞株培养将肺癌细胞A549和H460接种于含10%新生牛血清的RPMI1640培 养基的培养瓶中，37°C、5%C02、饱和湿度条件下常规培养，每2 d换液传代培养，取对数生长 期细胞用于实验。2. 2石油醚提取物对肺癌细胞AM9、H460增殖抑制作用的检测取
对数生长期细胞接种于对孔培养板内，2X104 / mL个细胞/孔。细胞贴壁后加入不同浓度的峨参石油醚提取物，共设7个药物浓度梯度，分别为1. 25,2. 5、5、10、20、40、80μ g / μ L。每个浓度3个复孔，每孔体积500 μ L，培养48 h后，每孔加入lmg/mL MTT工作液 500 yL，37°C放置4 h，弃上清，每孔加入500 μ L 0. 4%酸化异丙醇，220 r / min摇床震 荡5min溶解结晶，经充分震荡后，吸取200 μ L至96孔酶标板于全自动酶标仪检测570 nm 波长处的各孔吸光度(0D值)，0. P/oDMSO作为阴性对照，根据0. 1% DMSO值绘制曲线，比较 不同浓度峨参石油醚提取物对2个细胞株增殖的影响。细胞增殖抑制率(%) = (I"药物组平均OD值/对照组平均OD值)X 100%
2.3 DAPI染色将洁净无菌盖玻片置于6孔板内，种入细胞培养过夜，使为60% 80%。设对照组、2. 5yg / yL,5yg / μ L峨参石油醚提取物组(AM9)和对照组、1. 25 Ug / yL,2.5yg / μ L峨参石油醚提取物组(H460)，分别继续培养M h，吸弃废液，然后 用4%多聚甲醛固定细胞爬片35min，IxPBS冲洗3次，每次2min，加入2 mL DAPI染色液，染 色15min，IxPBS冲洗两次，取出爬片用封片液封片，荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右。2. 4统计学分析采用SPSS13. 0软件进行数据分析，各组数据以 7 士s表示，实验组及对照组比较用单因素方差分析。实验结果
3. 1峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460生长的抑制作用 采用MTT比色法 检测峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460
生长的抑制作用，结果表明，(1.25 80) yg / μ L的峨参石油醚提取 物对体外培养的人肺癌细胞Α549和Η460的增殖呈明显抑制作用，并 且随着药物浓度的升高，细胞存活率不断下降，峨参石油醚提取物对 肺癌细胞Η460的抑制作用比对细胞Α549明显。经计算得出，峨参石 油醚部位提取物对肺癌细胞Α549和Η460的IC5tl分别为6. 13 Ug / μ L和 0. 97 μ g/ μ L。见图 1。3.2峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460凋亡的影响倒置显微镜 观察到，经峨参不同部位提取物处理4 后，肺癌细
胞A549和H460的生长明显受到抑制，细胞体积缩小，连接消失，与 周围的细胞脱离，细胞由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中。荧光显微镜观察到，经峨参石油醚提取物处理24h后，肺癌细胞A549 和H460生长明显受到抑制，荧光增加，有明显的细胞核断裂和皱缩， 随剂量增加，细胞凋亡现象越明显，见图2。
本实验应用MTT比色法观察到1. 25-80 μ g / μ L的峨参石油醚部位提取物对肺癌 细胞Α549和Η460的生长具有明显抑制作用，结果提示峨参石油醚提取物对肺癌细胞Α549 和Η460的抑制作用的IC5tl值分别为6. 13 Ug / μ L和0. 97 Ug / μ L,且抑制率与浓度 呈明显的效应关系，随着药物浓度的增加，细胞存活率不断下降。用倒置显微镜观察到，经 峨参石油醚部位提取物处理肺癌细胞Α549和Η460后，癌细胞生长明显受到抑制，细胞体积 缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞由梭形变成圆形细胞脱落，浮悬于培养液中。不同 浓度的峨参石油醚提取物作用于Α549和Η460细胞，24 h后用DAPI染色，荧光下可见细胞核发生明显皱缩和断裂。 综上所述，峨参石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460的生长确有明显抑制作用， 通过进一步研究石油醚提取物对肺癌细胞A549和H460的作用机理，发现其对以上两种癌 细胞凋亡有明显诱导作用。这为峨参抗肺癌的研究提供了实验依据。
权利要求
1.一种抑制肺癌细胞生长的峨参提取物，其特征在于所述的提取物通过以下方法制 备(1)将峨参切断，粉碎成细小颗粒，过20目筛，烘干，用8倍体积量的80%乙醇浸泡24h ； (2)利用闪式提取器，对(1)步骤的浸泡体系间断提取，抽滤，得滤液；旋转蒸发仪回收溶 剂，得峨参浸膏；C3)用石油醚萃取浸膏，浓缩后，得到石油醚部位提取物。
2.权利要求1所述之抑制肺癌细胞生长的峨参提取物的用途，其特征在于以峨参石 油醚提取物为药用活性成分制备对肺癌细胞A549和H460产生抑制作用的药物。
全文摘要
本发明公开了一种对肺癌细胞具有明显抑制作用的峨参石油醚部位提取物及其药用用途，所述的提取物通过以下方法制备将峨参切断，粉碎成细小颗粒，过20目筛，烘干，用8倍体积量的80%乙醇浸泡24h，利用闪式提取器，对(1)步骤的浸泡体系间断提取，抽滤，得到滤液，旋转蒸发仪回收溶剂，得到浸膏。再用石油醚萃取，得到石油醚部位提取物，用旋转蒸发仪回收溶剂。本发明提取物的制备工艺简便合理。本发明还公开了以峨参石油醚提取物为药用活性成分制备对肺癌防治药物的用途，所述活性提取物对肺癌细胞A549和H460癌细胞凋亡有明显诱导作用，可作为药用活性成分制备药物。
文档编号A61K36/23GK102125588SQ201110058789
公开日2011年7月20日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者万军, 吴晓青, 唐静, 李娜, 涂显琴, 耿耘, 蒋合众, 马超英, 高雅蓉, 魏屹 申请人:西南交通大学