专利名称：一种病毒类疫苗的纯化方法
技术领域：
本发明为一种源自哺乳动物体细胞的病毒类疫苗的纯化方法，将源自上游的病毒收获液进行浓缩、溶解和分离等处理，获得形态较为统一的含抗原成分的溶解液，再对溶解的病毒抗原进行层析纯化处理，工艺中还包括灭活处理。这种纯化工艺可以获得较高的抗原回收率的同时，也可以获得较高的抗原纯度以降低疫苗对人体的副作用。
背景技术：
很多病毒可以引起人类疾病并具有传染性，如肺炎、肝炎、流行性感冒、手足口病等。预防这些传染性疾病的有效、经济的手段之一是进行疫苗预防接种。病毒性疫苗通过严格的制备工艺，如病毒培养和抗原纯化等步骤生产出来。制备工艺的产能水平、效率和质量保证等往往决定着疫苗产品带来的经济和社会效益。流行性感冒可引起多种呼吸道疾病，全球范围内每年约有300-500万人口患流感类疾病，因流感致死的人数也在25万-50 万人。在我国，流感及其并发症所造成的死亡率仅次于心脏病、肿瘤和心血管病。预防流感的最有效、最经济的手段是进行流感疫苗的预防接种。传统的流感疫苗是通过鸡胚培育流感病毒，再经过纯化灭活和装配等工序生产的。成套的鸡胚系流感疫苗工艺在近60年里一直是世界范围内成熟且唯一的流感疫苗的生产方法。因为工艺技术本身并不复杂也一直未有大的改进，生产的流感疫苗在世界各地得到了广泛的使用，其有效性和安全性也获得了广泛的认可，多年的统计数据证实了季节性流感疫苗的接种有效的预防和降低了人群中流感及并发症的发病率。然而，在2004年爆发H5N1禽流感和2009年爆发HlNl甲型流感的背景下，流感疫苗供不应求，世界性的产能不足以及生产时间过长突显了传统生产工艺已经不能满足新的全球市场变化和新的生物制品安全要求。突出的矛盾集中表现在以下几个方面I.季节性流感疫苗的需求不断增加；全球流感疫苗市场规模巨大，并且呈每年递增的趋势。为了降低世界范围内的流感疫病致死率，从80年代开始，很多国家都增加了流感疫苗的接种率，尤其是针对高危人群(婴幼儿和老年人)的保护力度；然而流感疫苗的产量并没有同速提升。2.疫苗供应链脆弱；虽然流感疫苗的需求量不断增加，市场不断扩大，欧美大型的疫苗生产商却遇到了产能瓶颈。由鸡胚生产的流感疫苗受到了越来越严格的行业监管(如cGMP的规定)的限制，突出体现在从养鸡场的监管到合格鸡蛋的筛选的各个环节中。到了 90年代末，美国市场上两家大型流感疫苗厂商相继退出了市场；到2002年仅剩下3家，在2004-2005年度，美国Powderjec公司因为产品质量问题，其生产超过3千万剂的季节性流感疫苗被迫停止销售，但是由于制作流感疫苗所需的鸡蛋无法得到及时补充，市场上的流感疫苗数量骤减。同年，席卷全球的禽流感疫情使得流感疫苗需求量大增，直接导致了市场供不应求的局面。这次教训促使美国政府乃至全球加大研发力度，寻求较传统工艺更可靠的新生产技术。3.大流行流感疫情的突袭
随着禽流感疫情在亚洲和其他地区的不断出现，人患高致病性禽流感风险的增力口，世卫组织的多数专家认为禽流感病毒从畜传染人到人传染人的转变只是时间问题。由于禽流感病毒对家禽的致死率极高，传统鸡胚生产的流感疫苗所需的鸡蛋供应源受到威胁，因此在大流行流感爆发时的疫苗供应受到很大挑战。此外，根据美国BARDA的数据显示，用传统工艺生产出HlNl首支甲流疫苗的平均时间为21-24周，疫苗大规模供应市场的时间明显晚于甲流疫情的爆发高峰，并不能有效的控制疫情。2009年中国疫苗企业创造了生产首支甲流疫苗87天的全球最快速度，然而由于产能不足等原因，大规模的接种迟到一个多月才得以展开。传统工艺在面对大流行流感疫情时突出的产能和产速问题，促使流感疫苗企业在面对大流行流感前不能再依靠一种生产技术，相对更可靠、更灵活、更快速的新工艺技术成了近几年世卫组织和欧美等国家支持的重点。这种新工艺技术的突出代表之一是基于哺乳动物细胞培养技术和纯化技术开发的第二代流感疫苗制备工艺，较传统鸡胚工艺的优势主要体现在四个方面灵活性，可靠 性，时效性和可持续发展。灵活性由于生产流感病毒的哺乳动物细胞在密封的生物反应器中进行培养，疫苗剂量可以通过增加或减少生物反应器的数量或者容积来实现，可操作性强；细胞种可以长期保存在体积小的容器中，用存方便，保证细胞的培养可以随时进行；生产操作全部在厂房中进行，受到外界的影响小。可靠性细胞的培养和增殖具有同源性，细胞间的差异小，对于病毒的繁殖、纯化、杂质去除都有稳定的保障；密闭的生物反应器有效的避免了外源杂质的污染，更符合药品生产质量管理规范(如cGMP标准)，对疫苗产品质量有更好的保障。相较传统鸡胚生产工艺，由于鸡蛋个体间的差异大，导致质量控制难度大，产品质量的可靠性不如细胞系流感疫苗好。此外，鸡胚流感疫苗有明显的不适宜接种人群，尤其指对鸡蛋中物质(如卵清蛋白)过敏的人。时效性一般来说，细胞系流感疫苗生产工艺的时间较鸡胚类的短。对于大流行流感疫情，更短的生产周期可以使疫苗供应市场的时间早于大流感爆发的高峰，更有效的在第一时间保护人群；对于季节性流感，较短的生产周期为世卫组织赢得了更多的时间来分析判断下一冬季可能流行的流感病毒株种类，相应的疫苗产品的针对性更强，保护效果更好。从细胞中可有效分离的毒株种类较从鸡胚中分离的更广、变异性更小。在遇到禽流感时，由于对家禽的高致死率，蛋源的供应和在鸡胚中病毒的培育都受到冲击，然而通过哺乳动物细胞生产禽流感疫苗的方法不受影响。此外，不能在鸡胚中有效分离的H3N2类毒株有超过65%的可以有效的从细胞中分离。可持续发展细胞系生产工艺的不断优化对于新一代技术的研发和应用具有积极推动作用。细胞培养技术和纯化技术的发展可以促进下一代以基因技术为基础的流感疫苗的研发和应用；此外，传统鸡胚工艺占用的社会资源(如土地资源、物流和人员监管等)和产生的生物废弃物较细胞系流感疫苗多，可持续性差。细胞系流感疫苗的制备工艺还在不断的优化中，其中需要解决的一个问题是较低的血凝素产量。根据试验观察，病毒收获液中的含抗原成分呈现出多种形态，比如 单一完整病毒颗粒 多数病毒颗粒的聚集体 病毒颗粒和细胞残骸的连接体 病毒残片或不完整病毒颗粒 游离的抗原蛋白或者其聚集体在下游纯化的步骤中，由于每个步骤的分离原理不同，导致了不同形态的含抗原成分在多重步骤后的明显损失，因此抗原回收率较低，直接影响了整体工艺的经济效益。此次发明提供一种纯化方法，可以解决上述问题，提高抗原回收率和纯度。
发明内容
本发明为一种源自哺乳动物体细胞培养的病毒性疫苗的纯化方法。首先将源自上游的病毒收获液进行浓缩和溶解处理使病毒收获液的成分呈现溶解部分和非溶解部分，再将两部分分离并保留病毒收获液中的溶解部分，然后对其中的溶解剂进行吸附去除处理，获得形态较为统一的含抗原成分的溶解液，用层析法纯化溶解液中的抗原成分以获取较高抗原纯度和其回收率的抗原收获液，然后对抗原收获液进行灭活处理。本发明涉及的病毒收获液是从哺乳动物体细胞中培养产生的，如MDCK狗肾细胞和Vero猴肾细胞，可以在生物反应器中培养，本发明所述病毒可以在细胞中增殖，如源自季节性、大流行前或大流行的流感病毒A和B亚型毒株。抗原是疫苗中促进免疫效果的成分，比如流感病毒的表面抗原血凝素、神经氨酸苷酶和/或离子通道M2蛋白。所述的溶解处理方法是加入至少一种溶解剂，有效的将抗原蛋白从不同形态的含抗原成分中游离溶解，使其与非溶解物质(含大部分杂质)分离，溶解后的抗原蛋白形态较为统一，杂质较少，易于下游的层析纯化。本发明涉及病毒收获液的预处理步骤。收获液中可以含有供细胞生长的微载体，也可以是悬浮培养的细胞，不含微载体。预处理的方法可以包括向病毒收获液中加入盐，如NaCl (浓度1M-10M)，也可以不加入，以及低速离心，建议控制在2_10分钟，转速200g_4000g内，或者澄清过滤(例如静置5分钟左右后除去沉淀物)，将绝大部分含有抗原的成分与大型固体物质(例如细胞、大型细胞残骸和/或微载体)分离。预处理后的病毒收获液可以通过超滤进行浓缩。超滤可以选用截流分子量在50-500KD范围内的过滤膜，滤膜表面积在30-500cm2范围内，浓缩倍数建议在8-15倍之间。将绝大多数含抗原成分与水以及小分子分离。浓缩后的病毒收获液体积小、抗原浓度高等特点有利于溶解步骤的进行(例如溶解剂用量少)和抗原含量的检测。溶解步骤包含加入一种阳离子溶解剂，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，建议在加入这种溶解剂之前，先期加入一种无离子溶解剂，如聚山梨酯-80 (Polysorbate-80 (PB-80))，使病毒收获液在溶解后的成分呈现溶解部分和非溶解部分。在溶解过程中一些溶解条件对抗原回收率和杂质回收率(抗原纯度)具有显著影响，因此研究和鉴别这些溶解条件对回收率影响的方法也包括在本发明中。所述的溶解条件及数值初始范围为、
# PB-80 浓度300 μ g/ml 到 1000 μ g/ml。· PB-80溶解时间0. 5小时到3小时。· PB-80溶解时温度4摄氏度到室温。 病毒收获液浓缩倍数1. 5倍到10倍。· CTAB 浓度900 μ g/ml 到 3000 μ g/ml。· CTAB溶解时间0· 5小时到14小时。 · CTAB溶解时温度4摄氏度到室温。溶解后将溶解液做低温高速分离处理，转速建议控制在80，000g-120, OOOg范围内，温度在4-10摄氏度内；保留含有抗原成分的上清液，即病毒收获液中的溶解部分。阳离子溶解剂，如CTAB，如果较长期和抗原混合，可能对其产生破坏作用，所以本发明还涉及一种可去除CTAB溶解剂的方法。所述的溶解剂CTAB的去除，可以通过向上清液加入吸附剂，比如Amberlite XAD4，经过充分混合，建议在混合后14小时内将吸附剂过滤，可以使用孔径为5微米的过滤网，获得的液体即为形态较为统一的抗原溶解液。溶解液可以进一步的纯化，也可以在低温中冷冻保存待用。本发明还涉及评估所述溶解条件对抗原回收率和杂质回收率影响的量化方法，通过调控一些溶解条件数值使相应回收率得到显著优化。在溶解条件数值初始范围内，单一的溶解条件或者多重溶解条件互作后对抗原回收率和杂质回收率的影响可以通过软件进行评估，如运用试验设计软件(Design of Experiment)把选定的溶解条件与抗原回收率或杂质回收率组成矩阵按照一定标准建立数学模型，这些标准是单一溶解条件的数值初始范围及其范围内所选定具体值和数量(参见实施例3)。可靠的模型可以提供试验所需数量和每组试验对应溶解条件选定的具体值，最后将每组试验得到的数据，如抗原回收率和杂质回收率，输入到对应的矩阵中，软件根据数学模型鉴别出对相关回收率有统计学显著影响(P值<0. I)的因子，包括单一的溶解条件，或者多重溶解条件的互作。这些溶解条件在试验范围内对相关回收率的影响可以通过模型构建的趋势图来量化(参见附图1-5)。所述分析方法可以用于评估上述溶解条件对流感病毒A和B亚型毒株抗原血凝素回收率和杂质回收率的影响并通过制作的趋势图来量化，方便在溶解步骤对血凝素回收率和血凝素纯度进行参数优化。本发明涉及的层析法包括离子交换层析法和/或亲疏水性层析法。纯化的对象包括按照上述步骤溶解了的病毒抗原(抗原溶解液)，例如流感病毒A和B亚型流感病毒抗原。离子交换层析法离子交换层析法建议使用阴离子交换柱,例如CIM QA Monolithic Column和Capto Q Column。一些层析纯化的条件对抗原回收率和抗原纯度具有显著影响,这些条件包括 平衡缓冲液导电率、pH值。籲纯化原料导电率、pH值。 上柱原料量抗原量。 洗脱液导电率、pH值。平衡缓冲液建议使用由KH2PO4和Na2HPO4配成的缓冲液，也可以使用例如Tris盐酸等缓冲液。平衡缓冲液的导电率(离子强度)建议控制在3ms/cm-12ms/cm的范围内，pH值控制在7. 0-8. 5范围内。需要时，注射用水可作为稀释剂。按照上述溶解步骤获得的抗原溶解液(纯化原料)的pH值一般在7. 8-8. 5的范围内，导电率一般在12ms/cm-16ms/cm的范围内。根据层析柱填料对纯化原料中抗原的承载能力，上柱的抗原量一般控制在100 μ g-1000 μ g每Iml填料容积的范围内。洗脱液导电性的应用范围和顺序一般是从下限为平衡缓冲液导电率的水平到上限为1M-2M NaCl盐溶液相当的导电率水平。根据上述条件对源自A亚型流感病毒(例如A/California/07/2009/X-179A型毒株)的抗原溶解液进行阴离子交换层析纯化处理，对收集的洗脱抗原峰进行血凝素含量、 全蛋白含量、DNA含量、神经氨酸苷酶、牛血清白蛋白含量的测定，获得的效果如下 血凝素回收率较纯化原料可以达到60%以上。 全蛋白的水平可以达到小于240μ g/ΙΟΟμ g血凝素。· DNA的水平可以达到小于20ng/100 μ g血凝素。 神经氨酸苷酶存在。 牛血清白蛋白水平可以小于lOOng/lOOy g血凝素。其中，全蛋白含量、DNA含量、神经氨酸苷酶和牛血清白蛋白含量均达到欧盟相关细胞系流感疫苗的质量标准。亲疏水性层析法亲疏水性层析法建议使用层析柱含有苯基、丁基、辛基等集团的填料,例如CIMBlC4 A-I Monolithic Column和Capto Phenyl Column。一些层析纯化的条件对抗原回收率和抗原纯度具有显著影响，这些条件包括 平衡缓冲液盐浓度、pH值。·纯化原料盐浓度、pH值。 上柱原料量抗原量。 洗脱液盐浓度、pH值。平衡缓冲液建议使用由硫酸铵、KH2PO4和Na2HPO4配成的缓冲液。平衡缓冲液硫酸铵的浓度建议控制在IM -3M的范围内，pH值控制在7. 0-8. 5范围内。按照所述溶解步骤获得的抗原溶解液(纯化原料)的pH值一般在7. 8-8. 5的范围内。根据层析柱填料对纯化原料中抗原的承载能力，上柱的抗原量一般控制在100 μ g-1000 μ g每Iml填料容积的范围内。洗脱液盐浓度的应用范围和顺序一般是从上限为平衡缓冲液盐浓度的水平到下限为洗脱液O. IM盐浓度的水平。根据上述条件对源自A和B亚型流感病毒(例如A/California/07/2009/X_179A型毒株和B/Malaysia/2506/2004型毒株)的抗原溶解液分别进行亲疏水性层析纯化处理，对收集的洗脱抗原峰进行血凝素含量、全蛋白含量、DNA含量、神经氨酸苷酶、牛血清白蛋白含量的测定，获得的效果如下 血凝素回收率较纯化原料均可以达到60%以上。
全蛋白的水平均可以达到小于240μ g/ΙΟΟμ g血凝素。· DNA的水平均可以达到小于20ng/100 μ g血凝素。 神经氨酸苷酶存在。 牛血清白蛋白水平可以小于lOOng/lOOy g血凝素。其中，全蛋白含量、DNA含量、神经氨酸苷酶、牛血清白蛋白含量均达到欧盟相关细胞系流感疫苗的质量标准。本发明还涉及评估上述层析条件在建议范围内对抗原回收率和杂质回收率影响的量化方法。具体的方法如上述对溶解条件的评估方法所述一致，可以用于上述层析条件对流感病毒A和B亚型毒株抗原血凝素回收率和杂质回收率的影响并通过制作的趋势图来量化，方便在层析纯化步骤对血凝素回收率和血凝素纯度进行参数优化。此外，根据本发明 中所述的浓缩条件，即超滤膜截流分子量、滤膜表面积和浓缩倍数，通过上述评估方法也可以用于量化浓缩条件在建议范围内对抗原回收率和杂质回收率的影响。抗原收获液可以通过加入最终含O. 1% (体积比)的丙内酯进行灭活处理，或者加入相同浓度的甲醛。灭活处理也可以针对病毒收获液或抗原溶解液进行。综上所述，源自A和B亚型流感病毒的抗原溶解液可以通过层析法得到有效纯化，这种方法可以通过阴离子交换层析法或亲疏水性层析法或上述两种层析法的结合使用来实现。针对A和B亚型流感病毒抗原的纯化效果做如下总结 抗原溶解液的血凝素回收率较病毒收获液可达85%以上。 层析纯化后的血凝素回收率较抗原溶解液可达60%以上。 从病毒回收液到层析纯化后的整体血凝素回收率可达50%以上。 层析纯化后全蛋白的水平可达到小于240 μ g/100 μ g血凝素。 层析纯化后DNA的水平可达到小于20ng/100 μ g血凝素。 在整个纯化过程中神经氨酸苷酶存在。 层析纯化后牛血清白蛋白的水平达到小于100ng/100 μ g血凝素。
图I :溶解条件“收获液浓缩倍数”与“CTAB浓度”对A/California/7/2009/X_179A型流感病毒抗原溶解液血凝素回收率影响的趋势图。此图中其它三个溶解条件值为PB-80浓度:900 μ g/ml ；CTAB溶解时间0. 5小时=CTAB溶解时温度4°C。图2 :溶解条件“收获液浓缩倍数”与“CTAB浓度”对B/Brisbane/60/2008型流感病毒抗原溶解液血凝素回收率影响的趋势图。此图中其它三个溶解条件值为PB-80浓度900 μ g/ml ；CTAB溶解时间3小时；CTAB溶解时温度4°C。图3 :溶解条件“收获液浓缩倍数”与“CTAB浓度”对A/California/7/2009/X_179A型流感病毒抗原溶解液全蛋白回收率影响的趋势图。此图中其它三个溶解条件值为PB-80浓度900 μ g/ml ；CTAB溶解时间0. 5小时；CTAB溶解时温度4°C。图4 :溶解条件“收获液浓缩倍数”与“CTAB浓度”对B/Brisbane/60/2008型流感病毒抗原溶解液全蛋白回收率影响的趋势图。此图中其它三个溶解条件值为PB-80浓度900 μ g/ml ；CTAB溶解时间3小时；CTAB溶解时温度4°C。图5 :溶解条件“收获液浓缩倍数”与“CTAB浓度”对B/Brisbane/60/2008型流感病毒抗原溶解液DNA回收率影响的趋势图。此图中其它三个溶解条件值为PB-80浓度900 μ g/ml ；CTAB溶解时间3小时；CTAB溶解时温度4°C。图6 :强阴离子交换层析纯化A/California/7/2009/X-179A型流感抗原溶解液的层析谱图。图7 :含苯基集团的亲疏水性层析纯化A/California/7/2009/X_179A型流感毒株抗原溶解液的层析谱图。图8 :含苯基集团的亲疏水性层析纯化B/Brisbane/60/2008型流感毒株抗原溶解液的层析谱图。为了清楚的说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本专申请的限制。
具体实施例方式实施例I :流感病毒侵染MDCK细胞后病毒收获液的预处理和浓缩I)预处理A亚型流感毒株(A/California/7/2009/X_179A型)或者B亚型流感毒株(B/Brisbane/60/2008型和B/Malaysia/2506/2004型)侵染并在MDCK细胞中增殖后获取了病毒收获液，在4摄氏度条件下，300g离心2分钟或者3200g离心8分钟，吸取上清液。2)浓缩将上清液用截流分子量为300KDa、表面积为150cm2的超滤膜进行浓缩8-12倍，浓缩液存于4摄氏度条件下待用。实施例2 :溶解条件的建立在A/California/7/2009/X_179A型流感病毒的溶解试验中，选择的5个溶解条件及相应测定值或范围# PB-80 浓度300 μ g/ml 到 900 μ g/ml。 收获液浓缩倍数1.5倍到4. 8倍。· CTAB 浓度900 μ g/ml 到 3000 μ g/ml。· CTAB溶解时间0. 5小时至Ij 14小时。· CTAB溶解时温度室温和4摄氏度。选择以上5个溶解条件的目的是研究它们对血凝素回收率、全蛋白回收率、DNA回收率和神经氨酸苷酶的影响。借助试验设计软件对上述5个溶解条件和血凝素回收率和全蛋白回收率进行数学建模，目的是用较少的试验数据有效模拟和评估上述溶解条件在单一和多重互作下对回收率的影响。所述的溶解条件和回收率的矩阵由32组试验组成，即5个溶解条件的14种可选值和未知的血凝素回收率和全蛋白回收率。根据32组试验数据计算出相应血凝素回收率和全蛋白回收率并输入到矩阵中，通过模型模拟5个溶解条件对回收率的影响并评估和鉴别对回收率有重要影响的溶解条件。矩阵中5个溶解条件的具体数值和试验组数量可见表I。表lA/California/7/2009/X_179A型流感病毒溶解条件的可选值和对应的试验
组数量。
权利要求
1.一种源自哺乳动物体细胞培养的病毒性疫苗的纯化方法，所述方法包括如下步骤将源自上游的病毒收获液进行浓缩和溶解处理使病毒收获液的成分呈现溶解部分和非溶解部分，再将两部分分离并保留病毒收获液中的溶解部分，然后对其中的溶解剂进行吸附去除处理，获得形态较为统ー的抗原溶解液，用层析法纯化溶解液中的抗原成分以获取较高抗原纯度和其回收率的抗原收获液，然后对抗原收获液进行灭活处理。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述浓缩通过低速离心和超滤法和/或澄清过滤进行。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述溶解处理通过加入至少ー种溶解剂进行。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述溶解处理通过加入选自如下的溶解剂进行阳离子溶解剂、无离子溶解剂和双离子溶解剂。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述将两部分分离的方法通过高速离心进行，吸取上清液，即为病毒收获液中的溶解部分。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述溶解部分含有病毒抗原和少量的杂质，非溶解部分含有大量杂质和极少的病毒抗原或者不含有病毒抗原。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述吸附去除处理通过加入和过滤吸附剂。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述层析法通过选自如下的纯化方法进行离子交换层析法、亲疏水性层析法、亲合层析法、液相-液相层析法和分子筛层析法。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述灭活处理通过加入甲醛或者丙内酯进行。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述较高抗原纯度和其回收率通过鉴别和优化纯化步骤中对抗原纯度和回收率有重要影响的參数进行。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述有重要影响的參数包括浓缩步骤里的截流分子量、浓缩倍数和滤膜表面积；溶解步骤里的溶解剂浓度、溶解时间、溶解时温度和病毒收获液浓缩倍数；层析步骤里的缓冲剂盐浓度、洗脱液盐浓度、PH值和上柱抗原量。
12.如权利要求10和11所述的方法，其中所述鉴别和优化的方法还包括对多个參数和抗原纯度和抗原回收率通过软件进行建模，依据试验数据模拟评估參数在単一或者多重互作下对抗原纯度和回收率的影响。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，所述的方法还包括构建趋势图来量化多个參数在単一或者多重互作下对抗原纯度和回收率的影响。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞选自MDCK狗肾细胞和Veix)猴肾细胞。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述病毒性疫苗来自RNA病毒。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒是源自季节性、大流行前或大流行的流感病毒。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述病毒抗原来自流感病毒，即血凝素蛋白和/或神经氨酸苷酶和/或离子通道M2蛋白。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述抗原回收率是血凝素回收率抗原纯度包括全蛋白含量、DNA含量、牛血清白蛋白对血凝素的比率。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，所述方法还包括将盐或盐溶液加入所述病毒收获液中。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，所述方法还包括对病毒收获液或溶解液的灭活处理。
全文摘要
本发明为一种源自哺乳动物体细胞的病毒类疫苗的纯化方法，将源自上游的病毒收获液进行浓缩、溶解和分离等处理，获得形态较为统一的含抗原成分的溶解液，再对溶解的病毒抗原进行层析纯化处理，工艺中还包括灭活处理。这种纯化工艺可以获得较高的抗原回收率的同时，也可以获得较高的抗原纯度以降低疫苗对人体的副作用。
文档编号A61K39/12GK102690334SQ20111006665
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者王一丁 申请人:王一丁