专利名称：一种筛选敏感型难治性癫痫药物的方法
技术领域：
本发明属生物医药领域，涉及药物筛选的方法，具体涉及ー种筛选敏感型难治性癫痫药物的方法。
背景技术：
癫痫是一种以反复发作的神经元异常放电导致中枢神经系统功能失常为特征的常见的神经科疾病，据研究报道，其中超过1/3的患 者表现为频繁出现的难以被単一或联合应用抗癫痫药物所控制的癫痫发作，临床通常称之为难治性癫痫。近年来，该疾患的抗癫痫药物(antiepileptic drugs,AEDs)治疗和外科手术治疗取得了很大进展,但难治性癫痫仍然是困扰临床医生的ー个重要难题。这种难以控制且频繁出现的癫痫发作会导致很严重的后果，其中包括生命期限缩短、身体外伤、神经心理和精神障碍，以及社会能力障碍等，严重影响患者的工作能力和生活质量，给国家、社会及患者家庭带来沉重的精神及经济负担。药物抵抗是难治性癫痫病的ー个重要特征，目前，其发生机制尚不明了，主要存在两种假说=AEDs作用靶体发生改变和多种抗药蛋白过度表达。绝大多数难治性癫痫患者的ー个重要特征就是对多种AEDs均有抗药性，而这些药物的作用机制并不相同，这种多药抵抗性对药物作用特定靶点发生改变导致抗药性的假说提出了质疑，同时提示可能存在某种非特异性机制导致患者对多种AEDs抵抗，其中多药转运体过度表达假说获得了广泛关注。P-糖蛋白(P_glycoprotein,Pgp)是ATP结合蛋白超家族多药转运体中的重要成员。目前多项研究结果均提示，难治性癫痫多药抵抗的多药转运体假说在生物学上是可能的，但尚缺乏有力的证据来证实这一假说。虽然在人类难治性癫痫的致痫脑组织中检测到Pgp的过度表达，但这一研究结果缺乏有效的实验对照组，因为将其与药物敏感型癫痫患者相应脑组织中的Pgp表达水平相比较是不可能的-这样的患者不会进行外科手术治疗。因此，该领域需要通过能够出现反复自发性痫性发作(spontaneous recurrent seizures,SRS)的癫痫动物模型，然后通过给予抗癫痫药物筛选出药物敏感型和药物抵抗型亚组，从而研究血脑屏障中Pgp的表达在药物敏感组和药物抵抗组中是否存在差异，区域范围，以及发挥的病理生理学作用。以便开发出相应的靶向治疗药物，为治疗难治性癫痫服务。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选难治性癫痫药物的方法，尤其涉及一种筛选敏感型难治性癫痫药物的方法。本发明方法通过建立一种能够出现反复自发性痫性发作的癫痫动物模型，然后通过给予抗癫痫药物筛选出药物敏感型和药物抵抗型亚组，从而研究难治性癫痫相关危险性因子的表达在药物敏感组和药物抵抗组中是否存在差异，区域范围，以及发挥的病理生理学作用，进ー步开发靶向治疗难治性癫痫的药物。具体而言，本发明的一种筛选敏感型难治性癫痫药物的方法，其特征在于，其包括步骤
I、建立反复自发性痫性发作的癫痫动物模型实验动物选用体重为200_230g的雌性Sprague-Dawley大鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)；诱导带电极的实验动物产生癫痫持续状态(SE)及自发性反复痫性发作(SRS)，2、苯巴比妥筛选药物敏感型组和药物抵抗型组3、选出药物敏感型和药物抵抗型亚组，4、研究难治性癫痫相关危险性因子的表达在药物敏感组和药物抵抗组中是否存在差异，区域范围，以及发挥的病理生理学作用；
5、获得新的治疗靶点及解决方法，开发靶向治疗难治性癫痫的药物。本发明中，按现有技术建立带电极的实验大鼠模型，所述的电极包括刺激电极和记录电极，通过导线连接四孔接插件，与刺激器及脑电图放大器连接。本发明中，电刺激诱导带电极的实验大鼠产生癫痫持续状态，本发明的一个实施例中，刺激时间为25分钟；电刺激为每毫秒转换正负电极的方波序列组成；时限为100ms，频率为2次/s，序列内部的脉冲频率为50次/s ;峰刺激强度为700uA ；本发明中，实验大鼠出现全面性強制-痉挛发作癫痫持续状态(SSSE) 2小时以后，给予地西泮终止SSSE。本发明中，实验开始4周后，对实验动物进行视频脑电图监测，本发明的一个实施例中，最长监测期为2个月。本发明中，出现SRS的大鼠给予苯巴比妥，筛选药物敏感型组和药物抵抗型组，其中，实验过程为6周，治疗前对照期2周，苯巴比妥治疗期2周，治疗后对照期2周，采用视频脑电图监测痫性发作频率；给予能够24小时维持有效血药浓度(10-40ug/ml ；Baulac,2002)的苯巴比妥最大耐受剂量2周治疗首日给予25mg/kg早上腹腔注射(i. p.)，IOh后给予 15mg/kg, i. p.,次日起给予 15mg/kg, 2 次/日，i. p.；本发明中，首次注射给药后IOh和末次给药后12h采血样应用高效液相方法进行血药浓度分析；本发明中，根据实验动物对苯巴比妥的不同个体反应，将其分为癫痫发作得到控制的药物敏感组和癫痫发作频率没有明显减少的药物抵抗组；本发明中，采用反复自发性痫性发作(spontaneous recurrent seizures, SRS)的癫痫动物模型，通过给予抗癫痫药物筛选出药物敏感型和药物抵抗型亚组；本发明中，根据癫痫相关危险因子与癫痫发作频率、持续时间的相关性及病理生理学意义，同时筛选靶向治疗敏感型难治性癫痫的药物；本发明中，癫痫相关危险因子是小分子化合物或单克隆抗体或携帯小分子干扰RNA的病毒载体。本发明可进ー步制备抑制所述癫痫相关危险因子的靶向药物组合物。本发明经动物实验，结果表明，药物抵抗型亚组的实验动物大脑皮层Pgp的表达水平较敏感组上调50%左右，癫痫相关危险因子对P-糖蛋白的表达抑制效率达到30%及以上时，其癫痫发作频率、持续时间的抑制作用即发挥出来，同时相应脑波也呈现癫痫发作频率、持续时间相似的改变。本发明的筛选敏感型难治性癫痫药物的方法为解决目前临床应用中出现的难治性癫痫药效减低难题提供了新的治疗靶点及解决方法。
具体实施例方式实施例I :小分子化合物/单克隆抗体/携帯小分子干扰RNA的病毒载体的对P-糖蛋白的表达抑制在难治性癫痫发作频率、持续时间的抑制作用。I、实验动物实验动物选用体重为200_230g的雌性Sprague-Dawley大鼠，共20只，购自中国科学院上海实验动物中心。2 植入电极I %戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，将大鼠头部固定于立体定向仪上(江湾II型)，參考Paxinos和Walson大鼠脑图谱对左侧杏仁基底外侧核进行定位((AP-2. Omm, ML 5. Omm, VD 8. Omm)，将直径0. 2mm的特氟龙双极不锈钢电极植入杏仁基底节外侧核(basolateral nucleus of the amygdala ；BLA) [16]作为刺激电极和记录电极；在左侧顶叶皮质放置不锈钢螺丝钉，作为中间參考电扱。以牙托粉将电极固定在颅骨表面，所有电极均用导线连接四孔接插件，以备与刺激器及脑电图放大器连接。手术后，给予实验动物2周的恢复期。3.诱导产生癫痫持续状态(SE)及自发性反复痫性发作(SRS)I)电极植入后2周，对实验大鼠进行电刺激诱导产生SE。刺激參数如下刺激时间为25分钟；电刺激为姆毫秒转换正负电极的方波序列组成；时限为100ms,频率为2次/s，序列内部的脉冲频率为50次/s ;峰刺激强度为700uA ;18只大鼠诱发了表现为全面性强制痉挛发作的SSSE。2)当实验大鼠出现全面性強制-痉挛发作癫痫持续状态(SSSE)2小时以后，给予所有实验动物地西泮(10mg/kg，腹腔注射)终止SSSE。3)4周以后，对实验动物进行视频脑电图监測，最长监测期为2个月[17]。出现SRS的大鼠(n = 11)给予苯巴比妥进行筛选。4.苯巴比妥筛选药物敏感型组和药物抵抗型组I)实验过程为6周，治疗前对照期2周，苯巴比妥治疗期2周，治疗后对照期2周，采用视频脑电图监测痫性发作频率；2)给予能够24小时维持有效血药浓度(10-40ug/ml ；Baulac, 2002)的苯巴比妥最大耐受剂量2周治疗首日给予25mg/kg早上腹腔注射(i. p.), IOh后给予15mg/kg,
i.P-，次日起给予15mg/kg, 2次/日，i. p.；3)首次注射给药后IOh和末次给药后12h采血样应用高效液相方法进行血药浓度分析；4)根据实验动物对苯巴比妥的不同个体反应，将这些它们分为癫痫发作得到控制的药物敏感组和癫痫发作频率没有明显减少的药物抵抗组；5.采用反复自发性痫性发作(spontaneous recurrent seizures, SRS)的癫痫动物模型，然后通过给予抗癫痫药物筛选出药物敏感型和药物抵抗型亚组，从而研究血脑屏障中PgP的表达水平在药物敏感组和药物抵抗组中是否存在差异，以及确定Pgp的表达水平发生变化的脑区域范围，以及发挥的病理生理学作用。实验结果显示，药物抵抗型亚组大脑皮层Pgp的表达水平较敏感组上调50%左、右，小分子化合物/单克隆抗体/携帯小分子干扰RNA的病毒载体的对P-糖蛋白的表达抑 制效率达到30%及以上时，其癫痫发作频率、持续时间的抑制作用即发挥出来，同时相应脑波也呈现癫痫发作频率、持续时间相似的改变。
权利要求
1.一种筛选敏感型难治性癫痫药物的方法，其特征在干， 通过给予癫痫动物模型抗癫痫药物筛选出药物敏感型和药物抵抗型亚组，根据相关危险性因子的表达差异，筛选敏感型难治性癫痫药物；其包括步骤 1)建立反复自发性痫性发作的癫痫动物模型 选用体重为200-230g的雌性Sprague-Dawley实验大鼠,诱导带电极的实验大鼠产生癫痫持续状态及自发性反复痫性发作； 2)苯巴比妥筛选药物敏感型组和药物抵抗型组； 3)选出药物敏感型和药物抵抗型亚组； 4)分析难治性癫痫相关危险性因子的表达在药物敏感组和药物抵抗组中存在的差 巳升； 5)获得新的治疗靶点，筛选靶向治疗敏感型难治性癫痫的药物。
2.按权利要求I的方法，其特征在于，所述的癫痫相关危险因子为小分子化合物或单克隆抗体或携带小分子干扰RNA的病毒载体。
3.权利要求I的筛选敏感型难治性癫痫药物的方法在制备靶向抑制癫痫相关危险因子中的用途。
4.权利要求I的筛选敏感型难治性癫痫药物的方法在制备抑制癫痫相关危险因子靶向药物组合物中的用途。
5.按权利要求4的用途，其特征在于，所述的靶向药物组合物治疗癫痫发作频率、持续时间。
6.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的癫痫是难治性癫痫。
全文摘要
本发明属生物医药领域，涉及药物筛选的方法，具体涉及一种筛选敏感型难治性癫痫药物的方法。本发明通过建立能够出现反复自发性痫性发作的癫痫动物模型，通过给予癫痫动物模型抗癫痫药物筛选出药物敏感型和药物抵抗型亚组，根据相关危险性因子的表达差异，筛选敏感型难治性癫痫药物。本发明为解决目前临床应用中出现的难治性癫痫药效减低难题提供了新的治疗靶点及解决方法。
文档编号A61K49/00GK102727910SQ20111008444
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者刘振国, 王枫, 赵永波 申请人:上海市第一人民医院, 潍坊市人民医院