专利名称：一种人血管瘤动物模型及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物模型及其构建方法和应用，具体地说，是一种血管瘤干细胞和脐静脉血内皮细胞共同构建的人血管瘤动物模型及其构建方法和应用。
背景技术：
血管瘤是婴幼儿期最常见的高发性良性肿瘤，发病率高达5_10%。，尽管能够自发性不同程度地消退，但约60%的血管瘤发生在头面部，会造成畸形，影响美观；如果发生在重要器官也可能由于肿瘤血管的破裂造成死亡的危险。目前为止，血管瘤的形成机理不明。很大程度是由于没有建立真正意义上人血管瘤动物模型造成缺乏对其基础研究的深入及对治疗该肿瘤的药物的筛选模型。目前报道的建立动物模型的方法有多瘤病毒及基因转录、血管瘤组织移植法、血管生长因子转基因技术的应用和血管瘤干细胞移植技术；但是这些血管瘤动物模型都不能模拟血管瘤生长、消退的自然过程，而且不能表现出类似的组织病理特点。由于人类血管瘤并不发生在其他物种，进一步增加了建立动物模型的难度。中国专利申请号200610087309. 4公开了一种人血管瘤鼠动物模型及其构建方法，该发明应用人血管瘤内皮细胞和人骨肉癌细胞系H0S、人肝癌细胞系Bel-7402或人肝癌细胞系IfepG2共同移植法建立了人血管瘤鼠动物模型。但是该方法有发展成为恶性肿瘤潜在的危险，仍然不能模拟血管瘤生长、消退的自然过程，而且不能表现出类似的组织病理特点。因此需要建立一种血管瘤的实验动物模型，克服上述已有的动物模型的缺点，建立完全类似人类的血管瘤的特性，用来研究人类的血管瘤的发生机制和筛选出特效药物等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人血管瘤动物模型。本发明的再一的目的是，提供一种人血管瘤动物模型的构建方法。本发明的另一的目的是，提供一种人血管瘤动物模型的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种人血管瘤动物模型，所述的动物模型由以下方法构建
a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；
b、将8X105 IXlOici血管瘤干细胞和7X104 1X IOltl个人脐静脉内皮细胞用 100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于100 μ 1蛋白浓度18_2aiig/mL的Matrigel胶中；
C、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。所述的人血管瘤干细胞数量为8X IO5 IX IO8个，人脐静脉内皮细胞数量为 7 X IO4 IXlO8 个。所述的人血管瘤干细胞数量为IXio6 IXlO7个，人脐静脉内皮细胞数量为 7 X IO5 IXlO6 个。
所述的人血管瘤干细胞数量为IXio6个，人脐静脉内皮细胞数量为7X105个。所述的免疫缺陷的动物是指T细胞免疫缺陷的裸鼠或T细胞和B细胞严重联合免疫缺陷的SCID鼠。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是所述的动物模型的构建方法包括以下步骤
a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；
b、将8X105 IXlOici血管瘤干细胞和7X104 1X IOltl个人脐静脉内皮细胞用 100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于100 μ 1蛋白浓度18_2aiig/mL的Matrigel胶中；
C、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。所述的人血管瘤干细胞数量为8X IO5 IX IO8个，人脐静脉内皮细胞数量为 7 X IO4 IXlO8 个。所述的免疫缺陷的动物是指T细胞免疫缺陷的裸鼠或T细胞和B细胞严重联合免疫缺陷的SCID鼠。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是所述的人血管瘤动物模型在人血管瘤形成机理的研究和制备治疗人血管瘤的药物中的应用。本发明优点在于
1、本发明形成的血管瘤完全具有人源化的特点，克服以往只有部分的人源特性，应用荧光蛋白示踪技术证实，所形成的血管瘤由完全具有人源化的细胞组成；
2、形成的血管瘤模型完全具有人类血管瘤的病理特点，病理组织学基础实验也证实， 血管瘤组织中存在膨大的血窦样结构和新生的毛细管等，这些病理特点与人类的血管瘤组织非常相似；
3、本发明的动物模型非常适合于人血管瘤的发病机理研究和开发治疗人类血管瘤的药物或方法，及评价各种治疗血管瘤药物的疗效和筛选治疗血管瘤的药物。
附图1是体外培养的人血管瘤干细胞及其鉴定。A.用MTT分析检测的生长曲线显示分离培养出来的干细胞具有旺盛的增殖能力，在10天内细胞数目扩增到了初始的16倍； B. RT-PCR结果显示⑶133分选出来的阳性细胞表达干细胞特异性基因0ct_4，而阴性细胞明显表达明显减弱，S9为内参；C.流式细胞分析显示分离培养的干细胞表达CD^KCD44等间充质干细胞的标记。附图2是对照组皮下注射HUVEC的Matrigel凝胶。附图3是皮下注射HemSC+HUVEC的Matrigel凝胶。
附图4是皮下注射HemSC+HUVEC成瘤组织的HE切片。附图5是肿瘤动物模型。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1①血管瘤干细胞(HemSC)的分离、培养
a、取新鲜离体的人血管瘤组织，用加双抗的DMEM液反复冲洗组织块，去除血凝块。b、将标本放入IOcm2细胞培养皿中，加入少许DMEM培养液浸润，用眼科剪将组织块剪成Imm长条状，用DPBS再次反复冲洗去除残余的血凝块后放入15ml离心管中，加入浓度为2.如/ml的中性蛋白酶II (Dispase II)溶液10 ml，于4度冰箱过夜。c、取出15ml离心管，吸去中性蛋白酶II液，用PBS洗2遍，将组织块放入IOcm2细胞培养皿中，用眼科剪将组织剪成Imm3大小的组织碎片后，置于15ml离心管中，加入IOml 的0. 2% I型胶原酶在37度水浴箱摇床内消化3h，在胶原酶消化2小时时加入浓度为25u/ ml的DNA酶Iml共消化1小时。d、以800g离心力离心5分钟，弃上清，用DMEM液重悬，重复1次以去净脂肪。e、先以150目金属滤网过滤细胞悬液，再以一次性30 μ m无菌滤膜过滤，滤液以 600g离心5分钟，弃上清，用5mlPBS/0. 1%BSA液重悬，血球计数板计数。②血管瘤干细胞磁珠分选
a、以300g离心细胞悬液10分钟，完全吸去上清；
b、加300 μ 1PBS/0. 1%BSA 液重悬；
C、加入100 μ 1 FcR封闭液(Miltenyi磁珠试剂盒)；
d、加入100μ 1的CD133磁珠；
e、混合好后在4度孵育30分钟，每5分钟摇勻一次；
f、加入2ml的PBS/0.5% BSA液洗并以300g离心10分钟，弃上清；
g、加入500 μ 1 的 PBS/0. 5% BSA 液重悬；
h、将磁珠安放在磁铁上；
i、用500μ 1的PBS/0. 5% BSA液洗柱预备；
j、把细胞加入柱中，收集流下的未标记的细胞；
k、用500 μ 1的PBS/0. 5% BSA液洗柱3次，收集流下的未标记细胞；
1、去除磁铁并换收集管；
m、吸取lml500 μ 1的PBS/0. 5% BSA液加入磁柱，洗出磁珠标记的细胞，洗3次，最后1 次通过稳推最大限度地洗出磁珠标记的细胞。重复h-m步一次以提高纯度；
η、细胞悬液以300g离心10分钟，将分选出的⑶133阳性细胞加入EGM_2/20%FBS培养基在6孔板内培养。③血管瘤干细胞(HemSC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)构建血管瘤动物模型
a、将培养的血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞用0.25%胰酶/0. 02%EDTA消化；
b、计数后，各取含IXlO6和7XIO5个细胞的消化液混合于15ml离心管中，另取 1. 5 X IO6人脐静脉内皮细胞作为对照，以600g离心5分钟，弃上清；
C、加入100 μ 1的EGM-2/20%FBS预冷培养液重悬细胞，并加入100 μ 1的高浓度 Matrigel胶(BD公司，含蛋白18_22mg/mL)中混勻，对照组同法操作；
d、取Iml注射器，吸取总共200 μ 1的混合液，注射于6_8周大的免疫缺陷动物皮下。所述血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞的数量8X IO5 1 X 101°血管瘤干细胞和7X104 IXlOici个人脐静脉内皮细胞。优选的血管瘤干细胞数量为IXlO5 1X108， 更优选为IXlO6 IXlO7个，最优选为IXlO6个；和优选的人脐静脉内皮细胞数量为7 X IO4 IX IO8个，更优选为7 X IO5 IX IO6个，最优选为7 X IO5个。用无血清的DMEM 培养基洗涤，除去培养基中的血清，然后重新悬浮于0. 05 0. 2毫升的高浓度Matrigel胶 (含蛋白 18-22mg/mL)中。所述的免疫缺陷动物包括T细胞免疫缺陷的裸鼠，如裸大鼠或小鼠(BALB/c-nu裸鼠)、T细胞和B细胞严重联合免疫缺陷的鼠如SCID鼠、免疫缺陷的兔子及猴子等。请参照附图1，附图1是体外培养的人血管瘤干细胞及其鉴定。A.用MTT分析检测的生长曲线显示分离培养出来的干细胞具有旺盛的增殖能力，在10天内细胞数目扩增到了初始的16倍；B. RT-PCR结果显示⑶133分选出来的阳性细胞表达干细胞特异性基因 Oct-4，而阴性细胞明显表达明显减弱，S9为内参；C.流式细胞分析显示分离培养的干细胞表达⑶四、⑶44等间充质干细胞的标记。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。请参照附图2、附图3和附图4，附图2是对照组皮下注射HUVEC的Matrigel凝胶，附图3是皮下注射HemSC+HUVEC的Matrigel凝胶，附图4是皮下注射HemSC+HUVEC成瘤组织的HE切片。20-30天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。请参照附图5，附图5 是肿瘤动物模型。病理组织检查发现，动物模型的组织中存在内含红细胞和大量的新生血管等。我们从免疫组化实验及组织切片等实验同婴儿血管瘤标本进行了对照，发现几乎各项指标等同于婴儿血管瘤的特征。这种动物模型非常适合于人血管瘤的发病机理研究和开发治疗人类血管瘤的药物或方法，及评价各种治疗血管瘤药物的疗效和筛选治疗血管瘤的药物。血管瘤的内皮细胞是从人的脐静脉的内皮组织分离纯化和培养来，血管瘤的瘤细胞也是从人的血管瘤的组织细胞中分离纯化和培养来，因此整个血管瘤完全具有人源化的特点，克服以往只有部分的人源特性。应用荧光蛋白示踪技术证实，在动物模型的血管和肿瘤细胞都存在大量的荧光，表明所形成的血管瘤完全具有人源化的细胞组成。由于接种的两种细胞都是人源化的细胞，故形成的血管瘤模型完全具有人类血管瘤的病理特点，病理组织学基础实验也证实血管瘤组织中存在膨大的血窦样结构和新生的毛细管等。这些病理特点与人类的血管瘤组织非常相似。实施例2
①分别从人血管瘤的临床手术标本中分离出人血管瘤干细胞和人脐静脉中分离出内皮细胞并进行培养扩增；
②将8X IO5的血管瘤干细胞和7 X IO4的人脐静脉内皮细胞用100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于同样体积的高浓度Matrigel胶(含蛋白18_22mg/mL)中；
③用注射器将上述人血管瘤干细胞(HemSC)和脐静脉内皮细胞(HUVEC)共同接种到免疫缺陷的BALB/c-nu裸鼠皮下。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。14天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。
实施例3
①分别从人血管瘤的临床手术标本中分离出人血管瘤干细胞和人脐静脉中分离出内皮细胞并进行培养扩增；
②将1X IO6的血管瘤干细胞和7 X IO5的人脐静脉内皮细胞用100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于同样体积的高浓度Matrigel胶(含蛋白18_22mg/mL)中；
③用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠皮下。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。14天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。实施例4
①分别从人血管瘤的临床手术标本中分离出人血管瘤干细胞和人脐静脉中分离出内皮细胞并进行培养扩增；
②将IXlO7的血管瘤干细胞和IXIOki的人脐静脉内皮细胞用100μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于同样体积的高浓度Matrigel胶(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠皮下。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。14天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。实施例5
①分别从人血管瘤的临床手术标本中分离出人血管瘤干细胞和人脐静脉中分离出内皮细胞并进行培养扩增；
②将1X IO8的血管瘤干细胞和1 X IO6的人脐静脉内皮细胞用100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于同样体积的高浓度Matrigel胶(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠皮下。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。14天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。实施例6
①分别从人血管瘤的临床手术标本中分离出人血管瘤干细胞和人脐静脉中分离出内皮细胞并进行培养扩增；
②将1X IO9的血管瘤干细胞和1 X IO8的人脐静脉内皮细胞用100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于同样体积的高浓度Matrigel胶(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠皮下。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。14天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。实施例7
①分别从人血管瘤的临床手术标本中分离出人血管瘤干细胞和人脐静脉中分离出内皮细胞并进行培养扩增；
②将IXIOki的血管瘤干细胞和IXlO9的人脐静脉内皮细胞用100μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于同样体积的高浓度Matrigel胶(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠皮下。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。14天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。实施例8
①分别从人血管瘤的临床手术标本中分离出人血管瘤干细胞和人脐静脉中分离出内皮细胞并进行培养扩增；
②将1X 101°的血管瘤干细胞和1 X 101°的人脐静脉内皮细胞用100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于同样体积的高浓度Matrigel胶(含蛋白18_22mg/mL)中
③用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠皮下。本发明建立的血管瘤的动物模型形态和组织结构都非常类似于人类的血管瘤，而且形成的时间快，几乎一周后观察凝胶内的血管形成情况，就能观察HE切片均可见血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞共注射组凝胶内有多量血管形成，对照组则无血管形成。14天后在细胞接种的地方出现非常明显的人类血管瘤肿块。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
8
权利要求
1.一种人血管瘤动物模型，其特征在于，所述的动物模型由以下方法构建a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；b、将8X105 IXlOici血管瘤干细胞和7X104 1X IOltl个人脐静脉内皮细胞用 100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于100 μ 1蛋白浓度18_2aiig/mL的Matrigel胶中；C、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。
2.根据权利要求1所述的人血管瘤动物模型，其特征在于，所述的人血管瘤干细胞数量为8X IO5 IX IO8个，人脐静脉内皮细胞数量为7X IO4 IX IO8个。
3.根据权利要求1所述的人血管瘤动物模型，其特征在于，所述的人血管瘤干细胞数量为1 X IO6 1 X IO7个，人脐静脉内皮细胞数量为7 X IO5 1 X IO6个。
4.根据权利要求1所述的人血管瘤动物模型，其特征在于，所述的人血管瘤干细胞数量为1 X IO6个，人脐静脉内皮细胞数量为7 X IO5个。
5.根据权利要求1所述的人血管瘤动物模型，其特征在于，所述的免疫缺陷的动物是指τ细胞免疫缺陷的裸鼠或T细胞和B细胞严重联合免疫缺陷的SCID鼠。
6.根据权利要求1-5任一所述的人血管瘤动物模型的构建方法，其特征在于，所述的动物模型的构建方法包括以下步骤a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；b、将8X105 IXlOici血管瘤干细胞和7X104 1X IOltl个人脐静脉内皮细胞用 100 μ 1的EGM-2培养液重悬，然后混勻于100 μ 1蛋白浓度18_2aiig/mL的Matrigel胶中；C、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。
7.根据权利要求6所述的人血管瘤动物模型的构建方法，其特征在于，所述的人血管瘤干细胞数量为8 X IO5 1 X IO8个，人脐静脉内皮细胞数量为7 X IO4 1 X IO8个。
8.根据权利要求6所述的人血管瘤动物模型的构建方法，其特征在于，所述的免疫缺陷的动物是指T细胞免疫缺陷的裸鼠或T细胞和B细胞严重联合免疫缺陷的SCID鼠。
9.根据权利要求1-5任一所述的人血管瘤动物模型，其特征在于，所述的人血管瘤动物模型在人血管瘤形成机理的研究和制备治疗人血管瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种人血管瘤动物模型，所述的动物模型由以下方法构建a、取人血管瘤干细胞和人脐静脉内皮细胞备用；b、将8×105～1×1010血管瘤干细胞和7×104～1×1010个人脐静脉内皮细胞用100μl的EGM-2培养液重悬，然后混匀于100μl蛋白浓度18-22mg/mL的Matrigel胶中；c、用注射器将上述人血管瘤干细胞和脐静脉内皮细胞混合物接种到免疫缺陷的动物皮下。本发明还提供了这种人血管瘤动物模型的构建方法和用途。本发明优点在于所形成的血管瘤由完全具有人源化的细胞组成；血管瘤模型完全具有人类血管瘤的病理特点；非常适合于人血管瘤的发病机理研究和开发治疗人类血管瘤的药物或方法。
文档编号A61K49/00GK102239821SQ20111011883
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者袁伟恩, 郑家伟, 麦华明 申请人:袁伟恩, 郑家伟, 麦华明