专利名称：一种生产蝉拟青霉孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产蝉拟青霉分生孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用。
背景技术：
蝉花即蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)，是一种虫生真菌，因其与冬虫夏草一样同属虫菌复合体，且含有相近的化学、营养成分，所以常用被用作冬虫夏草的代用品。蝉花具有免疫调节、解热镇痛、改善肾功能、镇静催眠、抗辐射等多种药理作用，可被应用到食品、保健品、药品、化妆品等领域。研究发现，在蝉拟青霉孢子中检测出与其他部位如孢梗束、菌质中同样的营养成分，甚至含量更高。此外，蝉拟青霉作为拟青霉属的虫生真菌，其分生孢子同样可作为生物防治的有效手段，从源头上解决农产品农药残留超标的问题。现有专利中蝉花的人工培育方法只是为了获得菌丝体、孢梗束或带虫体的子实体而设计的培养基和方法，并没有专门为了获得蝉花孢子粉而设计的培养基和培养方法。另外，现有的培养方法中，单纯的液体培养并不能获得蝉拟青霉分生孢子，而固体培养存在生产周期长、菌剂含孢量低、成本高等弊端。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种生产蝉拟青霉分生孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用。本发明采用如下技术方案解决上述技术问题
一种生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，所述固相培
麸皮20 45 ■量份；
玉米粉5 30重量份；
蔗糖0. 5 5 ■量份；
蚕蛹粉0. 5 5 ■量份；
KNO30. 1 3 1I量份；
KH2PO40. 05 1重量份；
MgSO40. 05 0.8重量份；
H2O25 70I量份。
或者，所述固相培养基的原料组分包括
麸皮40 70重量份；
营养液30 60重量份；
贝壳粉0. 01 2 ■量份；
蚕蛹粉0. 01 5 ■量份；
其中，所述I爹养液中含有的组分名称及其重量百分比为
KNO3蔗糖KH2PO,
0. 1 5% ； 1 20% ； 0. 05 3%MgSO4 0.01 0.5%:柠檬酸铵 0.01 0.1%;H2O余量。本发明还提供了一种生产蝉拟青霉分生孢子的液相培养基，所述液相培养基中含有的组分名称及其重量百分比为马铃薯 10 30%;蔗糖1 10%;柠檬酸0.01 1%;H2O余量。本发明还提供了一种蝉拟青霉孢子的培养方法，该培养方法采用上述固相培养基及液相培养基，且所述培养方法包括如下步骤1)斜面菌种制备将蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)菌株接种到斜面培养基上，20 25°C下，培养3 5天；2)种子液的制备从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的三角瓶液体培养基中，20 25°C下，140 160rpm，培养3 5天即可制得蝉拟青霉种子液；3)将步骤幻中制得的蝉拟青霉种子液按重量百分比为10 15%接入所述液体培养基中，在20 25°C下，140 160rpm，振荡发酵3 5天；4)将步骤3)中制得的发酵液按重量百分比为3% 10%接入灭菌后的所述固相培养基中，在温度为18 23°C，湿度为50 90%的条件下，静置开放式培养15 25天。较佳的，步骤1)中，所述斜面培养基为PDA固相培养基，其制备可由本领域技术人员参考现有技术进行确认。进一步优选的，所述PDA固相培养基的制备方法为挑取新鲜马铃薯，去皮洗净并切碎后与水混合，其中，马铃薯和水的重量比例为1 (3 7)，灭菌后过滤，其滤液为马铃薯煮汁，然后在所述马铃薯滤液中加入琼脂2 %份，蔗糖2 %份，加热溶解后加水补足使得体积至原来马铃薯滤液体积，然后分装至试管，在121°C，1. 05Kg/cm2灭菌30min后摆斜面， 冷却后使用。优选的，步骤4)中，所述的生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，其特征在于，所述固体培养基的制备方法为先将玉米粉和麸皮煮熟，将蔗糖、KN03、KH2P04、MgS04在水中溶解，再与蚕蛹粉、煮熟后的玉米粉和麸皮按照比例混合均勻。较佳的，步骤4)中，所述静置开放式培养过程中，周围环境为万级洁净空间，同时通无菌风保证培养室内空气交换流通；进一步优选的，在静置开放式培养过程中，还需要在培养基上面覆盖多层厚度为0. 1 0. 3mm/层，含水量为饱和的无菌吸水纸进行固相发酵。 更佳的，所述静置开放式培养过程中，在培养基上面覆盖多层厚度为0. 1 0. 3mm/层，在所述固相培养基的营养液中浸泡至饱和的无菌吸水纸进行固体发酵。本发明第三方面提供了一种由上述蝉拟青霉孢子的培养方法所产生的发酵产物， 该发酵产物包括发酵过程产生的孢子、次生代谢产物以及剩余培养基等。
本发明的培养产物中含有多糖、虫草酸、腺苷、多种氨基酸等成分，具有免疫调节、 解热镇痛、改善肾功能、降血压、抗辐射、抗肿瘤及降血糖等功能，可以应用于人们的健康生活领域，比如用于制备功能食品、药品或日化洗护用品等。同时发酵过程能够产生大量孢子，且培养产生的孢子可以作为生物防治的有效手段，从源头上解决农产品农药残留超标的问题，因此，可以用于生物防治领域，比如生物农药等。
图1 人工培养蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激或未刺激的淋巴细胞作用M小时时对淋巴细胞增殖的影响。图2 人工培养蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激或未刺激的淋巴细胞作用48小时时对淋巴细胞增殖的影响。图3 人工培养蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激或未刺激的淋巴细胞作用72小时时对淋巴细胞增殖的影响。图4 蝉拟青霉分生孢子对PHA刺激的人淋巴细胞细胞周期的影响试验结果。
具体实施例方式下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例11、培养基的制备1.PDA斜面制备(固体)挑取新鲜无发芽无病害的马铃薯，去皮洗净，切成小薄片，称200g，加水lOOOmL， 煮沸30min后过滤，其滤液为马铃薯煮汁。然后加入琼脂20g，蔗糖20g，加热溶解后补足水至IOOOmL,分装试管，121°C，1. 05Kg/cm2,灭菌30min后，摆成斜面，冷却后使用。2.固相培养基的制备称取麸皮800g，玉米粉 150g，H20 720ml，混合蒸煮 lh，蔗糖 10g，KNO3 5g，KH2P043g， MgSO4 2g，用少量H2O溶解后，与蚕蛹粉10g，与煮熟后的麸皮和玉米粉混合均勻，121°C， 1. 05Kg/cm2，灭菌 30min 后使用。所述固体培养基还可为称取麸皮1200g，蚕蛹粉20g，贝壳粉15g，营养液IOOOmL,混合后，121°C，1. 05Kg/ cm2,灭菌30min后使用。其中，所述营养液具体组成如下=KNO3为0. 5 %，蔗糖为10 %，KH2PO4 为1 %, MgSO4 % 1%，柠檬酸铵为0. 05%，H2O为余量。3.液体培养基的制备挑取新鲜无发芽无病害的马铃薯，去皮洗净，切成小薄片，称200g，加水lOOOmL， 煮沸30min后过滤，其滤液为马铃薯煮汁。然后加入蔗糖20g，柠檬酸0. Ig加热溶解后补足水至 lOOOmL，混合后，121°C，1. 05Kg/cm2，灭菌 30min 后使用。2、蝉拟青霉孢子的培养过程1.蝉拟青霉菌种的制备将蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)接到PDA斜面固体培养基上，22°C恒温培养4 6天，备用。2.液固双相发酵生产蝉拟青霉孢子取斜面种，用接种环刮取少量带分生孢子的菌丝体接入液体培养基中，摇瓶装液量200mL/500mL，22°C下，140rpm，振荡发酵3 5天，再将发酵液按照3 5%的接种量接入固相培养基上，混勻，在培养基上面覆盖一层厚度为0. 1 0. 3mm，含水量为饱和的无菌吸水纸进行固体发酵，25°C，湿度为60%的条件下培养10 25天即得到大量蝉拟青霉孢子。在所述含有营养液组分的固相培养基中培养时，在培养基上面覆盖一层厚度为 0. 1 0. 3mm，在所述固相培养基的营养液中浸泡至饱和的无菌吸水纸，然后将液体发酵培养基中培养好的蝉拟青霉菌丝体按照3 5%的接种量喷洒在吸水纸表面，25°C，湿度为 60%的条件下培养10 25天即得到大量蝉拟青霉孢子。3.蝉拟青霉分生孢子的收集方法，具体包括以下步骤(1)菌种培养实施例1(2)培养物烘干将培养物整体倒入沸腾干燥机，脱水烘干；(3)培养物粗粉碎将烘干的培养物进行粗粉碎，使孢子从培养物上脱落；(4)孢子分离开启旋风收集器，将孢子与培养物分离，使孢子从管道中进入收集室；(5)孢子收集孢子从管道中进入收集室，在收集室顶端通过微风装置将孢子吹至收集室底部收集袋，获得蝉拟青霉孢子粉。4、培养产物的成分分析试验1)多糖含量测定精确称取实施例1中制得的蝉拟青霉孢子粉0.5g，加入IOmL蒸馏水，超声萃取 lOmin，然后放入90°C水浴锅，热水浸提2h，4000r/min离心lOmin，获得上清液。重复上述步骤一次，合并上清液，用紫外可见分光光度法在490nm的波长处测定吸光度首先将样液稀释12. 5倍；然后用加样抢精确吸取ImL稀释后样液，加入ImL蒸馏水，再加入5%苯酚溶液，摇勻；再加入5mL 98%浓硫酸，摇勻并冷却至室温后采用紫外可见分光光度计检测，波长为490nm。其中，所述多糖含量测定计算公式为多糖含量=a - C - V/W ；上述公式中，a 稀释倍数，C 由回归方程计算得到的浸提液中糖浓度(mg ·πι 。)， V 体积(mL) ；W 为样品的重量(mg)。结果见表1。2)总三萜含量测定称0. 05g供试品于25mL容量瓶，超声20min，用无水乙醇定容到刻度。供试品溶液中取0. 4mL，沸水浴挥去无水乙醇，冷却，加入5%香草醛冰乙酸溶液0. 2mL，高氯酸0. 8mL, 将容量瓶放人60°C水浴中加热15min，冷却至室温，用冰醋酸定容到刻度，摇勻。在548nm 波长处测定吸光度值。以熊果酸作为对照品溶液。结果见表1。3)腺苷含量测定A.溶液的制备对照品溶液称取腺苷对照品适量，精密称定，加90%甲醇溶解制成含量为 16. 04μ g/mL的腺苷对照品溶液，摇勻，即得。
供试品溶液称取蝉拟青霉孢子粉0. 5g，精密称定，置于带塞锥形瓶中，加入90% 甲醇10mL，闭塞，摇勻，称定重量，加热回流30min，冷却，再称定重量，用90%甲醇补足减少的重量，摇勻，过滤，取续滤液，即得。B.色谱条件Diamonsil Cw 色谱柱 6mmX 250mm，5 μ m)，以磷酸盐缓冲液(PH6. 5)-甲醇 (17 3)为流动相；流速为lmL/min，检测波长为260nm，理论塔板数以腺苷峰计不低于 2000。磷酸盐缓冲液(PH6. 5)制备取0. Olmol/L磷酸二氢钠68. 5mL与0. 01mol/L磷酸氢二钠31. 5mL,混合，调PH至6. 5。C.测定法按照色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ L，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表1。4)虫草酸含量测定称取0. 500g样品加去离子水10mL，超声30min，4000r/min离心10分钟，获取上清液。两个循环，上清液定容到20mL。精密量取待测样品溶液lmL，加入IOmL刻度试管中， 加ImL高碘酸钾溶液，混勻，室温放置IOminJn 2mL 0. 1% L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，混合后加4mL新鲜配制的NaS1试剂，53°C水浴加热15min使其呈色；之后快速冷却至室温，用分光光度计以蒸馏水代替待测样品溶液，用同样方法操作作为对照，测定其吸光度，其计算公式如下=M = C ^ V/m ；其中，M 虫草酸含量(mg/g) ；C 虫草酸浓度(mg/mlL)； V 提取溶液体积(mL) ；m 测试样品量(g)。结果见表1。表1孢子和天然蝉花的成分比较
权利要求
1. 一种生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，所述固相培养基的原料组分包括麸皮20 -45 ]重量份；玉米粉5 30 S量份；蔗糖0. 5 5 ]重量份；蚕蛹粉0. 5 5 ]重量份；KNO30. 1 -^ 31■量份；KH2PO40. 05 1 ；重量份；MgSO40. 05 0.8重量份H2O25 70 I■量份。
2. —种生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，所述固相培养基的原料组分包括麸皮40 70重量份；营养液 30 60重量份；贝壳粉 0.01 2重量份；蚕蛹粉 0. 01 5重量份；其中，所述营养液中含有的组分名称及其重量百分比为KNO30.1 5% ；蔗糖1 20% ；KH2PO40.05 3% ；MgSO40.01 0. 5%柠檬画殖0 01 0. 1%H2O 余量。
3.—种生产蝉拟青霉分生孢子的液相培养基，所述液相培养基中含有的组分名称及其重量百分比为马铃薯 10 30% ；蔗糖 1 10%;柠檬酸 0. 01 1%;H2O余量。
4.一种蝉拟青霉孢子的培养方法，该培养方法采用上述固相培养基，且所述培养方法包括如下步骤1)斜面菌种制备将蝉拟青霉菌株接种到斜面培养基上，20 25°C下，培养3 5天；2)种子液的制备从斜面上刮取菌丝接种到以PDA液体为基础的三角瓶液体培养基中，20 25°C下，140 160rpm，培养3 5天即可制得蝉拟青霉种子液；3)将步骤幻中制得的蝉拟青霉种子液按重量百分比为10 15%接入所述液相培养基中，在20 25°C下，140 160rpm，振荡发酵3 5天；4)将步骤幻中制得的发酵液按重量百分比为3% 15%接入灭菌后的所述固相培养基中，在温度为18 23°C，湿度为50 90%的条件下，静置开放式培养15 25天。
5.如权利要求1中所述的生产蝉拟青霉分生孢子的固相培养基，其特征在于，所述固体培养基的制备方法为先将玉米粉和麸皮煮熟，将蔗糖、KN03、KH2PO4, MgSO4在水中溶解， 再与蚕蛹粉按照比例混合均勻。
6.如权利要求4中所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述斜面培养基为PDA固体培养基。
7.如权利要求6中所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，所述斜面培养基的制备方法为马铃薯去皮洗净并切碎后与水混合，其中，马铃薯和水的重量比例为1 (3 7)，灭菌后过滤得到马铃薯煮汁，然后在所述马铃薯滤液中加入琼脂2%，蔗糖2%，加热溶解后加水补足使得体积至原来马铃薯滤液体积，然后分装至试管，在121°C，1. 05kg/cm2灭菌30min后摆斜面，冷却后使用。
8.如权利要求4中所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述静置开放式培养过程中，周围环境为万级洁净空间，同时通无菌风保证培养室内空气交换流通；进一步优选的，在静置开放式培养过程中，还需要在培养基上面覆盖多层厚度为0. 1 0. 3mm/层，含水量为饱和的无菌吸水纸进行固体发酵。
9.如权利要求4中所述的蝉拟青霉孢子的培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述静置开放式培养过程中，周围环境为万级洁净空间，同时通无菌风保证培养室内空气交换流通；进一步优选的，在静置开放式培养过程中，还需要在培养基上面覆盖多层厚度为0. 1 0. 3mm/层，在所述固相培养基的营养液中浸泡至饱和的无菌吸水纸进行固体发酵。
10.一种蝉拟青霉的的发酵产物，所述发酵产物由蝉拟青霉经过权利要求4-9中所述培养方法进行培养后制得。
11.权利要求10中所述的蝉拟青霉的的发酵产物在功能食品领域、药物制备领域、日化洗护用品制备领域以及生物防治领域中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产蝉拟青霉分生孢子的培养基、培养方法和培养产物及其应用。该生产蝉拟青霉分生孢子的培养基包括固相培养基和液体培养基。本发明的培养方法能够产生大量蝉拟青霉分生孢子，且其培养产物中含有多糖、虫草酸、腺苷、三萜类、多种氨基酸等成分，具有免疫调节、解热镇痛、改善肾功能、降血压、抗辐射、抗肿瘤及降血糖等功能，可以应用于人们的健康生活领域，同时发酵过程能够产生大量孢子，且培养产生的孢子可以作为生物防治的有效手段，从源头上解决农产品农药残留超标的问题。
文档编号A61P35/00GK102242079SQ20111012200
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月12日 优先权日2010年5月14日
发明者孙长胜, 李成, 赵伟, 陈祝安 申请人:浙江泛亚生物医药股份有限公司