专利名称：一种基于dna水平的高致病性猪蓝耳病病毒jev复制子疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用。
背景技术：
目前临床应用的PRRS疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。由于灭活疫苗免疫效果不理想，而减毒活疫苗又存在毒力返强的可能性。当前PRRS己成为严重危害养猪业的重大传染病之一，疫苗的免疫接种仍是预防与控制PRRS最有效的措施。目前用于预防PRRS的商品化疫苗主要是弱毒苗和灭活疫苗， 但因存在安全隐患或免疫效果差的缺陷，不能提供理想的免疫保护。而被誉为“第三次疫苗革命”DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下，构成重组表达质粒DNA，将其直接导入动物体内，通过宿主细胞表达加工合成抗原分子，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。虽然DNA疫苗具备许多优势，但是却因接种剂量大和存在与宿主基因组重组的安全隐患在发展受到很多限制。因此，研究更安全、有效的新型疫苗载体对预防和控制PRRS的发生与流行具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗。本发明另一目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的构建方法。本发明还有一个目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗，是建立在JEV复制子 (PJEV-REP)上的。所述JEV复制子系统是以改造过的低拷贝质粒pOKM为骨架，在缺失绝大部分结构基因(第165-M02核苷酸)的情况下，构建包括CMV启动子、5’ UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信号肽(E25)、所有非结构蛋白、3’ UTR、核酶(HDVr)和polyA序列的基于DNA水平的JEV复制子载体系统。上述JEV复制子系统的构建方法，包括如下步骤设计引物，其序列如SEQ ID NO: Γ18所示，从质粒pWF-GFP中扩增片段A，再从JEV的基因组RNA中扩增出片段B、C、D
和片段II ,再以片段A和B为模板，通过融合PCR的方法扩增出片段I ；以片段C和D为模板，融合PCR扩增出片段III，将片段I、Π和III定向克隆到低拷贝质粒中，得到基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统。本发明所述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗是将蓝耳病的结构基因GP5与M蛋白插入到基于DNA水平的JEV复制子(pJEV-REP)中，包括CMV启动子、 5'UTRX蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信号肽、所有非结构蛋白编码区、3’ UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白编码区、FMDV-2A的序列和M蛋白编码区。上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的构建方法包括如下步骤设计引物，其序列如SEQ ID N0:19l8所示，扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的 GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在两个基因中间插入FMDV-2A的序列，从而得到G-2A-M 片段，最后通过SpeI和MlI两个酶切位点克隆到JpJEV-REP ；另外，为了使M蛋白能够产生真实的N末端，G-2A-M片段的下游插入了 IRES序列(G-2A-M-IRES)，最后利用MlI-HF 和SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和 M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗。IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。G-2A-M片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:30所示。本发明上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子能有效表达并能诱发特异性抗体和细胞免疫反应，可作为预防高致病性猪蓝耳病的一种新型基因工程疫苗。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
目前市场普遍存在的蓝耳病疫苗弱毒疫苗，但减毒活疫苗最大的缺点是存在毒力返强的可能性，而传统的基因工程疫苗蛋白表达量低，免疫原性较差等不足。而本发明研发的复制子疫苗不存在活病毒，因此不存在病毒毒力返强的可能性，另外，本发明也证明了与传统的DNA疫苗相比，本发明的疫苗可以产生更高的抗体和更强的淋巴细胞增殖反应。
图1为基于JEV复制子载体的猪高致病性蓝耳病疫苗的构建图，其中，A为 JEV-REP-G-2A-M-IRES ；B 为 pJEV-REP-G-2A_M ；
图2为GP5基因、M基因及其融合PCR的扩增产物；其中，1为DNA Marker DL2, 000 ； 2为GP5基因PCR片段；3为M基因PCR片段；4为G-2A-M片段；5为G-2A-MR片段；6为 IRES序列PCR片段；7为G-2A-M-IRES片段；
图3为各重组质粒的酶切鉴定；其中，1为λ-EcoTH I digest Marker ;2为DNA Marker DL2, 000 ；3 为 pJEV-REP-G-2A-M_IRES (Sall/Spel);4 为 pJEV-REP-G-2A_M (Sail/ Spel);5 为 ρJEV-REP-GFP (Sall/Spel);6 为 pJEV-REP-IRES (Sall/Spel);7 为 pCAGGS-GM (EcoRI 和 XhoI)；
图4为表达GP5/M蛋白的三组重组质粒的Wfestern blot检测结果；其中， 1 为 pageRuler Prestained Protein Ladder ；2 为 pJEV-REP-G-2A-M-IRES ；3 为 PJEV-REP-G-2A-M ；4 为 pCAGGS-GM ；5 为 293T 细胞；
图5为三组pJEV-REP重组质粒转染细胞48h的IFA结果(X400)；其中，A 为 pJEV-REP-G-2A-M-IRES 转染细胞；B 为 pJEV-REP-IRES 转染细胞；C 为 PJEV-REP-G-2A-M 转染细胞；D 为细胞； 图6为免疫小鼠血清抗体的生长曲线；图7为不同疫苗免疫小鼠的脾脏淋巴细胞特异性增殖反应。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。材料=PRRSV-XH株由农业部动物疫病防控重点开放实验室张桂红教授惠赠； Mac 145细胞由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供；8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠购自广东省实验动物中心。实施例1 构建猪高致病性蓝耳病复制子疫苗
1.构建猪高致病性蓝耳病复制子疫苗的设计(结构图如图1)
通过自行设计的引物(如SEQ ID NO: 19^29所示)，以HP PRRS基因RNA的反转录产物为模板，引物GP5F与GP5R-FMDV2A-R可扩增出GP5基因的完整编码区及2A序列的前45个碱基，结果扩增出大小为648bp特异性片段；引物MF-FMDVF2A-F与MR- MlI则可以扩增出 2A序列的后45个碱基及M基因的完整编码区，扩增出570bp。另外，引物GP5F和MR-&ilI 通过融合PCR的方法扩增出约1，200bp的G-2A-M片段。同时以G-2A-M片段为模板，以 GP5F和MR为引物扩增出约1，200bp的G-2A-MR片段，再以IRESlF和IRES-588R为引物， 以pIRESl-neo为模板扩增出588bp的IRES序列。接着利用G-2A-MR片段和IRES为模板， 以GP5F和IRES-588R为引物融合扩增出约1，800bp的G_2A_M_IRES特异性片段，最后利用 MlI-HF和SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达 GP5和M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗(如图2)。2.真核表达质粒的构建
以GP5-EcoRI和MR-XhoI为引物，以质粒pJEV-REP-G-2A_M为模板通过PCR的方法扩增出G-2A-M-EX片段。然后将G-2A-M-EX片段和真核表达载体pCAGGS分别用限制性内切酶EcoRI和B10I进行消化连接产物直接用于转化以及重组质粒的获得，命名为pCAGGS-GM 伐口图2)。3.各重组质粒的酶切鉴定
重组质粒 pCAGGS-GM 用 EcoRI 和 XhoI 进行酶切鉴定，而 pJEV-REP-G-2A-M_IRES、 PJEV-REP-G-2A-M和pJEV_REP_IRES三个重组质粒则均用MlI和SpeI进行酶切鉴定(如图3)。实施例2化学荧光法flfestern-blot检测GP5蛋白和M蛋白表达
将共表达 PRRSV 的 GP5 和 M 蛋白的质粒(pJEV-REP-G-2A_M 和 pJEV-REP-G-2A-M_IRES) 与真核表达质粒(pCAGGS-GM)分别转染细胞，转染4 后收集细胞，重组质粒转染4 后，收获细胞，PBS洗2次，适量PBS重悬，加入2 X SDS上样缓冲液，沸水浴作用lOmin。制备12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，按每孔20 μ 1点样，并于80V/0. 5h和120V/1. 5h条件下电泳。电泳结束后，在半干电转印仪上于17V/10min条件下将蛋白转移至硝酸纤维膜上。 转移完成以后用1\ 83洗膜5!^11，5%脱脂乳371封闭lh。用抗GP5蛋白和抗M蛋白特异性单克隆抗体室4°C孵育过夜，PBST洗3遍，每遍5min，将IRDye 800标记的羊抗鼠荧光二抗作1 7，500稀释后一起加入，室温摇床上孵育lh，PBST洗膜3次，每次5min，用Odyssey 红外荧光扫描成像系统进行扫描，结果发现，三种转染了质粒的细胞都在43KD出现特异性条带，表明GP5和M蛋白的表达是以GP5/M异源二聚体的形式存在(见图4)，表明这几种重组质粒在转染细胞后均可正确表达目的蛋白。实施例3间接免疫荧光检测JEV非结构蛋白的表达
将共表达PRRSV的GP5和M蛋白的JEV复制子质粒(pJEV-REP-G-2A_M和 PJEV-REP-G-2A-M-IRES)与载体对照质粒(pJEV_REP_IRES)分别转染细胞48h后，用间接免疫荧光的方法检测到三种JEV复制子重组质粒均能表达JEV NSl蛋白(见图5)。实施例4免疫小鼠血清特异性抗体的检测
60只8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠分为5组，每组12只，分别免疫 pJEV-REP-G-2A-M-IRES、pJEV-REP-IRES、pJEV-REP-G-2A-M、pCAGGS-GM 和 PBS，免疫剂量为 100 μ L/只，每侧各50 μ L，共免疫3次，每隔3周免疫一次。采集免疫后0、2、4、6、8和10周的免疫小鼠血清，用猪蓝耳病ELISA检测试剂盒进行检测(其中将猪的酶标二抗更换为小鼠的酶标二抗)。主要步骤如下1:100稀释待检小鼠血清，取预包被的板，每孔加100 μ L待检血清，置37°C温育30min ；300 μ L/孔洗涤液洗板4次，每次静置:3min ；每孔加NBL公司的鼠酶标二抗(1:7，500稀释)100 μ L， 置37°C温育60min ；洗涤4次，方法同上；每孔加底物A液和B液各50 μ L，室温避光显色 IOmin ；每孔加终止液50 μ L, 10 min内用酶标仪630nm波长测定各孔的OD值(见图6)。 从图中可以看出免疫组在一免后两周开始检测到特异性抗体，二免后ρJEV-REP-G-2A-M 和ρJEV-REP-G-2A-M-IRES免疫组相比对照组抗体水平开始增加，并在三免后两周(8 周)三组疫苗组均达到抗体的高峰，此时PJEV-REP-G-2A-M (0D630=0. 73士0. 09)和 PJEV-REP-G-2A-M-IRES (0D630=0. 71 士0. 08)免疫组比 pCAGGS-GM (0D630=0. 59 士0. 11)DNA 疫苗免疫组产生更高的抗体。结果表明复制子疫苗比DNA疫苗能产生更高的抗体水平。实施例5免疫小鼠的特异性淋巴细胞增殖水平
三免后两周进行淋巴细胞增殖试验。首先用眼球采血法处死小鼠，浸泡于75%的乙醇中；在超净台中取出小鼠脾脏置于35mm培养皿中，注意无菌操作；在培养皿中加入4_5 mL淋巴细胞分离液。用注射器将脾脏挑成碎块，然后于200目的筛网下用注射器的活塞进行研磨，然后吹打成单个细胞悬液；然后把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，覆盖200-500 μ L的1640培养基，保持液面分界明显；室温，800g离心30min ；接下来吸出淋巴细胞层，再加入10 mL1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心IOmin收集细胞；最后倾倒上清液，用1640培养基重悬细胞，细胞计数，然后用1640完全培养基将细胞稀释到IX IO6个/ mL。将上述制备的淋巴细胞悬液离心后悬浮到RPMI1640完全培养基，然后加到96孔平底细胞培养板(1 X 105个/孔)，每孔加入100 μ L的细胞悬液。再加入相同体积的PRRSV(1 μ g)、Mac 145空细胞对照或是RPMI1640完全培养基。培养板在含5% C02的37°C恒温培养箱培养84h后，每孔加入10 μ L CCK-8试剂，混勻后继续培养池，然后用酶标仪检测波长为450 nm的光密度值。每个样品设三个重复，计算刺激指数 (Stimulation Index, Si)。SI=PRRSV 刺激孔的平均光密度度值 0D450nm/Macl45 空细胞对照孔密度度值0D450nm。脾细胞加入PRRSV刺激培养80h后，加入WST-8溶液，来判断活细胞数量。活细胞的量由样品的0D450nm显示，根据PRRSV刺激组和空细胞对照组的 0D450nm计算刺激指数(Stimulation Index, Si)从而判断增殖水平。实验结果表明(见图 7)pJEV-REP-G-2A-M(SI=l. 804士0. 175)和 pJEV-REP-G-2A-M_IRES (SI=L 853士0. 254)免疫组的 SI 明显高于 pJEV-REP-IRES (SI=1. 155士0. 037)空载体免疫组(ρ<0· 01) ； DNA 疫苗组(pCAGGS-GM) SI指数(SI=1. 54士0. 10)也明显高于PBS对照组(ρ<0· 01)，但是增殖水平低于其它两组复制子疫苗组。
权利要求
1.一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗，其特征在于将蓝耳病的结构基因GP5与M蛋白插入到基于DNA水平的JEV复制子(pJEV-REP)中，包括CMV启动子、5’ UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信号肽、所有非结构蛋白编码区、3’UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白编码区、FMDV-2A的序列和M蛋白编码区。
2.权利要求1所述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的构建方法，其特征在于包括如下步骤设计引物，其序列如SEQ ID NO: 1918所示，扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在两个基因中间插入FMDV-2A的序列，从而得到G-2A-M片段，最后通过SpeI和MlI两个酶切位点克隆到JpJEV-REP ；另外， 为了使M蛋白能够产生真实的N末端，G-2A-M片段的下游插入了 IRES序列(G-2A-M-IRES)， 最后利用MlI-HF和SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗。
3.权利要求1或2所述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗在制备生物制品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用。本发明是通过引物扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在两个基因中间插入FMDV-2A的序列，从而得到G-2A-M片段，最后通过SpeI和SalI两个酶切位点克隆到JpJEV-REP；另外，为了使M蛋白能够产生真实的N末端，G-2A-M片段的下游插入了IRES序列(G-2A-M-IRES)，最后利用SalI-HF和SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗。
文档编号A61K39/12GK102247606SQ201110135690
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者亓文宝, 廖明, 李红梅, 臧富玉, 陈孝明 申请人:华南农业大学