靶向型pten基因复合物及其制备方法和应用的制作方法

文档序号:863615阅读:141来源:国知局
专利名称:靶向型pten基因复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,涉及一种靶向型复合物,特别涉及一种靶向型 PTEN基因复合物,还涉及该复合物的制备方法及其在制药领域的应用。
背景技术
神经胶质瘤是威胁人类健康的重要疾病,其治疗方法的研究一直是医学和生命科学研究的重点。肿瘤的生物治疗已被世界医学界公认为是继手术、放射治疗和化学治疗之后的第四大治疗方法,其中基因治疗更是目前肿瘤生物治疗中最活跃的研究领域之一。基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞,使靶细胞表达此基因而获得特定的功能,继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用,从而达到治疗之目的。癌基因激活和抑癌基因失活是目前公认的肿瘤发生的重要分子机制。已发现多种抑癌基因的缺失或突变与神经胶质瘤的发生和发展密切相关。PTEN基因是1997年发现的一种与人类多种肿瘤的恶性增殖与转移密切相关的抑癌基因。该基因定位于人类第10q23 染色体上,具有9个外显子,含有由1212个核苷酸组成的开放阅读框,编码由403个氨基酸组成的蛋白质。有学者检测了 41例原发性胶质母细胞瘤中PTEN基因的表达,结果显示,59% 的标本中存在10q23染色体上PTEN位点的杂合性缺失。也有学者比较了不同病理等级神经胶质瘤中PTEN基因的表达,证实低分化神经胶质瘤中PTEN基因的突变率明显高于高分化神经胶质瘤,提示PTEN基因的突变有可能导致其抑瘤活性的降低。目前研究认为,PTEN蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性,可将磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)转变为PIP2,而PIP3是胰岛素、 表皮生长因子等细胞生长因子的信号传递分子,可通过蛋白激酶B抑制细胞凋亡以及通过其它效应分子刺激细胞增殖,PTEN蛋白可能是通过减少PIP3而最终诱导细胞凋亡。在肿瘤基因治疗中,为了提高杀伤肿瘤细胞的特异性,寻找肿瘤细胞与正常细胞的差异十分重要。其中,以外源性肿瘤特异性启动子调控目的基因的表达是一种重要的技术手段。生存素(Survivin)是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子,具有抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的双重功能。Survivin在正常的终末分化组织中几乎不表达,但在几乎所有恶性肿瘤组织中高表达,并与疾病的进展、预后密切相关。既往研究已经证实,在肺癌、 胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤及黑色素瘤等肿瘤中,Survivin启动子都具有较强的调控能力,表明Survivin启动子是一个广谱的肿瘤特异性启动子。HIV-I的反式激活蛋白Tat能主动穿过细胞膜进入细胞内部,并且,Tat能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA等以浓度依赖的方式高效、快速地导入细胞内,而细胞的正常结构和功能不受影响。由于Tat蛋白具有这种穿膜活性,使得目的分子能被简单高效地引入细胞。血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)是促进内皮细胞生长作用最强、特异性最高的一种因子。大量研究表明,VEGF在促进新生血管生成,特别是在促进神经胶质瘤生长及转移中起着重要作用。神经胶质瘤组织中VEGF的表达水平与肿瘤的血管化程度、恶性程度呈正相关;VEGF阳性表达与患者的生存时间具有显著的相关性。文献报道,噬菌体12肽VASAVFYSALVE (又称为VEGF受体结合抑制肽)呈剂量依赖性竞争抑制VEGF诱导的内皮细胞生长,其可能模拟了 VEGF的空间结构表位而与其受体位点结合,从而阻断了 VEGF与其受体KDR的作用。但迄今为止,国内外尚未见涉及PTEN基因、Survivin启动子、穿膜肽Tat49_57及上述VEGF受体结合抑制肽的复合物的相关报道。

发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种靶向型PTEN基因复合物,通过肿瘤特异性启动子控制PTEN基因的表达,使PTEN基因能选择性地表达于肿瘤细胞中,从而准确杀伤肿瘤细胞,尽量减少正常组织的损伤。为达到上述目的,本发明提供如下技术方案
靶向型PTEN基因复合物,由穿膜肽Tat49-57和VEGF受体结合抑制肽的融合肽与PTEN 基因重组真核表达载体复合而成,所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示,所述PTEN 基因重组真核表达载体由Survivin启动子调控PTEN基因的表达。进一步,所述PTEN基因重组真核表达载体为pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0本发明的目的之二在于提供一种所述靶向型PTEN基因复合物的制备方法。为达到上述目的,本发明提供如下技术方案
靶向型PTEN基因复合物的制备方法,将穿膜肽Tat49-57和VEGF受体结合抑制肽的融合肽溶液滴入处于混旋状态的PTEN基因重组真核表达载体的PBS溶液中,融合肽与PTEN 基因重组真核表达载体的质量比为2 1,滴加完毕后,继续混旋15 45分钟,再静置15 45分钟,即制得靶向型PTEN基因复合物。进一步,所述PTEN基因重组真核表达载体的构建方法为
a.以人神经胶质瘤U251细胞的基因组DNA为模板,采用核苷酸序列分别如SEQID No. 2和SEQ ID No. 3所示的上下游引物PCR扩增Survivin启动子片段,再将其与pGEM-T 载体连接,获得重组质粒pGEM-T/SurvivinP ;
b.将人神经胶质瘤U251细胞总RNA逆转录为总cDNA,再以总cDNA为模板,采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的上下游引物PCR扩增PTEN基因,再将其与pMD18-T载体连接,获得重组质粒pMD18-T/PTEN ;自重组质粒pMD18_T/PTEN中用 Hind III和BamH I双酶切出PTEN基因,与同样经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体 pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA连接酶的作用下连接,获得重组质粒pcDNA3. I-PTEN ;
c.自步骤a所得重组质粒pGEM-T/SurvivinP中用XhoI和Nco I双酶切出Survivin 启动子片段,与同样经Xho I和Nco I双酶切的步骤b所得重组质粒pcDNA3. I-PTEN在T4 DNA连接酶的作用下连接,即获得PTEN基因重组表达载体pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0本发明的目的之三在于提供所述靶向型PTEN基因复合物在制药领域的应用。为达到上述目的,本发明提供如下技术方案
靶向型PTEN基因复合物在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用。本发明的有益效果在于本发明的靶向型PTEN基因复合物通过穿膜肽的穿膜特性,可以有效地携带PTEN基因重组真核表达载体进入细胞;通过VEGF受体结合抑制肽的功能活性,可以有效抑制VEGF诱导的肿瘤血管内皮细胞生长,同时,由于神经胶质瘤细胞表面高表达受体KDR,因此,通过VEGF受体结合抑制肽与受体KDR的结合,可以使PTEN基因重组真核表达载体更多地靶向神经胶质瘤细胞;通过Survivin启动子控制PTEN基因的表达, 可以使PTEN基因选择性地表达于肿瘤细胞中,从而准确杀伤肿瘤细胞,尽量减少正常组织的损伤。体内外研究结果显示,本发明的靶向型PTEN基因复合物能够有效地靶向神经胶质瘤细胞,特异地诱导细胞凋亡并抑制细胞克隆,有效地抑制神经胶质瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。因此,本发明的靶向型PTEN基因复合物可用于制备抗神经胶质瘤的药物,在神经胶质瘤的基因治疗领域有着良好的开发应用前景。


图1为Survivin启动子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2为PTEN基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图3为靶向型PTEN基因复合物的透射电镜分析。图4为感染靶向型PTEN基因复合物的神经胶质瘤细胞与正常组织细胞的凋亡率比较。图5为感染靶向型PTEN基因复合物的神经胶质瘤细胞与正常组织细胞的克隆形成率比较。图6为给予靶向型PTEN基因复合物的荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线。图7为给予靶向型PTEN基因复合物的荷瘤裸鼠的平均生存率。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件, 例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、靶向型PTEN基因复合物的制备
一、穿膜肽与VEGF受体结合抑制肽的融合肽的合成
穿膜肽Tat49-57与VEGF受体结合抑制肽的融合肽由Tat49_57 (RKKRRQRRR)的羧基端与VEGF受体结合抑制肽(VASAVFYSALVE)的氨基端直接连接而成,氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。融合肽的合成在AB-431A型多肽合成仪上进行。采用标准9_芴甲氧羰基(Fmoc) 方案,以0. 125mmol的对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂为起始树脂,按照融合肽的氨基酸序列使肽链从C-端逐个向N-端延伸;各种保护氨基酸的用量为0. 5mmol,偶联前用 1-羟基苯并三唑(HOBt)和N,N' - 二环己基碳二亚胺(Dcc)活化保护氨基酸的羧基,偶联后用体积分数为20%的六氢吡啶的N,N- 二甲基甲酰胺溶液去除氨基酸的Fmoc保护基。肽链合成完毕后,将含有肽链的树脂转移至冰浴条件下的切割液A/C混合液中(切割液A由结晶苯酚0. 75g、EDT 0. 25mL、苯甲硫醚0. 5mL、三氟乙酸IOml和去离子水0. 5mL组成;切割液 C由EDT 0. 5mL、三氟乙酸IOml和去离子水0. 5mL组成),待平衡至室温后,搅拌反应2小时使肽链从树脂上裂解下来同时去除各种侧链保护基;反应液用G4玻砂漏斗过滤去除树脂, 收集滤液,室温下低压蒸馏至体积广2ml,加入冰冷乙醚50ml沉淀多肽,4°C放置过夜,用G6玻砂漏斗过滤,得粗肽产物,-20°C保存备用;将粗肽产物用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度为20mg/ml的溶液,用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜过滤后,在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪上用SOURCE凝胶柱进行纯化,流动相A为体积分数为10%的乙醇+质量体积分数为0. 1%的三氟乙酸,流动相B为体积分数为90%的乙醇+质量体积分数为0. 1%的三氟乙酸,二元线性梯度洗脱,先用100%的流动相A平衡1. 5个柱体积,然后将流动相B在8个柱体积内由体积分数为0线性上升至80%,最后将流动相B在0. 5个柱体积内由体积分数为 80%线性上升至100%,在主峰处收集多肽洗脱液,用Delta 600型高压液相色谱仪鉴定多肽纯度,用API2000 LC/MS型电喷雾粒子化质谱仪测定多肽分子量,最后冷冻干燥,得融合肽纯品,用DMSO溶解,-20°C保存备用。二、Survivin启动子调控的PTEN基因重组真核表达载体的构建 1、Survivin启动子的克隆
采用基因组DNA提取试剂盒提取人神经胶质瘤U251细胞的基因组DNA, 按照试剂盒说明书操作。以所得细胞基因组DNA为模板,采用上游引物Fl 5‘-gcctcgagctggccatagaacca- gagaagtga-3,(SEQ ID No. 2,下划线部分为 Xho I 酶切位点)禾口下妨学弓丨物 Rl :5,-gcccatgg- ccacctctgccaacgggtcccgcg-3,(SEQ ID No. 3,下戈丨」线部分为Nco I酶切位点)PCR扩增Survivin启动子片段(GenBank登录号为U75285)。PCR 循环条件参数为94°C预变性3分钟,然后94°C变性1分钟、58°C退火1分钟、72°C延伸1. 5 分钟,共30个循环,最后72°C延伸7分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后,与PGEM-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,将阳性克隆质粒命名为 pGEM-T/SurvivinP。2、PTEN基因的克隆
采用Trizol试剂提取人神经胶质瘤U251细胞总RNA,按照试剂说明书操作。将所得细胞总RNA逆转录为总cDNA,再以总cDNA为模板,采用上游引物F2 5' -gggaagcttatgacagcca tcatcaaaga-3,(SEQ ID No. 4,下划线部分为 Hind III酶切位点)和下游引物 R2 5 -atRRRatcctcaRacttttRtaatttRtR-3 (SEQ ID No. 5,下划线部分为 BamH I酶切位点)PCR扩增PTEN基因(GenBank登录号为NM_000314)。PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟,然后94°C变性30秒、65°C退火1分钟,72°C延伸1分钟,共30个循环,最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后,与PMD18-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞,用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,将阳性克隆质粒命名为pMDIS-T/PTEN。自阳性克隆质粒pMD18-T/PTEN中用HindΠI和BamH I双酶切出PTEN基因,与同样经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA连接酶的作用下连接, 连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞,用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆,抽提质粒,Hind III和BamH I双酶切鉴定及测序鉴定,将阳性克隆质粒命名为pcDNA3. I-PTEN03、Survivin启动子调控的PTEN基因重组真核表达载体的构建
自阳性克隆质粒pGEM-T/SurvivinP中用Xho I和Nco I双酶切出Survivin启动子片段,与同样经Xho I和Nco I双酶切的阳性克隆质粒pcDNA3. I-PTEN在T4 DNA连接酶的作用下连接,连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞,用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆,抽提质粒,Xho I和Nco I双酶切鉴定,将阳性克隆质粒命名为 pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN,即得Survivin启动子调控的PTEN基因重组真核表达载体。三、靶向型PTEN基因复合物的制备
将浓度为ΙΟΟΟμ g/ml的融合肽溶液100 μ 1以5 μ 1/min的速度滴入处于混旋状态的浓度为500 μ g/ml的重组表达载体pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN的PBS溶液100 μ 1中,滴加完毕后,继续混旋30分钟,再静置30分钟,即制得靶向型PTEN基因复合物。将新鲜制备的上述复合物滴于200目铜网上,吸附3分钟,吸水纸吸干,晾干30秒,以质量体积分数为1% 的水溶性醋酸铀负染30秒,吸水纸吸干,晾干30秒,用SOkV透射电镜观察,结果显示,所得靶向型PTEN基因复合物呈大小均一的近圆形颗粒,绝大多数颗粒的长径小于50nm (图3)。实施例2、靶向型PTEN基因复合物的抗神经胶质瘤作用检测一、体外抗神经胶质瘤作用
1、细胞凋亡率检测
分别将人神经胶质瘤U251细胞和美洲绿猴肾C0S-7细胞接种于6孔板,培养24小时后,以500 μ 1靶向型PTEN基因复合物感染细胞,同时设置相应对照组(用PBS替代靶向型PTEN基因复合物),感染3天后收集细胞,用PBS洗涤并调整细胞浓度为1 X IO5个/ml, 加入浓度为250 μ g/ml的异硫氰酸荧光素标记磷脂结合蛋白V (Annexin V) 5μ 1和浓度为250 μ g/ml的碘化丙啶(PI) 5 μ 1,冰浴避光孵育10分钟,用PBS洗涤细胞,再用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况=Armexin V和PI均低染的细胞为正常活细胞; Annexin V高染而PI低染的细胞为凋亡细胞,Annexin V和PI均高染的细胞为坏死细胞。 结果见图4,感染靶向型PTEN基因复合物或PBS的人神经胶质瘤细胞U251的凋亡率分别为 (34士5)%和(8士2)%,而感染靶向型PTEN基因复合物或PBS的正常组织细胞C0S-7的凋亡率分别为(7士 1)%和(6士 1)%,表明本发明的靶向型PTEN基因复合物能够有效并且特异地诱导神经胶质瘤细胞的凋亡。2、细胞克隆形成率检测
分别将人神经胶质瘤U251细胞和美洲绿猴肾C0S-7细胞各200个接种于6孔板,培养 24小时后,以500 μ 1靶向型PTEN基因复合物感染细胞,同时设置相应对照组(用PBS替代靶向型PTEN基因复合物),感染2周至细胞集落形成后,行吉姆萨染色,镜下计数大于50个细胞的集落,计算细胞克隆形成率细胞克隆形成率=克隆数/接种细胞数X 100%。结果见图5,感染靶向型PTEN基因复合物或PBS的人神经胶质瘤细胞U251的克隆形成率分别为 (8士 1. 2)%和(76士 10)%,而感染靶向型PTEN基因复合物或PBS的正常组织细胞C0S-7的克隆形成率分别为(73士 12)%和(72士 11)%,表明本发明的靶向型PTEN基因复合物能够有效并且特异地抑制神经胶质瘤细胞的克隆。二、体内抗神经胶质瘤作用
将IX IO5个人神经胶质瘤U251细胞接种于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠,将荷瘤裸鼠随机分为两组对照组和实验组,对照组尾静脉注射PBS,实验组尾静脉注射500μ 1靶向型PTEN 基因复合物,观察60天内两组小鼠的生存率和肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。两组小鼠的肿瘤生长曲线见图6,第30天时对照组小鼠肿瘤体积达到2600mm3,而实验组小鼠肿瘤生长缓慢,肿瘤体积仅为700mm3。两组小鼠的平均生存率见图7,对照组小鼠于35天内全部死亡,而实验组小鼠60天的生存率为50%。表明本发明的靶向型PTEN基因复合物能够有效抑制神经胶质瘤的生长,同时能够延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.靶向型PTEN基因复合物,其特征在于由穿膜肽Tat49-57和VEGF受体结合抑制肽的融合肽与PTEN基因重组真核表达载体复合而成,所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示,所述PTEN基因重组真核表达载体由Survivin启动子调控PTEN基因的表达。
2.根据权利要求1所述的靶向型PTEN基因复合物,其特征在于所述PTEN基因重组真核表达载体为 pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0
3.权利要求1所述靶向型PTEN基因复合物的制备方法,其特征在于将穿膜肽 Tat49-57和VEGF受体结合抑制肽的融合肽溶液滴入处于混旋状态的PTEN基因重组真核表达载体的PBS溶液中,融合肽与PTEN基因重组真核表达载体的质量比为2:1,滴加完毕后, 继续混旋15 45分钟,再静置15 45分钟,即制得靶向型PTEN基因复合物。
4.根据权利要求3所述的靶向型PTEN基因复合物的制备方法,其特征在于所述PTEN 基因重组真核表达载体的构建方法为a.以人神经胶质瘤U251细胞的基因组DNA为模板,采用核苷酸序列分别如SEQID No. 2和SEQ ID No. 3所示的上、下游引物PCR扩增Survivin启动子片段,再将其与pGEM_T 载体连接,获得重组质粒pGEM-T/SurvivinP ;b.将人神经胶质瘤U251细胞总RNA逆转录为总cDNA,再以总cDNA为模板,采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的上、下游引物PCR扩增PTEN基因,再将其与pMD18-T载体连接,获得重组质粒pMD18-T/PTEN ;自重组质粒pMD18_T/PTEN中用 Hind III和BamH I双酶切出PTEN基因,与同样经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体 pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA连接酶的作用下连接,获得重组质粒pcDNA3. I-PTEN ;c.自步骤a所得重组质粒pGEM-T/SurvivinP中用XhoI和Nco I双酶切出Survivin 启动子片段,与同样经Xho I和Nco I双酶切的步骤b所得重组质粒pcDNA3. I-PTEN在T4 DNA连接酶的作用下连接,即获得PTEN基因重组表达载体pcDNA3. I-SurvivinP-PTEN0
5.权利要求1所述的靶向型PTEN基因复合物在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种靶向型PTEN基因复合物及其制备方法和应用,该复合物由穿膜肽Tat49-57和VEGF受体结合抑制肽的融合肽与PTEN基因重组真核表达载体复合而成,融合肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示,PTEN基因重组真核表达载体由Survivin启动子调控PTEN基因的表达;其制备方法是按质量比为2:1将融合肽溶液滴入处于混旋状态的PTEN基因重组真核表达载体的PBS溶液中,混旋,静置,即得;本发明复合物能够有效地靶向神经胶质瘤细胞,特异地诱导细胞凋亡并抑制细胞克隆,有效地抑制神经胶质瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率,可用于制备抗神经胶质瘤的药物。
文档编号A61K38/10GK102241777SQ20111014589
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者杨卫忠, 王如密, 王守森, 石松生, 袁邦青, 赵琳, 郑兆聪, 陈宏颉, 高进喜 申请人:中国人民解放军南京军区福州总医院
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