专利名称：咖啡酸用于制备抑制白细胞Src的活化的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及咖啡酸的新用途，具体涉及咖啡酸用于制备抑制白细胞Src的活化的药物中的应用。
背景技术：
咖啡酸(Caffeic acid,以下均用CA表示)可以从市场上买到，它存在于很多种中药材中，如丹参、咖啡菊科植物等，具有具有显著的抗氧化、抗炎、抗菌抗病毒、抗蛇毒等作用，且毒性小，小鼠腹腔注射LD50为1583mg/kg ;家兔静脉注射14mg/kg/天,连续十天,其心、肝、肾功能及解剖镜检均未见病理变化。体外研究证明CA能够抑制过氧化氢引起的HUVECs的凋亡，可调节NF- κ Β、Ρ53和Bcl-2蛋白的表达；能够抑制oxLDL诱导的人内皮细胞的氧化损伤；可抑制TNF-α诱导的单核细胞U973在HUVECs上的粘附，该作用与CA抑制内皮表面的E-selectin和ICAM-1的表达，抑制MCP-1和IL-8的产生有关。但是，关于CA能否抑制HHcy诱导的小鼠软脑膜细静脉内白细胞的滚动和粘附，特别是对白细胞粘附分子表达的影响及其机制尚不清楚。脑血管疾病是全世界最重要的致死性和致残性疾病之一。近年来的研究发现炎症是脑血管病发病的中心环节之一。白细胞与脑细静脉内皮细胞的粘附是脑血管炎症的始动因素，血管内皮细胞和白细胞粘附分子的表达是其粘附关键环节，调控血管内皮细胞和白细胞粘附分子的表达，抑制白细胞与脑血管内皮细胞的粘附可能成为治疗脑血管疾病的新靶点。高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocystinemia, HHcy)是动脉粥样硬化、心血管疾病和脑血管疾病的独立危 险因素之一。Hcy是体内蛋氨酸代谢过程中脱甲基生成的一种含巯基的氨基酸，在结构上与 半胱氨酸、蛋氨酸相似。Hcy主要通过再甲基化途径、转硫途径、释放到细胞外液等三个途径进行代谢。B族维生素叶酸和维生素B6、B12等与Hcy代谢有关的酶或辅助因子的缺乏，会影响Hcy的代谢，导致HHcy。Hcy在体内多以二硫化物氧化形式存在，包括双硫同型半胱氨酸、混合同型半胱氨酸-半胱氨酸，以及混合同型半胱氨酸二硫化物等，其中与血浆白蛋白结合的Hcy最多，约占70-80 %，只有约I %的Hcy是以还原形式存在的。不同形式的Hcy总称为总同型半胱氨酸，目前测定的都是机体内总同型半胱氨酸水平。在人体内，正常的血浆Hcy浓度是5-15 μ Μ，如果血浆内Hcy浓度超过15 μ Μ，通常被认为是HHcy[10]。按照Hcy血浆浓度的不同，可分为轻度(16_30μΜ)，中度(30-100 μ Μ)和重度(大于100 μ Μ)HHcy。亚洲人HHcy的发病率明显高于欧洲人。在我国主要大城市中，由于食品的过度精细加工，造成B族维生素流失，Hcy代谢受阻，HHcy的发病率显著增加。在临床上,通常采用补充folate/Vitamin B6/Vitamin B12而降低HHcy病人的血中Hcy水平，但是这种治疗方案对Hcy已经诱发的炎症反应是否有抑制作用尚存争议。同型半胱氨酸(以下均用Hcy表示)是一种致炎因素。以往的研究已经证明Hcy可诱导单核/巨曬细胞分泌单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和白介素-8(interleukin-8，IL_8)，从而导致血管壁炎症反应，加速动脉粥样硬化的发生；Hcy可诱导T淋巴细胞分泌干扰素-Y (Interferon-gamma, IFN- y )、IL-2、肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-alpha, TNF- α )和 IL-10。另有文献证明 Hcy 可影响白细胞的粘附分子CDllb/CD18的表达，引起白细胞的滚动和粘附；Hcy在体外诱导的中性粒细胞与人胳静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的粘附可被CD18抗体、CDllb抗体、过氧化氢酶显著抑制；Hcy诱导的肠系膜细静脉中白细胞的滚动、粘附、游出能被一氧化氮供体抑制，且一氧化氮供体能够减少Hcy诱导的回肠P-选择素(P-selectin)及细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule I, ICAM-1)的表达增加；Hcy在体外诱导的单核细胞粘附于人主动脉内皮细胞(human aortic endothelialcells, HAECs)可被血管内皮细胞粘附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)抗体、E-selectin抗体、ICAM-1抗体、环氧酶抑制剂所抑制，环氧酶抑制剂能够抑制Hcy诱导的HAECs上VCAM-1的表达增加。以上研究证明Hcy诱导氧化应激，血管内皮细胞和白细胞的粘附分子表达，引发了白细胞与内皮细胞间的相互反应。
发明内容
本发明最重要的贡献在于提供咖啡酸的新用途，具体涉及咖啡酸用于制备抑制白细胞非受体酪氨酸激酶Src的活化的药物中的应用。所述的咖啡酸是现有技术，可以从市场上买到，也可以根据现有技术制备，符合药用标准即可。优选纯度> 30%，更优选纯度>50%，最优选纯度> 90%。本发明所述制备的药物，是用咖啡酸作为药物活性成分的药物制剂组合物。本发明的药物制剂组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中咖啡酸作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0. 1-99.9%，其余为药物可接受的载体。本发明的药物制剂组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。本发明的药物制剂组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴齐 、贴剂。本发明的中药制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉齐U、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。本发明的中药制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、FDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶，聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性齐IJ、聚乙二醇、环糊精、β -环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。 本发明的制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服1-3次，每次1—20 剂，如1-20袋或粒或片，每剂Img-1000mg。以下通过实验方法证明本发明的有益效果以下为本案中用到的简写在此做集中说明肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor, TNF- α )白介素 _6 (interleukin-6, IL-6)单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)巨卩遼细胞炎性蛋白-1 ct (Macrophage inflammatory protein-1 α ,MIP-1 α )的浓
度白细胞表面P-选凝素糖蛋白配基-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)L-选择素(L-selectin)整合素a L (CDlla)整合素aM(CDllb)整合素3 2(CD18)白细胞非受体酪氨酸激酶Src (src)憐脂酸肌醇3 激酶(phosphoinsitol 3-kinase, PI3K)丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)用股静脉注射Hcy引起的白细胞与微血管粘附的模型，通过研磨法建立脑非创伤性观察窗，探讨CA对HHcy诱导的脑微血管内皮上白细胞的滚动和粘附的影响，进而探讨CA对白细胞表面粘附分子的表达和激活的影响，研究其相关的信号转导机制。以探寻CA对Hcy引起的软脑膜细静脉内白细胞的滚动和粘附有抑制作用与其抑制Src/PI3K/Akt通路介导的白细胞表面整合素⑶I la、⑶I Ib和⑶18的表达和激活的关系。
本发明采用的软脑膜细静脉微血管观察方法是非创伤性的研磨脑骨方法。该方法可以在不影响脑内微环境的条件下，观察脑微循环动态。本研究用该方法首次观察到HHcy可以诱导软脑膜细静脉中白细胞的滚动和粘附。粘附于细静脉的白细胞可以释放过氧化物和蛋白酶，损伤脑血管内皮细胞和血管基底膜，进而，游出于血管外。抑制HHcy诱导的白细胞与脑微血管的粘附，是防治HHcy引发的脑血管损伤的重要治疗策略。以往的研究结果显示Hcy能够诱导单核细胞及淋巴细胞分泌的MCP-1、IL_8、IFN-Y、IL-2、TNF-α和IL-10等细胞因子及趋化因子；可以上调人外周血中各种类型白细胞表面粘附分子⑶11a，⑶Ilb和⑶18的表达。本研究进一步证明了 HHcy可升高血浆中IL-6、TNF_a、MCP_1和ΜΙΡ-1 α的含量，升高粘附分子⑶I la、⑶I Ib和⑶18的表达。CA可以抑制血浆MCP-1的升高，抑制白细胞表面粘附分子⑶11a，⑶Ilb和⑶18的表达，而对其它细胞因子及趋化因子没有显著的影响。该结果提示CA抑制HHcy诱导的脑细静脉白细胞粘附的作用与其抑制白细胞粘附分子表达和趋化相关。白细胞表面PSGL-1和L-selectin是诱导白细胞滚动的因素。在体研究结果证实HHcy可以在注射45分钟后诱导的脑细静脉内白细胞的滚动，而体外实验的结果却提示HHcy可以降低白细胞PSGL-1和L-selectin的表达，由于，白细胞PSGL-1和L-selectin的表达是先升高，后降低的过程，本研究的结果可能与取样时间有关。本发明的结果是证实了 Hcy可以引起白细胞粘附分子⑶18的磷酸化，CA可以抑制⑶18的磷酸化。属于β 2整合素的⑶18细胞内C末端的丝氨酸和苏氨酸位点的磷酸化是细胞黏附所必要条 件。以往的研究多集中于白细胞粘附分子CD18表达方面。本研究不但证明了 Hcy可以引起白细胞粘附分子CD18的表达，还可以引起白细胞粘附分子CD18的磷酸化。进而，发现了 CA可以抑制白细胞粘附分子⑶18表达和⑶18 Ser745位点磷酸化。本发明的重要贡献是发现了 Src/PI3K/Akt信号通路参与了 Hcy体外诱导的白细胞粘附分子CD18的表达和磷酸化。以往的研究已经知道PI3K与整合素的激活相关，而且Src-family tyrosine kinases在白细胞内多种信号通路的激活起到重要作用。Srckinase介导了 Hcy与胶原诱导的人血小板的聚集，Hcy诱导的人血管平滑肌细胞的增殖也与PI3K/Akt途径的激活相关。我们首次证明了 Src/PI3K/Akt信号通路参与了 Hcy诱导的白细胞粘附分子⑶18的，Hcy可以体外诱导Src Y416和Akt S473的磷酸化，促进p85的膜转位。CA可以抑制Hcy体外诱导Src Y416和Akt S473的磷酸化以及p85的膜转位，进而，抑制白细胞粘附分子⑶18的表达。本研究结果揭示CA抑制Src/PI3K/Akt通路的激活是其发挥抑制Hcy诱导的白细胞粘附分子CD18的表达，抑制Hcy诱导的脑细静脉内白细胞粘附的作用机理。总之，本发明证明了 CA可以抑制HHcy诱导的软脑膜细静脉白细胞的滚动和粘附，该作用与CA抑制HHcy诱导的血浆中MCP-1含量的升高，抑制白细胞粘附分子CDllb/CD18的表达，CD18的磷酸化相关。CA抑制HHcy诱导的白细胞粘附分子CD18的表达的作用与其抑制了 Src的活化，进而抑制了 PI3K/Akt信号通路。本发明揭示了咖啡酸即丹参主要成分，可以用于抑制白细胞非受体酪氨酸激酶Src的活化的药物中的应用，特别是用于抑制HHcy诱导的脑细静脉内白细胞粘附的药物中的应用，还对丹参以及含咖啡酸的其他药物对于防治HHcy相关的脑血管病提供了重要的依据。
图1咖啡酸的化学结构式图2同型半胱氨酸代谢途径图3对照组、CA组、Hcy组和Hcy+CA组小鼠软脑膜细静脉内粘附的白细胞数的经时变化图4HHcy和CA注射30分钟时，各组血浆中趋化因子和炎症因子的含量图5各组小鼠脑皮层组织中微血管内皮E-selectin免疫组化染色的图象图6各组小鼠脑皮层组织中微血管内皮ICAM-1免疫组化染色的图象图 7CA 对 HHcy 体外诱导的白细胞表面 PSGL-1、L-selectin, CDlla、CDllb、CD18平均突光强度(mean fluorescence intensity, MFI)的图不图8CA对HHcy体外诱导的白细胞粘附分子⑶18磷酸化的图示图9HHcy体外诱导的白细胞Src/PI3K/Akt通路活化与诱导白细胞表面粘附分子⑶11/⑶18的表达和憐酸化的关系的图不图1OHcy体外诱导白细胞Src磷酸化的经时变化的Western blot分析结果
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。试验例材料与方法一、主要仪器今正置荧光显微镜BX51WI，Olympus,日本今超敏感摄像机USS_301，UNIQ，美国今图像合成器SP_460color quad processor, SUNSPO,日本今视频分配器VDA-106, Olympus,日本今监视器J2118A，TCL，中国今时间视频显示器VTG_55B，FOR-A,日本今DVD 刻录机DVR_R25，Malata,中国今体视显微镜SZ_40, Olympus,日本今便携式牙科钻STR0NG_90，SAESHIN，韩国今冷光源SJ8038HA2，SANJUN，中国今加热毯ME04008, FHC BowDOINHAM，美国今小动物呼吸机:ALC_V8，上海奥利特生物科技有限公司，中国今微量注射泵ALC_IP，上海奥利特生物科技有限公司，中国今全自动切片机RM2255，LEICA，德国今恒温水浴服·SYl1-Kl，北京市长风仪器仪表公司，中国今离心机centrifuge 5471R, EPPEND0RF,中国今细胞培养板及培养瓶Coring，美国
+洁净工作台北京半导体仪器设备厂今C02细胞孵育箱Precision,美国今分析天平Sartorius AG,德国今pH 计Beckman,美国今微量高速离心机Heraeus,美国今高速离心机Beckman,美国今电热鼓风干燥箱重庆实验设备厂今细胞计数器Medonic,美国
今-40 V低温冰箱SANYO，日本今-70 V低温冰箱SANYO，日本今电泳仪北京六一仪器厂今蛋白质电泳及转膜系统Bio_Rad,美国
今倒置显微镜01ympus,日本+激光共聚焦显微镜Bio-rad,美国今显微成像系统冷泉港，美国今酶标仪Bio-Rad，美国今流式细胞仪FACS Calibur, BD，美国二、主要试剂今咖啡酸风山渐药业，昆明，中国今D. L-Hcy, Su6656, PP2, LY294002, TEMED, PMSF, Pepstatin A，罗丹明6G (Rhodamine-6G) Sigma-Aldrich,美国令RMP1640培养基，胎牛血清(FBS) :Hyclone，美国今BCA蛋白定量试剂盒Pierce,美国今Aprotinin :Gibcol,美国今细胞裂解液，5X白凝胶上样缓冲液普利莱，北京，中国令二巯基乙醇(β-ΜΕ) :Merk，德国今牛血清白蛋白(BSA):华美生物，北京，中国今脱脂奶粉Meijer，美国今核蛋白提取试剂盒NE，美国今PVDF 膜Zerbrechlich-Fragile,德国今硝酸纤维素膜Pall，美国今兔抗p-Src抗体,兔抗Src抗体,兔抗ρ-Akt抗体,兔抗Akt抗体,兔抗p85抗体，兔抗 β-actin 抗体，兔抗 β-tublin 抗体Cell Signaling Technology,美国今兔抗Q)18抗体Abcam,美国今FITC标记的抗小鼠⑶Ila单克隆抗体，同型对照FITC标记的小鼠IgAκ，FITC标记的抗小鼠⑶Ilb单克隆抗体，同型对照FITC标记的小鼠IgA κ，PE标记的抗小鼠⑶18单克隆抗体，同型对照PE标记的小鼠IgGl κ，FITC标记的抗小鼠L-selectin单克隆抗体，同型对照FITC标记的小鼠IgG2a κ，PE标记的抗小鼠PSGL-1单克隆抗体，同型对照PE标记的小鼠IgG2a κ
Biosciences Pharmingen,美国今DyLightTM 488 标记的羊抗兔 IgG (H+L) :KPL, Gaithersburg, MD,美国今溶血素(IOX):利文公司，北京，中国今乌拉坦天莲精细化工有限公司，上海，中国今山羊免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，PBS粉末，EDTA抗原修复缓冲液粉末中杉金桥生物技术有限公司，北京，中国今山羊抗小鼠E-selectin 和 ICAM-1 抗体Santa Cruz Biotechnology,美国今其他普通化学试剂均为分析纯试剂，购自中国化学药品公司三、试剂配制今乌拉坦 生理盐水配制成20%溶液，常温保存。今咖啡酸储存液用无水乙醇配成20mg/kg，使用前以生理盐水稀释，小鼠按按10mg/kg使用，新鲜配制。今罗丹明6G (Rhodamine_6G):生理盐水配制成0. 5mg/ml溶液,4°C保存。今PBS粉剂使用前每包加入蒸馏水定容至2L，充分溶解后分装。今EDTA抗原修复缓冲液(50X):使用前蒸馏水稀释。今DAB显色试剂盒(20X)使用前三蒸水稀释。今Mayer’s苏木素配制将Ig苏木素溶于蒸馏水内(需要时刻微热)，加入研细的硫酸铝钾50g，加热搅拌，溶解后依次加入0. 2g碘酸钠，Ig柠檬酸和50g今水合氯醛,充分搅拌溶解后室温保存,使用前过滤。今溶血素(10X):实验前用三蒸水稀释至IX,室温保存备用。今红细胞裂解液150mMNH4C1, IOmM NaHC03, ImM EDTA。今1.5mol/L Tris Cl (H8. 8) Tris 18. 16g，去离子水定容至 100ml，以 HCl 调 pH 值
至 8. 8。今L0mol/L Tris Cl (pH6. 8) Tris 12.1lg，去离子水定容至 100ml，以 HCl 调 pH
值至6. 8。10% SDS SDS 10g，去离子水定容至 100ml。今10%过硫酸铵过硫酸铵lg，加去离子水至10ml，分装后_20°C保存。今Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 25mmol/L,甘氨酸 250mmol/L, SDS 0.1%。今电转移缓冲液甲醇150ml, Tris 3. 03g，甘氨酸14. 4g，SDS 0. 37g，去离子水定容至 1000ml。今Tris 缓冲液(TBS) Tris 6. 057g, NaCl 8. 775g,以 HCl 调 pH 值 7. 6。今TBST TBS 1000ml，吐温-20 0. 5ml。+封闭液TBST 100ml，脱脂奶粉5g。今洗膜缓冲液=Tris· Cl (pH6. 8)62. 5mmol/L, β -ME IOOmmoI/L, SDS 2%0四、动物C57BL/6J小鼠，雄性，体重18_22g，购自北京大学医学部动物部。自由进食饮水，饲养条件为温度22°C，相对湿度40%，12小时切换照明。一切饲养及实验皆依照北京大学医学部实验动物处理规定进行(许可证号SYXK (京)2006-0008)。五、小鼠软脑膜细静脉内白细胞滚动及粘附情况的测定
小鼠脑微循环观察模型取C57BL/6J小鼠，用20% (w/v)乌拉坦按2. Og/kg. bw的剂量肌肉注射麻醉。游离股静脉，插入PE-10聚乙烯导管并留置。将小鼠以俯卧位置于固定板上，固定头部后剪开头部皮肤暴露整个左侧顶骨，剥离表面筋膜后置于体视显微镜下，用手提式牙科钻沿顶骨表面均匀研磨至清晰可见软脑膜上3级静脉，间歇滴加37°C生理盐水保持顶骨表面湿润，并避免研磨导致的局部温度升高。将小鼠静置30分钟后置于正置显微镜下观察。选择直径30-50 μ m、200 μ m无明显弯曲的软脑膜微静脉作为观察对象，按后述的方法静脉推注罗丹明6G 10分钟后，进行10分钟基础观察，确认观察的细静脉内滚动白细胞少于5个/30秒，没有粘附白细胞者进行后续研究。动物分组符合上述观察条件的动物随机分为4组。对照组静脉缓慢注射生理盐水，20ml/kg. bw ；CA组静脉缓慢注射CA,按照10mg/kg体重的剂量给药,20ml/kg. bw ；Hcy组静脉缓慢注射Hcy,按照O. lmg/g体重的剂量给药,20ml/kg. bw ；Hcy+CA 组先静脉缓慢注射 Hcy(0. lmg/g 体重),10ml/kg. bw ;随即注射 CA(10mg/kg 体重)，10ml/kg. bw。所有液体在一分钟内缓慢注射完毕。细静脉内白细胞滚 动及粘附数的计数C57BL/6J小鼠于基础观察前10分钟，按1. 5mg/kg. bw的投予量，经股静脉缓慢推注与白细胞和血小板特异性结合的荧光探针罗丹明6G (激发波长543nm)。用连接于正立荧光显微镜的超敏感摄像机观察并记录。将沿细静脉血管壁滚动和粘附于细静脉血管壁少于30秒的白细胞记为滚动白细胞，用滚动白细胞/30秒表示。将停留于细静脉血管同一位置超过30秒的白细胞记为粘附白细胞，用粘附白细胞数/200 μ m细静脉表示。记录并分析静脉注射Hcy前(O)、注射Hcy后10、30、45、60和90分钟等时间点，同一细静脉内滚动和粘附白细胞数量。六、血浆Hcy水平的检测另取小鼠，每组3只，在注射Hcy30分钟时，麻醉，摘除眼球取血，加肝素抗凝(50unit/ml全血),3500rpm, 4°C, IOmin离心取上层血衆,用ELESA法检测血衆Hcy水平。七、流式细胞计数仪微球分析法测定血浆趋化因子和炎症因子浓度另取小鼠，每组6只，注射Hcy和/或CA 30分钟后，麻醉，摘除眼球取血，加肝素抗凝(50unit/ml全血)，离心取血浆。取50 μ I血浆或标准品中加入50 μ I捕获微球，室温避光孵育I小时。加入50 μ I巯基化藻红蛋白(phycoerthrin PE)标记的TNF-α、IL-6、MCP-1和MIP-1a抗体，室温避光孵育2小时，形成“三明治”夹心复合物。用流式细胞仪(FACS Calibur, B. D. Co, USA)检测平均荧光强度，同时使用标准样品测定浓度-荧光强度曲线，用BD Cytometric Bead Array分析软件进行结果处理,计算血衆细胞因子浓度,用pg/mL表不。八、免疫组化法观察脑微血管内皮粘附分子表达的阳性区域微循环观测结束后，每组取3只小鼠，取脑皮层组织块(5mmX 5mm)，经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片。经梯度脱水，37°C透膜，H2O2和山羊血清封闭。滴加1: 100稀释的 Ε-selectin 和 ICAM-1 —抗(Santa Cruz, California, USA)于湿盒内 4°C过夜。PBS清洗后，加入兔抗羊二抗(中杉公司，中国)，置室温I小时。滴加辣根酶标记的链霉素卵白素工作液，PBS清洗。DAB显色，苏木素复染细胞核，树胶封片。每只动物取4张切片，每张切片在皮质区随机取4个视野(X400倍)，用Image-Pro Plus 5. O软件,计算4个视野内E-selectin或ICAM-1阳性血管数，用阳性血管数/视野表示。九、流式细胞计数仪检测体外全血白细胞粘附分子的表达另取C57BL/6J小鼠，每组6只，麻醉后摘眼球取外周血，加肝素抗凝(20unit/ml全血)，分装到EP管中。为了检测CA对Hcy处理90分钟时白细胞表面粘附分子PSGL-1、L-selectin,CDlla、CDllb和CD18表达的影响，将全血分5组处理Control，Hcy(ImM),Hcy (ImM) +CA (10 μ Μ)，Hcy (ImM) +CA (100 μ Μ)，Hcy (ImM) +CA (400 μ Μ)。Hcy 和 CA 同时加入，处理90分钟。为了检测Src抑制剂Su6656、PP2和PI3K抑制剂LY294002对Hcy处理90分钟时白细胞表面粘附分子PSGL-1、L-selectin、⑶11a、⑶Ilb和⑶18表达的影响，将全血分 5 组处理Control，Hcy(ImM)，Hcy(ImM)+Su6656(20 μ Μ)，Hcy(ImM)+ΡΡ2(20 μ Μ)，Hcy (ImM) +LY294002 (50 μ Μ)。抑制剂预处理10分钟后，加入Hcy处理90分钟。药物处理90分钟后，将I μ g FITC或PE分别进行标记的PSGL-1、L-selectin,CDlla、CDllb 和 CD18 抗体(BD biosciences Pharmingen, USA)分别加入至盛有 50 μ I 抗凝全血的离心管中。溶血素破碎红细胞，PBS洗涤2次。用流式细胞仪根据前向角/侧向角分选粒细胞，计数5000个粒细胞，测定PSGL-1、L-selectin、CDlla、CDllb和CD18抗体的阳性细胞数和平均荧光强度。十、白细胞⑶18磷 酸化的western blot分析和免疫细胞化学观察取正常小鼠外周血，肝素抗凝(50unit/ml全血)。分离白细胞2500rpm离心10分钟，加红细胞裂解液5ml重悬，2000rpm离心10分钟，弃上清。用大于5ml的PBS重悬，IOOOrpm离心10分钟，沉淀细胞用RPMI 1640培养基重悬，按IO6细胞/孔放于24孔板中培养。用western blot检测Hcy (ImM)处理不同时间(10、20、40、60、90分钟)点，白细胞⑶18磷酸化的变化。另取白细胞，在Hcy添加后60分钟后,用western blot分析CA对Hcy (ImM)诱导的白细胞⑶18磷酸化的影响。白细胞分组处理Control,Hcy (ImM) ,Hcy (ImM) +CA(10 μ Μ),Hcy(ImM)+CA(100 μ Μ)，Hcy (ImM)+CA(400 μ Μ)。另取白细胞，用激光共聚焦显微镜观察CA(400 μ Μ)对Hcy (ImM)诱导的白细胞⑶18磷酸化的影响。在Hcy添加后60分钟后，将培养基连同白细胞吸出，3000rpm离心3分钟，弃上清。加ImLPBS重悬白细胞，3000rpm离心3分钟，弃上清。用50 μ I PBS将白细胞重悬，滴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，于37°C 5min内烤干。在_20°C预冷的丙酮中固定10 分钟。用 PBST (0. 3% Triton X-100-PBS)透膜 15 分钟。用 5% BSA-PBST 封闭 10 分钟。滴加一抗P_CD18(1 100)4°C孵育过夜，室温复温30分钟，PBS洗两次。滴加二抗DyLight 488-标记的羊抗兔IgG(l 100)，室温孵育I小时，PBS洗两次。用Hoechst 33342 (50ng/mL)染核5分钟。用甘油-PBS封片，激光共聚焦显微镜(Biorad，Hertfordshire，UK)观察和记录。根据镜下观察到的白细胞形态特征，分别观察和记录中性粒细胞和淋巴细胞的磷酸化。另取白细胞，在Hcy添加后60分钟后,用western blot分析Src抑制剂Su6656、PP2和PI3K抑制剂LY294002对Hcy (ImM)诱导的白细胞⑶18磷酸化的影响。白细胞分组处理Control，Hcy (ImM)，Hcy (ImM)+Su6656 (20 μ M)，Hcy (ImM)+PP2 (20 μ M)，Hcy (ImM)+LY294002(50 μ Μ)。-|--、白细胞 Src/PI3K/Akt 通路激活的 Western blot 分析取白细胞,用western blot分析Hcy (ImM)处理不同时间点(5、10、20、40分钟),白细胞P-Src的变化。另取白细胞，在Hcy添加10分钟后,用western blot分析CA对Hcy (ImM)诱导的白细胞P-Src的影响，并用Src抑制剂Su6656作为阳性对照。白细胞分5组处理Control，Hcy (ImM)，Hcy (ImM) +CA (100 μ Μ)，Hcy (ImM) +CA (400 μ Μ)，Hcy (ImM) +Su6656 (20 μ Μ)。另取白细胞，在Hcy添加10分钟后，用western blot分析CA对Hcy(ImM)诱导的白细胞PI3K亚基p85膜转位的影响，并用PI3K抑制剂LY294002作为阳性对照。白细胞分组处理Contro I, Hcy(ImM), Hcy (ImM)+CA (100 μ M)，Hcy(ImM) +CA (400 μ Μ),Hcy(ImM)+LY294002(50 μ Μ)。另取白细胞，在Hcy添加10分钟后，用western blot分析CA对Hcy (ImM)诱导的白细胞P-Akt的影响，并用Src抑制剂Su6656和Akt抑制剂LY294002作为阳性对照。白细胞分 6 组处理Control, Hcy(ImM), Hcy(ImM) +CA (100 μ M), Hcy(ImM) +CA (400 μ Μ),Hcy(ImM)+Su6656(20 μ Μ)，Hcy (ImM)+LY294002(50 μ Μ)。另取白细胞，在Hcy添加10分钟后，用RIPA裂解液提取IO6白细胞的总蛋白，或用普利莱公司的细胞核-胞浆-胞膜蛋白提取试剂盒，提取8 X IO6-1O7白细胞的膜蛋白和浆蛋白。用BCA法进行蛋白定量，取30 yg蛋白上样，在10% SDS-PAGE胶中进行电泳，转移到 NC 膜上。5% BSA 室温封闭 lh。一抗 p-Src Y416(l 1000), p-Akt S473(l 1000)，p85a(l 1000)4°C孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5min。二抗(I 20000)室温孵育lh。TBST洗膜3次，每次lOmin。膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。将曝光完得NC膜用洗脱液在室温洗30min后，用Src抗体和Akt抗体杂交。十二、统计学处理所有实验结果以平均值土标准误(Mean土SEM)表示，以Prism软件分析、作图。进行多组结果比较时采用单因素方差分析(One way AN0VA),采用Student-Newman-Keuls进一步进行组间两两比较的分析检验。比较两组结果时采用组间方差分析，F-检验，设P< 0. 05为有显著性意义。结果—、CA抑制HHcy诱导的小鼠脑皮层细静脉中白细胞的滚动和粘附图3A显示了对照组、CA组、Hcy组和Hcy+CA组小鼠软脑膜细静脉内粘附的白细胞数的经时变化。Hcy注射前，各组小鼠脑细静脉内滚动白细胞数低于2个/30s，且未见白细胞粘附。对照组和CA组，在本观察期间内，滚动白细胞数量未见明显变化。在90分观察结束时，粘附白细胞数分别为0. 3±0· lcells/200ym和0. 2±0· 2cells/200 μ m。Hcy组，在Hcy注射45分钟后，滚动白细胞数量有显著性增加，至90分钟时，白细胞滚动数量增加到7. 8±1. 2cells/30秒。静脉注射Hcy60分钟后，粘附白细胞数量有显著性增加，至90分钟时，增加到3. 4±O. 5cells/200 μ m长度。CA组能显著地抑制Hcy引起的白细胞滚动和粘附的增加。二、CA对HHcy诱导的小鼠血浆炎症因子IL-6、TNF_a，趋化因子MIPl a、MCP-1增高的影响图4显示了 HHcy和CA注射30分钟时，各组血浆中趋化因子和炎症因子的含量。与对照组相比，HHcy组血浆中细胞因子IL-6、TNF_a，趋化因子MIPl a、MCP-1的含量显著地升高。CA对HHcy诱导的血浆中IL-6，TNF_a和MIPl-α含量的增高没有显著的抑制作用，而对血浆中MCP-1的升高有显著的抑制作用。三、CA对HHcy诱导的小鼠脑皮层组织微血管E-selectin及ICAM-1的影响图5是各组小鼠脑皮层组织中微血管内皮E-selectin免疫组化染色的图象。对照组小鼠脑皮层组织内仅可见少量呈褐染E-selectin阳性染微血管(图Al)。Hcy组小鼠脑皮层组织内可观察到较多的E-selectin (图A2)阳性染色的微血管。Hcy+CA组小鼠脑皮层组织内E-selectin(图A3)阳性染色的微血管，与Hcy组相比明显减少。图6是各组小鼠脑皮层组织中微血管内皮ICAM-1免疫组化染色的图象。对照组小鼠脑皮层组织内仅可见少量呈褐染ICAM-1阳性染微血管(图Al)。Hcy组小鼠脑皮层组织内可观察到较多的ICAM-1 (图A2)阳性染色的微血管。Hcy+CA组小鼠脑皮层组织内ICAM-1 (图A3)阳性染色的微血管，与Hcy组相比明显减少。四、CA 对 HH cy 体外诱导的白细胞表面 PSGL-l、L_selectin、CDlla、CDllb、CD18 表达的影响HHcy在体外对白细胞L-selectin、PSGL_l、CDlla、CDllb和CD18阳性细胞的百分比没有显著影响，CA也没有引起显著变化(数据未显示)。图7 显示了 CA对HHcy 体外诱导的白细胞表面PSGL-l、L_selectin、CDlla、CDllb、CD18平均突光强度(mean fluorescence intensity,MFI)的影响。Hcy处理后90分钟后，白细胞L-selectin和PSGL-1的平均荧光强度降低，而⑶IlaXDllb和⑶18的平均荧光强度显著升高。CA对Hcy诱导的白细胞PSGL-1和L-selectin的平均荧光强度降低没有抑制作用(图7A，7B)，但CA在剂量为100 μ moL和400 μ moL时可显著抑制Hcy诱导的白细胞粘附分子 CDl la、CDl Ib 和 CD18 的表达(图 7C，7D，7E)。五、CA对HHcy体外诱导的白细胞粘附分子⑶18磷酸化的影响图8A是HHcy体外诱导的白细胞⑶18磷酸化western blot法分析的结果。Hcy处理10分钟后，白细胞粘附分子CD18的磷酸化显著增加，并持续到60分钟，然后降低。图8B显示的是CA对Hcy处理60分钟时白细胞粘附分子⑶18磷酸化的影响。CA可剂量依赖性地抑制Hcy诱导的白细胞粘附分子CD18磷酸化。图SC是用激光共聚焦显微镜观察到的中性粒细胞粘附分子CD18磷酸化的图象。图中蓝染部分是细胞核，绿染部位显示的是⑶18磷酸化。与对照组相比(C-al)，Hcy处理的中性粒细胞粘附分子⑶18磷酸化显著增加(C-bl) ,400 μ M的CA能显著地抑制中性粒细胞粘附分子CD18磷酸化(C-cl)。图8D是用激光共聚焦显微镜观察到的淋巴细胞粘附分子CD18磷酸化的图象。图中蓝染部分是细胞核，绿染部位显示的是⑶18磷酸化。与对照组相比(D-al)，Hcy处理的淋巴细胞粘附分子⑶18磷酸化显著增加(D-bl) ,400 μ M的CA能显著地抑制淋巴细胞粘附分子CD18磷酸化(D-c1)。六、HHcy体外诱导的白细胞Src/PI3K/Akt通路活化与诱导白细胞表面粘附分子⑶11/⑶18的表达和磷酸化的关系图9显示的是HHcy体外诱导的白细胞Src/PI3K/Akt通路活化与诱导白细胞表面粘附分子⑶11/⑶18的表达和磷酸化的关系。用Src kinase抑制剂Su6656和PP2、PI3K抑制剂LY294002预处理白细胞能够阻断Hcy诱导的⑶IlaXDllb和⑶18平均荧光强度的增加(图9A、B、C)，可以抑制白细胞粘附分子CD18磷酸化(图9D)。七、CA对HHcy体外诱导的白细胞Src/PI3K/Akt通路活化的影响图1OA显示的是Hcy体外诱导白细胞Src磷酸化的经时变化的Western blot分析结果。Hcy处理5分钟，可诱导白细胞Src磷酸化，在10分钟时，其磷酸化达到峰值，以后下降。图10B显示的是CA对Hcy体外处理10分钟时，白细胞Src磷酸化的影响。100 μ moL和400 μ moL的CA可抑制Hcy诱导的Src的磷酸化，其作用与Src抑制剂Su6656的抑制效果相似。图1OC显示的是Hcy体外处理10分钟时，诱导的白细胞PI3K亚基p85从胞浆向膜转位，及CA和PI3K抑制剂LY294002的抑制效果。Hcy可以诱导白细胞PI3K亚基P85从胞浆向膜转位。400 μ moL的CA可抑制Hcy诱导的p85的膜转位，其作用与PI3K抑制剂LY294002的抑制效果相似。图10D显示的是Hcy体外处理10分钟时，诱导的白细胞Akt磷酸化，及CA、Src抑制剂Su6656、PI3K抑制剂LY294002的抑制效果。Hcy体外处理10分钟时，白细胞AKT磷酸化显著增加。100 μ moL和400 μ moL的CA可抑制Hcy诱导的AKT磷酸化磷酸化，其作用与Src抑制剂Su6656、PI3K抑制剂LY294002的抑制效果相似。因此可以得出CA可以抑制HHcy体外诱导白细胞粘附分子⑶11a、⑶Ilb和⑶18的表达以及⑶18的磷酸化，其作用与其抑制Src/PI3K/Akt信号通路相关。实施例1丹参中咖啡酸的提取(a)用酸将丹参煎液的pH调节至2. 0-3. 5，放置8_24小时，过滤得到滤液；(b)向滤液中加入乙醇至最终体积浓度为75± 10%，然后放置36-72小时，过滤得到滤液；(c)用碱将滤液pH调节至7. 5-8. 5，放置8_24小时，过滤得到滤液(d)用酸将滤液pH调节至5. 0-7. O,回收乙醇并得到浓缩液；(e)将浓缩液用活性炭进行脱色处理，过滤得到滤液；(f)调节滤液至pH6. 8 士 0. 5，得到的提取液即包含咖啡酸。实施例2丹参中咖啡酸的提取优选工艺(a)用盐酸溶液(5 % — 30 % )将丹参煎液酸化至pH值(2. 0-3. 5)，静置数小时，过滤得到滤液。(b)滤液加乙醇至含醇量为75%至85%，冷处静置数十小时，过滤得到滤液。(c)滤液用氢氧化钠溶液(5% — 40% )调节pH值(7. 5-8. 5)，冷处静置数小时，过滤得到滤液。(d)用盐酸溶液(5% — 30% )调节pH值至5. 0-7.0，回收乙醇，得到浓缩液。(e)浓缩液加入数倍量的注射用水中，冷藏，过滤，滤液浓缩得到浓缩液。浓缩液可冷藏。然后加适量活性炭煮沸，冷藏，过滤得到滤液。(f)用氢氧化钠溶液(5% — 40% )或盐酸溶液(5% — 30% )调节pH值，过滤即得。实施例3用其他含咖啡酸的的药物提取咖啡酸 咖啡酸提取物可以来源于菊科植物一枝黄花或蒲公英全单，蔷薇种植物山里红果实，无患子科植物坡柳，毛茛科植物升麻根茎，水龙骨科植物欧亚水龙骨根茎，芸香科植物柠檬果皮，寥科植物全草，败酱科植物缬草根，唇形科植物麝香草全草或杜仲科植物杜仲叶等。上述提取物中咖啡酸含量优选1_95%。提取方法简述如下以蒲公英为例，将蒲公英和水按1: 5-1 40浴比投料，加热保温提取，过滤收集滤液，将滤液浓缩至一定浓度，喷雾干燥得粉。
权利要求
1.咖啡酸用于制备抑制白细胞非受体酪氨酸激酶Src的活化的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的药物中的应用，其特征在于咖啡酸抑制白细胞非受体酪氨酸激酶Src的磷酸化。
3.如权利要求1所述的药物中的应用，其特征在于所述的抑制白细胞非受体酪氨酸激酶Src的活化是指抑制白细胞磷脂酰肌醇3激酶的活化。
4.如权利要求1所述的药物中的应用，其特征在于所述的抑制白细胞非受体酪氨酸激酶Src的活化是指抑制丝氨酸/苏氨酸激酶的磷酸化。
5.如权利要求1所述的药物中的应用，其特征在于所述的药物抑制白细胞粘附分子整合素a L、整合素a M的表达及整合素β 2的磷酸化。
6.如权利要求1所述的药物中的应用，其特征在于所述的药物抑制白细胞的滚动及粘附。
7.如权利要求6所述的药物中的应用，其特征在于所述的药物抑制软脑膜细静脉中白细胞的滚动及粘附。
8.如权利要求1所述的药物中的应用，其特征在于所述的药物抑制高同型半胱氨酸诱导的软脑膜细静脉中白细胞的滚动及粘附。
9.如权利要求1所述的药物中的应用，其特征在于所述的药物用于治疗心脑血管疾病及动脉粥样硬化。
10.如权利要求1-9所述的药物中的应用，其特征在于咖啡酸来源于丹参或者含咖啡酸的原料药中。
全文摘要
本发明揭示了咖啡酸可以抑制高同型半胱氨酸诱导的白细胞非受体酪氨酸激酶Src的活化，进而，抑制了PI3K/Akt信号通路，抑制了白细胞粘附分子整合素β2的表达，抑制了高同型半胱氨酸血症诱导的小鼠软脑膜细静脉白细胞的滚动和粘附，因此可以得出咖啡酸对于高同型半胱氨酸血症引发的脑血管病变性疾病有防治作用。
文档编号A61P9/10GK103027904SQ20111022798
公开日2013年4月10日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者韩晶岩, 赵海苹, 王宪, 刘育英, 孙凯, 卫晓红 申请人:天士力制药集团股份有限公司