一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型及其构建方法

文档序号:866726阅读:519来源:国知局
专利名称:一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型及其构建方法
技术领域
本发明涉及慢性肺动脉高压动物模型领域,特别涉及一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型及其构建方法。
背景技术
肺动脉高压(Pulmonary Hypertension, PH)主要临床表现为肺动脉压力的增高,是人类重大的心肺血管疾病之一。PH动物模型的建立是对该病进行基础和临床研究的平台。目前PH动物模型分为急性和慢性二种类型。急性动物模型的建立以低氧性或/和低压低氧性PH动物模型为主,以大白鼠较为常用(陈莉延等.白藜芦醇苷对慢性常压低氧性肺动脉高压模型中磷脂酶A_2、一氧化氮和内皮素水平的影响.中国病理生理杂志2006),其次有小鼠、兔等实验动物。
慢性动物模型的建立以药物诱导为主,国内外常用的诱导药物主要是野百合碱(Monocrotaline, MCT)或野百合碱活性代谢物。野百合碱属双稠吡咯啶生物碱,对癌细胞DNA可发生烃化作用,而起抗癌作用,注射后主要分布于肝、肾和胃,对多种实验性肿瘤有抑制作用,临床主要试用于皮肤磷状细胞癌和基底细胞癌,疗效较好,对急性白血病、子宫颈癌和阴茎癌也有效。野百合碱是复制慢性PH疾病模型的常用药物,无论大鼠、小鼠、兔子或犬,都可以复制成功,但是其病理特征不完全相同。MCT单次剂量(60 mg/kg)注射大白鼠后2 — 3周就形成大鼠慢性PH模型(JiangBH, Tawara S,Abe K,et al. Acute vasodilator effect of fasudil, a Rho—kinaseinhibitor,in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats. J CardiovascPharmacol, 2007,49(2) :85-89)。一般釆用右心导管插入术测量右心室收缩压,确立PH的形成以及达到何种程度,同时进行心、肺组织的大体解剖和组织学评价,其病理特征类似于临床上原发性和继发性PH。病理变化主要是肺动脉血管内皮细胞损伤,平滑肌明显增生导致肺动脉血管壁的重建和右心室肥厚,肺血管重构引起的内皮损伤的。组织学特征还包括在肺动脉和小动脉中层平滑肌细胞的肥大等等。但是由于模型动物本身在生理学和解剖结构等方面与人类差别较大,特别当动物处在麻醉状态下,心率、呼吸频率的变化较大,临床表现不稳定。Jones(2002)发现,当大鼠的心率(260 450次/分)下降到200次/min以下时(当麻醉过深等条件下时),肺动脉血流加速时间(PAAT)的长度与肺动脉收缩压(PASP)的高度没有相关性了。临床上右心室的射血前期和射血前期与加速时间的比值都与PASP的增加具有相关性。然而大鼠模型中,射血前期不随PASP的增加而延长;反而加速时间与PASP 的增加紧密关联。(JOHN E. JONES, I, 2 LISA MENDES, 2 M. AUDREY RUDD, 2 Serialnoninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model .Am J Physiol Heart Circ Physiol 283: H364 -H371, 2002)
陈洪茂等在对用MCT诱导的模型兔实时超声监测时,显示并不是所有PH模型兔均出现三尖瓣反流及肺动脉瓣反流,兔的肺动脉瓣反流出现率只有53. 8% ;三尖瓣反流出现率仅为69. 2%(陈洪茂,段云友,周宁等.实时超声监测兔慢性肺动脉高压模型的建立及其意义·中国超声医学杂志2008,24(8) :864-867.)。总的来讲,小体型实验动物由于心肺血管生理结构的不同,所建立的药物诱导模型与实际临床特征存在很大差异,同时,也不适合实时超声监测。近年来较大的实验动物一实验用犬(杂种犬或比格犬)已用于慢性PH模型复制和石开究(Takahashi M, Nakamura T, Toba T, Transplantation of endothelial progenitorcells into the lung to alleviate pulmonary hypertension in dogs. Tissue Eng.2004 May-Jun; 10 (5-6) :771_9)。但是犬的心脏结构与人类有很大差异,并且常常表现为心律不齐;同时犬类属于宠物,是人类的朋友,用犬做动物试验愈来愈受到动物保护主义者的限制和反对。尤其是人和犬对于药品的代谢途径不同,从而造成病理特征不同于临床。如犬缺少野百合碱的代谢酶,只能代谢野百合碱的衍生物,因此用犬做动物试验给药剂量、方法与人不同。近年来猪也常用于急性低氧性PH动物模型的研究(徐军,侯恕,陈顺存等.内皮素在低氧肺动脉高压形成中的作用.中华结核和呼吸杂志.1995. 18(5) : 290-292)。但是,急性动物模型的缺点在于不能连续、长期观察PH的形成过程和变化特点。·因此,迫切需要一种可进行连续、长期观察、治疗和研究,且接近人类肺动脉高压临床特征的慢性肺动脉高压动物模型。

发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于,提供一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型及其构建方法,所述小型猪慢性肺动脉高压动物模型采用的小型猪的体型大小、结构与人体相似,可以采用临床设备进行测定和临床观察,且其病理变化较其他实验动物更接近人类临床病理变化,有利于进行长期的观察、治疗和研究。为达到上述技术效果,本发明实施例提供了一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型,是将野百合碱溶液注射到健康的1飞月龄、雄性或雌性、体重3 15kg小型猪腹腔中,在注射野百合碱第4、周后得到小型猪慢性肺动脉高压动物模型。优选地,所述小型猪为健康的2 4月龄小型猪,雄性,体重4 14kg。优选地,所述野百合碱溶液是将野百合碱溶于浓度为5(Γ80%的酒精溶液后所得的浓度为22 28mg/gl的溶液;
所述野百合碱溶液的注射剂量为9. (T25mg/kg。相应地,本发明实施例还提供了一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法,包括
选用健康的广5月龄小型猪,所述小型猪为雄性或雌性,体重3 15kg ;
将野百合碱与酒精混合配成野百合碱溶液,将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中;
在将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔后第4、周内将所述小型猪进行心导管压力测定。优选地,所述小型猪为健康的,2 4月龄,雄性,体重为4 14kg的小型猪。优选地,所述酒精的浓度为5(Γ80%,所述野百合碱溶液的浓度为22 28mg/gl,所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中的注射剂量为9. (T25mg/kg。
优选地,所述心导管压力测定为右心导管术压力测定,所述右心导管术压力测定对象包括平均肺动脉压、右心室压力和右心房压力。优选地,在将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔后第4、周内将所述小型猪进行心导管压力测定之后还包括
将所述小型猪进行器官观察和组织切片HE染色;
所述器官观察的步骤为取所述小型猪的心脏和肺组织,称量右心室和左心室加中隔重量,右心室重量/体重,左心室重量/体重,右心室/左心室比值;
所述组织切片HE染色的步骤为将所述心脏和肺组织用3. 5^4. 5%甲醛磷酸缓冲液固定2Γ50 h,然后沿着肺动脉垂直方向取材,包埋、切片,HE染色,光镜下观察肺血管形态学改变。优选地,所述心脏和肺组织为将所述部分小型猪用麻醉剂致死后即刻取得的心脏和肺组织;
所述麻醉剂注射于所述小型猪的腹腔中;
所述麻醉剂为戊巴比妥钠。实施本发明具有如下有益效果
本发明关于一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型是利用野百合碱建立一个慢性肺动脉高压模型,即慢性PH模型,其病理特征与人类临床病理特征接近,方法简单,动物也容易处理。一、选用小型猪用于慢性肺动脉高压模型的建立,与采用缺氧或低氧方法建立的急性模型相比,模型的构建更加精确与稳定,模型的可复制性也较强,可以进行长期的观察、治疗和研究。二、与大鼠、小鼠和兔相比,小型猪相对来讲体型较大、血液量大、有利于外科手术操作等临床治疗研究,且其体型大小、结构与人体相似,例如猪的心率、肺脏血管床结构、呼 吸频率、潮气量等方面与人类极为相似。因此对于小型猪可以采用临床设备进行测定观察,采用与临床病人相同的方法进行各项指标的测定,既可以通过右心导管术进行有创观察,又可以利用临床设备如超声心动图进行无创临床研究。而检测得到的指标也更加接近临床指标,这样可以从不同侧面(动物模型)和研究水平探讨导致PH的发病机制和决定因素。三、与犬、猴实验动物相比,猪作为食用动物进行实验,从伦理方面容易被人们接受。且猪的饲养成本低,价格便宜,又不易对人造成伤害。


图I为本发明一种构建小型猪慢性肺动脉高压动物模型过程中右心导管术压力的测定方法的流程 图2为本发明一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法的流程 图3为本发明一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法的又一流程 图4为对照组小型猪肺动脉压力波曲线 图5为实验组小型猪肺动脉压力波曲线 图6为对照组小型猪右心室压力波曲线 图7为实验组小型猪右心室压力波曲线图;图8为对照组小型猪肺组织切片 图9为实验组小型猪肺组织切片图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。本发明实施例提供了一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型,是将野百合碱溶液注射到健康的广5月龄、雄性或雌性、体重3 15kg小型猪腹腔中,在注射野百合碱第4、周后得到小型猪慢性肺动脉高压动物模型。优选地,所述小型猪为健康的2 4月龄小型猪,雄性,体重4 14kg。 所述野百合碱溶液是将野百合碱溶于浓度为5(Γ80%的酒精溶液后所得的浓度为22 28mg/gl的溶液;
所述野百合碱溶液的注射剂量为9. (T25mg/kg。优选地,所述野百合碱溶液是将野百合碱溶于浓度为55 75%的酒精溶液后所得的浓度为25mg/gl的溶液;
所述野百合碱溶液的注射剂量为l(T20mg/kg。需要说明的是,野百合碱为Monocrotaline,简称为MCT。相应地,本发明实施例还提供了小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法。如图I所示,本发明实施例提供了一种构建小型猪慢性肺动脉高压动物模型过程中右心导管术压力的测定方法,包括
S100,准备好实验动物、麻醉剂、手术器械、生理盐水、肝素、注射器、三通阀、实验用的插管、动脉夹。需要说明的是,所述麻醉剂为戊巴比妥钠,按50mg/kg腹腔注射。S10ljE0.9 %氯化钠溶液和肝素10 U/ ml混合成肝素生理盐水,用注射器吸入
一定容量备用。S102,把插管和换能器连接起来,并接入三通阀,把注射器插入换能器的另一端,慢慢推动注射器,使换能器和插管中充满肝素生理盐水;
需要说明的是,在步骤S102的把注射器插入换能器的另一端,慢慢推动注射器,使换能器和插管中充满肝素生理盐水操作中,不允许有气泡的产生。S103,麻醉动物,在准备要插管的手术位置,暴露20mm左右的血管,用手术线结扎远心端,用动脉夹夹住近心端,用剪刀在血管上剪一个小口,把插管插入,结扎好。S104,测平均肺动脉压、右心室压力及右心房压力;
自右侧颈外静脉插入直径为Imm充有肝素溶液的聚乙烯塑料微导管,导管的另一端与微型压力传感器相连监测压力变化,在X光透视下,确定导管经前腔静脉进入右心房、三尖瓣口、右心室(RV),最后进入肺动脉干,测定平均肺动脉压(mPAP)、右心室压力(RVP)及右心房压力。S105,另一充盈肝素溶液的微导管插入右侧颈动脉测定动脉压(mCAP)。S106,稳定30 min后,应用MedLab生物信号采集处理系统采集、记录和分析各项指标。
如图2所示,本发明实施例提供了一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法,包括
S200,选用健康的f 5月龄小型猪,所述小型猪为雄性或雌性,体重3 15kg ;
优选地,所述小型猪为健康的,2 4月龄,雄性,体重为4 14kg的小型猪。S201,将野百合碱与酒精混合配成野百合碱溶液,将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中;
所述酒精的浓度为5(Γ80%,所述野百合碱溶液的浓度为22 28mg/gl,所述野百合碱溶 液注射于所述小型猪腹腔中的注射剂量为9. (T25mg/kg。优选地,所述酒精的浓度为55 75%,所述野百合碱溶液的浓度为25mg/gl,所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中的注射剂量为l(T20mg/kg。S202,在将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔后第4、周内将所述小型猪进行心导管压力测定;
优选地,在将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔后第Γ8周内将所述小型猪进行心导管压力测定。所述心导管压力测定为右心导管术压力测定,所述右心导管术压力测定对象包括平均肺动脉压、右心室压力和右心房压力。需要说明的是,步骤S202可以采用图I所示的右心导管术压力的测定方法来测定平均肺动脉压、右心室压力和右心房压力。如图3所示,本发明实施例还提供了另一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法,包括
S300,选用健康的2 4月龄小型猪,所述小型猪为雄性,体重4 14kg ;
S301,将野百合碱与酒精混合配成野百合碱溶液,将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中;
所述酒精的浓度为5(Γ80%,所述野百合碱溶液的浓度为22 28mg/gl,所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中的注射剂量为9. (T25mg/kg。优选地,所述酒精的浓度为55 75%,所述野百合碱溶液的浓度为25mg/gl,所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中的注射剂量为l(T20mg/kg。S302,在将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔后第Γ8周内将所述小型猪进行心导管压力测定。所述心导管压力测定为右心导管术压力测定,所述右心导管术压力测定对象包括平均肺动脉压、右心室压力和右心房压力。需要说明的是,步骤S302可以采用图I所示的右心导管术压力测定的方法来测定平均肺动脉压、右心室压力和右心房压力。S303,将所述小型猪进行器官观察和组织切片HE染色;
所述器官观察的步骤为将所述部分小型猪用麻醉剂致死后即刻取得的心脏和肺组织,
称量右心室和左心室加中隔重量,右心室重量/体重,左心室重量/体重,右心室/左心室比值;
所述组织切片HE染色的步骤为将所述即刻取得的心脏和肺组织用3. 5^4. 5%甲醛磷酸缓冲液固定24飞0h,然后沿着肺动脉垂直方向取材,包埋、切片,HE染色,光镜下观察肺血管形态学改变。优选地。所述组织切片HE染色的步骤为将所述心脏和肺组织用4. 0%甲醛磷酸缓冲液固定48 h。需要说明的是,本步骤通过把50mg/kg的戊巴比妥钠麻醉剂注射于所述部分小型猪的腹腔中,待其麻醉致死后即刻取得所述小型猪的心脏和肺组织。S304,观察所述心脏和肺组织的结构变化,结合肺动脉压力指标的变化,检验模型构建成功与否。临床上肺动脉血压增高的诊断标准为在海平面状态下,静息时右心导管检查肺动脉收缩压>30mmHg (ImmHg=O. 133kPa)和/或肺动脉平均压>25mmHg,或者运动时肺动脉平均压>30mmHg。西藏小型猪的血流动力学指标,正常肺动脉平均压为15. 1-19. 8mmHg,与人类的肺动脉高压的指标接近。临床上肺动脉高压特征性的病理改变为小肺动脉内膜纤维化,中膜肥厚,外膜增·生,丛样病变及动脉管腔闭塞。具体表现为肺泡充血、水肿、间隔增宽,小肺动脉血管中膜肥厚,内膜纤维化等。当所述小型猪注射野百合碱溶液4、周后,平均肺动脉压由15. ImmHg上升至32. 5mmHg,同时出现明显的肺动脉高压的病理特征肺泡充血、水肿、间隔增宽,小肺动脉血管中膜肥厚,内膜纤维化等,模型构建成功。将构建慢性肺动脉高压动物模型的小型猪进行如下的动物对比实验
一、实验材料西藏小型猪12头,雄性,3-4月龄,体重13 14kg,实验组8头,对照组
4头,由南方医科大学实验动物中心提供。野百合碱(MCT)购自成都曼思特生物科技有限公司(HPLC, 99. 0%)
二、实验步骤
I、正常血流动力指标测定用3%戊巴比妥钠按lml/kg的剂量将西藏小型猪麻醉后仰卧位捆绑在实验用床上,右侧颈部剃毛,备皮,碘酒酒精消毒,铺巾,切开局部皮肤(靠近气管右侧),游离皮下组织,暴露动静脉、分离右颈内静脉约20_后,用手术线结扎远心端,用动脉夹夹住近心端,直视下用5F挠动脉穿刺针法穿刺右颈内静脉,从穿刺针内送入导引钢丝(约IOcm),退出穿刺针,沿导引钢丝送入5F动脉鞘后退出导引钢丝,再经动脉鞘送入5F导管至前腔静脉、右心房,右心室,肺动脉主干,测定血流动力学参数包括中心静脉压(CVP),右室压(sRVP ),肺动脉收缩压(sPAP ),肺动脉平均压(mPAP ),肺动脉舒张压(dPAP)。使用MedLab生物信号采集处理系统监测压力。整个过程严格执行无菌操作规范。2、选用8头小型猪按图2或图3所示的小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法培养为实验组,其中把野百合碱(MCT)用70%医用酒精配成25%野百合碱注射溶液,按20. O mg/kg剂量腹腔注射,培养时间为5飞周;
3、选用4头小型猪为对照组,在与实验组相同饮食及饲养环境条件下给予同样剂量的70%医用酒精腹腔注射,培养时间为5飞周;
4、培养5飞周后,将对照组和实验组依图I所示的右心导管术压力的测定方法分别检测对照组和实验组的肺动脉压力和右心室压力,得出如图4所示的对照组小型猪肺动脉压力波曲线和图5所示的实验组小型猪肺动脉压力波曲线,以及图6所示的对照组小型猪右心室压力波曲线和图7所示的实验组小型猪右心室压力波曲线;5、培养5飞周后,将对照组和实验组依图3中步骤S303所示的方法,将所述小型猪进行器官观察和组织切片HE染色,分别检测对照组小型猪和实验组小型猪的肺组织,得到图8所示的对照组小型猪小型猪肺组织切片图和图9所示的实验组小型猪肺组织切片图。三、实验分析
由图4和图5可看出,当所述小型猪注射野百合碱溶液5飞周后,平均肺动脉压由15. IlmmHg上升至30. 952mmHg,收缩压由25. 916mmHg上升至38. 383mmHg,舒张压由9. 707mmHg 上升至 27. 237mmHg ;
由图6和图7可看出,当所述小型猪注射野百合碱溶液5飞周后,右心室平均压由16. 656 mmHg上升至22. 03ImmHg,收缩压由26. 526mmHg上升至47. 825mmHg,舒张压由
11.722mmHg 变化至 9. 135mmHg,脉压差由 14. 805mmHg 上升至 38. 69mmHg ;
由图8和图9可看出,当所述小型猪注射野百合碱溶液5飞周后,图8显示正常肺泡以及小肺动脉血管结构,而图9所示的实验组小型猪的肺组织切片出现明显的肺动脉高压的病理特征肺泡充血、水肿、间隔增宽,小肺动脉血管中膜肥厚,内膜纤维化等。因此,通过将野百合碱溶液注射到健康的I飞月龄、雄性或雌性、体重3 15kg小型猪腹腔中,在注射野百合碱第4、周后可以得到病理特征明显且接近人类临床病例特征(包括血流动力学指标和压力波形)的小型猪慢性肺动脉高压动物模型。需要说明的是,图8为对照组小型猪肺组织切片图(HE染色X 100);图9为实验组小型猪肺组织切片图(HE染色X 200)。表一为小型猪注射野百合碱溶液8周前后部分血流动力学指标的变化
权利要求
1.一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型,其特征在于,是将野百合碱溶液注射到健康的f 5月龄、雄性或雌性、体重3 15kg小型猪腹腔中,在注射野百合碱第4、周后得到小型猪慢性肺动脉高压动物模型。
2.如权利要求I所述的小型猪慢性肺动脉高压动物模型,其特征在于,所述小型猪为健康的2 4月龄小型猪,雄性,体重4 14kg。
3.如权利要求2所述的小型猪慢性肺动脉高压动物模型,其特征在于,所述野百合碱溶液是将野百合碱溶于浓度为5(Γ80%的酒精溶液后所得的浓度为22 28mg/gl的溶液; 所述野百合碱溶液的注射剂量为9. (T25mg/kg。
4.一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法,其特征在于,包括 选用健康的广5月龄小型猪,所述小型猪为雄性或雌性,体重3 15kg ; 将野百合碱与酒精混合配成野百合碱溶液,将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中; 在将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔后第4、周内将所述小型猪进行心导管压力测定。
5.如权利要求4所述的小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法,其特征在于,所述小型猪为健康的,2 4月龄,雄性,体重为4 14kg的小型猪。
6.如权利要求4所述的小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法,其特征在于,所述酒精的浓度为5(Γ80%,所述野百合碱溶液的浓度为22 28mg/gl,所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔中的注射剂量为9. (T25mg/kg。
7.如权利要求4所述的小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法,其特征在于,所述心导管压力测定为右心导管术压力测定,所述右心导管术压力测定对象包括平均肺动脉压、右心室压力和右心房压力。
8.如权利要求4所述的小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法, 其特征在于,在将所述野百合碱溶液注射于所述小型猪腹腔后第4、周内将所述小型猪进行心导管压力测定之后还包括 将所述小型猪进行器官观察和组织切片HE染色; 所述器官观察的步骤为取所述小型猪的心脏和肺组织,称量右心室和左心室加中隔重量,右心室重量/体重,左心室重量/体重,右心室/左心室比值; 所述组织切片HE染色的步骤为将所述心脏和肺组织用3. 5^4. 5%甲醛磷酸缓冲液固定2Γ50 h,然后沿着肺动脉垂直方向取材,包埋、切片,HE染色,光镜下观察肺血管形态学改变。
9.如权利要求8所述的小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法, 其特征在于,所述心脏和肺组织为将所述部分小型猪用麻醉剂致死后即刻取得的心脏和肺组织; 所述麻醉剂注射于所述小型猪的腹腔中; 所述麻醉剂为戊巴比妥钠。
全文摘要
本发明公开了一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型,是将野百合碱溶液注射到健康的1~5月龄、雄性或雌性、体重3~15kg小型猪腹腔中,在注射野百合碱第4~9周后得到小型猪慢性肺动脉高压动物模型。相应地,本发明公开了一种小型猪慢性肺动脉高压动物模型的构建方法。采用本发明,所述小型猪慢性肺动脉高压动物模型采用的小型猪体型大小、结构与人体相似,可以采用临床设备进行测定和临床观察,且其病理变化较其他实验动物更接近人类临床病理变化,有利于进行长期的观察、治疗和研究。
文档编号A61P11/00GK102960309SQ20111025666
公开日2013年3月13日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者李洪涛, 刘蓉, 顾为望 申请人:广州医学院第一附属医院, 广州呼吸疾病研究所, 东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司
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