使用汉黄芩素抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物及其应用的制作方法

专利名称：使用汉黄芩素抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种抑制癌干细胞生长或癌细胞转移(growth of cancer stemcells)的医药组成物及其应用，尤其指一种含汉黄岑素化合物(wogonin compounds)以抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物以及使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途。
背景技术：
癌症系已连续二十七年蝉联十大死因的榜首。当细胞变成异常且持续的自行分裂 时，会形成更多的异常细胞，即可能引发癌症。一般肿瘤细胞中，潜存些许具有干细胞特性的癌细胞，此种癌细胞虽然数量不多，但却类似干细胞，可以不断的进行癌细胞分裂及分化，因此称的为癌干细胞。由于癌干细胞具有极高的抗药性，西方医学化学治疗药物难以将其毒杀，因此常听到许多经过化疗的病患体内癌症复发的情形。目前生物医学已知的标准癌症疗法，对癌干细胞根本束手无策。再者，目前西医疗法所使用的手术、放射线治疗、化学疗法、贺尔蒙疗法、生物制剂疗法等，常常对于患者身体产生强烈副作用，因此若能使用比较温和，且能抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的疗法，进行癌症治疗，对于病患而目将是一大福首。现今，民众普遍认以中药对患者进行治疗，属于比较温和的治疗方法，且具有相当高的市场接受度，而成为一种替代性疗法(complementary alternative medicines)。因此，自众多中药材中，经筛选实验后，可证实某中药材确实可阻止癌干细胞进行分裂并抑制癌细胞转移，势必可对于癌症治疗具有相当的帮助。

发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物。本发明的又一目的在于提供一种使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途。为实现上述目的，本发明提供的抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，包括一汉黄芩素化合物；以及一医药上可接受性载体。所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该汉黄芩素化合物包含于一黄岑萃取物中。所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该黄芩萃取物是一黄芩水萃取物或由该黄芩水萃取物干燥而得。所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该黄芩水萃取物是提供一黄芩药材，添加50倍至200倍该黄芩药材重量的水，形成一混合物后,对该混合物加热萃取而得。所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该萃取的时间为30分钟至2小时。所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该混合物是加热至体积成为原始体积的四分之一至二分之一。所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该癌干细胞是非小细胞型肺癌细胞。所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该癌干细胞或该癌细胞是非小细胞型肺癌细胞。 本发明提供了一种使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途。所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该汉黄芩素化合物包含于一黄芩萃取物中。所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该黄芩萃取物是一黄芩水萃取物或由该黄芩水萃取物干燥而得。所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该黄芩水萃取物是提供一黄芩药材，添加50倍至200倍该黄芩药材重量的水，形成一混合物后，对该混合物加热萃取而得。所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该萃取的时间为30分钟至2小时。所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该混合物是加热至体积成为原始体积的四分之一至二分之一。所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该癌干细胞是非小细胞型肺癌细胞。所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该癌干细胞或该癌细胞是非小细胞型肺癌细胞。综上所述，本发明上述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物、以及使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，可以突破癌症治疗中无法有效抑制癌干细胞的瓶颈，进而发展成为预防与治疗癌症的保健食品与临床治疗用药。


图IA为黄芩萃取物对A549、NCI-H460、NCI-H520与MRC5等细胞株的测试结果。图IB为汉黄芩素溶液与A549细胞株培养48小时后的MTT测试结果。图IC为黄芩萃取物对A549细胞株的萘胺蓝染剂测试结果。图2A为黄芩萃取物处理后A549细胞株的细胞周期分析结果。图2B为黄芩萃取物处理后A549细胞株(培养基中仅含I %低浓度的血清)的细胞周期分析结果。
图3A为黄芩萃取物处理后⑶K4的表现结果。图3B为黄芩萃取物处理后⑶K6的表现结果。图3C为黄岑萃取物处理后cyclin D3的表现结果。图3D为黄芩萃取物处理后P-RB的表现结果。图3E为黄岑萃取物处理后cyclin BI的表现结果。图3F为黄岑萃取物处理后p_cdc2的表现结果。
图3G为黄芩萃取物处理后上皮标帜蛋白E型钙黏素(E-cadherin)的表现结果。图3H为黄芩萃取物处理后间叶标帜蛋白(Vimentin)的表现结果。图31为黄芩萃取物处理后ALDH1A1的表现结果。图3J为黄岑萃取物处理后β -catenin的表现结果。图3K为黄芩萃取物处理后⑶147的表现结果。图3L为黄芩萃取物处理后ABCG2的表现结果。图4为穿孔分析中黄芩萃取物处理后全数15个显微镜观察视野中单位视野的细胞数量。图5A为黄芩萃取液处理后的侧群细胞(SP)分析结果。图5B为汉黄芩素溶液处理后的侧群细胞(SP)分析结果。
具体实施例方式本发明提供的抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，以能显著的减低癌细胞株的细胞存活率，如非小细胞型肺癌细胞(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC),但在有效剂量下不会使正常细胞株受到影响，并且能有效抑制癌细胞转移。本发明提供的使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，此药剂能降低癌细胞增生、转移以及类癌干细胞的比例，此药剂亦涵盖预防与治疗癌症的保健食品与临床治疗用药。本发明的一态样提供一种抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，包括一汉黄芩素化合物；以及一医药上可接受性载体。本发明的另一态样提供一种使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途。本发明抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物及上述用途中，该汉黄芩素化合物可以在市面上购买而得，例如汉黄岑素水合物(wogonin hydrate)、汉黄岑素硫酸盐(wogonin sulfate)等,或者利用黄岑药材萃取而得。若萃取黄芩药材，则汉黄芩素化合物包含于黄芩萃取物中。举例而言，可以提供黄芩药材,添加50倍至200倍该黄芩药材重量的水，形成一混合物后,对该混合物加热萃取持续30分钟至2小时，或直至该混合物加热至体积成为原始体积的四分之一至二分之一，便可以得到一黄芩水萃取物。如此，该黄芩水萃取物便含有汉黄芩素化合物，且该黄芩水萃取物可经过干燥工艺，如喷雾干燥法、冷冻干燥法、科学中药造粒法等，形成一干燥形式的萃取物。由上述可知，含有汉黄芩素化合物且用于抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物、抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的治疗方法、以及汉黄芩素化合物用于制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，同样落于本发明的范畴中，其中该癌干细胞或该癌细胞可为非小细胞型肺癌细胞。本发明将黄芩药材萃取而得的黄芩萃取物，经过一系列生物性测试实验，发现此可以抑制癌干细胞生长或癌细胞转移，并对此黄芩萃取物初步进行文献查询，而发现黄芩萃取物中主要活性成分为汉黄芩素，因此利用市面上购得的汉黄芩素化合物，配制成溶液形式后以有效剂量进行生物性测试实验，进而确认汉黄芩素与黄芩萃取物皆可以达到抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的功效。本发明所使用的「抑制」一词，是指将一种含汉黄芩素化合物的医药组成物，投予患有癌症、具有癌症症状、或朝癌症发展倾向的主体，以期达到治疗、治愈、减轻、减缓、改变、医治、改善、改进、或影响此病症、其症状、或朝癌症发展的倾向。「有效剂量」一词是指能够对于受抑制主体产生预期疗效所需的活性药剂量。对于有效剂量，本领域具有通常知识者可了解到其会根据投药路径、使用赋形剂、以及与其它药剂共同使用的可能性而改变。本发明的方法可治疗的癌症，包含各种器官的实体或血液肿瘤两者。实体肿瘤举 例包含胰腺癌；膀胱癌；大肠直肠癌；乳癌，包括转移性乳癌；肾癌，例如包括转移性肾细胞癌；肝癌；肺癌，例如包括非小细胞型肺癌(non-small cell lung cacinoma, NSCLC)、细支气管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma, BAC)、和肺腺癌；前列腺癌,包括雄激素依赖性和雄激素非依赖性前列腺癌症；卵巢癌，例如包括进行性上皮或原发性腹膜癌；神经内分泌癌，包括转移性神经内分泌肿瘤；脑肿瘤，例如包括神经胶瘤、退化性寡轴突胶质细胞瘤、多型性神经胶母细胞瘤、以及成人退化性星细胞瘤；子宫颈癌；胃癌；食道癌；头颈部癌，例如包括头颈部的鳞状细胞癌；黑色素瘤；骨癌；以及软组织肉瘤。恶性血液疾病举例包括急性骨髓性白血病(AML);慢性骨髓性白血病(CML)，包括加速性CML和CML的爆发阶段(CML-BP);骨髓增生不良症候群(myelodysplastic syndromes, MDS),包括顽抗性贫血(refractory anemia, RA)、伴有环状含铁胚细胞的顽抗性贫血(refractory anemiawith ringed siderblasts, RARS)、伴有过多胚细胞的顽抗性贫血(refractory anemiawith excess blasts, RAEB)、及转变中的 RAEB(RAEB-T);非霍奇金氏病(non-Hodgkin’ slymphoma, NHL)，包括滤泡型淋巴瘤、和外套细胞淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM);急性淋巴母细胞性白血病(ALL);慢性淋巴母细胞性白血病(CLL);霍奇金氏病(Hodgkin’ s disease, HD);华尔登氏巨球蛋白血症(Waldenstrom，s macroglobulinemia);以及骨髓增生性症候群。本发明的医药组成物可更包含如细胞毒性剂的治疗剂，或者与如放射性治疗、或免疫性治疗的治疗法一起施用。举例而言，此细胞毒性剂可为抗代谢药物(antimetabolites)，包含如卡培他滨(capecitibine)、吉西他滨(gemcitabine)、5-氟尿B密唳(5-fiuorouracil)或5-氟尿喃卩定/白叶酸(Ieucovorin)、氟达拉滨(fiudarabine)、阿拉伯糖基胞卩密唳(cytarabine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、喷司他丁(pentostatin)、和胺甲叶酸(methotrexate);拓踐异构酶(topoisomerase)抑制剂，例如包括依妥普赛(etoposide)、坦尼坡赛(teniposide)、喜树碱(camptothecin)、拓踐替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、阿德力霉素(doxorubcin)、和道诺鲁比辛(daunorubicin);长春花生物喊(vinca alkaloid),例如包括长春新碱(vincristine)、和长春碱(vinblastin);紫杉烧类(taxanes),例如包括紫杉醇(paclitaxel)、和多西紫杉醇(docetaxel);钼剂(platinum agents),例如包括顺钼(cisplatin)、卡钼定(carboplatin)、和奥沙利钼(oxaliplatin);抗生素(antibiotics),例如包括放线菌素D (actinomycin D)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素C (mitomycin C)、阿霉素(adriamycin)、道诺鲁比辛(daunorubicin)、埃达鲁比辛(idarubicin)、阿德力霉素(doxorubicin)、和聚乙二醇脂质体阿德力霉素(pegylated liposomal doxorubicin)；烧基化剂(alkylating agents),如霉法兰(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、硫酸布他卡因(busulfan)、沙奥特帕(thiotepa)、依弗酰胺(ifosfamide)、卡氮芥(carmustine)、环己亚硝(Iomustine)、司莫司汀(semustine)、链球霉素(streptozocin)、达卡巴仁(decarbazine)、和环憐酸胺(cyclophosphamide);沙利窦迈(thalidomide)和相关类似物，例如包括CC-5013和CC-4047 ;蛋白酪胺酸激酶抑制剂，例如包括甲磺酰伊麻替尼普(imatinib mesylate)、吉非替尼(gef itinib)、达沙替尼(dasatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、拉帕替尼(Iapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼罗替尼(nilotinib)、以及索拉非尼(sorafenib);抗体,例如包括曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥西单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、和贝伐珠单抗(bevacizumab);迈杜葱酮(mitoxantrone);地塞米松(dexamethasone);普赖松(prednisone);以及替莫唑胺·(temozolomide)。为实行本发明所述的方法，上述医药组成物可经由口服、非口服、喷雾吸入、局部、经直肠、经鼻、舌下、阴道、或经由植入型药盒(implanted reservoir)等方式投药。于此使用的「非口服」(parenteral)是指皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌肉内注射、关节腔内注射、动脉内注射、关节液内注射、胸腔内注射、脊髓内注射、疾病部位内注射、及颅内注射或注入技术。无菌可注射的组成物，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据本领域已知技术，使用适合的分散剂或湿润剂(如Tween 80)及悬浮剂来配制。无菌可注射的配制液可为无菌可注射的溶液、或是悬浮于无毒的非口服注射稀释液或溶剂中，例如1，3_ 丁二醇的溶液。可使用的可接受载体及溶剂为甘露醇(mannitol)、水、林格氏溶液(Ringer’ ssolution)或等渗透的氯化钠溶液。除此之外，非挥发油是公知的溶剂或是悬浮介质(例如合成单甘油酯或双甘油酯)。脂肪酸如油酸(oleic acid)与其甘油酯衍生物，亦可用于制备注射剂，天然医药可接受的用油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是其多氧乙基化的型态，同样可用于制备。这些油酯溶液或悬浮液，可包含长链醇类稀释液或分散剂、羧甲基纤维素、或类似的分散剂。其它常用的界面活性剂，如Tween或Spans、或其它相似乳化剂、或一般医药制造业所使用于医药可接受的固态、液态或其它可用于剂型开发目的的剂量型式的生物可利用增强剂。用于口服投药的组成物可为任何一种口服可接受的剂型，包括胶囊、锭片、乳化液与水悬浮液、分散液与溶液，但不限于此。以锭片为例，一般所使用的载体为乳糖或是玉米淀粉，润滑剂(如硬脂酸镁)亦常被添入其中。以口服胶囊投药型式而言，可用的稀释剂包括乳糖与干燥玉米淀粉。当以水悬浮液或乳化液经口投药时，活性成分可悬浮或是溶解于混有乳化剂或悬浮剂的油状界面中。如果需要，可添加适度的甜味剂、风味剂或是色素。鼻用气化喷雾剂或吸入剂组成物，可根据医药剂型领域中已知技术进行制备。例如，此组成物可制备为盐溶液，应用苯甲醇(benzyl alcohol)或其它适合的防腐剂、增强生物可利用性的促吸收剂、碳氟化合物、及/或该领域中其它技艺中已知的溶解剂或分散剂。含汉黄芩素化合物的医药组成物，亦可以栓剂方式进行直肠投药。医药组成物的载体必须为「可接受性」，即其必须与组成物的活性成份兼容(较佳系能稳定活性成份)，并且不能对被治疗的试体造成伤害。一种或多种能与汉黄芩素化合物形成溶解性更佳的复合物的溶解剂(如环糊精)，也可用为传递活性化合物的医药载体。其它载体举例包括胶质氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、月桂硫酸钠与D&C黄色10号。以下是由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟习此技艺的人士，可由本说明书所揭示的内容，轻易地了解本发明的其它优点与功效，亦可了解以下实施例仅为说明用，并非用于限制本发明范围。本发明亦可由其它不同的具体实施例加，以施行或应用，本说明书中的各项细节，亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。 黄芩萃取物的制备取11. 25克黄芩药材(Coptis chinensis)，加入I. 2公升的水，煮沸萃取持续I小时后，大约可得到450ml的萃取产物，分成数份储存于4°C。除上述直接储存水萃产物于
4°C之外，亦可使用冷冻干燥储存萃取产物。于进行后续实验前，储存于4°C的萃取产物先行使用O. 22 μ m的滤膜过滤。汉黄芩素溶液的制备使用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)作为溶剂,溶解汉黄岑素水合物(wogonin hydrate,购自Wako),以制备不同浓度的汉黄岑素溶液。细胞培养自中国台湾生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and ResearchCenter,BCRC)购得非小细胞型肺癌(non-small cell lung cacinoma,NSCLC)细胞株A549、NCI-H460与NCI-H520以及正常肺细胞株MRC5，其中A549以F12K培养基(21127，GIBC0,Carlsbad, U. S. A.)培养，NCI-H460 与 NCI-H520 两者皆以 RPMI1640 培养基(23400，GIBC0，Carlsbad, U. S. A.)培养，MRC5 则以 MEM 培养基(41500, GIBC0, Carlsbad, U. S. A.)培养。上述所有培养基皆含有10% FBS (10437，GIBC0, Carlsbad, U. S. A.)，且所有细胞培养皆在37°C>5% CO2 的培养箱(Thermo forma 370，Waltham, U. S. A.)中进行。高效液相层析分析使用装配有逆相管柱(reverse-phaseODS Hypersil C18,250mm x 4. 6mm)的高效液相层析系统(High-performance liquid chromatographysystem, HPLC system,Hitachi)，于管柱温度为30°C下进行分析。样本注射体积为50 μ 1，流速为I. 0ml/min,并测量流出液的UV吸收值(280nm)。冲提时以甲醇(methanol) (A)与水(H2O) (B)比例调整为0min, A : B =25 : 75 — 18min, A : B = 70 : 30 — 26min, A : B = 70 : 30 — 28min, A B =25 : 75 — 30min, A : B = 25 : 75。将上述汉黄芩素溶液与黄芩萃取物进行HPLC分析，其结果显示汉黄芩素吸收峰的滞留时间大约在24分,而黄岑萃取物在滞留时间大约在24分的位置同样具有一个吸收峰，此表示本发明的黄芩萃取物含有汉黄芩素化合物。统计分析
以下测试例所得的数据，全数皆以平均值土标准差(mean土SE)表示，并使用SPSS软件，以学生氏测试法(Student，s test)与变异数分析法(Analysis of variance,ANOVA)判定各群组的差异显著与否，其中当P值小于O. 05时，则视为显著差异。测试例一细胞增殖测试于24孔盘中，每孔培养IX IO4个待测细胞，待培养16小时后，将黄芩萃取物(图中以SB代表)或不同浓度的汉黄芩素溶液等待测样本直接加入24孔盘内，再于37°C下培养24小时、48小时与72小时。 MTT分析法使用经O. 22 μ m过滤膜过滤的PBS，配置出浓度为5. 5mg/ml的溴噻唑蓝溴化四唑(Thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT, m5655, Sigma, St. Louis, U. S. A.)溶液。配置所得的MTT溶液，取50 μ I加入经过24小时、48小时与72小时培养的Α549、NCI-H460、NCI-H520与MRC5等细胞株的24孔盘内，再于37°C下培养2小时后，移除所有的培养液。每孔再加入500 μ 1DMS0,以溶解MTT与粒线体中去氢酶反应所得的产物甲臜(formazan)。以吸液器反复吸吐使甲臜完全溶解，将200 μ I所得溶液转至96孔ELISA盘，使用微孔盘测量仪(Microplate Autoreader EL311, Bio-Tek Instruments, Winooski, U.S.A.)侦测吸光值(0. D. 570nm)，结果如图IA与IB所示，其中所有的数据皆以不含药剂的DMSO处理细胞的背景值进行标准化(normalization)。参考图1A，其为黄芩萃取物(4% v/v)对A549、NCI-H460、NCI-H520与MRC5等细胞株的测试结果，其中*代表P < O. 05。由图IA可知添加黄芩萃取物经过24小时培养后，便可以看到相较于正常细胞的存活率，癌细胞的存活率明显下降，持续培养至72小时后，癌细胞的存活率更是显著下降，此表示本发明的黄芩萃取物可以在不影响正常细胞的前提下毒杀癌细胞或抑制其增值，使其存活率下降。参考图1B，其为汉黄芩素溶液(40μΜ、80μΜ、120μΜ、160μΜ)与Α549细胞株培养48小时后的测试结果。如图IB所示，对于Α549细胞株的抑制随着汉黄芩素溶液的浓度增加而增加，且其半抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration, IC50)约为 85 μ Μ。由图IB可知汉黄芩素化合物类似于本发明黄芩萃取物，同样可以毒杀癌细胞，使其存活率下降。萘胺蓝染剂分析使用萘胺蓝染剂(Trypanblue, T10282, Invitrogen, Carlsbad, U. S. A.),对经过黄芩萃取物(4% v/v)处理的A549细胞株染色，然后将细胞染色液转至细胞计数腔室玻片上(Countess Cell Counting Chamber Slide,C10228,Invitrogen,Carlsbad,U. S. A.),再使用自动化细胞计数器(Countess Automated Cell Counter, C 10227, Invitrogen,Carlsbad,U. S. A.)测量细胞数目，结果如图IB所示，其中所有的数据皆以不含药剂的DMSO处理细胞的背景值进行标准化(normalization)。参考图1C，其为黄芩萃取物(4% v/v)对A549细胞株的测试结果，其中*代表P<0.05。由图IB可知添加黄芩萃取物经过48小时培养后，便可以明显看到相较于无处理组(控制组，ctrl)的存活率，处理组癌细胞的存活率明显下降，持续培养至72小时后，癌细胞的存活率更是显著下降。图IC的结果呼应图IA的结果，因此更加证明本发明的黄芩萃取物可以在不影响正常细胞的前提下毒杀癌细胞，使其存活率下降。测试例二 细胞周期测试于IOcm培养皿中，培养3 X IO5个A549细胞株，当细胞进入对数(Iogarithmical)生长期时，细胞数目便足以进行分析。待16小时后，此细胞以黄芩萃取物处理24小时、48小时与72小时，再以胰蛋白酶处理(trypsinization)以收集细胞。使用冰乙醇(70% )于_20°C下将细胞固定过夜后，使用PBS清洗细胞以移除乙醇。将PI染色缓冲液(PBS RNase (10 μ g/ml) PI (I μ g/ml) = 97 I 2)加入细胞液，其中每 I X IO6 个细胞添加Iml PI染色缓冲液，以确保DNA完全染色，于37°C下避光持续震荡染色30分钟。使用尼龙筛(35μπι)过滤细胞，防止细胞群集。然后，将样本移入圆底管并尽快以流式细胞仪(FACSCalibur)分析，并制订单细胞闸以排除聚集的细胞。每样本收集一万五千个细胞，以完成细胞周期分布，再使用Modfit软件(Verity Software House, Topsham, U. S. A.),计算不同细胞周期阶段的百分比，其结果如图2A及2B所示。 参考图2A，其为黄芩萃取物(4% v/v)处理后A549细胞株的细胞周期分析结果，其中*代表P < O. 05，**代表P < O. 01，***代表P <0.001。由图2A可知黄芩萃取物处理48小时及72小时后，A549细胞株的细胞周期明显阻断在Gl阶段，而黄芩萃取物处理24小时、48小时及72小时后，皆发现A549细胞株的细胞周期明显阻断于G2阶段，此表示本发明的黄芩萃取物可抑制癌细胞持续分裂。参考图2B，其为黄芩萃取物(4% v/v)处理48小时后，A549细胞株(培养基中仅含I %低浓度的血清)的细胞周期分析结果，其中***代表P < 0.001。由图2B可知黄芩萃取物处理明显增加Sub-Gl阶段的细胞族群，此表示本发明的黄芩萃取物可以让癌细胞不继续分裂、增殖而朝向细胞凋亡(apoptosis)。测试例三西方氏点墨测试于IOcm培养皿中，培养3 X IO5个A549细胞株，当细胞进入对数(Iogarithmical)生长期时，细胞数目便足以进行分析。细胞以IC5tl剂量的黄芩萃取物或汉黄芩素处理48 小时，收集细胞并以 RIPA 缓冲液(IOmM Tris (pH 7. 4), 150mM NaCl,5mM EDTA (pH
8.0),0. I % SDS,1 % DOS, I % NP40)溶解，再混入蛋白酶抑制剂混合组(proteaseinhibitor cocktail, Pierce, Rockford, U. S. A.)、憐酸酶抑制剂混合组(phosphataseinhibitorcocktail, Sigma, St. Louis, U. S. A.),而后以 13, 000g、4 °C 离心 30 分钟，以将细胞残渣离心而沉降于底部，离心后收集上清液，再混入样本缓冲液(IOOmM Tris-Cl(pH 6.8),4% (w/v) SDS,0. 2% (w/v)溴酚蓝，20% (v/v)甘油，200πιΜβ -巯基乙醇，储存于-80°C直至使用为止)。根据制造商操作手册，以BCA蛋白质分析套组(BCA protein assay kit, 23250,Thermo Scientific, Waltham, U. S. A.)定量蛋白质浓度，每一样本取20 μ g的蛋白质，以10%至15%的SDS-PAGE进行电泳，SDS-PAGE的浓度系根据与侦测的蛋白质的分子量决定。而后将SDS-PAGE，以400mA转印至硝酸纤维(nitrocellulose，NC)膜，持续I至2小时。转印膜置于含5 % 脱脂奶粉的 TBST (Tris Buffered Saline with 0. 05 %Tween-20)中，在室温下浸泡I小时。而后，转印膜以TBST清洗两次，每次五分钟，以去除多余的牛奶，而后在4°C下，将转印膜泡在适当稀释之一级抗体并缓和震荡持续过夜。转印膜以TBST清洗三次，去除过多一级抗体后，再将转印膜浸泡于对应HRP键结的二级抗体持续 I 小时。最后，膜上添加 HRP 基质(WBKLS0050, Millipore, Billerica, U. S. A.)，以显现蛋白质表现图型，再利用影像系统(Fuji LAS-3000imaging system)抓取影像,而后使用软件(Multi Gauge software (FUJIFILM, Tokyo, Japan)对墨点影像定量,其结果如图3A至图3L所示。参考图3A至图3F，其分别为黄芩萃取物处理后CDK4、CDK6、cyclinD3 (G1/S调控蛋白)、P_RB(磷酸化视网膜胚细胞瘤蛋白质(retinoblastoma protein)) >cyclin BI (G2/M调控蛋白)、p_cdc2 (磷酸化细胞分裂控制蛋白2)的表现结果,其中p-RB与p_cdc2分别以ser807/811及Thrl61的抗体辨识。参考图3G与图3H，其分别为上皮标帜蛋白E型钙黏素(E-cadherin)与间叶标巾只蛋白(Vimentin)的表现结果。参考图31至图3L,其分别为ALDHlAl、0_catenin、⑶147与ABCG2(四者为癌干细胞标帜蛋白)的表现结果。上述图3A至图3L中，*代表P < O. 05，#代表P < O. 01，*#代表P < O. 001，胞内控制组(internalctrl)为β-肌动蛋白。
由图3Α至图3F可知黄芩萃取物处理后，上述Gl调节蛋白质⑶Κ4、⑶Κ6、cyclinD3与p-RB，以及G2调节蛋白质cyclin BI以及p-cdc2的表现量皆显著减少；由图3G及图3H可知黄芩萃取物处理后，间叶标帜蛋白(Vimentin)的表现量显著减少；由图31至图3L可知黄芩萃取物处理后，上述癌干细胞标帜蛋白质ALDH1A1、β -catenin、⑶147与ABCG2的表现量皆显著减少，此表示本发明的黄芩萃取物可以抑制癌干细胞增殖。测试例四穿孔(Transwell)分析于24孔穿孔盘(Corning, Lowell,U. S. A.)中，每孔使用不含血清的培养基100 μ I培养2Χ IO4个Α549细胞，每一 6. 5mm嵌插件的上方部分设有孔，尺寸为8 μ m，底间隔填满有500μ I含10% FBS的F12K培养基。以黄芩萃取物(4% v/v)处理四小时后，以对甲醒(paraformaldehyde, PFA)固定细胞10分钟，然后使用4 ' ,6-二脒_2_苯基Π引哚(DAPI PBST,= I 10000,PBST Phosphate Buffered Saline with 0. 2% Tween-20)染色10分钟。嵌插件以PB ST清洗三次每次10分钟，而后以活细胞影像系统(Leica，Wetzlar, Germany)观察，并用 MetaXpress 软件(Molecular Devices, Sunnyvale, U. S. A.)定出细胞数量，其结果如图4A所示。参考图4，其为黄芩萃取物处理后全数15个显微镜观察视野中单位视野的细胞数量，其中***代表P < 0. OOl0由图4结合图3H可知相较于控制组，黄芩萃取物明显可以减少癌细胞转移。测试例五侧群细胞(Side population)分析于IOcm培养皿中，培养3 X IO5个A549细胞株，获得足以进行分析的细胞数目。细胞以IC5tl剂量的黄芩萃取物或汉黄芩素处理48小时，以胰蛋白酶处理收集细胞后离心，细胞重新悬浮于含2 % FBS的培养基，其中每一毫升含有I X IO6个细胞。将50 μ M作为阻断剂的 ABC 转运蛋白族群(reserpine, Sigma, St. Louis, U. S. A.)连同 Hoechst33342 染剂(Invitrogen, Carlsbad, U.S.A. , 5 μ g/ml)加入细胞,或上述染剂单独加入细胞。所得样本在37°C下缓和震荡培养2小时，以确保染色均匀。以PBS清洗细胞后，使用PI染色(20ng/ml)判定活/死细胞。为了设定荧光补偿，亦制备单染色及无染色群组。以35 μ m尼龙筛过滤样本，防止细胞群聚。PI阳性反应的死细胞首先排除，以避免伪阳性，然后赫斯特蓝(Hoechst blue)与赫斯特红点绘制可判定侧群细胞。对于样本两组群(reserpine添加族群与无reserpine添加组群)，减少的区域则定义为侧群细胞，侧群细胞的百分比则以Flowjo 软件(TreeStar, Ashland, U. S. A.)分析,其结果如图 5A 与 5B 所不。参考图5A与图5B，其分别为黄芩萃取液与汉黄芩素溶液处理后的侧群细胞(SP)分析结果，其中**与分别代表口 < O. 01与P < O. 001。由图5A与图5B可知经过黄芩萃取液与汉黄芩素溶液处理后，侧群细胞(即一般认定的类癌干细胞)明显减少，因此结合参考图5A与图31至图3L，可证明黄芩萃取液可以抑制癌干细胞。
上述实施例仅为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请的权利要求范围所述为准，而非仅限于上述实施例。
权利要求
1.一种抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，包括 一汉黄芩素化合物；以及 一医药上可接受性载体。
2.如权利要求I所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该汉黄芩素化合物包含于一黄芩萃取物中。
3.如权利要求2所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该黄芩萃取物是一黄芩水萃取物或由该黄芩水萃取物干燥而得。
4.如权利要求3所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该黄芩水萃取物是提供一黄芩药材，添加50倍至200倍该黄芩药材重量的水，形成一混合物后，对该混合物加热萃取而得。
5.如权利要求4所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该萃取的时间为30分钟至2小时。
6.如权利要求4所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该混合物是加热至体积成为原始体积的四分之一至二分之一。
7.如权利要求I所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该癌干细胞是非小细胞型肺癌细胞。
8.如权利要求I或7所述抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物，其中，该癌干细胞或该癌细胞是非小细胞型肺癌细胞。
9.一种使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途。
10.如权利要求9所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该汉黄芩素化合物包含于一黄芩萃取物中。
11.如权利要求10所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该黄芩萃取物是一黄芩水萃取物或由该黄芩水萃取物干燥而得。
12.如权利要求11所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该黄芩水萃取物是提供一黄芩药材，添加50倍至200倍该黄芩药材重量的水，形成一混合物后，对该混合物加热萃取而得。
13.如权利要求12所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该萃取的时间为30分钟至2小时。
14.如权利要求12所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该混合物是加热至体积成为原始体积的四分之一至二分之一。
15.如权利要求9所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该癌干细胞是非小细胞型肺癌细胞。
16.如权利要求9所述使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂的用途，其中，该癌干细胞或该癌细胞是非小细胞型肺癌细胞。
全文摘要
本发明是有关于一种抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的医药组成物及其应用，该医药组成物包括一汉黄芩素化合物；以及一医药上可接受性载体。该应用为使用汉黄芩素化合物制造抑制癌干细胞生长或癌细胞转移的药剂。
文档编号A61P35/00GK102973550SQ20111025998
公开日2013年3月20日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者谢秀梅, 李政育, 沈志谦, 王天骏 申请人:谢秀梅, 李政育