专利名称：环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环磷酰胺的应用，尤其涉及环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的肝脏疾病，是一种广泛影响人类健康的疾病，在中国有高达10%的人群被乙肝病毒感染成为乙肝病毒携带者或乙型肝炎患者。乙肝病毒感染肝脏的肝细胞并不造成肝细胞的损伤，但乙肝病毒对人体而言属于完全异己的生物体，其抗原成分会强烈刺激机体免疫系统，并趋化大量免疫细胞达到肝脏部位， 以便将乙肝病毒进行清除，但这种募集的免疫细胞会导致强烈的炎症反应，正是这种炎症直接地损伤肝脏细胞，引发乙型肝炎。目前对于乙肝病毒感染所致的乙型肝炎的治疗并不理想。尽管免疫调节剂如干扰素类和抗病毒的核苷类药物被广泛用于慢性乙型肝炎的治疗，并且是作为治疗乙型肝炎常用的临床用药，但干扰素类药物通常具有较强的毒性，长期或大量服用对于患者的毒副作用非常明显，而核苷类抗病毒药物只能抑制HBV的DNA复制，不能完全清除乙肝病毒，需要长期服药甚至是终身服药，但核苷类抗HBV药物又往往导致耐药性的产生，使治疗失败。其它种类的药物在临床治疗中也存在类似的问题。因此，如何克服现有的治疗乙型肝炎药物的缺陷成为有待解决的问题。
发明内容
本发明提供了环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。本发明还提供了环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎的辅助药物中的应用，该辅助药物为辅助核苷类抗病毒药物治疗乙型肝炎的药物。环磷酰胺是目前广泛应用的抗癌化疗药物，其对包括恶性淋巴瘤、急性或慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、乳腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌、肺癌、头颈部鳞癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤在内的肿瘤均具有一定的疗效。在临床治疗中主要为口服和注射给药，通过给患者摄入较大剂量的环磷酰胺，达到杀死肿瘤的目的，并且，为了杀死肿瘤，需要维持一定时间的连续给药，以及周期性治疗，但由于大剂量且长时间治疗，在杀死肿瘤的过程中对患者身体伤害也非常大。目前还没有报道显示环磷酰胺可作为乙型肝炎治疗药物或乙型肝炎治疗的辅助药物，尤其是可以经低剂量口服实现对乙型肝炎的治疗或辅助治疗。核苷类抗病毒药物例如包括拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦和阿德福韦等，是目前治疗乙型肝炎常用的临床用药中的一种或多种。上述核苷类抗病毒药物已被广泛应用于治疗乙型肝炎，但最大问题是上述核苷类抗病毒药物治疗机理是只能抑制HBV的DNA复制，而非清除乙肝病毒，临床上常见的情况是，采用治疗达到预期效果后一旦停药，由于病毒的反弹，其血清病毒DNA载量甚至超过治疗前水平，因此需要长期甚至终身服药，不仅给患者造成痛苦，同时还面临耐药的风险，不仅贻误治疗还可能引发其它病症(例如对其它脏器功能的损害)，这也是乙肝治疗难度大的原因。因此，开发新的抗乙肝病毒的药物具有重要的临床意义。本发明人研究发现，提高机体免疫能力来有效杀灭乙肝病毒，是清除乙肝病毒的理想手段。低剂量的环磷酰胺通过选择性地杀伤调节性T细胞，使效应性T细胞增殖活化能力增强，从而能够有效增强机体的抗病毒免疫反应。该结论虽然已经有公开，但从另一方面，增强抗病毒免疫，同时也导致炎症的加强，后者会进一步恶化对肝细胞的损伤。所以，环磷酰胺药物与治疗乙型肝炎之间的关系，在本发明以前始终没有确定的结果。本案发明人的研究发现，使用环磷酰胺，尤其是口服低剂量环磷酰胺，在治疗乙型肝炎中具有意想不到的效果，对乙肝患者，口服环磷酰胺治疗能够平衡免疫反应和炎症反应，达到治疗乙肝病毒感染的目的。发明人的研究还发现，虽然上述核苷类抗病毒药物不能从根本上治愈乙型肝炎， 但经核苷类抗病毒药物治疗后的乙型肝炎患者，其血清HBV-DNA载量迅速下降、肝功能恢复正常、肝脏组织学的病变明显改善，体内存在的乙肝病毒数量已大大减少，如在此时应用环磷酰胺作为辅助核苷类抗病毒药物治疗乙型肝炎的辅助药物，即，实施对乙肝的免疫治疗，提高机体抗病毒免疫能力以杀灭这些残余的病毒，同时不会造成过多的肝损伤，并且经核苷类抗病毒药物治疗之后转好的肝功能也为后续的抗病毒免疫治疗提供了支撑。环磷酰胺可以在清除剩余乙肝病毒的同时保持肝脏细胞的炎症反应在机体可承受的范围，不对患者的肝肾功能产生不良影响。本发明的研究发现，乙型肝炎患者经核苷类抗病毒药物治疗之后，在病毒载量和肝功能恢复的情况下，再联合低剂量的环磷酰胺可有效清除乙型肝炎患者所感染的乙肝病毒，而且对患者肝肾功能均不产生影响，无明显的毒副作用。在停止核苷类抗病毒药物治疗之后，未见乙肝病毒的反弹，达到防止复发，无须长期服用核苷类抗病毒药物的目的。可以理解，环磷酰胺作为治疗乙型肝炎的辅助药物，具有独特的优势。在本发明的方案中，作为治疗用药的环磷酰胺可以是目前已经临床使用的药物种类和规格，也可以是利用环磷酰胺作为有效成分而自制的药剂。可以商购的药物例如环磷酰胺注射液、环磷酰胺片等。优选采用环磷酰胺片通过低剂量口服给药实现对乙型肝炎的治疗。进一步的，可以使用单位制剂的环磷酰胺，所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，常见的单位制剂如一单位(片)片剂、一单位(针)针剂等，其中作为有效成分的环磷酰胺含量为一次给药所需的量。本领域技术人员可以根据患者乙型肝炎的严重程度，选择合适的药物规格(含有的环磷酰胺的量)，同时也可以根据使用核苷类抗病毒药物治疗后的状态，选择合适的辅助药物规格(含有的环磷酰胺的量)，作为药物或辅助药物时，采用低剂量给药，优选给患者口服环磷酰胺片，对于成人(体重在正常范围)给药剂量每天一次，每次50mg (—片)，远低于环磷酰胺通常在肿瘤化疗中使用的剂量(一般为 2mg-10mg/kg体重)。治疗过程为连续服药7天，间隔7天后，再连续服药7天，再间隔7天后，再连续服药7天，作为一个治疗周期。总之，本发明的研究结果证明，将环磷酰胺作为治疗乙肝病毒感染肝脏的药物，尤其是控制低剂给药，在临床治疗中能够比较好地实现对免疫反应和炎症反应的平衡，可在提高机体免疫力的同时避免肝脏细胞产生严重的炎症反应；尤其是用于辅助核苷类抗病毒药物对乙肝病毒感染肝脏的治疗，可实现对乙肝病毒的有效清除，同时保持肝脏细胞的炎症反应在机体可承受的范围。
图1显示了环磷酰胺降低了乙型肝炎患者外周血调节性T细胞的比例。图2显示了环磷酰胺降低了乙型肝炎患者外周血调节性T细胞的数量。图3显示了环磷酰胺不影响乙型肝炎患者外周血总T细胞的数量。图4显示了环磷酰胺不影响乙型肝炎患者外周血NK细胞的数量。图5显示了环磷酰胺增强了乙型肝炎患者效应性T细胞的增殖活化能力。图6显示了环磷酰胺增强了乙型肝炎患者效应性T细胞的增殖活化能力。图7显示了环磷酰胺降低了乙型肝炎病毒携带者的HBV载量。图8显示了环磷酰胺作为辅助药物增强了对经核苷类抗病毒药物治疗后患者体内残余HBV的清除。图9A和图9B显示了环磷酰胺不影响乙型肝炎患者的肝肾功能。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明实施例的技术方案。为了证实将环磷酰胺应用于制备治疗乙型肝炎药物，所得的药物可在提高机体免疫力的同时避免肝脏细胞产生严重的炎症反应；将环磷酰胺应用于制备辅助核苷类抗病毒药物制备治疗乙肝病毒感染肝脏的辅助药物，获得的辅助药物可实现对乙肝病毒的有效清除，同时保持肝脏细胞的炎症反应在机体可承受的范围，下面结合附图和实施例进一步说明本发明。实施例1 环磷酰胺可清除乙型肝炎患者调节性T细胞。实验者为病症基本相同的乙型肝炎患者，共M名，分为等数量两组。第1天，对第一组的12名乙型肝炎患者(体重为52_7^g)每天施用50mg环磷酰胺片1次，连续给药7天，作为给药组；同时对第二组的12名乙型肝炎患者(体重为 55-77kg)每天施用50mg淀粉安慰剂1次，连续给药7天，作为对照组。第8天，分别取上述给药组和对照组患者的外周血进行流式细胞术分析。与施用安慰剂的对照组相比，施用环磷酰胺的给药组患者显示出显著降低的外周血调节性T细胞的比例和数量(图1和图2，* < 0. 05)，但其总T细胞和NK细胞的水平则不产生影响(图 3 和图 4，* < 0. 05)。实施例2 环磷酰胺增强了乙肝患者细胞免疫应答。实验者为病症基本相同的乙型肝炎患者(体重为45_85kg)，共12名，分为等数量两组。对第一组的6个乙型肝炎患者施用50mg低剂量环磷酰胺，作为给药组，同时对第二组的6个乙型肝炎患者施用50mg淀粉安慰剂，作为对照组，7天时间后，分别分离上述给药组和对照组患者的外周血单个核细胞(PBMCs)，进行效应性T细胞增殖试验(调节性T细胞为抑制性细胞，其抑制效应性T细胞的增殖，清除调节性T细胞能促进效应性T细胞的增殖)，具体为在96孔培养板中培养PBMCs，培养至良好状态。
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第1天，将上述培养好的来自给药组患者的PBMCs分为两组，在来自给药组患者的第一组PBMCs中加入抗⑶3和⑶观的抗体，48小时后，进行氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 标记实验以检测效应性T细胞的增殖；对来自给药组患者的第二组PBMCs中采用NK细胞分离试剂盒分离NK细胞，然后对分离的NK细胞进行对NK细胞敏感的1(5 白血病细胞的杀伤试验；同样在第1天，将来自对照组患者的PBMCs分为两组，以相同的方法检测检测效应性T细胞的增殖，以及进行NK细胞杀伤试验，结果如图5和图6所示。可以看出与施用安慰剂的对照组相比，施用50mg的环磷酰胺的给药组中效应性T 细胞的增殖能力显著增强(* < 0. 05)，并且对1(5 白血病细胞具有更强的杀伤作用。实施例3 环磷酰胺降低了乙型肝炎病毒携带者的HBV载量。实验者为病症基本相同的乙型肝炎病毒携带者，这些患者的外周血中HBV病毒载量> IO6拷贝数，但肝功能正常且无其它临床症状，共20名，分为等数量两组。对第一组的10名乙型肝炎病毒携带者(体重为52_75kg)，每天口服给药50mg环磷酰胺片1次，连续给药四周，作为给药组；对第二组的10名乙型肝炎病毒携带者(体重为55_77kg)，每天口服给药50mg淀粉安慰剂1次，连续服用四周，作为对照组；给药四周后，检测上述给药物和对照组患者的外周血中HBV病毒载量，结果如图7 所示，口服环磷酰胺片的给药组中有3人的病毒载量拷贝数显著下降，从IXlO6以上降到 1 X IO4以下，而施用淀粉安慰剂的对照组中则无一人病毒载量下降。实施例4 环磷酰胺作为辅助药物增强了对经核苷类抗病毒药物治疗后患者体内残余HBV的清除选取经核苷类抗病毒药物拉米夫定治疗后，血清转氨酶水平正常、HBV-DNA拷贝数小于IO4的乙型肝炎患者M人(体重为52-7^g)，随机平均分为3组进行不同治疗第1天开始，对第一组中的所有患者每天施用拉米夫定(IOOmg/次/天)并联合低剂量环磷酰胺片(50mg)，治疗5周后，停用拉米夫定但继续采用上述低剂量环磷酰胺片治疗5周(每天一次，每次50mg，连续7天，间隔7天后，再以同样剂量连续服用环磷酰胺片7 天，间隔7天，再连续服用7天，总时间为5周)，然后停药，一个月后检测患者血清HBV-DNA 拷贝数；第1天开始，对第二组中的所有患者每天施用第二组拉米夫定(IOOmg/次/天) 并联合低剂量环磷酰胺片(50mg)，治疗5周后停药，一个月后检测血清HBV-DNA拷贝数；第1天开始，对第三组中的所有患者每天施用拉米夫定(IOOmg/次/天)，5周后停药，一个月后检测血清HBV-DNA拷贝数。图8中各线条左端为停药时的HBV-DNA拷贝数，右端为停药1个月后的HBV-DNA 拷贝数，从图8可以看出第三组中的患者停药1个月后，HBV-DNA拷贝数均反弹上升在IO5 拷贝数以上；第二组中的患者，在1个月后多数患者的HBV-DNA拷贝数出现反弹，但力度不大，有2名患者未反弹；而第一组中有一半患者未反弹。上述结果表明环磷酰胺作为辅助药物增强了对经核苷类抗病毒药物治疗后患者体内残余HBV的清除。实施例5 环磷酰胺不影响乙型肝炎患者的肝肾功能。分别对上述实施例4的三组患者，在最后停药时，取患者的外周血，检测血中谷丙转氨酶和肌酐含量，结果如图9A-图9B所示。与未用环磷酰胺的第三组比较，服用了环磷酰胺的第一组和第二组患者血中的谷丙转氨酶和肌酐含量均没有显著变化，表明低剂量环磷酰胺不影响乙型肝炎患者的肝肾功能。
权利要求
1.环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述药物为口服制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，所述药物为片剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，所述药物每单位制剂含环磷酰胺50mg。
5.环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎的辅助药物中的应用，该辅助药物为辅助核苷类抗病毒药物治疗乙型肝炎的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，所述核苷类抗病毒药物包括拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦和阿德福韦中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的应用，所述辅助药物为口服制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，所述辅助药物为片剂。
9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，所述辅助药物每单位制剂含环磷酰胺50mg。
全文摘要
本发明提供了环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎药物中的应用，以及环磷酰胺在制备治疗乙型肝炎的辅助药物中的应用，本发明的研究证明，环磷酰胺作为治疗乙型肝炎的药物或辅助药物，可有效调动机体产生抗人乙型肝炎病毒的免疫应答，清除乙型肝炎患者所感染的乙型肝炎病毒，同时产生的炎症反应在机体的可承受范围，对乙型肝炎产生良好治疗作用，并可防止病毒反弹，而且无明显的毒副作用。
文档编号A61K31/675GK102349922SQ201110302298
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者黄波 申请人:湖北盛齐安生物科技有限公司