中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系的制作方法

文档序号:869576阅读:347来源:国知局
专利名称:中国患者c基因型多重耐药突变hbv稳定复制表达细胞系的制作方法
技术领域
本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)稳定复制表达细胞系,特别是所含病毒来源于我国患者C基因型HBV株,且具备多重耐药突变位点的HBV稳定复制表达细胞系。
背景技术
建立某种病毒的稳定复制细胞模型,产生具有完整的病毒生命周期并能长期持续分泌病毒颗粒,是进行体外抗病毒药物筛选以及研究抗病毒机制的必需工具。特别是在需要标准化的实验,如进行药物的抗病毒效果评价时,病毒的稳定复制表达细胞系的建立尤
其重要。由于HBV基因组不同的读码框架及调控序列之间相互重叠,需要携带大于一个完整3. 2kb基因组序列的载体才能在转染的细胞系里建立稳定的HBV复制状态,保证3. 5kb 前基因组RNA的有效转录。已有的研究证实从1. 05拷贝至4. 0拷贝质粒均可产生稳定复制细胞系。国内外学者经过不同的尝试,建立了数株HBV复制细胞系,如目前公认并广泛应用的整合了 D基因型/ayw亚型野生HBV株的H印G2. 2. 15细胞Sells MA, et al. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84 :1005_9,可被四环素调控表达的H印AD38细胞Ladner SK, et al. Antimicrob. Agents Chemother, 1997,41 :1715_20以及 Huh7. 93 细胞、H印G2. 117 细胞等Sun DX, et al. J H印atol,2006,45 :636-5。随着抗HBV药物核苷(酸)类似物种类增加及在临床长期广泛应用,HBV耐药突变株逐渐出现并成为临床抗病毒治疗失败或疗效不佳的主要原因。为满足耐药突变株的病毒学特性研究以及一些新研发的抗病毒药物的药效评价,耐药突变HBV稳定复制细胞株也相继在一些实验室建立。如Ladner等在1998年率先建立了拉米夫定 (LAM)耐药突变(rtM204V/I)稳定复制细胞系Ladner SK, et al. Antimicrob Agents Chemother, 1998,42 :2128-31], Delaney等利用定点突变方法先后建立了 LAM耐药突变(rtL180M士rtM204V/I),阿德福韦酯(ADV)耐药突变(rtA181V/T士rtN236T)细胞系 [Delaney WE, et al. Antimicrob Agents Chemother, 2001,45 :1705-13,Seifer 等也人为突变野生D基因型病毒,产生8株不同含LAM耐药突变(rtL180M+rtM204V/I)、ADV耐药突变(rtN236T+rtA181V)、替诺福韦酯(TDF)耐药突变(rtA194T)及替比夫定(LdT)耐药突变(rtL80I/rtM204I)稳定复制细胞系kifer Μ, et al. Antiviral Research, 2009,81 147-55。已知HBV至少分为A H等8个不同的基因型和若干基因亚型,不同基因型的HBV 复制表达细胞系具有不同的病毒学特点和表型耐药特征。上述建立的HBV复制细胞株所整合的是A基因型或D基因型HBV,而中国流行的HBV株主要为C基因型及B基因型,尤其是北方地区 84% 的 HBV 感染患者为 C 基因型Li X,et al. J Clin Microbiol, 2010,48 (12) 4363-9.。另外,上述耐药突变HBV大多是通过人为定点突变产生,其建立的稳定复制细胞系表型特点并不能真实反映临床患者分离的HBV耐药株的病毒学特点,因此,已有的成熟细胞株难以适用于针对我国流行的C基因型HBV,尤其是耐药突变HBV的抗病毒药效研究。
值得注意的是,虽然目前我国临床上仅有4种核苷(酸)类抗HBV药物,用药组合方式却多达40余种,耐药变异形式也复杂多样。临床上核苷(酸)类药的长期序贯治疗有可能在产生针对第一种药物耐药的基础上,增加了对随后使用药物的耐药率,并增加了多重耐药病毒产生的风险。所谓的多重耐药病毒是指HBV基因组上同时含有核苷类药物 (LAM、ETV、LdT)耐药位点和核苷酸类药物(ADV)耐药位点。多重耐药HBV感染的发生率的上升将给临床治疗带来新的挑战;多重耐药病毒可能的感染传播性将给公共卫生安全带来新的威胁。为此,基于我国患者流行的C基因型HBV株,建立其DNA聚合酶/逆转录酶区含有同时针对核苷类似物拉米夫定(LAM)、恩替卡韦(ETV)和核苷酸类似物阿德福韦酯(ADV)的多重耐药突变位点稳定复制细胞系,是非常必要和迫切的。对于深入了解多重耐药HBV的表型特性,阐明其病毒学特征及体外感染力,帮助临床制订合理有效的防治策略具有重要
眉、ο

发明内容
本发明的目的是从来源于中国患者流行的C基因型HBV株中构建一种HBV稳定复制表达细胞系,其DNA聚合酶/逆转录酶区含有典型的同时针对核苷类似物拉米夫定 (LAM)、恩替卡韦(ETV)和核苷酸类似物阿德福韦酯(ADV)的多重耐药突变位点。该耐药细胞系能用于各种核苷和核苷酸类似物的耐药表型分析,可为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。本发明人进行了如下工作1、发明人经长期大量的筛选,从13000余例中国慢性乙肝患者血清中分离得到多重耐药HBV突变株,扩增得到了 C基因型HBV逆转录酶区(RT)基因,挑选存在多重耐药突变位点的克隆序列,构建含1. 1倍长HBV基因组的真核细胞表达质粒。上述分离得到的突变细胞株命名为多重耐药人HBV稳定复制细胞系 H印G2. 1403F。已经在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC NO :C201162,保藏时间2011年7月29日。2、建立能够支持HBV长期高水平复制并稳定表达病毒抗原和分泌完整病毒颗粒的肝癌细胞系。所建的细胞系基因组中整合有GenBank GQ402162所示的HBV RT基因序列。3、通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组化方法检测病毒抗原表达,通过对肝细胞质内HBV复制中间体中核心颗粒DNA、肝细胞核内共价闭合环状cccDNA、肝细胞培养上清中分泌的病毒DNA载量进行实时荧光定量PCR测定,以透射电镜观察浓缩的培养上清中 HBV颗粒,评估稳定细胞克隆的复制表达情况。4、以四种核苷和核苷酸类抗病毒药物用于体外表型分析,证实该细胞系的耐药表型特征。将LAM、ADV、ETV和TDF分别作用于该细胞系,通过比较其核心颗粒HBV DNA的荧光定量PCR及Southern杂交的结果分析其表型耐药特点。结果证明该细胞系对LAM、ETV 和ADV高度耐药,对TDF敏感(见实施例4)。本发明建立了多重耐药HBV稳定复制细胞系,其有益效果是1、能够持续HBV复制并产生特异性分泌抗原和分泌型病毒颗粒,能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒分泌;
2、病毒来源于中国流行的C基因病毒株,该多重耐药HBV突变株是经大样本筛选鉴定得到的,来自于13000余例中国乙肝患者;3、含有典型的多重耐药突变位点,对目前常用核苷(酸)类抗病毒药物具有明确的敏感或耐药特性。本发明的HBV稳定复制细胞系为中国流行C基因型病毒株,为研究中国患者来源的HBV的生物特性和药物筛选提供了一种实用工具,在针对对中国人群HBV的耐药监测、交叉耐药分析和新药开发等方面具有较高应用价值。


图1是重组载体pTriEx-1. I-HBV结构示意图; 图2是H印G2. 1403F细胞各代DNA复制及HBsAg和HBeAg抗原表达情况;图3是H印G2. 1403F细胞与H印G2. 2. 15细胞平均分泌抗原及DNA定量比较结果。图4是H印G2. 1403F细胞、H印G2. 2. 15细胞和H印G2细胞内HBsAg和HBcAg免疫组化染色结果;图5是H印G2. 1403F细胞分泌上清中HBV全长PCR电泳图;图6是Southern Blot检测H印G2. 1403F细胞内不同形式病毒复制DNA结果;图7是浓缩H印G2. 1403F细胞培养上清病毒颗粒电镜结果,图中A :42nm Dane颗粒B :20nm小球状表面抗原颗粒(X93,000 ;bar = 200nm);图8是H印G2. 1403F细胞对4种药物敏感性的表型分析结果(定量PCR法);图9是H印G2. 1403F细胞对4种药物敏感性的表型分析结果(Dot Blot法);生物材料保藏信息培养物名称多重耐药人HBV稳定复制细胞系H印G2. 1403F保藏编号CCTCCNO :C201162保藏单位中国典型培养物保藏中心保藏时间2011年7月29日
具体实施例方式实施例中所使用的试剂和材料来源如下Taq DNA聚合酶及限制性内切酶均购自TaKaRa公司;JM109感受态细胞购自Promega公司;DNA凝胶回收试剂及转染级质粒提取试剂盒均购自Qiagen公司;DMEM、无血清培养基购自Gibco公司;转染试剂FuGENE HD及地高辛标记dUTP等Southern杂交试剂均购自Roche公司;荧光定量PCR 试剂 Taqman PCR fluorescence detection kit for HBV 购自上海
复星公司;HBsAg和HBeAg定性检测ELISA试剂盒购自北京科卫公司。HBsAg定量检测由302医院临检中心完成。其他生化试剂购自Sigma公司。
免疫组化抗体和显色试剂为北京中杉公司产品。引物由上海生工公司合成。克隆测序由北京天一辉远生物科技公司完成。人肝癌细胞系H印G2细胞及表达neo基因抗性的质粒pSV2-ne0由解放军302医院病毒性肝炎研究室保存;支持病毒复制的载体pTriEx-mod由法国里昂大学Fabien Zoulim教授馈赠。血清S5857取自2009年3月解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者,男,45 岁,排除其他因素所致肝功能损害。提取血清中病毒DNA,扩增HBV逆转录酶区基因并克隆于pGEM-Teasy载体,挑取不同克隆进行测序,确定为C基因型。其中37_17#克隆核苷(酸) 类似物耐药相关的氨基酸突变:rtL180M, rtS202G, rtM204V, rtN236T。实施例1 1. 1倍长HBV重组表达载体构建由于该患者长期服用并经常更换核苷(酸)类药物,病毒载量检测阴性(< 250 拷贝/ml),未能扩增出HBV全基因组DNA,因此以本课题组以前构建的pTriEx-1. 1HBV-63-2 重组载体为模板,替换该患者含多药耐药突变的RT区。具体方法用Biol/Ncol分别消化 pTriExl. 1-HBV-63-2 及 Teasy-RT37-17 载体,回收 pTriEx-1. 1 HBV 载体和 RT37-17片段,同一体系中以T4 DNA连接酶连接,产生新的1. 1倍HBV基因组重组载体 pTriEx-1. 1HBV-37-17-1。1. 1倍长HBV重组片段始于前C蛋白N端止于polyA尾,含有 DRU DR2、polyA等病毒转录复制所需的元件(图1)。在HBV序列内部合成5条引物进行全长测序鉴定,结果与原序列完全一致,逆转录酶区含有典型多重耐药突变位点rtL180M, rtS202G, rtM204V, rtN236T。实施例2稳定细胞系筛选(1)质粒DNA转染和细胞克隆筛选提取转染级重组质粒pTriEx-1. 1HBV-37-17-1, 紫外分光光度计定量浓度。在37°C、含有5% C02、10% FBS的DMEM完全培养基中培养H印G2 细胞。转染前将细胞接种到M孔板培养过夜,细胞融合达到80%时更换无血清和抗生素的DMEM,用FuGENE HD脂质体导入DNA,具体方法按操作手册进行。转染后他补入FBS至 10%。设置未转染孔为阴性对照。4 细胞培养皿内加入G418(终浓度600yg/ml)筛选, 每隔2d换液,待对照组细胞完全死亡后换为维持浓度G418 (300 μ g/ml)继续筛选,2 3周时形成细胞克隆。挑取细胞克隆至96孔板,以维持浓度的G418继续培养至大面积融合,定量检测上清分泌的抗原蛋白和HBV DNA,保留高表达株扩大培养。(2)亚克隆将其中一株高表达细胞克隆进行有限稀释,具体方法制备细胞悬液 5X IO3个细胞/ml,倍比稀释50倍并调整悬液浓度为10个细胞/ml,接种于96孔板中, 100 μ 1/孔,每孔再补充100 μ 1适应性培养基。细胞培养约1周左右,孔中形成较大克隆达到50%孔底面积时,转入48孔板并加入600 μ g/ml G418筛选。持续检测HBV抗原和HBV DNA,保留稳定高表达复制细胞一株命名为H印G2. 1403F,每3天传一代,稳定传代50代以上 (>6个月),批量冻存。实施例3对本发明所构建细胞系的检测1. HBV主要抗原表达(I)ELISA 检测收集 H印G2. 1403F 细胞系第 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60代(每3天传代1次)细胞培养上清液和H印G2. 2. 15对照组培养上清,ELISA (双抗体夹心法)检测HBsAg、HBeAg的表达,波长设为450nm。H印G2. 1403F细胞平均OD值HBsAg 为 2. 51 士0. 77, HBeAg ^ 1. 31 士0. 64 (图 2),相应的 H印G2. 2. 15 细胞分别为 0. 93士0. 29 和 3. 11 士 0. 61(图 3)。(2)免疫组化多聚赖氨酸处理的玻片置于6孔板内,加入1403F细胞5 X IO5/孔,各 2孔,使细胞爬片72h,细胞固定后采用二步法进行免疫组化染色,一抗为兔抗HBs/抗HBc, 1 100稀释使用;PV-9000替代传统二抗分子直接放大结合信号,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多聚体;AEC液显色。结果显示细胞浆内有红染的阳性信号,HBsAg为浆型分布,HBcAg以核型分布为主,结果类似于H印G2. 2. 15细胞,阴性对照!fepG2细胞未见染色(图4)。2.稳定传代50代后HBV DNA检测(1)上清全长HBV基因组扩增提取培养细胞分泌上清中的病毒DNA,根据Gimther 的方法以引物 PF (CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA)和 PR(CCGGAAAGCTTGA GCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG)扩增全长基因组Gunther S, et al. J Virol, 1995,69 5437-441,3. 2Kb处可见单一扩增条带,PCR产物全长测序结果与原病毒序列完全一致,提示细胞产生了分泌性的完整病毒(图5)。(2)上清及细胞内HBV DNA定量检测细胞传代3d后,先后经NP-40裂解,DNase/ RNase和蛋白酶K消化后,用酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇漂洗后,分别提取细胞裂解液中的HBV核心颗粒DNA(HBV复制中间体)和分泌上清中的HBV DNA。采用Taqman探针法进行绝对定量PCR反应,根据已设定的标准曲线计算样本DNA量。分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA分别为5. 55X IO5和6. 58X IO7拷贝/ml。而相应的H印G2. 2. 15细胞分泌上清及细胞复制中间体核心颗粒DNA分别为4. 78 X IO5和8. 08 X IO7拷贝/ml (图2)。 可见,新建立的H印G2. 1403F细胞系能够稳定支持HBV抗原分泌和DNA复制,与2215细胞相当(图3)。(3) Southern印记检测取25 μ L HBV核心颗粒溶液用Southern杂交检测病毒复制中间体。琼脂糖凝胶,50V电压电泳3 4h,0. 3A的电流转膜20min,80°C固定浊。DIG Easy Hyb 42°C预杂交30min,用含变性随机引物探针的DIGEasy Hyb 42°C杂交过夜。化学发光法显色,压片拍照。结果显示病毒复制中间体的rcDNA、dsDNA和ssDNA三条清晰显影带,提示细胞中有完整病毒复制(图6)。(4)细胞内HBV cccDNA检测以本课题组前期建立的滚环扩增法检测肝细胞内 HBV共价闭合环状cccDNA任晓强,等.解放军医学杂志,2009,34 :675_8。Qiagen试剂盒提取约2 X IO6个细胞的全部DNA,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化后进行滚环扩增反应,再以其为模板用跨缺口引物和Taqman探针介导进行实时荧光定量PCR反应, 用β-actin作为内参校正实际细胞数,量化结果显示,H印G2. 1403F细胞系每个细胞内平均含有1个拷贝HBV cccDNA分子。3.电镜检测病毒颗粒大量培养HepG2. 1403F细胞,取20ml病毒分泌上清3000rpm离心30min,0. 22 μ m 滤膜过滤。另外将HBV表面抗体阳性健康献血员血清細1,1 5PBS稀释,0.22μπι滤膜过滤。病毒上清液与健康抗血清1 1混勻,4°C过夜,12000rpm 4°C离心30min,弃上清,沉淀物用100μ 1细胞培养液重悬,滴于有支持膜的铜网上,2%的磷钨酸负染,透射电镜下观察可见到42nm左右大颗粒和20nm左右小球型颗粒(图7)。结果提示新建立的H印G2. 1403F 细胞系能够分泌完整HBV颗粒。实施例4细胞株用于4种抗病毒药物的体外表型分析1、实验目的将本发明所获得的多重耐药人HBV稳定复制细胞系H印G2. 1403F用目前常见核苷 (酸)类似物进行药物敏感性实验,评价该细胞系实际应用效果。2、方法实验药物拉米夫定(LAM)、恩替卡韦(ETV)、阿德福韦酯(ADV)及替喏福韦酯 (TDF)将H印G2. 1403F细胞以7X 104/ml密度接种在M孔板中,12h后更换为含2% FBS 的DMEM培养基,加入上述四种药物,浓度分别设定为LAM :0,0.01,0. 1、1、10、100 μ M、ETV 0、0. 001、0. 01、0. 1、1、10μΜ、ADV:0、0. 0625,0. 125、0. 25、0. 5、1 μ Μ、TDF :0、0. 01、0. 1、1、 10、100 μ Μ,连续更新5天含相同浓度药物的培养基。随后提取细胞核心颗粒,用于DNA的荧光定量PCR检测和Dot blot实验,改良寇氏法计算每种药物处理的50%病毒抑制率(IC5tl)。3、实验结果结果一不同药物处理H印G2. 1403F细胞的荧光定量PCR分析LAM、ETV、ADV及TDF 的 IC50 分别为 124. 5μΜ、0. 915μΜ、0· 434μΜ、0· 203 μ Μ,分别是Stephanie V, et al. J H印atol,2007,46 :531-8Jun Inoue, et al. Virology,2009,395 :202_9等文献报道的野生型病毒IC50的311倍、229倍、6. 2倍和4. 7倍,其中LAM和ETV的敏感性降低均> 100倍,体现为高耐药性;体外实验中对ADV的敏感性下降3倍即为耐药,而TDF下降2 9 倍仍在药物作用的敏感区域内。定量结果说明该细胞系对LAM、ETV和ADV耐药,对TDF敏感(图8)。结果二不同药物作用H印G2. 1403F细胞的Dot blot分析细胞对4类药物的反应趋势与定量PCR结果一致(图9),随着药物浓度增加LAM、ETV和ADV处理组病毒DNA没有明显下降,TDF处理组HBV随加药剂量增加而降低。4、结论多重耐药人HBV稳定复制细胞系H印G2. 1403F含有典型的多重耐药突变位点,对目前常用核苷(酸)类抗病毒药物具有明确的敏感或耐药特性。
权利要求
1.多重耐药人HBV稳定复制细胞系H印G2.1403F,其保藏编号为CCTCC NO :C201162。
2.多重耐药人HBV稳定复制细胞系,所述细胞系基因组中整合有GenBankGQ402162所示的HBV RT基因序列。
3.权利要求1或2所述的细胞系,所述耐药是对核苷类药物和核苷酸类抗病毒药物耐药。
4.权利要求3所述的细胞系,所述核苷类药物是拉米夫定和恩替卡韦,核苷酸类药物是阿德福韦酯。
5.权利要求1或2所述的细胞系在制备防治乙肝药物方面的用途。
全文摘要
本发明构建了一株从13000余例中国慢性乙肝患者血清中分离得到的多重耐药人HBV的稳定复制细胞系。经实验证实,该细胞系能够持续进行HBV复制并合成分泌特异性抗原和分泌型完整病毒颗粒,能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒分泌;该细胞系含有典型的多重耐药突变位点,对目前常用核苷(酸)类抗病毒药物具有明确的敏感或耐药特性。该细胞系在针对中国人群HBV的耐药监测、交叉耐药分析和新药开发等方面具有较高应用价值。
文档编号A61P1/16GK102399749SQ20111035375
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者刘妍, 刘 文, 徐东平, 思兰兰, 戴久增, 李晓东, 王琳, 许智慧, 钟彦伟 申请人:中国人民解放军第三〇二医院
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