专利名称：(1S,3S)-1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉酰氨基酸、其合成、抗栓活性和作为抗血栓 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰氨基酸、涉及它们的合成，涉及它们的体外抗血小板聚集活性、进一步涉及它们在大鼠血栓形成模型上的抗血栓活性。因而本发明涉及(13，3幻-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-0-咔啉酰氨基酸作为抗血栓剂的临·床应用前景。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
血栓性疾病是一种常见的心脑血管病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞等。每年每千人中有I 3人发生不同形式的血栓性疾病，严重影响人类健康。目前临床上常用的抗栓和溶栓药物都存在着这样或那样的缺点，如出血、肝损伤、胃黏膜损伤等毒副作用，寻找更加安全有效、毒副作用小的抗栓药物是药物研究研究的重要方向。一般认为血栓的形成与多种因素导致的血小板聚集、粘附和释放有关。抗血小板药物成为了人们研究的热点。四氢_β -咔啉-3-羧酸具有抗血小板活性已被人们广泛认知，但水溶性和脂溶性都差使得它的生物利用度很低，一定的结构改造势在必行。在咔啉类抗血栓药物研究中，发明人揭示过用氨基酸修饰四氢咔啉可改善水溶性和提高生物利用度。发明人在多年的探索中发现往咔啉的I位引入对硝基苯基可获得活性更好的咔啉母核。依据这些发现，发明人提出了(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4-四氢-β -咔啉酰氨基酸、它们的合成，它们的体外抗血小板聚集活性及它们在大鼠血栓模型上的抗血栓活性的发明。
发明内容
本发明的第一个内容是制备(13，35)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-3-咔啉酰氨基酸，该内容包括:I)制备L-色氨酸甲酯；2) L-色氨酸甲酯与对硝基苯甲醒经Pictet-Spengler缩合生成(IS, 3S) _1_对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；3) (13，35)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-3-咔啉-3-羧酸甲酯皂化，生成(1S，3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢昨琳-3-竣酸；4)将(13，35)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-0-咔啉-3-羧酸与氨基酸苄酯偶联制备(13，33)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔啉酰氨基酸苄酯；5) (1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰氨基酸苄酯皂化制备(1S，3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氧咔琳酸氛基酸。步骤I)的色氨酸甲酯的制备包括在甲醇溶液中滴加二氯亚砜，然后加入色氨酸。步骤2)的(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯的制备包括在盐酸的甲醇溶液中色氨酸甲酯与对硝基苯甲醛进行Pictet-Spengler缩合后用柱色谱进行分离。步骤3)的(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的制备包括冰盐浴下向(is，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔啉-3-羧酸甲酯四氢呋喃溶液先滴加2Ν氢氧化钠溶液至pH为12，反应完成之后再滴加2N的HCl溶液至pH为2。步骤4)的(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳_3_竣酸与氛基酸苄酯偶联反应在DCC、HOBt和NMM存在下进行，其中氨基酸苄酯选自L-亮氨酸苄酯、L-酪氨酸苄酯、L-苯丙氨酸苄酯、L-丙氨酸苄酯、L-缬氨酸苄酯、L-色氨酸苄酯、L-天冬氨酸双苄酯、L-Nε -Boc-赖氨酸苄酯、L-蛋氨酸苄酯、L-丝氨酸苄酯、L-脯氨酸苄酯、甘氨酸苄酯或L-谷氨酰胺苄酯。与L-脯氨酸苄酯偶联时，先把(13，33)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢! _ β _咔琳-3-竣酸制备为N-叔丁氧擬基-(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢-β -咔啉-3-羧酸，再与L-脯氨酸苄酯偶联，然后在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱去叔丁氧擬基。步骤5)的(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰氨基酸苄酯的四氢呋喃溶液先滴加2Ν氢氧化钠溶液至pH为12，反应完成之后再滴加2N的HCl溶液至pH为2得到(13，35)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-0-咔啉酰氨基酸。本发明的第一个内容可以用图1的合成路线描述。
图1.(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰氨基酸的合成路线.i)甲醇和二氯亚砜；ii)对硝基苯甲醒和浓盐酸；iii)四氢呋喃和2N氢氧化钠溶液；iv)DCC,HOBt,四氢呋喃和NMM ；v)四氢呋喃，2N氢氧化钠溶液和2N HCl溶液。4a和5a中AA为L-亮氨酸残基、4b和5b中AA为L-酪氨酸残基、4c和5c中AA为L-苯丙氨酸残基、4d和5d中A A为L-丙氨酸残基、4e和5e中A A为L-缬氨酸残基；4f和5f中AA为L-色氨酸残基、4g中AA为侧链苄酯保护的L-天冬氨酸残基、5g中AA为L-天冬氨酸残基、4h和5h中AA为L-赖氨酰基、4i 和5i中AA为L-蛋氨酸残基、4j和5j中AA为L-丝氨酸残基、4k和5k中AA为L-脯氨酸残基、41和51中AA为甘氨酸残基；4m和5m中AA为L-谷氨酰胺残基。本发明的第二个内容是评价(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳酸氨基酸(5a-m)的抗血小板聚集活性。本发明的第二个内容是评价(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳酸氨基酸(5a_m)的抗血栓活性。为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
具体实施例方式实施例1制备L-色氨酸甲酯冰-盐浴下，向150ml甲醇中边搅拌边滴加15ml 二氯亚砜，半小时后加入L-色氨酸10.2g(50mmol)，撤去冰盐浴，室温搅拌两天。TLC板显示原料基本消失后停止反应。减压去除甲醇。残留物用甲醇溶解并减压去除甲醇。该操作重复三次。残留物用乙醚溶解并减压去除乙醚。该操作重复三次。最后用甲醇/乙醚重结晶，经过两次重结晶共得到白色固体 12.6g(99.0% )。Mp:218-2200C ； [α];)5 = 17.9 (c = 5.0, CH3OH) ；ESI+-MS (m/e):219 [M+H]+.
实施例2制备(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β _昨琳-3-竣酸甲酷在30ml甲醇中缓慢加入5ml浓盐酸，向稀盐酸溶液中加入2.55g(IOmmol)L-色氨酸甲酯盐酸盐和1.66g(llmmol)对硝基苯甲醒,微波加热75°C反应两小时，TLC板显示基本反应完全。用浓氨水调PH值至6，过滤得到黄色固体。用石油醚/乙酸乙酯进行柱层析，得到1.28g(36.1% ) (1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔啉_3_羧酸甲酯。ES1-MS(m/e): 352[M+H]+；IH-NMR(300MHz, DMS0_d6): δ/ppm = 10.400(s，1Η)，8.242 (d，J=9.0Hz, 2Η)，7.662 (d, J = 8.7Ηζ, 2Η)，7.472 (d,J = 7.2Ηζ, 1Η)，7.209 (d, J = 7.5Ηζ, 1Η)，7.056 6.950 (m, 2Η)，5.397 (s，1Η) ,3.918 (dd, J = 3.9Hz, J = 11.1Hz, 1Η)，3.726 (s，3Η)，3.110 3.052 (m, 1Η), 2.929 2.835 (m, 1Η).
实施例3制备(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸冰盐浴搅拌下用四氢呋喃溶解3.51g (IOmmol) (1S，3S)-1-对硝基苯基_1，2，3，
4-四氢-咔啉-3-羧酸甲酯，滴加2Ν氢氧化钠溶液调节pH值至12，用TLC板检测反应。原料点基本消失后，用2N盐酸液调节pH值至2，过滤，滤渣用蒸馏水洗，干燥得到黄色固体 3.0g (90% )。ES1-MS (m/e):338 [M+H]+ ; 1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm = 10.400 (s,1H)，8.242 (d, J = 8.4Hz，2H)，7.672 (d, J = 8.7Hz，2H)，7.465 (d, J = 7.2Hz，1H) ,7.196 (d,J = 7.2Hz, 1H), 7.044-6.917(m，2H)，5.424 (s，1H), 3.764(dd, J = 3.9Hz, J = 11.1Hz, 1H)，
3.084 (dd, J = 2.7Hz, J = 15.0Hz,，1H)，2.875-2.781 (m，1H).
实施例4制备(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳-3-甲酸氛基酸节酯(4a_m)在50ml 茄瓶里加入 337mg (1.0mmol) (1S，3S)-1-对硝基苯基 _1，2，3，4_ 四氢-β -咔啉-3-羧酸,加入3ml无水四氢呋喃溶解,冰浴下搅拌，加入162mg(l.2mmol)HOBt, 247mg(l.2mmol)DCC形成A液。在25ml爺瓶中加入1.05mmolL-氨基酸节酯的四氢呋喃溶液，加入NMM调pH形成B液。半小时后向A液中加入B液，加入NMM调节pH至9。TLC板检测反应进度。反应完成后过滤除去二环己基脲(DCU)，减压浓缩除去溶剂，残留物加乙酸乙酯溶解，分别用5%碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液，5%硫酸氢钾溶液，饱和氯化钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各洗3遍。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥I小时，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到粗产物。再通过柱色谱进行分离得到纯品。洗脱剂。石油醚:乙酸乙酯5: 1-3: I梯度洗脱。(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸苄酯(4a)产量:227(42% )。ES1-MS (m/e):541 [M+H]+!1H-匪R(300MHz，CDCl3): δ /ppm = 10.404 (s, 1H), 8.273-8.223 (m, 3H), 7.667 (d, J = 8.7Hz，，2Η)，7.437-7.321 (m，6Η)，7.231-7.204 (m，1Η)，7.063-6.697(m，2H)，5.378 (d, J = 7.2Ηζ,，1Η)，5.160(s,2Η)，4.484-4.410 ( m，1Η)，3.744-3.674 (m，1Η)，3.324 (s，1Η)，3.030 (dd, J = 5.7Ηζ,，J=15.ΟΗζ，，1Η)，2.793-2.706(m，2H)，1.688-1.517(m，3H)，0.903(d，J = 6.3Ηζ，，3Η)，
0.868 (d，J = 6.0Hz，，3Η).
(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4_四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-酪氨酸苄酯(4b)
产量:141mg(24%)。ES1-MS(m/e):591[M+H]+!1H-匪R(300MHz，DMS0_d6):δ/ppm=10.428(s，1H)，9.272(s，1H)，8.282-195(m，3H)，7.648(d，J=8.7Ηζ，2Η)，7.433-7.196(m,9H)，7.056-6.910(m,2H)，6.661-6.609(m,2H)，5.354(d,J=6.3Hz,1H)，5.113(s，2H)，5.068-4.996(m,1H),4.561(dd,J=7.2Hz,J=14，4Hz,1H)，3.644-3.622(m,1H),3.575-3.536(m,1H),3.009-2.856(m,2H),2.770-2.692(m,1H).
(IS,3S)-1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢!-β-昨琳-3_甲酸-L-苯丙氣酸节酷(4c)产量:278mg(48%)。ES1-MS(m/e):575[M+H]+;1H-NmrGOOMHz,CDCl3):δ/ppm=8.229(d,J=8.7Hz,2H)，7.583 7.541(m,2Η)，7.501(d,J=8.7Ηζ,2Η)，7.390 7.356(m,3H),7.336 7.303(m,2Η),7.282(s,1Η),7.255 7.224(m,1Η),7.206
7.137(m,5H),7.014(dd,J=1.8Hz,J=7.2Hz，2Η)，5.311(s，1Η)，5.179(dd,J=12.ΟΗζ,J=21.0Ηζ，2Η)，4.984(dd,J=6.3Hz,J=14.4Hz,1Η),3.796 3.721(m，1Η),3.316 3.244(m,1Η),3.223 3.177(m，1Η)，3.117(dd，J=6.3Hz,J=13.8Hz,1Η),2.829 2.732(m,1Η),2.l(s,lH).
(IS,3S)-1-对硝基苯基-1,2,3,4_四氧-β_昨琳-3_甲酸-L-丙氣酸节酷(4d)产量:284mg(57%) ES1-MS(m/e):499[M+H]+;lH-NMR(300MHz，DMS0-d6):δ/ppm=10.845(s，1H),8.312(d，J=7.2Hz,1H),8.204(d,J=8.7Hz，2H)，7.513(d，J=8.7Hz,2H),7.434 7.286(m，7H)，7.104 6.984(m,2H),5.369(s，1H)，5.126(dd,J=12.6Hz,J=15.6Hz，2H)，4.323(dq,J=7.2Hz,J=28.8Hz,1H)，3.525 3.452(m，1H)，2.954
2.891(m,1H)，2.735 2.643(m,1H)，1.322(d,J=7.2Hz,3H).
(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰_L_缬氨酸苄酯(4e)产量:282mg(53%)。ES1-MS(m/e):527[M+H]+。1H-NMR(300MHz，DMS0_d6):δ/ppm=10.862(s,1H),8.218(d,J=8.7Ηζ，1Η)，8.099(d,J=8.1Ηζ，2Η)，7.531(d,J=8.4Hz,2Η)，7.439 7.282(m,7Η)，7.103 6.980(m,2Η)，5.371(s,1Η)，5.147(dd,J=12.6Ηζ,J=20.1Ηζ，2Η)，4.236(dd,J=6.ΟΗζ,J=7.8Ηζ，2Η)，3.566 3.521(m，lH)，3.442
3.391(m，1Η)，2.965(dd,J=4.5Hz,J=15.0Ηζ，2Η)，2.142 2.031(m，1Η)，0.884(dd,J=1.8Hz,J=6.6Ηζ,2Η).
(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-色氨酸苄酯(4f)产量:202mg(33%)。ES1-MS(m/e):614[M+H]+;1H-NMR(300MHz，DMS0_d6):δ/ppm=10.954(s,1Η),10.878(s,1Η),8.253(d,J=7.5Hz,1Η),8.148(d,J=8.1Hz,IH)，7.939(S，IH)，7.510(d,J=7.8Ηζ,IH)，7.446-7.373(m,3Η)，7.312-7.281(m,4Η)，7.205-6.944(m,7Η)，5.259(S，IH)，4.638-4.574(m,1Η)，3.209-3.168(m,1Η)，
2.957-2.890(m,2Η)，2.734-2.650(m,2Η).
(IS,3S)-1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢昨琳-3_甲酸_L-天冬氣酸双节酷(4g)产量:233mg(37%)。ES1-MS(m/e):633[M+H]+^H-NMR(300MHz，CDCl3):δ/ppm=
8.213(d,J=8.4Hz,2H)，7.616(d,J=8.4Hz,2H)，7.557 7.546(m,3H)，7.518(s,1H)，7.362 7.229(m，10H)，7.211 7.147(m，2H)，5.346(s，1H),5.164(s，2H)，5.057(s，2H)，
5.030 4.913(m，1Η)，3.818(dd,J=4.2Hz,J=11.1Hz,1Η)，3.369 3.260(m，1Η)，3.126 (dd, J = 4.8Hz, J = 17.1Hz, 1H), 2.964 (dd, J = 4.8Hz, J = 17.1Ηζ，1Η)，2.857 (dd,J = 2.4Hz, J = 15.3Hz, 1Η)，2.065 (s，1Η).
(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰赖氨酸苄酯(4h)产量:118mg(21% )。ES1-MS(m/e):556[M+H]+; 1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm = 11.188 (s, 1H) ,8.275 (d, J = 8.4Ηζ,2Η),8.105 (s, 1Η), 7.631 (d，J = 8.7Ηζ,1Η)，
7.478-7.322 (m, 7Η)，7.191-7.069 (m, 2Η)，6.166 (S，I H)，5.159 (s，1Η)，4.328-4.239 (m,1Η) ,3.734 (m, 1Η), 3.184 (d, J = 7.5Hz, 1Η), 2.967 (dd, J = 10.5Hz, J = 15.6Ηζ，1Η)，
2.713 (d，J = 5.7Ηζ，2Η)，1.734 (m, 2Η)，1.559 (m, 2Η)，1.436-1.343 (m, 2Η).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢!-β-昨琳-3_甲酸-L-甲硫氣酸节酷
(4i)产量:209mg(36%)。ES1-MS (m/e):559 [M+H]+ ; 1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm=10.835 (s，1Η)，8.308 (d, J = 7.5Hz, 1Η)，8.198 (d, J = 8.7Ηζ,2Η)，7.524 (d, J = 9.ΟΗζ,2Η)，7.437-7.280 (m, 7Η)，7.101-6.981 (m, 2Η)，5.369 (s，1Η)，5.136 (dd, J = 12.3Hz, J =16.2Ηζ,2Η)，4.502—4.431 (m, 1Η)，3.507—3.462 (m, 1Η)，2.948 (dd, J = 4.5Hz, J = 15.3,1Η)，2.715 (dd, J = 9.ΟΗζ, J = 15.ΟΗζ, 1Η)，2.013—1.975 (m, 6Η).
(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-丝氨酸苄酯(4j)产量:162mg(31% )。ES1-MS(m/e):515[M+H]+; 1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm = 10.403 (s, 1H) ,8.264 (d, J = 8.7Hz,2H) ,8.149 (d, J = 7.8Hz，1H)，7.670 (d，J = 8.7Hz, 1H), 7.457-7.337 (m, 6H), 7.213 (d, J = 7.8Hz, 1H) ,7.009 (dt, J = 6.9Hz,J = 7.8Hz,2H) ,5.393 (d, J = 6.3Hz，1H)，5.172 (s，2H)，4.496 (dd，J = 3.9Hz, J =
7.5Hz, 1H), 3.855-3.782 (m, 1H), 3.739-3.669 (m, 2H), 3.071-3.020 (m, 1H), 2.892 (s, 1H)，
2.836-2.793 (m, 1H), 2.735 (s, 1H).
(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4_四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-脯氨酸苄酯(4k)冰浴下将337mg(l.0mmol) (1S，3S)-1-对硝基苯基 _1，2，3，4_ 四氢-β-咔啉羧酸悬浮于含280mg(l.3mmol) (Boc)2O的四氢呋喃溶液中，然后加三乙胺调节pH9，TLC板检测反应，原料点消失后减压除去四氢呋喃，用乙酸乙酯溶解残留物，然后用5%硫酸氢钾溶液洗涤3次，饱和氯化钠溶液洗涤3次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得到N-Boc-(lS，3S)-l-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉羧酸。然后在50ml茄瓶里加入4371^(1.0臟010-80。-(15，35)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔啉 _3_ 羧酸，加入3ml无水四氢呋喃溶解,冰浴下搅拌,加入162mg(l.2mmol)H0Bt, 247mg(l.2mmol)DCC形成A液。在25ml茄瓶中加入1.05mmol氨基酸苄酯的四氢呋喃溶液，加入NMM调pH形成B液。半小时后向A液中加入B液，加入NMM调节pH至9。TLC板检测反应进度。反应完成后过滤除去DCU，减压浓缩除去溶剂，残留物加乙酸乙酯溶解之后，分别用5 %碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液、5%硫酸氢钾溶液、饱和氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液各洗3遍。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥I小时，过滤，减压浓缩除去溶剂，得到粗产物。再通过柱色谱进行分离得到纯品。洗脱剂:石油醚:乙酸乙酯5: 1-3: I梯度洗脱。在冰盐浴搅拌下向N-Boc-(IR, 3S) -1-对硝基苯基-1, 2, 3,4-四氧-β -咔琳酸脑氛酸节酷加入4Ν氣化氧的乙酸乙酯溶液，反应结束后减压去除乙酸乙酯。残留物用乙酸乙酯溶解并减压去除乙酸乙酯。该操作重复三次。残留物用乙醚溶解并减压去除乙醚。该操作重复三次。得到164mg(30% )目标化合物，为泡状固体。ES1-MS (m/e):547 [M+Na]+; 1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm = 10.876 (s, 1Η)，8.255 8.181 (m, 3Η)，7.498 (d, J = 8.7Ηζ,2Η)，7.423 (d, J = 8.7Ηζ,1Η)，7.315 7.264(m，2H)，7.106 6.931(m，3H)，5.354(s，2H)，5.116 (dd, J = 12.6Hz, J=18.6Ηζ，1Η)，4.367 (dd, J = 3.9Hz, J = 8.7Ηζ，1Η)，4.03 (dd, J = 7.2Hz, J= 14.4Ηζ，1Η)，
3.631 3.603 (m, 1Η), 3.362 (s, 1Η), 2.885 (s, 1Η), 2.752-2.667 (m, 1Η), 2.193-2.083 (m,1Η)，1.992 (s，1Η)，1.885-1.712 (m, 1Η).
(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰甘氨酸苄酯(41)产量:lllmg(23% )。ESI+-MS(m/e):485[M+H]+ ； 1H-NMR(300MHz, DMS0_d6): δ /ppm = 10.845 (s, 1H) ,8.379 (d, J = 6.ΟΗζ, 1H), 8.211 (d, J = 8.7Ηζ,2Η) ,7.522 (d, J =
8.7Ηζ,2Η)，7.462 (d, J = 7.5Hz, 1Η)，7.373-7.282 (m, 6Η)，7.104-6.979 (m, 1Η)，5.396 (d,J = 4.5Hz, 1Η)，3.951 (d, J = 6.ΟΗζ，2Η)，3.497—3.451 (m, 1Η) 2.979 (dd, J = 4.5Hz, J =15.ΟΗζ, 1Η)，2.814-2.763 (m, 1Η).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢!-β-昨琳-3_甲酸-L-谷氣酸胺节酷(4m)产量:105mg(19%)。ESI+-MS(m/e):556[M+H]+ ; 1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm=10.443 (s, 1H) ,8.329 (d, J = 8.7Ηζ，1Η)，8.261 (d, J = 8.7Ηζ，2Η)，7.678 (d, J = 8.4Ηζ,2Η)，7.436-7.322 (m, 7Η)，7.055-6.962 (m, 2Η)，5.371 (S，I H)，5.115s, 2Η)，4.422-4.351 (m,1Η)，3.764-3.688 (m, I H)，3.356 (s, 1Η)，3.044-2.994 (m, 1Η)，2.798-2.717 (m, 2Η)，
2.088-1.909 (m, 2Η).
实施例5制备(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4_四氢-β-咔啉-3-甲酰氨基酸(5a_m)冰盐浴搅拌下在 50ml茄瓶中称取0.1mmol (1S，3S)-1-对硝基苯基_1，2，3，4-四氢-β -咔啉酰氨基酸苄酯、加2ml无水THF溶解、滴加2N氢氧化钠溶液调节pH值至12、用TLC板检测反应。原料点基本消失后，用2N盐酸液调节pH值至2、过滤、滤渣用蒸馏水洗、干燥得到黄色固体。(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳_3_甲酸-L-売氛酸(5a)产量:39mg(88%)。ES 1-MS (m/e):449 [Μ-ΗΓ。1H-NMR (300MHz，DMS0_d6): δ /ppm =
12.360 (s，1H)，8.872(s，2H)，8.411-8.363 (m，5H)，7.310 (d，J = 7.8Hz, 1H)，7.597 (d，J =
6.，9Hz,1H)，7.323 (d, J = 6.9Hz, 1H)，4.274 (s, 1H)，1.738-1.582 (m, 3H)，0.944-0.886 (m,6H).
(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4_四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-酪氨酸(5b)产量:36mg(73% )。ES1-MS(m/e):498[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm = 12.236 (s, 1H)，8.544-8.444 (m, 3H)，8.356 (d, J = 8.1Hz，2H)，7.781-7.708 (m, 1H)，
7.638 (d, J = 8.4Hz, 1H)，7.349-7.294 (m, 2H)，7.136-7.045 (m, 2H)，6.729-6.702 (m, 2H)，
4.755 (d, J = 7.5Hz, 1H)，4.489 (s, 1H)，4.0326 (m, 1H)，3.801-3.733 (m, 1H)，3.189 (m, 3H)，
3.030 (d，J = 5.4Hz, 1H).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氧_ β _咔琳_3_甲酸_L_苯丙氛酸(5c)产量:39mg(82% )。ES1-MS(m/e):483[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm = 10.460 (s, 1Η)，8.438-8.297 (m, 1Η)，8.224 (d, J = 7.8Ηζ,2Η)，7.728-7.613 (m, 3Η)，7.454 (d, J = 7.2Hz, 1H), 7.325 (d, J = 7.2Hz，1H)，7.226-7.189 (m，5H)，7.027 (t，J =7.2Ηζ,2Η) ,5.340 (s, 1Η) ,4.218 (d, J = 3.9Ηζ，1Η)，3.171-3.142 (m，1Η)，3.046-3.001 (m，2Η)，2.663 (t, J = 6.6Hz, 1Η).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氧_ β _咔琳_3_甲酸_L_丙氛酸(5d)产量:35mg(86% )。ES1-MS(m/e):407[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm = 12.203 (s, 1H)，9.005-8.947 (m, 1H)，8.486-8.455 (m, 4H) ,7.818 (d, J = 8.4Hz, 1H)，
7.748 (d, J = 8.1Hz, 1H)，7.644 (d, J = 7.5Hz, 1H)，7.357 (d, J = 7.5Hz, 1H)，7.290 (d, J =
8.4Hz, 1H)，4.735-4.611 (m，1H)，2.997-2.919 (m, 2H)，2.801-2.757 (m, 2H)，2.588 (d, J =
2.7Hz, 1H) ,2.559 (m, 3H).
(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳-3-甲酸-L-缴氛酸(5e)产量:34mg(78%) ES1-MS (m/e):435 [Μ-ΗΓ。1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm =12.272 (s, 1H)，8.949 (s, 1H) ,8.601 (d, J = 9.0Hz, 1H)，8.511-8，450 (m, 3H) ,8.391 (d, J =
8.4Hz，2H)，7.756 (d，J = 8.1Hz, 1H)，7.663-7.613 (m，1H)，7.375-7.304 (m, 2H), 5.213 (d，J=5.1Hz，1H)，4.568-4.497 (m, 2H)，2.296 (d, J = 6.0Hz，1H)，1.000-0.983 (m, 8H).
(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4_四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-色氨酸(5f)产量:37mg(72% )。ES1-MS(m/e):522[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm = 10.860 (s, 1H), 10.431 (s, 1Η), 8.423 (d, J = 8.4Ηζ，1Η)，8.226 (d，J = 7.8Ηζ，1Η)，
7.826-7.727 (m, 1Η)，7.563 (d, J = 8.4Ηζ，，2Η)，7.461 (d, J = 7.2Hz, 1Η)，7.359-7.288 (m,4Η)，7.220 (d，J = 6.9 Hz, 1Η)，7.146 (s，1Η)，7.059-6，966 (m，2Η)，6.916-6.814 (m，I H)，
5.315 (s，I H)，4.516-4.465 (m，2H)，3.616 (d，J = 8.4Hz, 1Η)，3.328-3.291 (m，I H)，
3.053 (d, J = 14.1Hz, 1Η)，2.730—2.642 (m, 1Η).
(1S，3S)-1_对硝基苯基-1，2，3，4_四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-天冬氨酸(5g)产量:38mg(85%)。ES1-MS(m/e):451 [Μ-ΗΓ。1H-NMR(300MHz，DMS0_d6): δ /ppm=12.243 (s，1Η)，10.872 (s, 1Η)，8.487-8.452 (m, 2Η)，8.339 (d, J = 8.4Hz, 1Η)，7.8020 (d,J = 8.4Ηζ，2Η)，7.553 (d，J = 7.2Hz, 1Η)，7.385-7.274(m，2H)，7.134 (d，J = 7.2Hz, 1Η)，
7.093-7.044 (m, 1Η)，4.710-4.643 (m, 1Η)，2.934 (d, J = 5.4Hz, 1Η)，2.816-2.769 (m, 2Η)，1.916(s，2Η).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氧_ β _咔琳_3_甲酸_L_赖氛酸(5h)产量:34mg(73% )。ES1-MS(m/e):464[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm = 12.403 (s, 1Η) ,9.301 (d, J = 7.2Hz, 1Η)，8.488-8.456 (m, 1Η)，8.359-8.281 (m, 4Η)，7.849 (d, J = 8.4Ηζ,2Η)，7.537 (d, J = 7.5Hz, 1Η)，7.360-7.276 (m, 1Η)，7.151-7.035 (m,1Η)，4.303 (s，1Η)，3.590-3.465 (m，I H)，3.174(t，J = 10.5Ηζ, I)，2.758 (s，2Η)，
1.798-1.519(m,7H).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氧_ β _咔琳_3_甲酸_L_蛋氛酸(5i)产量:36mg(76%)。ES1-MS(m/e):467[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm=12.177 (s, 1H) ,9.136 (d, J = 8.7Hz, 1H), 8.954 (s, 1H), 8.490-8.405 (m, 4Η), 7.735 (d,J = 8.1Hz, 1Η) ,7.644 (d, J = 7.2Hz, 1Η), 7.381-7.244(m,2H) ,5.191-5.102 (m, 1Η),
4.939-4.894 (m, 1Η)，4.214-4.102 (m, 7Η)，3.657 (d, J = 12Hz, 1Η)，2.935 (d, J = 4.5Ηζ,2Η).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氧_ β _咔琳_3_甲酸-L-丝氛酸(5j)产量:31mg(74%)。ES1-MS(m/e):423[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm=12.354 (s, 1H), 8.960 (s, 1Η), 8.809 (d, J = 8.1Hz，1Η)，8.500-8.431 (m，5Η)，7.783 (d，J = 8.1Ηζ，7Η)，7.663-7.613 (m，1Η)，7.376-7.308 (m，1Η)，4.615 (d，J = 3.9Ηζ，1Η)，
3.975-3.939 (m, 2Η), 3.850-3.826 (m, 2Η).
(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳_3_甲酸-L-脑氛酸(5k)产量:30mg(69% )。ESI_MS(m/e):434[Μ_ΗΓ。1H-NmrOOOMHz, DMS0_d6):δ/ppm = 12.062(d，J = 213Hz,1Η),8.789 (d, J = 174Hz，1Η)，8.488-8.415(m，3Η)，
8.347-8.287 (m, 2Η)，7.874-7.561 (m, 2Η)，7.359-7.311 (m，2Η)，5.408 (d, J = 8.7Hz, 1Η)，
4.408 (d, J = 105Hz, 1Η)，4.090-4.069 (m, 1Η)，3.734-3.688 (m, 2Η)，2.348-2.306 (m, 1Η)，
1.947-1.799 (m, 6Η).
(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氧_ β _咔琳_3_甲酸_L_甘氛酸(51)
产量:35mg(89%)。ES1-MS(m/e):393[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm=12.093 (s，1Η)，8.945 (s，1Η)，8.476(s，4H)，7.734-7.621 (m，2H)，7.422-7.377(m，4H)，
5.199(s，2H)，4.239 (d，J = 6.0Ηζ，2Η)，4.095 (d，J = 5.7Hz, 1Η).
(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳_3_甲酸-L-谷氛酸胺(5m)产量:38mg(82% )。ESI_MS(m/e):464[Μ_ΗΓ。1H-NMR(300ΜΗζ，DMS0_d6): δ /ppm = 12.160(s，1H)，8.512-8.412(m，3H)，8.273(d，J = 8.4Hz, 1H), 7.751-7.618 (m,2H)，7.402-7.279 (m, 3H)，7.228 (d, J = 5.1Hz, 1H) ,4.572 (s, 1H) ,4.498 (s, 1H)，4.206 (d, J = 6.9Hz, 1H)，3.176-3.097 (m, 1H)，2.877-2.685 (m, 1H)，2.453-2.399 (m, 1H)，
2.249-2.089 (m, 5H).
实施例6体外抗血小板聚集活性评价猪颈动脉取血,用3.8%枸橼酸钠(V__: V个血=1: 9)抗凝。1000g/min离心10分钟得富血小板血浆(PRP)，再以3000g/min离心10分钟，得贫血小板血浆(PPP)。以胶原(ADP)、血小板活化因子(PAF)、凝血酶(TH)和花生四烯酸(AA)为诱导剂诱导血小板聚集。母核3和(IS, 3S)-1-对硝基苯基-1, 2, 3,4_四氧-β -咔琳_3_甲酸氛基酸(5a_m)均用生理盐水溶解。每个数据平行测6次。表I数据说明母核以及13个氨基酸修饰的目标化合物均对ADP诱导的血小板聚集的没有抑制作用，表2数据说明对PAF诱导的血小板聚集没有抑制作用，表3数据说明对TH诱导的血小板聚集具有抑制作用，表4数据说明对AA诱导的血小板聚集具有抑制作用。通过数据还可以看到本发明经过氨基酸修饰后的一些目标化合物抑制TH和AA诱导的血小板聚集作用比母核抑制作用增强。表15a_m在100 μ M浓度下对ADP诱导的血小板聚集作用的影响化合物抑制宇.化合物抑制率
315.6%5g7.5%
5a36.9%5h34.4%
5b35.6%5i44.4%
5c11.9%5j12.5%
5d30.0%5k3.8%
5e18.8%5126.9%
5f7.5%5m11.3%表25a_m在100 μ M浓度下对PAF诱导的血小板聚集作用的影响
化合物抑制宇.化合物抑制率
35.6%5g20.6%
5a30.0%5h31.3%
5b14.4%5i23.1%
5c11.9%5j31.3%
5d38.1%5k21.9%
5e28.1%5151.3%
5f36.9%5 m43.8%表35a_m在100 μ M浓度下对TH诱导的血小板聚集作用的影响
化合物抑制率化合物抑制率
332.1%5g70.5%
5a21.4%5h19.6%
5b0.0%5i12.5%
5c78.6%5j34.8%
5d15.2%5k37.5%
Se25.9%5 丨10.7%
5f31.3%5m15.2%表45a_m在100 μ M浓度下对AA诱导的血小板聚集作用的影响化合物抑制率化合物抑制率
320.5%5g44.3%
5a25.0%5h37.5%
5b18.2%5i9.1%
5c15.9%5j20.5%
5d25.0%5k17.0%
5e45.5%5145.5%
5f55.7%5m36.4%实施例75a_m的抗血栓活性评价实验前将化合物(母核3和5a_m)配成0.33nmol/l生理盐水溶液(加入少量的吐温80润湿助溶)，用于体内的剂量为1.0nmol/kg。阳性药Asprin配成10g/l生理盐水溶液，即55.5mmol/l的浓度，用于体内的剂量为167μπι01/1^。空白对照为生理盐水，抗凝剂为肝素钠2.4mg/ml生理盐水溶液。将雄性SD大鼠随机分组，每组12只大鼠。化合物(5a-m)、母核3、空白和阳性药共分为15组，以(3ml/kg)给大鼠灌胃，30分钟后，用乌拉坦(20g/100ml,7ml/kg)，麻醉后，分离右颈动脉和左颈静脉。把一根6cm长的事先精密称重的丝线放在聚乙烯管中，将插管充满肝素钠的生理盐水溶液(50IU/ml)后，一端插入左侧静脉，从一端加入定量肝素钠抗凝，然后插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉，15分钟后取出丝线并记录血栓湿重。数据列入表3。表35a_m对SD雄性大鼠血栓形成的影响
权利要求
1.通式I的化合物，式中AA为L-亮氨酸残基、L-酪氨酸残基、L-苯丙酸残基、L-丙氨酸残基、L-缬氨酸残基、L-色氨酸残基、侧链苄酯保护的L-天冬氨酸残基、L-赖氨酸残基、L-蛋氨酸残基、L-丝氨酸残基、L-脯氨酸残基、甘氨酸残基或L-谷氨酰胺残基。
2.制备权力要求I和2的化合物的方法，该方法包括: .1)制备L-色氨酸甲酯； .2)L-色氨酸甲酯与对硝基苯甲醒经Pictet-Spengler缩合生成(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯； .3)(15，35)-1-对硝基苯基-1，2，3，4_四氢-β -咔啉_3_羧酸甲酯皂化，生成(1S，.3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢昨琳-3-竣酸； .4)将(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与氨基酸苄酯偶联制备(13，33)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔啉酰氨基酸苄酯； 5)(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔啉酰氨基酸苄酯皂化制备(1S，.3S) -1-对硝基苯基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉酸氨基酸；
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤I)中所述的色氨酸甲酯的制备方法包括在甲醇溶液中滴加二氯亚砜，然后加入色氨酸。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)的(1S，3S)-1-对硝基苯基_1，2，3，.4-四氢-β -咔啉-3-羧酸甲酯的制备方法包括在盐酸的甲醇溶液中色氨酸甲酯与对硝基苯甲醒进行Pictet-Spengler缩合后用柱色谱进行分离,得到(1S,3S)_1_对硝基苯基-1,.2.3.4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯。
5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)的(13，33)-1-对硝基苯基-1，2，.3.4-四氧-β-咔琳_3_竣酸的制备方法包括冰盐浴下向(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1, 2, 3,.4-四氢-咔啉-3-羧酸甲酯四氢呋喃溶液先滴加2Ν氢氧化钠溶液至pH为12,反应完成之后再滴加2N的HCl溶液至pH为2得到(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔啉-3-羧酸。
6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4)的(15，35)-1-对硝基苯基-1，2，.3，4-四氢-β -咔啉-3-羧酸与氨基酸节酯偶联制备(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1，2, 3,4-四氢-β-咔啉酰氨基酸苄酯。反应在二环己基羰二亚胺(DCC)，N-羟基苯并三氮唑(HOBt)和N-甲基吗啉(NMM)存在下进行，其中氨基酸苄酯选自L-亮氨酸苄酯、L-酪氨酸苄酯、L-苯丙氨酸苄酯、L-丙氨酸苄酯、L-缬氨酸苄酯、L-色氨酸苄酯、L-天冬氨酸双苄酯、L-Ne-Boc-赖氨酸苄酯、L-蛋氨酸苄酯、L-丝氨酸苄酯、L-脯氨酸苄酯、甘氨酸苄酯或L-谷氨酰胺苄酯。与L-脯氨酸苄酯偶联时，先把(1S，3S) -1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β -咔琳_3_竣酸制备为N-叔丁氧擬基-(IS, 3S) -1-对硝基苯基-1, 2,3,4-四氧-β -咔琳-3-竣酸，再与L-脯氨酸苄酯偶联，然后在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱去叔丁氧羰基。
7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于步骤5)的(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉酰氨基酸苄酯的四氢呋喃溶液先滴加2Ν氢氧化钠溶液至pH为12，反应完成之后再滴加2N的HCl溶液至pH为2得到(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰氨基酸。
8.权力要求I的化合物的抗血栓作用。
9.权力要求I的化合物的作为抗血栓 剂的应用。
全文摘要
本发明公开了通式I的(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰氨基酸、公开了它们的合成、公开了它们的体外抗血小板聚集活性、进一步公开了它们在大鼠血栓模型上的体内抗血栓活性。因而本发明公开了(1S，3S)-1-对硝基苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉酰氨基酸作为抗血栓剂的临床应用前景。
文档编号A61K31/437GK103159758SQ201110415209
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者赵明, 彭师奇, 王玉记, 吴建辉, 李伟 申请人:首都医科大学