专利名称：一种金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种金属硫蛋白脂质体的生产工艺，具体地说涉及一种金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，属于生物制药领域。
发明背景
金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸基团，对多种重金属有高度亲和性，在一定的酸碱度(PH值)及细胞氧化-还原电位环境(可藉细胞器某处谷胱甘肽有还原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例显示)条件下易与多个镉、锌等金属离子结合的多肽蛋白质。哺乳动物的金属硫蛋白由约61个氨基酸组成，含有20个半胱氨酸和7个金属离子。金属硫蛋白作为一种应激蛋白、抗自由基氧化剂、细胞锌离子介导剂等，具有提高人体免疫力、抵抗重金属中毒、参与微量元素的贮存、运输和代谢、排铅补锌、抗辐射、延缓衰老、保护人体心肺各器官等多种独特有效的生物学功能。可是，金属硫蛋白作为一个无细胞膜跨膜传递序列 (MTS)以及细胞核定位序列(NLS)的非膜蛋白大分子，在单独裸露使用、或作为金属离子螯合金属硫蛋白使用、或作为金属硫蛋白与其它物质复合体(如普通纳米脂质体)使用时，难以自由穿过细胞膜或细胞核膜而发挥其功效。将金属硫蛋白制成柔性纳米脂质体，可提高其稳定性、尤其是细胞膜透过性可穿过比脂质体本身小数百倍的微孔通道。发明内容
本发明的目的是，针对无论是裸体金属硫蛋白、金属离子螯合金属硫蛋白还是现有已知金属硫蛋白与其它物质复合体(如普通纳米脂质体)都难以自由穿过细胞膜的缺点，提出了具有更好细胞膜孔等生物微小孔道透过性金属硫蛋白产品，一种金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺。
本发明的技术方案是这样实现的一种金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺， 实现该工艺的方法的主要特征包括下列步骤
1、取一定量的任何一种来源的金属硫蛋白、蛋白质稳定剂或冻干保护剂(0. l-5w/ v% ),配制成浓度为10-500mM的(缓冲)水溶液，控制溶液的pH值在6. 5到9. 0之间。
2、取一定比例的磷脂(0. 5-10w/v % )、胆固醇(0. 5-10w/v % )、表面活性剂 (0. 5-10w/v% )、溶剂(5-95V/V% )等制成有机相液；
3、将以上缓冲液与有机相溶液导入高压泵，在包括氮气保护的条件下充分混合制成混合分散液；
4、将以上混合分散液在均质工作压力5_480MPa、均质工作温度4 80°C，包括氮气保护的条件下通过超高压纳米均质机，制成纳米分散液；
5、将以上纳米分散液经过孔径为100-200nm的超滤膜，包括氮气保护条件下过滤，制成金属硫蛋白柔性纳米脂质体；
6、将以上金属硫蛋白柔性纳米脂质体经冷冻干燥、装瓶、充氮气、封口，于4 20°C保存。
本发明的理论依据是
嵌入金属硫蛋白柔性纳米脂质体包膜层的表面活性剂分子能在高压力部位蓄积而产生形变，形成较大的高曲度结构；这种结构可减少纳米粒子形成及储存过程中的能量耗散，从而使柔性纳米脂质体具有高度的形状可变性，使之能高效地穿透孔径比它本身粒径小5倍的微孔通道，而普通的纳米脂质体当其粒径为微孔通道的1. 7倍时，则完全不能通过。柔性纳米脂质体还赋予了脂质体高度的亲水性、渗透性与稳定性，从而克服了金属硫蛋白由于缺少跨膜传递序列(MTS)以及细胞核定位序列(NLS)引起的向细胞体、细胞器、生物体递送的诸多障碍。
本发明的效果作用是
1、通过使用高压泵混合、超高压纳米均质机造粒、超滤膜过滤等一系列现代纳米药剂制作技术，严格控制纳米脂质体的质量，制备出粒径分布更均勻、可控的纳米脂质体；
2、通过上述制备工艺，选用合理的脂质、表面活性剂、蛋白质稳定保护剂配方，得到高性能的柔性纳米脂质体；
3、通过氮气保护、柔性纳米脂质体制备技术，提高了脂质体的稳定性，包括储存稳定性；
4、通过上述制备工艺，所制得的纳米脂质体粒径分布为30-300nm、典型的为 80-120nm,平均粒径为80_200nm、典型的为lOOnm，包裹率为50-99%、典型的为80-90%，储存稳定期为4-12个月，典型的为6-8个月；
5、通过制得的柔性纳米脂质体，使金属硫蛋白高效地透过孔径小至10-30nm的细胞体、细胞器、生物体上的微孔通道等。
具体实施方式
实施例一将IOOmg由兔肝提取的纯度为99%的金属硫蛋白、1.5g海藻酸钠、 IOOmg谷胱甘肽，溶解在IOOml由注射级水配成的pH值为6. 8浓度为IOOmM磷酸盐PBS缓冲溶液中，混合均勻，过滤除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中；取3g卵磷脂、IOOmg胆固醇、 200mg胆酸钠、200mg 二硬脂酰磷脂酰胆碱，溶解在由25ml水及75ml无水乙醇组成的混合溶剂中，混合均勻，过滤除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中。
将以上缓冲液与有机相溶液导入高压泵中，在小于15°C、氮气保护的条件下充分混合5分钟，制成混合分散液。
将以上混合分散液导入均质工作压力进料器，开通氮气保护，在150MPal5°C条件下通过超高压纳米均质机，制成纳米分散液。
将以上纳米分散液经过孔径为IOOnm的超滤膜，在氮气保护条件下过滤，制成金属硫蛋白柔性纳米脂质体，其粒径分布为60-120nm、包封率为91%。
将以上金属硫蛋白柔性纳米脂质体经冷冻干燥、装瓶、充氮气、封口，于4°C保存。
实施例二 将150mg由兔肝提取的纯度为99%的金属硫蛋白、2. Og甘露醇、200mg 葡聚糖，溶解在IOOml由注射级水配成的pH值为6. 8浓度为IOOmMTris-HCl缓冲溶液中， 混合均勻，过滤除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中；取5g卵磷脂、150mg胆固醇、250mg胆酸钠、200mg聚山梨酯、250mg 二硬脂酰磷脂酰胆碱，溶解在由20ml水及IOOml无水乙醇组成的混合溶剂中，混合均勻，过滤除去不溶物，置于5°C冰浴或冰箱中。
将以上缓冲液与有机相溶液导入高压泵中，在小于15°C、氮气保护的条件下充分混合5分钟，制成混合分散液。
将以上混合分散液导入均质工作压力进料器，开通氮气保护，在150MPal5°C条件下通过超高压纳米均质机，制成纳米分散液。
将以上纳米分散液经过孔径为IOOnm的超滤膜，在氮气保护条件下过滤，制成金属硫蛋白柔性纳米脂质体，其粒径分布为75-120nm、包封率为87%。
将以上金属硫蛋白柔性纳米脂质体经冷冻干燥、装瓶、充氮气、封口，于4°C保存。
权利要求
1.一种金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征包括下列步骤A、取一定量的金属硫蛋白、蛋白质稳定剂或冻干保护剂，配制成一定浓度的缓冲溶液。B、取一定比例的磷脂、胆固醇、表面活性剂、蛋白质稳定剂或冻干保护剂、溶剂等制成有机相溶液。C、将以上缓冲液与有机相溶液通过高压泵充分混合制成混合分散液。D、将混合分散液通过超高压纳米均质机制成粒径比较均勻分布的纳米脂质体。E、将纳米脂质体通过纳米超滤膜过滤。F、冷冻干燥、保存。
2.根据权利要求1所述金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征是步骤A所述金属硫蛋白包括天然提取、人工合成、基因工程-基因重组表达的、人-动物-植物-微生物来源的所有金属硫蛋白；所述蛋白质稳定剂或冻干保护剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇、谷胱甘肽、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚糖、白蛋白、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、 甘氨酸、肌氨酸、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、牛磺酸、壳聚糖、壳寡糖等的一种或两种以上； 所述浓度为10-500mM ；所述溶液包括去离子水、无菌去离子水、注射用水、PBS或其它磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等类似溶液。
3.根据权利要求1所述金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征是步骤B所述磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂，PC)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂，PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二磷脂酰甘油(心磷脂)等甘油磷脂(含改性甘油磷脂、甘油磷脂衍生物如二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC)的一种或两种以上；所述表面活性剂为胆酸钠、胆酸钾、去氧胆酸钠、去氧胆酸钾、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯、蔗糖酯、二辛基琥珀酸磺酸钠、月桂酸钠等的一种或两种以上；所述溶剂为乙醇、水等溶剂的等一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征是步骤C的条件是混合温度-5-30°C，混合时间30秒至30分钟、包括氮气保护。
5.根据权利要求1所述金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征是步骤D所述超高压纳米均质机均质工作压力为5-480MPa、均质工作温度为4 80°C， 包括氮气保护；经此步骤制成的体系称为纳米分散液。
6.根据权利要求1所述金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征是步骤E所述超滤膜孔径为100-200nm，过滤过程包括氮气保护，经此步骤制成的体系称为柔性纳米脂质体。
7.根据权利要求1所述金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征是步骤A-E包含溶液的储罐、溶液流量计量阀，以及由储罐、阀门、高压泵、超高压纳米均质机、生产过程质量检测仪器仪表等构成的自动控制系统。
8.根据权利要求1所述金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺，其特征是制得的金属硫蛋白柔性纳米脂质体粒径分布为30-400nm、平均粒径为80_200nm、包裹率为50-99 %、 储存稳定期为4-12个月。
全文摘要
本发明针对金属硫蛋白及金属硫蛋白与其它物质复合体(如普通纳米脂质体)都难以自由穿过细胞膜的缺点，向人们公开了一种金属硫蛋白柔性纳米脂质体的生产工艺。本生产工艺的步骤包括取一定量的金属硫蛋白、蛋白质稳定剂或冻干保护剂，配制成一定浓度的缓冲液；取一定比例的磷脂、胆固醇、表面活性剂、溶剂等制成有机相溶液；用高压泵将缓冲液与有机相溶液充分混合制成混合分散液；将混合分散液通过超高压纳米均质机制成粒径比较均匀分布的纳米脂质体；将纳米脂质体通过纳米超滤膜过滤；冷冻干燥、保存。根据本发明生产工艺所生产的产品具有更好的保存稳定性、细胞透过性，可广泛的用于美容化妆品、心脑血管病等各种疾病的预防与治疗。
文档编号A61P37/04GK102512368SQ20111041888
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者汪志友 申请人:汪志友