用于生产和纯化重组溶酶体α-甘露糖苷酶的方法

专利名称：用于生产和纯化重组溶酶体α-甘露糖苷酶的方法
技术领域：
本发明涉及ー种用于纯化重组α -甘露糖苷酶的方法、ー种用于生产α _甘露糖苷酶的方法、ー种包含α -甘露糖苷酶的组合物、这种组合物作为药物的用途、作为治疗α-甘露糖苷忙积症的药物的用途以及ー种治疗α-甘露糖苷忙积症和/或减轻与α-甘露糖苷贮积症相关的症状的方法。
背景技术：
α -甘露糖苷贮积症α -甘露糖苷贮积症是世界范围以1/1，000, 000和1/500，000之间的频率发生的
ー种隐性常染色体疾病。甘露糖苷贮积症存在于欧洲、美洲、非洲以及还有亚洲的全部人种类别中。它在对于溶酶体贮积病具有良好诊断服务的所有国家中以相似的频率检测到。他们出生时是表面上健康的，然而本病的症状是进行性的。α -甘露糖苷贮积症显示出临床异质性，范围从十分严重至十分轻微的形式。常见临床症状是精神发育迟滞、骨骼变化、导致反复感染的受损免疫系统、听カ损害，并且本病经常与典型面部特征(如粗糙的脸部、凸出的前額、扁平的鼻梁、小鼻和阔嘴)相关。在最严重的病例(甘露糖苷贮积症I型)中，儿童患有肝脾肿大，并且它们在生命第一年期间死亡。这种早期死亡可能由归因于免疫缺损的重度感染引起，所述免疫缺损由本这种疾病引起。在较轻微的病例(甘露糖苷贮积症2型)中，患者通常达到成年年龄。患者的骨骼虚弱导致在年龄20至40时需要轮椅。这种疾病引起弥散性脑功能障碍，经常导致仅存最基本的简单阅读和写作技能的弱心智能力。与听力下降(hearing inability)和其他临床表现相关的这些问题使患者不能独立生活，结果就是需要終生护理。α -甘露糖苷贮积症α-甘露糖苷贮积症因溶酶体α-甘露糖苷酶(LAMAN，EC3. 2. 1.24)的缺陷活性引起。这种疾病以甘露糖寡糖大量胞内积累为特征，所述甘露糖寡糖是在其非还原末端携帯al，2-、al，3-和α 1，6_甘露糖基残基的寡糖。这些寡糖主要源自带有N联寡糖的糖蛋白的溶酶体内降解。然而，一些寡糖源自多萜醇联寡糖的代谢并源自错误折叠的糖蛋白，这些错误折叠的糖蛋白被再引导至细胞溶胶由蛋白酶体降解(Hirsch等人，EMBO J. 22，1036-1046, 2003 和 Saint-Pol 等人，生物化学杂志(J Biol Chem.)274，13547-13555，1999)。在类型广泛的细胞类型和组织(包括在全部脑区域内的神经元)中观察到溶酶体贮积。LAMAN是ー种外切糖苷酶，它在顺序降解N联糖蛋白期间从非还原性末端水解ct-D-甘露糖苷中的这些末端非还原性a-D-甘露糖残基(Aronson和Kuranda美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J) 3:2615-2622. 1989)。这种人前体酶作为1011个氨基酸的単一多肽(包括49个残基的信号肽)合成。该前体经蛋白酶解加工成15kD、42kD和70kD三种主要糖肽以在溶酶体中变成成熟酶。70kD糖肽进一歩加工成由ニ硫键连接的3个亚基。(Berg等人，分子基因和新陈代谢(Mol. Gen. and Metabolism)73，18-29，2001，Nilssen 等人，人类分子遗传学(Hum. Mol. Genet. ) 6, 717-726. 1997)。
溶酶体α -甘露糖苷贮积症基因编码LAMAN (MANB)的基因位于第19号染色体(19cen_ql2)处(Kaneda等人，染色体(Chromosoma) 95:8-12. 1987)。MANB 由 24 个外显子组成，覆盖 21. 5kb (GenBank 登录号 U60885-U60899 ;Riise 等人，基因组(Genomics) 42:200-207，1997)。LAMAN 转录物是》3，500个核苷酸(nt)并且含有编码1，011个氨基酸的可读框(GenBank U60266. I)。编码LAMAN的人cDNA的克隆和测序已经在三篇论文中发表(Nilssen等人，人类分子遗传学(Hum. Mol. Genet. ) 6，717-726. 1997 ；Liao 等人，生物化学杂志(J. Biol.Chem) · 271，28348-28358. 1996 ；Nebes等人，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys. Res. Commun. )200, 239-245. 1994)。有趣地，这三个序列不是相同的。与 Nilssen等人的序列(登录号U60266. I)相比时，Liao等人和Nebes等人发现在位置1670和1671处导致缬氨酸至天冬氨酸置換的TA至AT变化。另外，发现了在位置1152处不引起氨基酸序列任何变化的C至A变化。 诊断α-甘露糖苷贮积症的诊断目前基于临床评价、检测尿中的甘露糖寡糖和直接测量多种细胞类型如白细胞、成纤维细胞和羊水细胞中的α -甘露糖苷酶活性(Chester等人，引自Durand P, O’Brian J (编著)糖蛋白代谢的遗传错误(Genetic errors ofglycoprotein metabolism) Edi-Ermes,米兰(Milan),第 89-120 页，1982 ；Thomas 和Beaudet.引自Scriver CR, Beaudet AL, Sly WA, Valle D (编著)遗传病的代谢和分子基石出(The metabolic and molecular bases of inherited disease).第 5卷McGraw-Hi11，纽约(New York)，第 2529-2562 页 1995)。因为症状起初经常是轻微的并且生物化学诊断是困难的，所以诊断往往在疾病过程的晩期作出。显然患者和他们的家人将从早期诊断中大幅度获益。动物樽型α甘露糖苷忙积症已经在牛(Hocking等人，生物化学杂志(Biochem J)128:69-78.1972)、猫(Walkley 等人，美国科学院院刊(Proc. Nat. Acad. Sci.)91:2970-2974, 1994)和豚鼠(Crawley 等人，儿科研究(Pediatr Res) 46:501-509，1999)中描述。小鼠模型最近通过定向破坏α-甘露糖苷酶基因产生(Stinchi等人，人类分子遗传学(Hum Mol Genet) 8:1366-72, 1999)。如同人α甘露糖苷酶中那样，似乎由编码溶酶体α-甘露糖苷酶的基因中的特定突变引起。Berg等人(生物化学杂志(Biochem J. ) 328:863-870. 1997)报道了猫肝脏溶酶体α -甘露糖苷酶的纯化和其cDNA序列的測定。活性酶由3条多肽组成，分子质量据报道是72、41和12kD。与人酶相似，证实了猫酶作为单链前体合成，所述单链前体具有50个氨基酸的推定性信号肽，后续一条957个氨基酸的多肽链，这条多肽链切割成成熟酶的3条多肽。推导的氨基酸序列与人序列和牛序列分别相同81. 1%和83. 2%。在患病的波斯猫中鉴定到ー个4-bp缺失；这个缺失导致从密码子583的移码和在密码子645处提前终止。可能在猫的肝脏检测不到酶活性。表现较轻微表型的家养长毛猫具有正常者的2%酶活性；这种猫没有这个4_bp缺失。Tollersrud等人(欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)246:410-419. 1997)纯化了牛肾酶至均一并且克隆了该基因。该基因以涵盖16kb的24个外显子组织起来。基于基因序列，他们鉴定出牛中的两个突变。
α -甘露糖苷贮积症疗法的医学需求鉴于因富含甘露糖的寡糖积累产生的严重临床表现，充分认识到缺少α-甘露糖苷贮积症的有效疗法。目前，治疗这种疾病的主要治疗选项是骨髄移植，然而，本发明的目标是促进酶替换疗法作为ー项有潜力的未来替代物。骨髓移棺在1996年，Walkley等人(美国科学院院干丨J (Proc. Nat. Acad.Sci). 91:2970-2974, 1994)发表ー篇关于3只患有露糖苷贮积症的小猫的论文，所述小猫在1991年用骨髄移植(BMT)治疗。在处死的2只动物中，不仅在身体内，更重要地，还在脑内见到正常化。第三只在6年后完好无损。通常，未治疗的猫在3-6月死亡。在1987年，一名患有甘露糖苷贮积症的儿童用BMT治疗(将等人，Arch Dis Child 1987年10月；62
(10):1044-9).他在18周后因而方法相关的并发症死亡。在脑中，发现很少酶活性。这个令人沮丧的结果可以由死亡前重度免疫抑制性治疗或在BMT后酶活性花费长时间在脑内 増加来解释。供体是母亲(其作为携带者预期必须具有小于50%的酶活性)或可能是在男性中的BMT对脑内的酶功能没有影响。尽管获得可变的結果，骨髄移植的少量尝试已经因而表明，成功的植活可以纠正α-甘露糖苷贮积症的临床表现，至少部分如此。然而，在人疗法中采用骨髄移植时减少方法相关的严重并发症的难题仍待解決。
_9] 酶替换疗法在发现溶酶体贮积疾病时，提出了可能通过酶置換法治疗这种疾病的希望。酶替换疗法已经证明在戈谢病(Gaucher disease)中有效。当外源溶酶体葡糖脑苷脂酶注射入患者时，这种酶由酶缺陷细胞摄入(Barton等人，新英格兰医学期刊(N Engl J Med)324:1464-1470)。此类摄入受细胞表面上的某些受体(例如在细胞表面上几乎普遍存在的甘露糖-6-磷酸受体)和限于某些细胞类型如单核细胞/巨噬细胞细胞系的细胞和肝细胞的其他受体(如脱唾液酸糖蛋白受体和甘露糖受体)调节。酶的细胞摄入因此严重依赖于其糖基化概况(glycosylation profile)。如果恰当地设计,可以通过按照与糖尿病患者接受胰岛素的相同方式定期注射外源酶，替换缺陷酶。将纯化的活性溶酶体α-甘露糖苷酶添加至酶缺陷性成纤维细胞培养基的体外研究显示纠正溶酶体底物积累。另ー方面，体内治疗已经部分地受阻于产生足量酶的问题(这归因于困难的大規模生产和纯化方法)和因针对外源酶的免疫反应产生的并发症。然而，最重要地，特殊考虑事项相对于具有主要神经学组分的溶酶体贮积疾病如α -甘露糖苷贮积症适用，其中临床表现与中枢神经系统内溶酶体贮积增加相关。因而，酶替换疗法未曾证明有效对抗戈谢病(Gaucher disease)的急性神经病变形(Prows等人，美国医学遗传学杂志(Am J Med Genet) 71:16-21 )。递送治疗性酶类至脑受无法转运这些大分子透过血脑屏障阻碍。从必须绕过血脑屏障以便在脑中实现治疗药作用的共识中，已经构思了使用众多不同的递送系统。这些包括侵入性技术如采用例如山梨醇的血脑屏障的渗透开口和非侵入性技术如受体介导的嵌合酶内呑。由于预期酶替换需要定期地施用酶，应当避免侵入性技术的使用。非侵入性技术的用途仅最近才在动物模型中提供有希望的结果(对于α -甘露糖苷贮积症，见下文，对于其他溶酶体病症，见例如Grubb等人，PNAS 2008, 105(7)第2616-2621页)。已经构思在内脏器官和在脑膜中減少的贮积可能减少运送至脑的寡糖的量。然而，此类考虑没有考虑到适用于其中神经学损伤是主要和严重的溶酶体病症(Neufeld，E. F.酶替换疗法(Enzymereplacement therapy),引自“脑的溶酶体病症(Lysosomal disorders of the brain)”(Platt, F. M. ffalkley, S. V:编著，牛津大学出版社(Oxford University Press))。然而，如Roces等人，人类分子遗传学(HumanMolecular Genetics)2004, 13(18)第 1979-1988 页，Blanz 等人，人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)2008, 17(22)第3437-3445页和W098/07409中所述，已经证明，可以使用例如包含α -甘露糖苷酶的制剂的静脉内注射，增加动物的中枢神经系统内LAMAN的水平，从而减少中枢神经系统的一个或多个区域内富含中性甘露糖的寡糖的胞内水平。这表明重组α-甘露糖苷酶在α-甘露糖苷贮积症患者的酶替换疗法中有用。因而，对于使用酶替换法提供α-甘露糖苷贮积症的高效治疗的一个剩余主要障碍是以有成本效率的方式提供足够量的纯重组α-甘露糖苷酶。
α-甘露糖苷酶的产生和纯化WO 02/099092公开了ー种在中华仓鼠卵巢细胞(CH0 cell)中于37°C使用无血清培养基的rhLAMAN的小規模生产方法。还描述了一种小规模纯化方法，包括透滤粗制酶和在捕获步骤中使用ニこ胺基こ基纤维素(DEAE)琼脂糖凝胶FF柱的弱阴离子交換层析，随后是众多层析纯化步骤，包括疏水相互作用层析和混合模式层祈。WO 05/094874公开了ー种在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中于37°C使用无血清培养基的rhLAMAN的小規模生产方法。还描述了与WO 02/099092的ー种方法类似的一种小规
模纯化方法。WO 05/077093描述了高度磷酸化的溶酶体酶的制造。在实施例IV中，描述了使用多模态树脂(蓝色琼脂糖凝胶(blue-sepharose))的用于酸性α -葡糖苷酶(GAA)的纯化方法。GAA，虽然是ー种溶酶体酶，然而与rhLAMAN完全不同。GAA是高度磷酸化的，而rhLAMAN具有低程度的磷酸化。另外，在GAA和rhLAMAN之间的序列同一性评分小于12%,并且最終，它们的理论等电点相差多于ー个pH单位(分别是5. 42和6. 48)。因而，如WO 05/077093中所述的纯化GAA的方法不适用于rhLAMAN。已经公开了ー种在CHO细胞中使用0. 25% (V/V)血清和DMSO添加物的rhLAMAN的小规模生产方法(Berg等人，分子遗传学和新陈代谢(Molecular Genetics andMetabolism), 73,第18-29页，2001 )。还描述了两种纯化工艺，包括a) —个超滤、阴离子交换层析和凝胶过滤的三步骤方法或b)单步骤免疫亲和层析法。还公开方法a)怎样导致130kDa酶完全片段化成55kDa和72kDa片段，而方法b)怎样导致130kDa前体部分地片段化成明显量的55kDa和72kDa片段。因而，用于生产和纯化重组α -甘露糖苷酶的改进方法将是有利的。具体而言，用于大規模培养能够表达α-甘露糖苷酶的细胞系的改进方法和用于从细胞培养物中分离具有高度酶活性的纯α-甘露糖苷酶的更高效的大規模纯化方法将是有利的。发明简述因而，本发明的目的涉及重组α-甘露糖苷酶的生产和纯化方法。具体而言，本发明的目的是提供一种可扩展的生产和纯化方法，所述方法通过提供足够量的具有高度酶活性的高纯度α-甘露糖苷酶解决以上提到的现有技术问题，从而为患有α-甘露糖苷贮积症的患者提供ー种疗法。
因而，本发明的ー个方面涉及ー种用于从细胞培养物中纯化重组α -甘露糖苷酶的方法，其中包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物部分在包含多模态配体的树脂上经历层析。本发明人令人惊讶地发现这种纯化方法产生组合物，所述组合物包含与先前所实现相比具有更高纯度和更高百分数所需130kDa糖蛋白种类的重组α-甘露糖苷酶。在纯化后实现持续的高百分数(如多于80%)的非片段化的130kDa糖蛋白是有利的，因为这提供了与片段化酶相比更均一的产物，这转而增强获得药用级产物的能力。本发明的另ー个方面涉及ー种用于分批补料生产或连续生产重组α-甘露糖苷酶的方法，包括以下步骤a.在第O日用能够产生重组α -甘露糖苷酶的细胞接种包含基础培养基的生产反应器以提供细胞培养物；b.从第I日添加进料培养基至所述细胞培养物至少一次；
c.在第3日后或在活细胞密度高于2. lMVC/mL吋，以先到者为准，调节所述细胞培养物的温度最多到35°C，如34で、33で、32で、优选地最多31で。
0038]本发明人令人惊讶地发现以上生产方法以高产率产生包含重组α -甘露糖苷酶的细胞培养物，所述细胞培养物在无任何稀释的情况下轻易地转移至本发明的纯化柱。本发明的又ー个方面是提供一种包含纯化的重组α -甘露糖苷酶的组合物，其中至少80%的α -甘露糖苷酶作为130kDa糖蛋白存在。本发明的ー个其他方面是ー种用于治疗α -甘露糖苷贮积症的包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物。本发明的又ー个方面是ー种治疗α-甘露糖苷贮积症和/或減少或减轻与α-甘露糖苷贮积症相关的症状的方法，所述方法包括步骤施用包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物至有需求的受试者。


图I显示了从收获至原料药提交的α -甘露糖苷酶的当前优选纯化方法设计的概览。图2显示α -甘露糖苷酶的卡普托商标名MMC (Capto MMC)柱层析图的实例。图3显示α -甘露糖苷酶的丁基琼脂糖凝胶商标名FF柱(Butyl Sepharose FFcolumn)层析图的实例。图4显示α -甘露糖苷酶的I型陶瓷羟基磷灰石(CHT)柱层析图的实例。图5显示α -甘露糖苷酶的Q琼脂糖凝胶HP柱(Q Sepharose HP column)层析图的实例。图6显示纯化的α -甘露糖苷酶组合物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)层析图，其显示130kDa、75kDa和55kDa糖蛋白种类的分布。图7显示纯化的α -甘露糖苷酶的三幅高效液相色谱(HPLC)图，其中与55kDa和75kDa种类相比，描述130kDa种类的量。从左侧，第一峰是55kDa种类，随后分别是130kDa和75kDa种类。这个2步骤方法不使用多模态配体层析步骤，而3步骤方法和4步骤方法使用多模态配体层析步骤。本发明现在将在下文中更详细地描述。
发明详述定义在进ー步详细讨论本发明之前，首先将定义以下术语和惯例重组α -甘露糖苷酶在本发明的上下文中，重组α-甘露糖苷酶定义为就其起源或操作而言与自然界中存在的野生型α-甘露糖苷酶的全部或一部分不相等的α-甘露糖苷酶。因而，这种重组α -甘露糖苷酶使用包括重组DNA分子的重组技术构建，所述重组DNA分子是包含至少两个融合DNA序列的杂合DNA序列，第一序列在自然界中通常不与第 二序列融合。重组α-甘露糖苷酶蛋白可以是人来源或非人来源的。具体而言，它可以是重组的人溶酶体α-甘露糖苷酶(rhLAMAN)。这种α -甘露糖苷酶产物可以是单一多肽或单一多肽及其部分的混合物。另外，α-甘露糖苷酶可以经历翻译后修饰并且可以因此为糖蛋白形式。细胞培养细胞培养是在受控条件下培育细胞的过程。在本发明语境下，特别地设计细胞培养物的细胞以表达目的蛋白，如重组α-甘露糖苷酶。细胞培养物可以位于生物反应器内，其中生物反应器经专门设计从而允许控制化学条件和物理条件。部分在本发明语境下，部分指细胞培养物的部分。这种部分可以构成完整的细胞培养物，但是经常是培养物的处理部分，如澄清、过滤、浓缩、稀释或部分纯化的部分。树脂在本发明的上下文中，树脂构成基础层析系统中固定相的基础，在所述基础上连接多种化学基团或物质以提供某种量的针对的给定分子或目的蛋白的亲和力。树脂经常是具有共价连接的配体的聚合物珠，所述树脂不溶于所用的液态流动相中。多模态配体多模态配体意指设计g在以至少2种方式与分子或目的蛋白相互作用的任何配体。各个相互作用可以独立地是疏水性、亲水性、离子性、范德瓦尔斯相互作用、成氢键或任何其他分子内化学或物理相互作用。在本发明语境下，配体是与如上文定义的树脂连接的有机化学物质。多模态配体将对溶解流动相于中的通过层析柱的不同物质具有不同的亲和力。亲和カ的差异导致不同物质在层析柱上的停留时间变化，从而能够分离物质。停留时间还取决于其他因素，例如流动相的组分、PH和温度。包含多模态配体的树脂有时也称作“混合模式”树脂，但是在本发明语境下，包含多模态配体的树脂不与所谓的在相同树脂上包含几种不同“配体”的“混合模式离子交换树脂”混淆，所述的不同配体在陶瓷羟基磷灰石树月旨(CHT)情况下可以具有相反电荷，例如-0H、-Ca+和-PO广。在这些树脂中，各个配体不是多模态的。加载在本发明语境下，加载指将收获物、洗脱物或其他溶液转移到层析系统如包含树脂作为固定相的层析柱上。缓冲液术语缓冲液作为ー种溶液的一般描述是熟知，这种溶液含有抵抗pH变化的弱酸和/或其相应盐或弱碱和/或其相应盐。在本发明的上下文中，所用的缓冲液适用于层析系统，此类缓冲液包括但不限干磷酸盐缓冲液，例如，磷酸氢ニ钠(Na2HPO4),磷酸钠或磷酸钾、こ酸盐缓冲液，例如，こ酸钠或こ酸钾、硫酸盐缓冲液，例如，硫酸钠或硫酸钾、硫酸铵或羟こ基哌嗪こ磺酸(Hepes)，或其他缓冲液，例如，硼酸钠或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(triS-HC1)缓冲液。超滤超滤是ー种分离方法，在其中使用液压来迫使分子和溶剂跨过包含特定尺寸(也称作截留尺寸或截留值)的孔的膜。仅具有小于该膜截留值的分子量的分子能够穿过该膜，而仅具有较大分子量的那些分子不能够穿过该膜并且形成所谓截留物质。截留物质中存在的分子从而可以浓缩为跨过该膜的溶剂流。在ー个特定实施方案中，包含多肽如α-甘露糖苷酶的溶液或组合物的浓缩可以通过切线流过滤法(TFF)进行。这种方法尤其用于大規模浓缩，即，用于浓缩具有几升至几百升体积的溶液。因而，这种方法尤其用于以エ业规模生产目的多肽的浓缩溶液。
TFF技术基于特殊装置的用途，所述装置引起待过滤的溶液流动穿过半透膜，仅小于膜孔的分子将通过该膜，形成滤液，留下待收集的较大物质(截留物质)。采用TFF方法时，应用两种不同的压カ；将溶液泵送入系统并且使其在系统中循环(入口压力)的ー种压力和在膜上施加以使小分子和溶剂穿过该膜的另ー个压カ(膜压力)。入口压カ通常可以在l-3bar范围内，如在I. 5-2bar之间。跨膜压カ(TMP)通常可以大于lbar。在使用TFF来浓缩组合物时，可以将目的多肽的浓缩组合物收集为截留物质。用于TFF的膜通常可以由再生的纤维素或聚醚(PES)制成。透滤在本发明语境下，透滤是目的种类处于截留物质内(即不允许目的种类通过滤器，而其他组分例如缓冲剂和盐通过滤器)的过滤方法。因而透滤可以例如用来将ー种缓冲液由另ー种缓冲液交換或用来浓缩含有目的种类如重组α-甘露糖苷酶的溶液。本发明的第一方面是提供一种用于从细胞培养物中纯化重组α-甘露糖苷酶的方法，其中包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物部分在包含多模态配体的树脂上经历层析。在本发明语境下使用包含多模态配体的树脂的优点在于这些树脂使在具有高电导率水平的溶液中结合α-甘露糖苷酶种类成为可能。这具有以下优点可以使用具有高电导率水平的未稀释的收获物，并且不需要交换收获物缓冲液。在从细胞培养物分离出所述部分后，包含多模态配体的层析步骤因此可以优选地是第一层析步骤。包含多模态配体的所述层析步骤经常可以称作“捕获步骤”，因为目的蛋白最初固定在柱上(即，捕获)，而许多杂质在洗涤步骤期间通过该柱。这种蛋白质随后使用特定洗脱缓冲液洗脱。因而，在本发明的一个实施方案中，提供ー种方法，其中包含重组α-甘露糖苷酶的细胞培养物部分是澄清的未稀释收获物。在本发明的上下文中，术语“澄清的未稀释收获”意指细胞培养物的收获物，它不含未溶解的物质或固形物，即，它是清亮溶液。这种收获物可以已经经历过ー种处理以便转变成清亮溶液。此类处理可以包括，但不限于过滤和离心。另外，这种收获物在经历层析步骤之前不作大幅度稀释。因此，这种收获物稀释小于10%，如小于7%、小于5%、小于2%、小于1%、小于O. 5%，如小于O. 1%。在最优选的实施方案中，这种收获不作稀释。在另ー个实施方案中，提供ー种方法，其中澄清的未稀释收获物具有10_20mS/cm，如12-17mS/cm、优选地15mS/cm的电导率。电导率在加载收获物到层析系统上之前测量。在一个实施方案中，所述层析在包含具有羧酸或磺酸基团的多模态配体的树脂上进行。这些配体中所包含的羧酸和/或磺酸可以根据层析系统中的条件、尤其流动相的pH处于质子化形式或去质子化(盐)形式。在又一个实施方案中，提供了ー种方法，其中所述结合树脂的多模态配体是式(1)、(11)或(III)的物质
权利要求
1.ー种用于从细胞培养物中纯化重组α -甘露糖苷酶的方法，其中，包含重组α-甘露糖苷酶的所述细胞培养物部分在包含多模态配体的树脂上经历层祈。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，包含重组α-甘露糖苷酶的所述细胞培养物部分是澄清的未稀释收获物。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述结合树脂的多模态配体是具有羧酸或磺酸基团的物质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述结合树脂的多模态配体是式(1)、(11)或(III)的物质
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，加载到包含多模态配体的树脂上的所述细胞培养物部分经历采用包含异丙醇、优选地包含至少1% (v:v)异丙醇，如包含至少2%、3%、4%、4. 5% (V:V)异丙醇、优选地包含至少5% (V:V)异丙醇的溶液的至少ー个洗涤步骤。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，包含重组α-甘露糖苷酶的第一洗脱物从包含多模态配体的树脂中使用包含こニ醇或丙ニ醇的水溶液洗脱。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，从包含多模态配体的树脂中获得的包含重组α-甘露糖苷酶的第一洗脱物进ー步经历包括以下步骤的方法i)施加包含α-甘露糖苷酶的部分至疏水性相互作用层析树脂以提供包含重组α-甘露糖苷酶的洗脱物，ii)使包含α-甘露糖苷酶的部分通过混合模式离子交换树脂以允许滞留杂质以便提供包含重组α-甘露糖苷酶的通流；和iii)使包含α-甘露糖苷酶的部分在阴离子交换树脂上经历层析以提供包含重组甘露糖苷酶的洗脱物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述α-甘露糖苷酶具有选自以下的序列A). SEQ ID NO 2中所述的序列；B). Α)中的序列的类似物；C).A)或B)中的序列的子序列。
9.一种组合物，其包含通过根据权利要求1-8中任一项所述的纯化方法可获得的α-甘露糖苷酶。
10.一种用于分批补料生产或连续生产重组α-甘露糖苷酶的方法，其包括以下步骤a.在第O日用能够产生重组α-甘露糖苷酶的细胞接种包含基础培养基的生产反应器以提供细胞培养物；b.从第I日添加进料培养基至所述细胞培养物至少一次；c.在第3日后或在活细胞密度高于2.lMVC/mL吋，以先到者为准，调节所述细胞培养物的温度最多到35 °C，如34°C、33 °C、32 °C、优选地最多31 °C。
11.根据权利要求10所述的方法，其还包括以下步骤d.根据权利要求1-8中任一项所述的纯化方法。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养物基本上不含源自动物的任何补充物，如鱼肝油补充物。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中，用于分批补料生产或连续生产的方法以至少30L，如至少50L、75L、100L、150L、200L、优选地至少250L的体积进行。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中，所述α-甘露糖苷酶具有选自以下的序列A). SEQ ID NO 2中所述的序列；B). Α)中的序列的类似物；C).A)或B)中的序列的子序列。
15.一种组合物，其包含通过根据权利要求10-14中任一项所述的生产方法可获得的α-甘露糖苷酶。
16.ー种包含纯化的重组α-甘露糖苷酶的组合物，其中，至少80%的α-甘露糖苷酶作为130kDa糖蛋白存在。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述重组α-甘露糖苷酶在液态溶液中在+5°C下贮存时保持稳定至少4日或在_20°C下贮存时保持稳定至少24个月。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的组合物，其中，所述α-甘露糖苷酶具有选自以下的序列A). SEQ ID NO 2中所述的序列；B). Α)中的序列的类似物；C).A)或B)中的序列的子序列。
19.根据权利要求9和15-18中任一项所述的组合物，用作药物。
20.根据权利要求9和15-18中任一项所述的组合物，用于治疗α-甘露糖苷贮积症。
21.权利要求9和15-18中任一项所述的组合物在制备用于治疗α-甘露糖苷贮积症的药物中的用途。
22.—种治疗α -甘露糖苷贮积症和/或减少或减轻与α -甘露糖苷贮积症相关的症状的方法，所述方法包括步骤给药包含根据权利要求9和15-18中任ー项所述的纯化重组α-甘露糖苷酶的组合物至有需求的受试者。
全文摘要
本发明涉及一种用于纯化重组α-甘露糖苷酶的方法、一种用于生产α-甘露糖苷酶的方法、一种包含α-甘露糖苷酶的组合物、这种组合物作为药物的用途、作为治疗α-甘露糖苷贮积症的药物的用途以及一种治疗α-甘露糖苷贮积症和/或减轻与α-甘露糖苷贮积症相关的症状的方法。
文档编号A61K38/46GK102834111SQ201180010683
公开日2012年12月19日 申请日期2011年2月23日 优先权日2010年2月24日
发明者延斯·福格, 克拉斯·安德松, 塞西利亚·魏格尔特, 皮亚·许登, 海伦娜·雷乌特瓦尔, 斯特凡·尼尔松 申请人:齐姆内克斯公司