专利名称：H5n1谱系的通用疫苗的制作方法
H5N1谱系的通用疫苗相关申请的交叉参考本申请涉及并要求2010年4月30日申请的美国临时申请系列号61/329，802的优先权，其援引加入本文。序列提交本申请与电子形式序列表一起提交。序列表名称为2577_201PCT_ST25. txt，创建于2011年I月13日，大小为54kb。电子形式序列表的信息是本申请一部分并且以其全文援引加入本文。发明背景
本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，其覆盖大多数H5N1谱系中血凝素的中和表位中的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者包含这三种毒株每一毒株的血凝素肽。本文中用于例证本发明背景或者提供关于实施的其它详细描述的出版物及其它材料均援引加入本文，为方便起见在“参考文献”中分别列出。流感病毒通过随机改变抗原决定簇如存在于血凝素球形头部区域中的主要中和表位而逃避免疫系统。在感染时,宿主应答的主要特征在于诱导针对这种中和表位的抗体，其阻断病毒血凝素对于靶细胞受体的附着。然而，这些HA的中和表位内相当多的氨基酸变化导致抗原性独特的流感H5N1病毒的出现。事实上，已报道季节性流感病毒在人群中通过抗原性漂移能有效逃避疫苗诱导的免疫性。此外，HAl可变区中几个关键氨基酸的突变足以使得病毒逃避疫苗诱导的抗体应答。先前鉴别逃避单克隆抗体的中和作用的变体的HA序列内的氨基酸取代的尝试揭示了 HA的中和表位位点(Kaverin et al. , 2002 ；Kaverin etal. , 2007)。流感病毒随机突变及进化为具有多样抗原性决定簇的新类型的性质在流感感染控制中是重要的挑战(Plotkin et al. , 2002) 0通过近年来H5N1禽流感的爆发及目前HlNl猪源性甲型流感病毒(S-OIV)的大流行局面已经清楚地认识到这点。事实上，在文献中已经充分记录了 H5N1已经获得感染人体组织的能力，这主要由于突变事件发生所致(Ayora-Talavera et al.，2009)。高致病性禽流感(HPAI)H5N1由于血凝素(HA)序列中的差异而是抗原性可区别的，由此产生H5N1的不同谱系或进化枝，HA是流感免疫性的主要决定簇(Lam et al.，2008 ；WH0, 2005)。使用目前的H5N1疫苗控制感染看起来对于异源毒株或H5N1的系统发生变体进化枝不是有效的，这部分是由于HA序列、特别是中和表位区域中的变化所致。由于现有疫苗仅基于诱导针对这些表位的中和抗体，因此这些序列中的差异可导致目前的疫苗不能胜任预防全球性流感。事实上，目前的H5N1疫苗候选物持续提供对于相应进化枝内大多数分离株的良好的抗原性覆盖，近年来认识到进化枝1、2. 2及2. 3自身内一些病毒示出抗原性异质性的迹象。为克服这种限制及完全了解世界范围的疫苗潜力，近年来提出了基于保守病毒蛋白质的通用疫苗的观念。已经对流感病毒的高度保守的离子通道蛋白(M2)或者核蛋白(NP)诱导交叉保护性细胞免疫性和病毒清除进行了评估(Wu et al. , 2007 ；Chen andSubbarao, 2009)。一种类似的使用血凝素的保守的融合肽的方法是抑制病毒与宿主细胞膜融合的另一选项(Gerhard et al.，2006)。针对这些保守蛋白产生的抗体可以降低病毒传播及促进从流感中康复。然而，特异于这些蛋白质的抗体的免疫原性不佳且发现是感染容许的(infection permissive)。因此,基于流感病毒血凝素的疫苗的开发看起来是预防HPAI如H5N1感染的唯一可行选项。然而，H5亚型中主要抗原性中和表位区域内的氨基酸改变限制了针对不同H5N1谱系的这种通用疫苗的开发。因此，需要开发一种通用疫苗，其提供对于不同H5N1谱系的一定程度的保护性免疫性。发明概述本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，其覆盖大多数H5N1谱系中血凝素中和表位中的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者包含这三种中每一毒株的血凝素肽。
因此，第一方面，本发明提供了预防对象疾病的通用H5N1疫苗，其中所述疾病与禽流感病毒的H5N1亚型相关。在一个实施方案中，所述通用H5N1疫苗包含预防有效量的第一免疫原性物质，预防有效量的第二免疫原性物质以及预防有效量的第三免疫原性物质。在另一实施方案中，每种免疫原性物质均包含血凝素或其抗原性部分或者编码所述血凝素或其抗原性部分的核酸。在另一实施方案中，所述抗原性部分包括血凝素的表位。在进一步的实施方案中，所述对象可以是人、家畜(狗、猫、猴等)、牲畜(马、牛、绵羊、山羊、猪等)、野禽(野鹅、野鸭等)以及家禽(鸡、鸭、鹅等)。在一个实施方案中，免疫原性物质是包含血凝素的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是失活的。在另一实施方案中，所述病毒是减毒的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是病毒体形式。在进一步的实施方案中，所述病毒衍生自卵或者衍生自细胞培养物。在另一实施方案中，所述免疫原性物质是包含血凝素的裂解病毒或者裂解病毒抗原性制备物。在一个实施方案中，所述免疫原性物质是血凝素或其抗原性部分。在另一实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已经被分离。在另一实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分是通过表达系统产生的。在一个实施方案中，所述表达系统是任何表达系统，如病毒表达载体，其中血凝素或其抗原性部分呈递或展示在所述病毒表面。在一个实施方案中，所述病毒表达载体是任何病毒表达载体，如修饰的痘苗病毒表达载体，腺病毒表达载体，痘病毒表达载体，杆状病毒表达载体等。在一个实施方案中，所述表达载体是杆状病毒表达载体，呈递或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是杆状病毒。在另一实施方案中，所述免疫原性物质是编码血凝素或其抗原性部分的核酸，其能在对象中表达。第二方面，本发明提供了一种对禽流感病毒产生保护性免疫性的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第三方面，本发明提供了一种预防或治疗与禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第四方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在刺激对于禽流感病毒的免疫应答中的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第五方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在预防与禽流感病毒相关疾病中的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。
第六方面，本发明提供了通用H5N1疫苗，其用于医药中。第七方面，本发明提供了通用H5N1疫苗，其用于调节对象体内的免疫应答。第八方面，本发明提供了通用H5N1疫苗，其用于治疗或预防对象中与禽流感病毒相关的疾病。第九方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在生产调节对象体内免疫应答的药物中的应用。第十方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在生产治疗或预防对象中与禽流感病毒相关的疾病的药物中的应用。附图
简述图I示出血清血细胞凝集抑制效价。将小鼠组在第O天和第28天用 BacHA (BacHA-VN)的 Tri-BacHA (BacHA-mix)或 Mono-BacHA (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。每个点表示算术平均值(η = 10) 土SD。图2Α和2Β示出小鼠中交叉进化枝血清微量中和实验。将小鼠组在第O天和第28天用BacHA(Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA(Mono-BacHA)的单一毒株(Α/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在这项研究中使用来自进化枝 I. O (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))、进化枝 2. I (A/Indonesia/CDC1031/2007 (H5N1))、进化枝 2. 2 A/turkey/Turkeyl/05* (H5N1)、进化枝 4. O (clade 4. OA/goose/Guiyang/337/06 (H5N1))、进化枝 7. O (A/chicken/Shanxi/2/06 (H5N1))及进化枝
8.O (A/chicken/Henan/12/04 (H5N1))的病毒。进化枝I、2. I和2. 2在图2A中示出，进化枝
4、7和8在图2B中示出。来自峰值应答当天的血清及在最终免疫后14天的血清用于该测定。每个点表示算术平均值(η = 10) 土SE。图3示出小鼠免于致死性Η5Ν1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50(50%小鼠致死剂量)的进化枝1.0(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))HPAI H5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠存活情况。结果以存活率百分比表示。图4示出小鼠免于致死性H5N1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50 (50%小鼠致死剂量)的进化枝2. I (A/Indonesia/TLL013/2006 (H5N1))HPAIH5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠存活情况。结果以存活率百分比表示。图5示出小鼠免于致死性H5N1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50(50%小鼠致死剂量)的进化枝7. O (A/chicken/Shanxi/2/06 (H5N1))HPAIH5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠体重减轻情况。结果以体重百分比表示(在实验开始时)。
图6示出小鼠免于致死性H5N1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第O天和第28天用BacHA (Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA (Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004 (H5N1))或者失活的完全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50 (50%小鼠致死剂量)的进化枝7. O (A/chicken/Shanxi/2/06 (H5N1))HPAIH5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠存活情况。结果以存活率百分比表示。发明详述本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，其覆盖大多数H5N1谱系中血凝素中和表位的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者其包含这三株中每一株的血凝素肽。除非特别定义，本文使用的所有技术和学术术语均具有与本发明所属领域技术人员通常了解的相同含义。除非特别指出，本文中提及的所有专利、专利申请、公布的申请及出版物、Genbank序列、网站及及其它公开的材料均以其全部内容援引加入本文作参考。 虽然目前H5N1疫苗候选物继续提供对于相应进化枝内大多数分离株的良好的抗原性覆盖，但是近年来已经认识到进化枝1、2. 2及2. 3自身内的一些病毒示出抗原性异质性的迹象。由于H5N1病毒已经分为许多亚系或进化枝，因此本发明提供了代表H5亚型特别是在中和表位区域中的变化的疫苗毒株的分析和选择。根据本发明的这种疫苗毒株选择提供了对于大多数H5N1谱系的广泛保护作用。如本文所示，如果可以鉴别一些HPAI H5N1进化枝中中和表位的变化或保守性，则完全基于流感病毒HA的通用疫苗的开发是可行的。了解这种中和表位的分布模式有助于通过在疫苗组合物中掺入两或更多个理想的H5N1毒株而设计通用疫苗。选择的病毒毒株的中和表位覆盖大多数H5亚型中的变化，以获得针对大多数H5N1亚型的广泛的保护性免疫性。先前鉴别逃避单克隆抗体中和作用的变体的HA序列内的氨基酸取代的尝试揭示了HA的中和表位位点(Kaverin et al. , 2002 ；Kaverin et al.，2007)。结合先前的发现，本发明提供了通过使用中和性单克隆抗体对其氨基酸序列作图鉴别H5N1的其它主要中和表位。对H5亚型中所有鉴别的中和表位的分布进行的分析表明来自人和禽来源的H5N1亚型的抗原性决定簇中的变化。基于这些结果，本发明提供了三种疫苗毒株，其包含HA的主要中和表位以覆盖H5N1谱系内全部变体。为了检测证实在体内的广泛保护作用，将选择的疫苗毒株的HA蛋白在杆状病毒表面上表达并在用系统发生变体H5N1毒株攻击的小鼠模型中评估疫苗配制物的效力。根据本发明，所述通用疫苗开发策略包括三个步骤(i)使用中和性单克隆抗体(n-mAb)对H5N1病毒血凝素的中和表位作图；(ii)分析所有H5N1谱系中中和表位的分布；及(iii)选择理想的疫苗毒株以覆盖全部H5N1病毒的中和表位内的变化。根据本发明，使用一组5个n-mAb(6B8、4C2、2D9、4F8和3H11)作图H5N1病毒的中和表位。使用n-mAb对中和表位作图表明在第138或155或189或223位置的氨基酸参与H5N1病毒血凝素的主要中和表位的形成。此外，作为主要中和表位的一部分而被鉴别的其它氨基酸(140,159,194和218) (Kaverin et al. , 2007)也被考虑用于随后的分析。如本文所示，将H5N1病毒的主要中和表位序列与流感病毒研究数据库对比揭示了所有人和禽H5N1病毒血凝素的表位区域内的变化。见下表2。
基于本文描述的表位分布分析，选择三种不同毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)(进化枝 2. I)、A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)(进化枝 I. O)和Anhui/1/2005 (H5N1)(进化枝2. 3)共同代表所有H5N1亚型中的变化。通过病毒中和作用和HI效价证实选择的疫苗毒株与不同中和性mAb的反应性模式。如下表4A和4B所不,n-mAb4C2 和 4F8 仅识别 A/Indonesia/CDC669/2006 (H5N1)毒株，与 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)和A/Anhui/1/2005 (H5N1)毒株不反应。这种反应性模式可能是由于在第189位置的氨基酸改变所致，因为A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)毒株在第189位具有“Arg”，而在A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和 A/Anhui/1/2005 (H5N1)毒株的相同位置是“Lys”。另一方面，η-mAb 6B8 与 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)和 A/Anhui/1/2005 (H5N1)毒株均反应，可能是由于在第189位存在共同残基“Lys”所致。相似地，也已经发现在第155位的氨基酸对于H5N1毒株的抗体识别具有显著影响。此外，如下表2所示，150的环有两个变体，63. 4%的人H5N1分离株具有氨基酸“Ser”，而剩余34. 4%在这个位置具有氨基酸“Asn”。同样，位于HA的受体结合位点内的第189位的氨基酸，在64. 26%的所有人H5N1毒株中含有氨基酸“Arg”，剩余的34. 65%在此位置具有氨基酸“Lys”。因此，合理推测根据本发明选择的疫苗 毒株应代表几乎99%的所有H5N1谱系包括人和禽病毒的主要抗原性表位内的变化。将选择的毒株的HA蛋白分别在杆状病毒表面上表达，并在小鼠模型中评估疫苗配制物。构建具有WSSV的立即早期启动子I (iel)的重组杆状病毒以促进流感病毒H5血凝素在昆虫和哺乳动物细胞中的高水平表达。iel作为立即早期启动子的性质支持在杆状病毒生命周期的早期阶段的蛋白质表达，导致杆状病毒包膜上的功能性血凝素展示增强。由于寡聚化是HA蛋白质有效转运至宿主细胞膜所必需的(Copeland et al. , 1986),这是杆状病毒获得该蛋白质的先决条件，因此推定在杆状病毒表面上展示的HA应以其寡聚形式呈递。因此，这个模型将帮助模拟蛋白质的天然结构，因此模拟野生型流感病毒。通过血凝活性及HAO真正裂解为HAl和HA2证实，在杆状病毒表面上展示的HA保持其天然结构(数据未示出)。虽然表达流感病毒血凝素(HA)的杆状病毒在昆虫细胞中通常不裂解，但是在裂解位点具有多个碱性氨基酸的高致病性禽流感病毒(如H5和H7)的HA已经示出在不存在胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶条件下被裂解为HAl和HA2亚基(KuiOda etal.，1986)。目前的研究中HAO的部分裂解可能是由于昆虫细胞中枯草杆菌蛋白酶样前蛋白(piOprotein)转变酶(PC)的存在所致(Ci印Iik et al.，1998)，其底物特异性和抑制剂谱与哺乳动物PC相同。如本文所示，用展示A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)、A/VietNam/1203/2004 (H5N1)或 A/Anhui/1/2005 (H5N1)的 HA 的每种杆状病毒的佐剂化(adjuvanted)混合物(Tri-BacHA)进行皮下免疫接种，当与其未佐剂化对应物相比时显著增强血清HI效价。此外，用佐剂化Tri-BacHA接种的小鼠的HI效价与用佐剂化完全RG-H5N1病毒或展示H5Nl-A/VietNam/1203/2004(H5Nl)的HA的佐剂化杆状病毒(Mono-BacHA)接种的那些小鼠(针对A/Vietnam/1203/2004(H5N1))的相当。此外，佐剂化Tri-BacHA诱导较高的中和抗体效价，与未佐剂化Tri-BacHA相比，其有效地中和来自各个进化枝(进化枝I. O,进化枝2. 1，进化枝2. 2，进化枝4. 0，进化枝7. O及进化枝8. O)的100 TCID50的异源H5N1毒株。仅含有佐剂化Mono-BacHA或失活的RG-H5N1疫苗的疫苗配制物能中和进化枝I (同源)、进化枝2. I和进化枝8. 0，但是不有效中和来自其它进化枝(进化枝2. 2、进化枝4. O和进化枝7. O)的H5N1病毒。佐剂化Tri-BacHA疫苗配制物的强交叉-进化枝免疫性可能是由于覆盖H5N1谱系的中和表位内的变化所致。疫苗的保护性效力通过用来自进化枝I、进化枝2. I和进化枝7的H5N1毒株攻击接种的小鼠进行评估。如本文所示，在用针对进化枝I. O和进化枝2. I的佐剂化Tri-BacHA或Mono-BacHA或者失活的全病毒疫苗接种的组中获得100%存活率。此外，佐剂化Tri-BacHA提供针对进化枝7. O H5N1病毒100%的保护作用，无任何感染症状。然而，佐剂化失活的全病毒疫苗和Mono-BacHA针对进化枝7. O H5N1感染仅分别提供66. 6%和83. 3%的保护作用。同样，在不同组中感染的进展通过体重降低的不同倾向表示。用佐剂化Mono-BacHA或者佐剂化全病 毒疫苗接种的小鼠针对进化枝7. O示出在第6天直至17%的较高的体重降低。这表明一价疫苗不能赋予针对不同H5N1亚型的保护作用，这也许是由于不同病毒亚型的抗原性决定簇(如中和表位)内的变化所致。总的来说，用展示来自三种选择的疫苗毒株的血凝素的杆状病毒对小鼠进行皮下免疫诱导了系统性免疫应答，并呈现出针对无任何临床症状的H5N1病毒感染的交叉保护作用。同样，揭示了基于亚型中中和表位内的变化选择疫苗毒株的发现将有助于预防由新出现的H5N1突变体介导的感染。用于这项研究的疫苗配制物不用顾虑任何生物安全性而快速生产。展示HA的杆状病毒在大流行和大流行前情形是作为疫苗的理想选择，并加速完成疫苗技术而不需要高生物防护设备或冗长的蛋白质纯化过程。如本文所用，术语“治疗”是指以任何方式治愈病症或症状、预防病症或疾病建立或者以其他方式预防、阻碍、延迟、改善或逆转病症或疾病或其它不希望的症状进展的任何及所有应用。如本文所用，术语“有效量”或者“预防有效量”是指一种物质或化合物提供所希望的作用所需的无毒性但足够的量。例如，调节免疫应答的预防有效量是所述物质或化合物在对象体内提供希望的调节免疫应答作用的量。相似地，治疗或预防与禽流感病毒相关疾病的预防有效量是所述物质或化合物在所述对象体内提供希望的治疗或预防所述疾病作用的量。所需的精确量根据对象如治疗物种、对象年龄和健康状况、治疗病症的严重性、施用的特定药物以及施用模式等因素而不同。因此，不可能指定精确的“有效量”。然而，对于任何指定情况，合适的“有效量”可以由本领域技术人员仅使用常规实验确定。如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其片段、变体、类似物、直系同源物或者同系物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是合成的非天然发生的氨基酸，如相应天然发生的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然发生的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”可互换使用，是指包含一或多个核苷酸的分子，或者寡核苷酸，或者其片段，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或者其组合。如本文所用，短语“与H5N1亚型禽流感病毒相关疾病”是指由H5N1亚型禽流感病毒导致的或者与其相关的任何疾病、疾病状态或失调。如本文所用，术语“调节”当用于与免疫应答相关时是指直接或间接增加或降低针对抗原的免疫应答。疫苗典型增加对于抗原的免疫应答。因此，第一方面，本发明提供了治疗或预防对象疾病的通用H5N1疫苗，其中所述疾病与禽流感病毒H5N1亚型相关。在一个实施方案中，所述通用H5N1疫苗包含预防有效量的第一免疫原性物质，预防有效量的第二免疫原性物质及预防有效量的第三免疫原性物质。在另一实施方案中，所述对象可以是人、家畜(狗、猫、猴等)、牲畜(马、牛、绵羊、山羊、猪等)、野禽(野鹅、野鸭等)以及家禽(鸡、鸭、鹅等)。在一个实施方案中，每种免疫原性物质均包含血凝素或其抗原性部分或编码血凝素或其抗原性部分的核酸。如本文所用，血凝素的抗原性部分是指包括中和表位的血凝素的一部分。在另一实施方案中，所述抗原性部分包括血凝素的表位。在进一步的实施方案中，免疫原性物质是包含血凝素的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是失活的。在另一实施方案中，所述病毒是减毒的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是病毒体形式。在进一步的实施方案中，所述病毒衍生自卵或衍生自细胞培养物。在另一实施方案中，免疫原性物质是包含血凝素的裂解病毒或裂解病毒抗原性制备物。在一个实施方案中，所述免疫原性物质是血凝素或其抗原性部分。在另一实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已经被分离。在另一实施方案中，所述·血凝素或其抗原性部分是通过病毒表达载体产生的，由此其被呈递或展不在该病毒表面上。在一个实施方案中，所述病毒表达载体是杆状病毒表达载体，呈递或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是杆状病毒。在另一实施方案中，所述病毒表达载体如修饰的痘苗病毒表达载体、腺病毒表达载体、痘病毒表达载体等。在一个实施方案中，所述免疫原性物质是能在对象体内表达的编码血凝素或其抗原性部分的核酸。在一个实施方案中，所述免疫原性物质可以是相同类别，例如其可以均是失活的呈递或展示血凝素或其抗原性部分的病毒或杆状病毒。在另一实施方案中，所述免疫原性物质可以是不同类别，例如第一免疫原性物质可以是失活的病毒，第二免疫原性物质可以是呈递或展示血凝素或其抗原性部分的杆状病毒，第三免疫原性物质可以与这两类之一相同或者是不同类别。根据本发明，制备通用H5N1疫苗，其中第一免疫原性物质包含病毒毒株A/Indonesia/⑶C669/2006 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽，第二免疫原性物质包含病毒毒株A/Vietnaml203/2004 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽及第三免疫原性物质包含病毒毒株A/Anhui/1/2005 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽。如本文所述，每种免疫原性物质可以是病毒、蛋白质、肽、核酸等，其包含或编码指定病毒的血凝素或其抗原性肽。所述免疫原性物质可以配制成中性或盐形式组合物。药物可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基基团形成)，其是与无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，及衍生自有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。通常，可以根据本领域技术人员已知的方法制备合适的组合物，所述组合物可包括药物可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。所述稀释剂、佐剂和赋形剂必须是“可接受的”，与组合物的其它成分是相容的，且对其受体无害。药物可接受的稀释剂的实例是去矿物质水或蒸馏水；盐水溶液；植物油如花生油(peanut-oil),红花油,橄榄油,棉籽油，玉米油，芝麻油如花生油，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油，芝麻油，花生油(arachis oil)或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烧，苯基聚娃氧烧及methylphenyl polysolpoxane ;挥发性娃酮；矿物油如液体石腊，软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇，丙二醇，I, 3- 丁二醇或甘油；脂肪酸酯如异丙基棕榈酸酯，异丙基肉豆蘧酸酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜聚糖；西黄芪胶或阿拉伯树胶，以及凡士林油。典型地，所述一或多种载体形成所述组合物重量的1%-99. 9%。最优选地，所述稀释剂是盐水。对于作为注射溶液或悬浮液施用，无毒性胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括Ringer溶液，中链甘油三酯(MCT)，等渗盐水，磷酸盐缓冲盐水，乙醇及1，2-丙二醇。口服应用的合适载体、稀释剂、赋形剂及佐剂的一些实例包括花生油，液体石蜡，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，海藻酸钠，阿拉伯树胶，西黄芪胶，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，明胶和卵磷脂。除了这些之外，口服配制物可含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，所述胶囊可以用化合物如延迟崩解的单硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯包覆。佐剂典型包括润滑剂，乳化剂，增稠剂，防腐剂，杀菌剂和缓冲剂。可用于制备所述组合物的佐剂或免疫刺激性成分包括但不限于铝盐，矿物油，分支杆菌产物(如弗氏完全 或不完全佐剂)或者载体如植物糖苷皂苷、胆固醇和磷脂酰胆碱的混合物，其提供在笼样(cage-like)结构上呈递一些蛋白质拷贝的载体。对于本说明书而言，佐剂是强调、增加、适度或增强对于免疫原或抗原的免疫应答的物质。佐剂典型同时增强体液和细胞免疫应答，但是增强一种免疫应答而不增强另一种也定义为佐剂。此外，佐剂及其应用为免疫学者熟知并且当免疫原的剂量受限时、当免疫原的免疫原性不佳时或者当施用途径是次最佳时典型用于增强免疫应答。因此，术语“佐剂量(adjvating amount)”是能增强对于指定免疫原或抗原的免疫应答的佐剂的量。等于“佐剂量”的物质是变化的，依赖于多种因素，包括但不限于免疫原的特性、施用的免疫原的数量、宿主物种、施用途径以及施用免疫原的方案。“佐剂量”可易于根据指定特定环境通过常规实验量化。这为技术人员熟知，典型使用常规剂量应答确定以改变施用的免疫原和佐剂的量。应答可以使用酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、血凝测定等通过确定针对免疫原产生的血清抗体效价或者细胞介导的应答而测量。口服施用的固体形式可含有在人和兽药物学实践中可接受的结合剂，甜味剂，崩解剂，稀释剂，调味剂，包覆剂，防腐剂，润滑剂和/缓释剂。合适的结合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、西黄芪胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔豆胶、黄原胶、皂土、褐藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬绿油、樱桃、橘子或覆盆子调味剂。合适的包覆剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠，维生素Εδα-生育酚，抗坏血酸，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯或者亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁，硬脂酸，油酸钠，氯化钠或滑石。口服施用的液体形式除了上述物质之外，可含有液体载体。合适的液体载体包括水，油如橄榄油、花生油(peanut oil)、芝麻油、葵花籽油、红花油、花生油(arachis oil),椰子油，液体石蜡，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，甘油，脂肪醇，甘油三酯或其混合物。口服施用的悬浮液可进一步包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，藻酸钠或乙酰基醇(acetylalcohol) 0合适的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨糖醇单-或二 -油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖单-或二 -油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。口服施用的乳状液可进一步包含一或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上述举例的分散剂或者天然胶如瓜尔豆胶，阿拉伯树胶或西黄芪胶。制备胃肠外施用组合物的方法为本领域技术人员熟知，在例如Remington: TheScience and Practice of Pharmacy,21st Ed. , Ed. D. B. Troy, Lippincott, Williams &Wilkins, Baltimore, 2006中更详细描述,所述文献援引加入本文。所述组合物可掺入任何合适的表面活性剂，如阴离子、阳离子或非离子表面活性齐U，如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包含悬浮剂，如天然胶，纤维素衍生物或无机材料如silicaceous silicas,及其它成分如羊毛脂。所述组合物的制备使用本领域技术人员已知的常规方法进行。典型地，这种组合物制备为注射形式，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备为适于在注射前在液体中成为溶 液或悬浮液的固体形式。所述制备物也可以是乳化的。活性免疫原性成分通常与赋形剂混合，所述赋形剂是药物可接受的及与所述活性成分是相容的。第二方面，本发明提供了调节对于禽流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。尽管优选所述通用H5N1疫苗作为单一组合物施用，但是也考虑到疫苗的各个成分可以单独但同时施用给对象。根据本发明的方法，疫苗和组合物可以通过任何合适途径施用，全身性、区域性(regionally)或局部(locally)施用。在任何指定情况中使用的特定施用途径依赖于多种因素，包括治疗疾病的性质、疾病的严重性和程度、要输送的特定化合物的需要剂量以及希望的疫苗或组合物的潜在副作用。例如，在需要将适当浓度的希望的疫苗或组合物直接输送至治疗部位的情况中，施用可以是区域性而不是全身性的。区域性施用模式提供了将希望的疫苗或组合物以极高的局部浓度输送至需要的部位的能力，因此适于达到希望的治疗或预防作用，同时避免了机体的其它器官暴露于该疫苗或组合物，从而潜在地降低副作用。例如，根据本发明的实施方案，施用可以通过任何标准途径完成，包括腔内、膀胱内、肌肉内、动脉内、静脉内、皮下、表面或口服。腔内施用可以是腹膜内或胸膜内。如果需要，适于持续释放或间歇释放的含有免疫原性物质的装置或组合物可以植入在体内或表面应用以相对缓慢地将这种材料释放至体内。表达载体或宿主细胞的施用可包括通过直接口服、系统注射输送，或者输送至选择的组织或细胞，或者通过输送至分离自对象或相容供体的细胞而间接输送。关于基于核酸的组合物，这种组合物的所有输送模式均涵盖在本发明内。所述组合物可以脂质体形式施用。脂质体通常衍生自磷脂或其它脂质物质，是通过在水相介质中分散的单层或多层水合的液体结晶形成的。可以使用能形成脂质体的任何无毒性的生理学可接受的及可代谢的脂质。脂质体形式的组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，天然及合成的均可。形成脂质体的方法为本领域熟知。
施用的化合物对于任何特定对象的有效剂量水平依赖于多种因素，包括治疗的疾病的类型及疾病的阶段，应用的化合物的活性，应用的组合物，所述对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，化合物螯合速度，治疗持续时间，治疗中组合或同时使用的药物，及本领域熟知的其它相关因素。第三方面，本发明提供了预防或治疗与禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。合适的组合物、施用及剂量如上文所述。第四方面，本发明提供了通用H5N1疫苗调节对禽流感病毒的免疫应答的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。第五方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在治疗与禽流感病毒相关疾病中的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。制备及施用疫苗的方法为本领域熟知，如美国专利7，510，719、7，537，768、7，666，439 及 7，691，368 ;美国专利申请公开 2008/0187557、2009/0136532、2009/0263422、2009/0304730、2010/0047271、2010/0074916 和 2010/0086485 ;及国际申请公开 WO2007/129984、WO 2008/048984、WO 2008/115314、WO 2009/069447、WO 2009/115917、WO2010/021289及WO 2010/036948例证，所述文献均援引加入本文。除非特别指出，实施本发明使用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养及转基因生物学技术，这些为本领域技术人员已知。见例如 Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook et al.，1989，MolecularCloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork) ；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor, New York) ；Ausubel et al.，1992)，CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodicupdates) ；Glover,1985, DNA Cloning(IRL Press, Oxford) ;Russell，1984，Molecularbiology of plants:a laboratory course manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor, N. Y. ) ;Anand，Techniques for the Analysis ofComplex Genomes, (Academic Press, New York, 1992) ；Guthrie and Fink，Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press,New York, 1991)；Harlow and Lane， 1988，Antibodies， (Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, New York) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.J. Higginseds. 1984) ；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R.Lissj Inc. , 1987) ；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B.Perbalj A Practical Guide To MolecularCloning (1984) ；the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc. , N.Y. ) ；Methods In EnzymologyjVols. 154 and 155(Wu et al.eds. ), ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds. , AcademicPress, London, 1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weirand C. C. Blackwell, eds. , 1986) ;Riott，Essential Immunology, 6th Edition, BlackwellScientific Publications,Oxford, 1988 ；Fire et al. , RNA InterferenceTechnology:From Basic Science to Drug Development,Cambridge UniversityPress, Cambridge, 2005 ；SchepersjNRA Interference in Practice, Wiley - VCHj2005 ；Engelkej RNA Interference(RNAi):The Nuts &Bolts of siRNA Technology, DNAPress,2003 ;Gott，RNA Interference,Editing,and Modification : Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowaj NJj 2004 ；Sohail, GeneSilencing by RNA Interference:Technology and Application，CRC，2004 所述。
实施例本发明通过如下实施例进行描述，所述实施例只是例证本发明而不意图以任何方式限制本发明。利用本领域熟知的标准技术或在下文特别描述的技术。实施例I
材料和方法病毒来自进化枝2. 1A/Indonesia/CDC669/2006、A/Indonesia/TLL013/2006 及一个禽毒株A/Indonesia/TLL014/2006的H5N1人流感病毒得自印度尼西亚卫生部(MOH)。禽H5N2亚型得自新加坡农业食品与兽医管理局(AVA)。来自不同的系统发生进化枝/亚进化枝的H5N1病毒(表I)通过反求遗传学拯救[WH0，2004]。简言之，基于来自NCBI流感病毒数据库的序列合成来自进化枝1、2. 1、2. 2,2. 3、4、7和8的H5N1病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因(GenScript，USA)。将合成的HA和NA基因克隆进双启动子质粒中以进行甲型流感病毒反求遗传学(Prabakaran et al.，2009)。所述双启动子质粒得自美国佐治亚州亚特兰大的疾病控制与预防中心。再造病毒(reassortant virus)通过将含有HA和NA以及衍生自高度生长的主要毒株(master strain) A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的其余六个流感病毒基因的质粒使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.)转染进共培养的293T和MDCK细胞中进行拯救。在转染72小时后，将培养基接种于含胚卵或者MDCK细胞。对来自第二次传代的再造病毒的HA和NA基因进行测序，以证实导入的HA和NA基因的存在及不存在突变。将原种病毒在11天龄的含胚卵的尿囊腔中增殖，收获含有病毒的尿囊液并在_80°C等份贮存。病毒含量通过标准血凝测定(HA)确定。使用高致病性病毒的所有试验均在符合CDC/NIH和WHO建议的生物安全水平3级(BSL-3)的防范设施中进行。表I :产生自反求遗传学的再造甲型流感病毒
权利要求
1.一种通用H5N1疫苗组合物，其包含预防有效量的第一免疫原性物质或者编码所述第一免疫原性物质的核酸、预防有效量的第二免疫原性物质或者编码所述第二免疫原性物质的核酸、预防有效量的第三免疫原性物质或者编码所述第三免疫原性物质的核酸以及药物学可接受的载体，其中所述第一免疫原性物质包含病毒毒株A/Indonesia/CDC669/2006 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽，所述第二免疫原性物质包含病毒毒株A/Vietnaml203/2004 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽，及所述第三免疫原性物质包含病毒毒株A/Anhui/1/2005 (H5N1)的血凝素或其抗原性肽或者编码所述第三免疫原性物质的核酸。
2.权利要求I的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含血凝素。
3.权利要求I的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含血凝素的抗原性肽。
4.权利要求I的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含编码血凝素的核酸。
5.权利要求I的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含编码血凝素的抗原性肽的核酸。
6.权利要求I的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含呈递或展示血凝素的病毒。
7.权利要求6的组合物，其中每种病毒均是杆状病毒。
8.权利要求I的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含呈递或展示血凝素的抗原性肽的病毒。
9.权利要求8的组合物，其中每种病毒均是杆状病毒。
10.一种调节对象中对禽流感病毒的免疫应答的方法，包括给对象施用预防有效量的权利要求I-9任一项的组合物。
11.一种治疗或预防与禽流感病毒相关疾病的方法，包括给对象施用权利要求1-9任一项的组合物。
12.权利要求1-9任一项的组合物在对象中调节免疫应答的应用。
13.权利要求1-9任一项的组合物在治疗或预防对象中与禽流感病毒相关疾病的应用。
14.权利要求1-9任一项的组合物，用作药物。
15.权利要求1-9任一项的组合物，用于调节对象中的免疫应答。
16.权利要求1-9任一项的组合物，用于治疗或预防对象中与禽流感病毒相关的疾病。
17.权利要求1-9任一项的组合物在制备用于调节对象中免疫应答的药物中的应用。
18.权利要求1-9任一项的组合物在制备用于治疗或预防对象中与禽流感病毒相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，它们覆盖大多数H5N1谱系中血凝素的中和表位中的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者这三种毒株每一毒株的血凝素肽。
文档编号A61K39/145GK102869379SQ201180021766
公开日2013年1月9日 申请日期2011年2月9日 优先权日2010年4月30日
发明者P·木根, F·和, H-S·J·光 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司