使用了酶的蛋壳膜的溶解方法

专利名称：使用了酶的蛋壳膜的溶解方法
技术领域：
本发明涉及使用了酶的蛋壳膜的溶解方法。详细地说，涉及使用了蛋白质分解酶的蛋壳膜溶解方法及其用途。本申请基于2010年8月31日申请的日本专利申请第2010 —195076号主张优先权，该专利申请的全部内容通过参照的方式援用于此。
背景技术：
鸡肉和鸡蛋在日本国内的消耗量巨大，据称一年分别达到220万吨、250万吨。在全世界的消耗量中，鸡肉约为8300万吨，鸡蛋约为5600万吨。另一方面，还大量排出非食用部分的羽毛和蛋壳膜。羽毛和蛋壳膜的90%以上由蛋白质构成，羽毛的主要成分是角蛋白，蛋壳膜的主要成分是胶原蛋白样蛋白质。已知均大量含有半胱氨酸(约10%)、其分解物具有抗氧化作用等多种生理功能。蛋壳膜在鸡蛋中包裹卵细胞(蛋黄)和蛋白，并与蛋壳一起将蛋黄和蛋白与外界物理性地隔离，保护鸡蛋免受有害的紫外线、氧和干燥。另外，还有防御病原菌、病毒等外来生物的感染的重要作用。此外，蛋壳膜中含有抗菌物质和溶菌酶、β —N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶等抗菌酶。进而，据称蛋壳膜中含有其它特殊的蛋白质，其功能性备受关注。已知使用了蛋壳膜的各种功能物。例如，已知在烫发剂中为了保护毛发外皮层而加入蛋壳膜(日本特开2000 - 128744)，为了治疗创伤而在护创膏中加入蛋壳膜分解物(日本特开 2003 - 225298)等。现状是大部分蛋壳膜未被利用而 被废弃处理。作为其理由，可举出由于是难分解性而难以处理，没有有效率的溶解方法。目前主流的蛋壳膜处理技术是基于酸和碱处理的技术，但伴有茶褐色的着色、氨基酸分解所导致的发生异臭的问题。此外，还存在因过度反应导致的有用成分低收率化的问题。作为替代技术，研究了利用蛋白质分解酶(蛋白酶)进行的处理(例如参照专利文献I 4)，但存在如下问题(I)需要粉末化、超声波处理、沸腾处理之类的前处理；(2)需要长时间的处理；(3)分解率低(约20% )。酶反应由于在比较温和的条件下进行，所以能够期待有效成分的高收率化，但由于上述问题而没有确立实用的技术。专利文献专利文献1:日本特开2008 - 118887号公报专利文献2 :日本特开2008 - 061514号公报专利文献3 日本特开平09 - 040564号公报专利文献4 :日本特开2008 - 007419号公报

发明内容
因此，本发明的课题在于提供一种能够解决以往的处理方法(利用酸、碱进行的处理，利用蛋白质分解酶进行的处理)所存在的上述问题中的至少一个问题的蛋壳膜溶解方法及其用途等。
本发明人为了解决上述课题而反复进行了深入研究。其结果发现通过将蛋白质分解酶(蛋白酶)和还原剂联用、特别是在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶发生作用，能够使蛋壳膜极其有效率地溶解。令人惊讶的是，显示出还能够达到对于利用了酶的以往方法而言难以达到的完全溶解，并且在采用了酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的任一种的情况下，尽管在温和的PH条件下，也看到良好的溶解。经过进一步研究，成功地确定对溶解有效的各种条件。另一方面，研究了通过本方法得到的蛋壳膜溶解物的特性，结果确认了有用物质的存在，明确了该溶解物的利用价值高。主要基于以上成果，完成了以下本发明。[I] 一种蛋壳膜溶解方法，其特征在于，将蛋白质分解酶和还原剂联用。[2]如[I]所述的蛋壳膜溶解方法，包括在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜的工序。[3]如[I]所述的蛋壳膜溶解方法，包括以下的工序(I)和(2)(I)在溶剂中准备蛋壳膜的工序；(2)向所述溶剂添加还原剂和蛋白质分解酶，使之反应的工序。[4]如[3]所述的蛋壳膜溶解方法，其中，工序(2)的反应溶液的pH为4. 5 9. 5。[5]如[3]或[4]所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂的浓度为5mM 1M。[6]如[3] [5]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，继续所述工序(2)的反应，直至确认不到固态物。[7]如[3] [6]中任一`项所述的蛋壳膜溶解方法，还包括以下的工序(3)(3)将工序(2)后的溶液过滤，除去固态物的工序。[8]如[I] [7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶为碱性蛋白酶或中性蛋白酶。[9]如[I] [7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、金属内肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸内肽酶中的一种以上的酶。[10]如[I] [7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶(bacillolysin)、^·萝蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶中的一种以上的酶。[11]如[I] [7]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自 BIOSORK、PROLEATHER FG — F、PAPAINW40、PROTEASE N、BROMELAIN F、UMAMIZYME G、THERMOASE YlOO、ProteAX、PROTEASE S、SUMIZYME LP500、DESKIN C、PROTIN NY10、PROTINPClO, SUMIZYME MP、PROTIN AY以及蛋白酶K中的一种以上的酶。[12]如[I] [11]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂是选自亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、L 一半胱氨酸、N —乙酰基一 L 一半胱氨酸、2 —巯基乙醇、谷胱甘肽以及DTT中的一种以上的还原剂。[13]如[I] [11]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂为亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。[ 14]如[I ]所述的蛋壳膜溶解方法，包括以下的工序(I)和(2’)(I)在溶剂中准备蛋壳膜的工序；
(2’ )向所述溶剂添加还原剂而使之反应后，除去还原剂，接着添加蛋白质分解酶，使之反应的工序。[15] 一种蛋壳膜溶解剂，是将蛋白质分解酶和还原剂组合而成的。[16]如[15]所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，含有蛋白质分解酶和还原剂。[17]如[15]所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，是由含有蛋白质分解酶的第I构成组分、以及含有还原剂的第2构成组分构成的试剂盒。[18]—种蛋壳膜溶解物，是通过[I] [13]中任一项所述的蛋壳膜溶解方法得到的。[19]如[18]所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有选自溶菌酶、β — N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素以及硫酸皮肤素中的一种以上的成分。[20]如[18]所述的蛋壳膜溶解物，其中，显示选自抗氧化活性和血管紧张素转化酶抑制活性中的一种以上的活性。[21] —种蛋壳膜溶解物，是通过[14]所述的蛋壳膜溶解方法得到的。

[22]如[21]所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有赖氨酰氧化酶。[23]如[18] [22]中任一项所述的蛋壳膜溶解物，其中，是蛋壳膜的完全溶解物。[24] 一种组合物，含有[18] [23]中任一项所述的蛋壳膜溶解物。[25]如[24]所述的组合物,其中，是医药品、准医药品(quasi drug)、食品或化妆
品O[26]—种蛋壳膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i)和(ii):(i)采用[I] [13]中任一项所述的方法的溶解工序；(ii)将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。[27]如[26]所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii )中被纯化的成分是选自溶菌酶和β — N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶中的酶、或者选自透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的酸性粘多糖。[28]通过[27]所述的方法得到的溶菌酶、β — N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素或硫酸皮肤素。[29]—种蛋壳膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i’)和(ii):( i ’)利用[14]所述的方法的溶解工序；(ii)将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。[30]如[29]所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii )中被纯化的成分
为赖氨酰氧化酶。[31]通过[30]所述的方法得到的赖氨酰氧化酶。[32]通过[26]或[29]所述的蛋壳膜有用成分的提取方法得到的蛋壳膜提取物。


[图1]单独使用酶制剂(BIOSORK)将蛋壳膜分解的结果。[图2]将酶制剂(BIOSORK)和还原剂(DTT)联用而将蛋壳膜分解的结果。[图3]表示进行了试验的还原剂的种类和有无蛋壳膜溶解(分解)的表。
[图4]表示将酶制剂(BIOSORK)和还原剂(亚硫酸钠)联用时的pH条件与溶解程度的关系的图表。[图5]利用SDS-PAGE测得的蛋壳膜溶解物的分析结果。[图6]表示蛋壳膜溶解中的还原剂浓度依赖性的图表。左侧是使用了BIOSORK时的结果，右侧是使用了 PROLEATHER FG-F时的结果。[图7]使用了亚硫酸钠和BIOSORK时的蛋壳膜的溶解。[图8]使用了亚硫酸钠和PROLEATHER FG — F时的蛋壳膜的溶解。[图9]表示蛋壳膜浓度与溶解时间的关系的图。左侧表示反应前后的蛋壳膜的状态。右侧是将在各蛋壳膜量下完全溶解所需要的时间进行标绘而得的图表。[图10]将胃蛋白酶和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图11]将SUMIZYMELP500和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图12]将DESKINC和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图13]将PROTINNYlO和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图14]将PROTINPClO和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图15]将胰蛋白酶和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图16]将SUMIZYMEMP和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图17]将PROTI NAY和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图18]将蛋白酶K和还原剂联用时的蛋壳膜的溶解。[图19]使用N—乙酰基一 L 一半胱氨酸作为还原剂时的蛋壳膜的溶解。[图20]使用2—巯基乙醇作为还原剂时的蛋壳膜的溶解。[图21]表示蛋壳膜溶解物中的硫酸化糖胺聚糖(GAG)含量的表。[图22]表示蛋壳膜溶解物中的透明质酸含量的表。[图23]表示蛋壳膜溶解物的赖氨酰氧化酶活性的图表。[图24]表示蛋壳膜溶解物的溶菌活性的图表。[图25]表示蛋壳膜溶解物的自由基清除活性的图表。[图26]表示蛋壳膜溶解物的Cu2+还原活性的图表。[图27]表示蛋壳膜溶解物的血管紧张素转化酶(ACE)抑制率的图表。
具体实施例方式1.蛋壳膜溶解方法本发明的第一方面涉及蛋壳膜的溶解方法。根据本发明的方法，在避免因茶褐色的着色、氨基酸分解所导致的异臭发生的问题的同时，能够有效率地溶解蛋壳膜。此外，即使不进行前处理，也能够实现高的溶解(分解)率。在本说明书中，所谓“蛋壳膜”是存在于鸡、鹌鹑、乌鸡、鸭、鹅、鸵鸟等鸟类的蛋的外壳内侧的膜。在本发明的溶解方法中，将蛋白质分解酶和还原剂联用而对蛋壳膜进行处理、溶解。供给处理的蛋壳膜的状态没有特别限定。例如，可以使用从外壳分离后，实施过干燥处理(日光干燥、热风干燥、真空干燥、抽吸干燥、冻干等)的蛋壳膜(干燥状态)、实施干燥处理前的蛋壳膜(湿润状态)、干燥处理后使其膨润而得的蛋壳膜(湿润状态)。此外，也可以为实施了破碎、粉碎等处理而得的蛋壳膜(例如粉末状)。另外，还可以使用在不与壳分离的状态下的蛋壳膜。本发明中的“将蛋白质分解酶和还原剂联用”是指在利用还原剂的作用的同时使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜。只要形成能够利用这种还原剂的作用的环境，使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜的时机(时候)和使用还原剂的时机(时候)就没有受到特别限定。为了更有效率地溶解蛋壳膜，优选使还原剂的作用和蛋白质分解酶的作用得到同时发挥。典型的是，在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜。在该方式中，例如，实施下面的工序(I)和(2)。(I)在溶剂中准备蛋壳膜的工序(2)向上述溶剂中添加还原剂和蛋白质分解酶，使之反应的工序就工序(1)中使用的溶剂而言，只要发生酶反应，就没有特别限定，但是为了容易进行PH调整以及所需的pH维持，优选使用缓冲液。在工序(2)中，还原剂和蛋白质分解酶的添加时机以及顺序没有特别限定，优选同时添加还原剂和蛋白质分解酶、或者在添加还原剂后添加蛋白质分解酶(优选迅速添加)，以使得联用效果充分地发挥。若利用前者的方法，则添加操作为1次，在操作性方面是有利的。与上述方式不同，也可以使蛋白质分解酶作用于用还原剂处理后的蛋壳膜。在该方式的情况下，例如，实施下面的工序(1)和(2)。应予说明，该方式特别适合于获得含有维持活性的赖氨酰氧化酶的蛋壳膜溶解物的目的。(1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序(2’)向上述溶剂中添加还原剂而使之反应后，除去还原剂，接着添加蛋白质分解酶，使之反应的工序就本发明中使用的蛋白质分解酶而言，只要能够实现蛋壳膜的有效率的溶解，就没有特别限定。作为蛋白质分解酶，可以使用市售的酶制剂。若列举酶制剂的例子，则可以使用 BIOSORK、NEWLASE F3 — G,NEffLASE A、PROTEASE A “AMANO，，G、PROTEASE N “AMANO，，G、PROTEASE S “AMAN0”G、PAPAIN W — 40、BROMELAIN F,PROTIN NY10,PROTIN PC10,PROTINAY,PROTIN SD - NY10,PROTIN SD - PCIOF,THERMOASE PC10F,PROTIN SD - AC10F,PROTINSD - AYlO、PROLEATHER FG — F、PROTEASE P “AMANO” 3G、PROTEASE M “AMAN0”G、ProteAX(以上，天野酶公司)；M0LSIN F (KIKK0MAN FOOD PRODUCTS 公司)；SUMIZYME AP、SUMIZYMELP、SUMIZYME LP500、SUMIZYME FP、SUMIZYME LPL, SUMIZYME MP (以上，新日本化学工业公司);DENAPSIN2P、DENATYME AP, BIOPRASE OP, BIOPRASE AL — 15FG、BI0PRASE30G、BI0PRASEAPL - 30、BI0PRASE OR 一 10G、BI0PRASE30L、BI0PRASE XL 一 416F、BI0PRASE SP 一 20FG、BI0PRASE SP — 4FG、PROTEASE CL — 15 (以上，Nagese ChemteX 公司)；0RIENTASE20A、TETRASE S、NUCLEICIN、ORIENTASEIONL、0RIENTASE90N、0RIENTASE ONS, 0RIENTASE22BF(以上，HBI Enzymes 公司)；BREWERS CLAREX, VARIDASE AFP、VARIDASE FP60、BREWERSPROTEASE、ACCELERZYME NP50. 000、DELV0LASE、VARIDASETSP200、BAKEZYME PPU95. 000、BAKEZYME B500、C0LLUPULINE、VARIDASE PAPAIN SF、VARIDASE BROMELAIN (以上，DSMJapan )；PR0TEASE YP — SS、PANTIDASE NP - 2, PANT IDASE P, AROASE AP- 10, AROASE NP —10、AROASE NS、AROASE XA — 10、PROTEASE AL (以上，Yakult Pharmaceutical Industry公司)；PR0M0D223LP、PR0TEX7L、PR0TEX14L、Alkaline Protease GL、PR0TEX6L、PR0TEX89L、PURAFE C T、PURAFECT OX、PR0PERASE、PROTEX 0XG、PR0TEX40L (以上，Genencor Kyowa 公司)、PTN、NEWTRASE、ESPERASE、SAV INASE、ALCA LASE, CLEARLENSff PRO、EVERLRAAAV SE、KANNASE、POLARZYME、FLAVOURZYME、PROTAMEX、NOVOLAN (以上，Novozymes Japan) ；PAPAINF.、TRYPSIN4. OT、COROLASE N、VERON L10、C0R0LASE LlO、C0R0LASE7089、VERON W (以上，樋口商会)；ENZYLON NBS, ENZYLON SA, MAGNAX MT (以上，洛东化成工业公司)；K0KULASE P(Mitsubish1-Kagaku Foods 公司);ACTINASE AS、ACTINASE AF (以上，Kaken Pharma 公司)；GRINDAMYL PR59、GRINDAMYL PR43 (以上，Danisco Japan)；SOFTERGEN M2 (Taisho TechnosCo.，Ltd.);蛋白酶K (和光纯药工业公司)；DESKIN C (大和化成公司)等。如后述的实施例所示，使用BIOSORK、PROLEATHER FG 一 F、PAPAIN W40、PROTEASEN、BROMELAIN F、UMAMIZYME G、THERMOASE YlOO、ProteAX、PROTEASE S 时，能够在短时间内将蛋壳膜完全溶解。此外，使用 SUMIZYME LP500、DESKIN C、PR0TINNY10、PROTIN PC10、SUMIZYME MP、PROTIN AY及蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶时，也看到蛋壳膜的有效率的溶解。基于这些结果，在优选的方式中，采用从这些酶制剂或酶中选择的I种以上的酶制剂作为蛋白质分解酶。在此，在构成这些酶制剂的酶中，包括最适PH范围为碱性且被分类为丝氨酸内肽酶的糜蛋白酶、最适PH范围为碱性且被分类为丝氨酸内肽酶的枯草杆菌蛋白酶、最适PH范围为中性且被分类为半胱氨酸内肽酶的木瓜蛋白酶、最适pH范围为中性且被分类为金属内肽酶的芽孢杆菌蛋白酶、最适PH范围为中性且被分类为半胱氨酸内肽酶的茎菠萝蛋白酶、最适PH范围为中性且被分类为氨基肽酶的亮氨酰氨基肽酶。此外，胃蛋白酶的最适pH范围为酸性且被分类为天冬氨酸内肽酶，胰蛋白酶的最适pH范围为中性且被分类为丝氨酸内肽酶。由这些事实可知，在本发明优选的一种方式中，使用选自丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、金属内肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸内肽酶中的一种以上的酶。更具体地说，使用选自糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、茎菠萝蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶以及胰蛋白酶中的一种以上的酶。另一方面，从许多碱性蛋白酶和中性蛋白酶实现了良好的溶解的事实出发(参照后述的实施例)，作为优选的一种方式，采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶。如后述的实施例所示，当采用BIOSORK、PROLEATHER FG — F和PAPAIN W40时，能够在极短的时间内将蛋壳膜完全溶解。因此，特别优选采用这些酶制剂的I种以上、或者构成这些酶制剂的酶(即 ，糜蛋白酶(BIOSORK的成分)、枯草杆菌蛋白酶(PROLEATHER FG-F的成分)及木瓜蛋白酶(PAPAIN W40的成分))的I种以上作为蛋白质分解酶。在最优选的方式中，采用在最短时间内看到蛋壳膜完全溶解的BIOSORK或作为其成分的糜蛋白酶作为蛋白质分解酶的至少一种。本发明中使用的蛋白质分解酶也可以不是纯化品。例如，植物提取物、动物提取物、利用微生物的培养提取物、或者它们的部分纯化物等，只要能够实现蛋壳膜的有效率的溶解，也能够作为蛋白质分解酶使用。作为还原剂，使用例如亚硫酸盐或亚硫酸氢盐。此处的盐例如是碱金属盐或碱土金属盐或者铵盐(具体地说，是钠盐、钾盐、单乙醇胺盐等)。更优选使用亚硫酸盐(例如亚硫酸钠)。还可以使用硫醇类或膦类作为还原剂。硫醇类的例子是半胱氨酸及其衍生物(例如N-乙酰基半胱氨酸)、半胱胺及其衍生物(作为衍生物的例子，可举出C1-C4酰基衍生物，更具体地，可举出N-乙酰基半胱胺和N-丙酰基半胱胺等)、硫代乳酸及其酯(作为硫代乳酸的酯，例如有单硫代乳酸甘油酯等)、巯基乙醇酸及其酯(作为巯基乙醇酸的酯，例如可举出单巯基乙醇酸甘油酯或单巯基乙醇酸乙二醇酯等)和硫甘油以及它们的混合物。若示出硫醇类的具体例，则为N-巯基烷基酰胺类、N-(巯基烷基)ω -羟基烷基酰胺类、N-单-或N, N- 二烷基巯基-4- 丁基酰胺类、氨基巯基烷基酰胺类、以及烷基氨基巯基烷基酰胺类、2 —巯基乙醇。作为N-巯基烷基酰胺类，例如可以使用N-(巯基-2-乙基)葡糖酰胺、β -巯基丙酸及其衍生物、硫代苹果酸、泛酰巯基乙胺。作为N-(巯基烷基)ω-羟基烷基酰胺类，例如可以使用日本特开平2 - 104515号中记载的化合物。作为N-单-或N，N- 二烷基巯基-4-丁基酰胺类，例如可以使用日本特开平2 — 196711号中记载的化合物。作为氨基巯基烷基酰胺类，例如可以使用日本特开平3 - 170411号中记载的化合物。作为烷基氨基巯基烷基酰胺类，例如可以使用日本特开平5 - 279322号中记载的化合物。作为膦类，例如可举出三(羟基甲基)膦、三(羟基丙基)膦、双(羟基甲基)(苯基)膦、烯丙基二苯基膦、苄基二苯基膦、双(3，4，5 —三甲氧基苯基)氯化膦、双(3，4，5 —三甲氧基苯基)膦、苄氧基(二异丙基氨基)甲基膦、双(二异丙基氨基)氯化膦、双(2—氰基乙基)膦、双(3，5—二叔丁基苯基)氯化膦、双(3，5—二叔丁基苯基)膦、双(二乙基氨基)甲基膦、双(二乙基氨基)氯化膦、双(二乙基氨基)苯基膦、双(3，5—二甲基一 4 一甲氧基苯基)氯化膦、双(3，5—二甲基一 4 一甲氧基苯基)膦、双(3，5—二甲基苯基)氯化膦、双(3，5 —二甲基苯基)二乙基氨基膦、双(3，5 —二甲基苯基)膦、双(3，5 —二(三氟甲基)苯基)氯化膦、双(3，5—二(三氟甲基)苯基)膦、双(4 一氟苯基)氯化膦、双(2—呋喃基)氯化膦、双(2 —呋喃基)膦、双(羟基甲基)苯基膦、双(4 一甲氧基苯基)苯基膦、双(3，5—二甲基苯基)膦、双(3，5—二叔丁基苯基)氯化膦、双(3，5—二叔丁基苯基)膦、双(3，5 —二(三氟甲基)苯基)氯化膦、双(3，5 —二(三氟甲基)苯基)膦、双(4 一氟苯基)氯化膦、双(4 -甲氧基苯基)氯化膦、双(4 -甲氧基苯基)苯基膦、双(4 一甲基苯基)氯化膦、双(4 一甲基苯基)膦、双(4 一三氟甲基苯基)氯化膦、双(4 一三氣甲基苯基)勝、双(―乙基氣基)甲基勝、双(―乙基氣基)苯基勝、双(轻基甲基)苯基膦、双(邻甲苯基)氯化膦、双(邻甲苯基)膦、双(吡咯烷基)甲基膦、丁基二氯化膦、丁基二苯基膦、叔丁基二苯基膦、环己基(二乙基氨基)氯化膦、环己基(二甲基氨基)氯化膦、环己基二氯化膦、环己基二苯基膦、2—氯乙基二苯基膦、2 —(二环己基膦基)联苯、2—二环己基勝基一 2’ — (Ν，Ν—二甲基氛基)联苯、二乙基氛基二乙基勝、二甲基氛基二氯化膦、(4 一二甲基氨基苯基)二苯基膦、N — [ ( 二苯基氧膦基)甲基]一 N —甲基苯胺、邻一二苯基膦基苯甲酸、2 —甲氧基(二氯膦基)苯、4 一甲氧基苯基(二乙基氨基)氯化膦、4 一甲氧基苯基(二甲基氨基)氯化膦、(2—甲氧基苯基)甲基苯基膦、2—甲氧基膦基苯、(5 —甲基一 2 —异丙基环己基)二苯基膦、三苯基膦、二烯丙基苯基膦、二节基膦、二丁基苯基膦、二丁基膦、二环己基氯化膦、二环己基苯基膦、二环己基膦、二乙基氯化膦、二乙基苯基膦、二乙基膦、二异丁基膦、二异丙基氯化膦、二异丙基膦、二甲基(苯基)膦、二甲基(二甲基甲娃焼基)勝、—甲基氣化勝、—苯基(邻甲苯基)勝、—苯基(对甲苯基)勝、—苯基(二甲基甲娃焼基)勝、—苯基氣化勝、—苯基勝、—苯基丙基勝、—苯基乙稀基勝、二叔丁基氯化膦、二叔丁基羟基膦、二叔丁基甲基膦、二叔丁基苯基膦、二叔丁基膦、二乙烯基苯基勝、乙基—氣化勝、乙基—苯基勝、异丙基—氣化勝、甲氧基—乙氧基勝、甲基—氣化勝、甲基—苯基勝、甲基苯基氣化勝、苯基勝、丙基—氣化勝、叔丁基双(二甲基甲娃焼基)膦、叔丁基二氯化膦、叔丁基二乙基膦、叔丁基二苯基膦、叔丁基膦、三(间甲苯基)膦、三(邻甲苯基)膦、三(对甲苯基)膦、三环己基膦、三环戊基膦、三乙基膦、三异丁基膦、三异丙基膦、三甲基膦、三正丁基膦、三正辛基膦、三丙基膦、三(I 一萘基)膦、三(2，4，6 —三甲基苯基)膦、三(2，6—二甲氧基苯基)膦、三(2—羰基乙基)膦、三(2—氰基乙基)膦、三(2 —呋喃基)膦、二(2 —甲氧基苯基)膦、二(2 —二乙基)膦、二(3, 5 一二甲基一 4 一甲氧基)膦、三(3 —氯苯基)膦、三(3 —氟苯基)膦、三(3 -甲氧基苯基)膦、三(3 -甲氧基丙基)膦、二(4 一氯苯基)膦、二(4 一氟苯基)膦、二(4 一甲氧基苯基)膦、二(4 一吗啉基)膦、三(羟基甲基)膦、三(三甲基甲硅烷基)膦、三[3，5 —双(三氟甲基)苯基]勝、二一叔丁基勝、2 —氰基乙基二苯基勝、2 —二环己基勝基一 2’ —甲基联苯、双(2,4,6 —二甲基苯基)勝、2 — ( _■叔丁基勝基)联苯等。在优选的一种方式中，采用通过其使用而可看到良好溶解的还原剂(参照后述的实施例)，即亚硫酸盐(例如亚硫酸钠)、亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠)、L 一半胱氨酸、L 一半胱氨酸盐酸盐、N —乙酰基一 L 一半胱氨酸、2 —巯基乙醇、谷胱甘肽(可以使用含有谷胱甘肽的酵母提取物)或DTT。应予说明，只要能获得本发明所需要的作用和效果，则也可以将2种以上的还原剂联用。工序(2)的反应优选在弱酸性pH 弱碱pH条件下(具体是ρΗ4· 5 9. 5)进行。更优选在中性PH条件下进行。此处的中性pH条件下是指pH为6. O 8. O。优选在pH调整为7. O 7. 5的反应液中进行反应。工序(2)的反应的时间可以在例如10分钟 24小时的范围内任意设定。根据本发明的方法，由于进行有效率的溶解，所以能够在短时间内将蛋壳膜溶解。优选以能够实现蛋壳膜的完全溶解的方式设定反应时间。为了提高反应效率，也可以加以搅拌、振荡等。对于温度条件也没有特`别的制约，在对使用的蛋白质分解酶的作用没有抑制的范围下进行设定即可。若举出温度条件的例子，则为30°c 80°C。优选的温度条件为40°C 70。。。就蛋白质分解酶的使用量(添加浓度)而言，只要能够进行蛋壳膜的有效率的溶解，就没有特别限定。最佳的使用量一般根据使用的酶的种类不同而异，但是例如，使用反应液中的蛋白水解酶的浓度成为0.01% (W/W) 20% (W/W)的量的酶。反应液中的蛋白质分解酶的浓度优选为O. 1% (W/W) 20% (W/W)，更优选为O. 1% (W/W) 10% (WO。只要充分获得与蛋白质分解酶的联用效果，则还原剂的使用量也没有特别限定。最佳的使用量一般根据使用的还原剂的种类不同而异，但是例如，使用反应液中的还原剂的浓度成为5mM IM的量的还原剂。反应液中的还原剂的浓度优选为IOmM 500mM，更优选为 50mM 500mM。就最佳条件(pH、反应时间、温度、酶使用量、还原剂使用量等)而言，若参考本说明书的教导事项，则可以通过预实验来容易地确定。应予说明，以上的各种条件也适合工序(2’)的反应。如后述的实施例示出的实验结果所证明，利用本发明的方法时，尽管操作简便，但也能够实现蛋壳膜的完全溶解。“蛋壳膜的完全溶解”是指蛋壳膜被分解到至少通过目视确认不到固态物的程度。在本发明的方法中，“蛋壳膜的完全溶解”不是必需的，但在蛋壳膜中的有用成分能够不浪费地提取这点、不需要残渣的除去等这点等上，优选以实现“蛋壳膜的完全溶解”的方式设定条件。因此，在本发明的一种方式中，继续工序(2)(或(2’))的反应，直至确认不到固态物。与此相反，在本发明的另一方式中，以固体成分残存的状态结束工序(2 )(或(2 ’))，然后，过滤溶液，除去固体成分(工序(3 ))。该方式在例如为了获取容易分解或失活的成分方面是有用的。2.蛋壳膜溶解剂本发明的第2方面涉及蛋壳膜溶解剂。本发明的蛋壳膜溶解剂的特征点在于是将蛋白质分解酶和还原剂组合而成的。换言之，在本发明的蛋壳膜溶解剂中，将蛋白质分解酶和还原剂联用。典型的是，本发明的蛋壳膜溶解剂被以将蛋白质分解酶和还原剂混合而成的配合剂的形式提供。另一方面，例如，也可以以由含有蛋白质分解酶的组分(第I构成组分)以及含有还原剂的组分(第2构成组分)构成的试剂盒的形式提供本发明的蛋壳膜溶解剂。还可以将2种以上的蛋白质分解酶联用。同样地也可以将2种以上的还原剂联用。应予说明，对于蛋白质分解酶和还原剂，由于与本发明的蛋壳膜溶解方法的情况相同，所以省略重复的说明。就本发明的蛋壳膜溶解剂而言，除了含有有效成分(蛋白质分解酶和/或还原剂)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形齐IJ，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。3.蛋壳膜溶解物及含有其的组合物本发明的进一步的方面是提供 通过本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物。作为优选的一种方式，提供蛋壳膜的完全溶解物。根据本发明的蛋壳膜溶解方法，能够在温和的条件下将蛋壳膜溶解。因此，利用该方法得到的蛋壳膜溶解物大量含有在蛋壳膜中含有的有用成分(蛋白质(包括赖氨酰氧化酶、溶菌酶、β — N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶等酶、胶原蛋白)、糖蛋白、肽(包括胶原蛋白肽)、糖肽、氨基酸、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等酸性粘多糖等)。在一种方式中，利用本发明的方法得到的蛋壳膜溶解物含有选自溶菌酶、β - N —乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素以及硫酸皮肤素中的一种以上的成分。此外，利用本发明的方法得到的蛋壳膜溶解物通过显示抗氧化活性和/或显示血管紧张素转化酶抑制活性而能被赋予特征。另一方面，另外一种方式的蛋壳膜溶解物的特征点是含有赖氨酰氧化酶。含有赖氨酰氧化酶的该蛋壳膜溶解物典型的是采用包括上述工序(I)和(2 ’)的蛋壳膜溶解方法而得到。本发明还提供含有蛋壳膜溶解物的组合物。本发明的组合物的用途没有特别限定，优选为医药品、准医药品、食品或化妆品。即，作为优选的方式，本发明提供含有蛋壳膜溶解物的医药组合物、准医药组合物、食品组合物以及化妆品组合物。作为本发明的医药组合物和准医药组合物的用途或效果的例子，可举出抗氧化、抗菌、抗炎症、创伤治疗、降血压、毛发生长、营养补充。本发明的医药组合物和准医药组合物的制剂化可以依照常法来进行。进行制剂化时，可以含有制剂上容许的其它成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、镇痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羰甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羰甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为镇痛剂，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。进行制剂化时的剂型也没有特别限定，例如可以以片剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、注射剂、外用剂以及栓剂等的形式提供本发明的医药组合物或准医药组合物。本发明的医药组合物中含有为了获得所期待的治疗效果、预防效果所必需的量(即治疗上有效量)的有效成分。同样地，本发明的准医药组合物中含有为了获得所期待的治疗效果、预防效果所必需的量的有效成分。本发明的医药组合物或准医药组合物中含有的有效成分量一般根据剂型、形式不同而异，但是将有效成分量以能够达到所需的给药量的方式，在例如约O.1重量％ 约95重量％的范围内进行设定。本发明的医药组合物和准医药组合物根据其剂型、形式而通过经口或非经口(静脉内、动脉内、皮下、肌肉、或腹腔内注射、经皮、经鼻、经粘膜、涂布等)方式应用于对象。此处的“对象”没有特别限定，包括人以及人以外的哺乳动物(包括动物宠物、家畜、实验动物。具体为例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴子、牛、猪、山羊、绵羊、狗、猫、鸡、鹌鹑等)。在优选的一种方式中，应用对象是人。本发明的医药组合物和准医药组合物的给药量、使用量以能获得所期待的效果的方式设定。在有效给药量的设定中，一般考虑应用对象的症状、年龄、性别、体重等。应予说明，只要是本领域技术人员，就能够考虑这些情况而设定适当的给药量。作为给药时间表，可以采用例如一天一次 数次、二天一次、或者三天一次等。在给药时间表的制作方面，可以考虑应用对象的症状、有效成分的效果持续时间等。如上所述， 本发明的一种方式是含有通过本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物的食品组合物。作为本发明中的“食品组合物”的例子，可举出普通食品(谷类、蔬菜、食用肉、各种加工食品、点心类、牛奶、清凉饮用水、酒精饮料等)、营养补充食品(以抗氧化、抗菌、抗炎症、创伤治疗、降血压、防老化等为目的的补充物或营养饮料等)、食品添加物。在为营养补充食品或食品添加物时，可以以粉末、颗粒、片剂、糊、液体等形状提供。通过以食品组合物的形式提供由本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物，能够日常摄取蛋壳膜溶解物，或者持续地摄取蛋壳膜溶解物。蛋壳膜溶解物的添加量能够根据目的而任意地设定。例如，在对本发明的食品组合物期待有助于维持或增进健康或者治疗或预防特定的疾病、病症的效果时，优选含有足以发挥该效果的量的蛋壳膜溶解物。添加量可以考虑食品的种类、食品的消费者(性别、年龄、体重等)、对食品所期待的效果等来确定。如上所述，本发明的一种方式是含有通过本发明的蛋壳膜溶解方法得到的蛋壳膜溶解物的化妆品组合物。本发明的化妆品组合物可以通过配合蛋壳膜溶解物与在化妆品中通常使用的成分、基材(例如，各种油脂、矿物油、凡士林、角鲨烷、羊毛脂、蜂蜡、改性醇、棕榈酸糊精、甘油、脂肪酸甘油酯、乙二醇、对羟基苯甲酸酯、樟脑、薄荷醇、各种维生素、氧化锌、氧化钛、苯甲酸、依地酸、洋甘菊油、角叉菜胶、甲壳质粉、壳聚糖、香料、着色料等)而得至|J。作为化妆品组合物的形式，可以例示脸或身体用的乳液、化妆水、膏、乳液(lotion)、精华液、油、美容涂敷剂(pack)、美容贴膜(sheet)、清洁剂等。化妆品组合物中的蛋壳膜溶解物的添加量没有特别限定。例如，可以以成为O.1重量％ 60重量％的方式添加蛋壳膜溶解物。作为本发明的化妆品组合物的用途或效果的例子，可举出保湿、浸润、防止皮肤粗糙、美肌、防止皱纹、防止下垂、防止老化。除了上述以外，本发明的蛋壳膜溶解物还可以在金属离子的回收、保湿剂、吸水齐U、抗菌剂、毛发生长剂等方面使用。4.蛋壳膜有用成分的提取方法本发明还提供应用了本发明的蛋壳膜溶解方法的蛋壳膜有用成分的提取方法。在本发明的蛋壳膜有用成分的提取方法中，进行以下的工序(i)和(ii)。(i)基于本发明的蛋壳膜溶解方法的溶解工序(ii)将上述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序在工序(ii)中， 适当组合过滤、离心处理、脱盐、硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种色谱(离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱等)等来进行纯化。作为纯化目标的有用成分，可例示溶菌酶、赖氨酰氧化酶、β - N —乙酰基氨基葡萄糖苷酶等酶、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等酸性粘多糖。也可以阶段性地纯化，获取2种以上的有用成分。采用本发明的方法得到的蛋壳膜有用成分与蛋壳膜溶解物的情况相同，可以用作在医药品、食品、化妆品等中使用或添加的成分。实施例1.利用蛋白质分解酶的蛋壳膜溶解的研究将鸡蛋打破后取出蛋液，然后将带蛋壳I旲的蛋壳在4重量％的乙酸水溶液中浸溃5 10分钟左右，用手剥离蛋壳膜并取之。使用如下的蛋壳膜将剥取的蛋壳膜进行水洗，并充分去除水分。以蛋壳膜为基质，研究利用现有酶制剂能否将蛋壳膜溶解。使用市售的15种酶制剂(NEWLASE F3G、PROTEASE M、PROTEASE N、PROTEASE P3G、PROTEASE S、BROMELAIN F、PROLEATHER FG — F、肽酶 R、UMAMIZYME G、THERMOASE YlOO、ProteAX、PROTEASE A、PAPAINW40、PANCREATIN8AP、BI0S0RK)，在各种pH条件下(ρΗ4· 0 13. 0)进行反应。各pH范围的缓冲液如下所述。PH4. 0,5. O使用IOOmM的NaOAc缓冲液，pH6. O使用IOOmM的MES-NaOH缓冲液，pH7. O使用IOOmM的HEPES-NaOH缓冲液，pH8. O使用IOOmM的Tris-HCl缓冲液，pH9. O 12. O使用IOOmM的甘氨酸-NaOH缓冲液，pH13. O使用IOOmM的KCl-NaOH缓冲液。酶量为0. l%(w/v)，蛋壳膜量为1. 0%(w/v)，反应温度为60°C，孵育72小时。图1表示使用BIOSORK作为试验酶制剂时的结果。如该结果所示，即使进行了 72小时反应，在目视上也无法确认蛋壳膜的溶解(分解)。其它的14种酶制剂在目视上也未见溶解。2.基于蛋白质分解酶和还原剂共存的蛋壳膜溶解的研究由于单独使用酶制剂时未见蛋壳膜的溶解，所以研究了与还原剂组合所带来的效果。在本试验中，使用BIOSORK和PROLEATHER FG-F作为对象酶制剂。使用IOOmM的甘氨酸-NaOH pH9. O作为缓冲液，在添加了 IOmM DTT或未添加的条件下尝试溶解。酶量为0. l%(w/v)，蛋壳膜量为1. 0%(w/v)，反应温度为60°C，进行孵育。图2表示使用BIOSORK作为试验酶制剂时的结果。如图2所示，单独使用DTT和单独使用酶制剂时未见蛋壳膜的溶解，但在DTT与酶制剂共存的条件下在1. 5小时这样的短时间内就看到溶解。此外，使用PROLEATHER FG-F时也获得同样的结果，完全溶解所需的时间比BIOSORK长(约2小时)。认为是还原剂使构成蛋壳膜的蛋白质中存在的二硫键开裂，结果变得容易溶解。此外，认为由于溶解被作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的PMSF所抑制，所以该试验中的蛋壳膜的溶解是由蛋白酶所致的。3.基于蛋白质分解酶和还原剂(食品添加物)共存的蛋壳膜溶解的研究考虑安全性和成本，从食品添加物中探索能进行蛋壳膜的溶解的还原剂。首先，使用BIOSORK作为试验酶制剂，分别添加10种还原剂(亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、L 一抗坏血酸、L 一半胱氨酸盐酸盐、亚硝酸钠、硝酸钠、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、DTT、硼氢化钠、HITHIONEXTRACT YH_8、HITHI0N EXTRACT YH-15,HITHION EXTRACT YH-D12)，尝试溶解。亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、L 一抗坏血酸、亚硝酸钠、硝酸钠、DTT、硼氢化钠的试验浓度为1、10、IOOmM0 L 一半胱氨酸盐酸盐、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽的试验浓度为1、10、20、50mM。ΗΙΤΗΙ0ΝEXTRACT YH-8、HITHION EXTRACT YH-15, HITHION EXTRACT YH-D12 的试验浓度为 1、5、10%(w/v)。缓冲液的pH条件分别在4. O 13. O下进行，并使用与前述相同的缓冲液。酶量为O. 1%或O. 5%(w/v)，蛋壳膜量为1. 0%(w/v)，反应温度为600C，孵育6小时或12小时。在亚硫酸钠存在的条件下基于PH变化的分解能力的比较中，亚硫酸钠的浓度为IOOmM,使用ρΗ4· O 13. O的各缓冲液(IOOmM)进行试验。在使用了 BIOSORK和PROLEATHER FG-F的试验中，ρΗ4· O 5. 5使用NaOAc缓冲液，ρΗ5· 5 6. 5使用MES-NaOH缓冲液，ρΗ6· 5
7.5使用HEPES-NaOH缓冲液，ρΗ7· 5 9. O使用Tris-HCl缓冲液，ρΗ9. O 12. 5使用甘氨酸-NaOH缓冲液，ρΗ12. 5 13. O使用KCl-NaOH缓冲液。在使用了其它的13种酶制剂的试验中，使用NaOAc缓冲液(ρΗ4. 0,5. 0)、MES-NaOH缓冲液(ρΗ6. 0)、HEPES-NaOH缓冲液(ρΗ7· 0)、Tris-HCl 缓冲液(ρΗ8. 0)、甘氨酸-NaOH 缓冲液(ρΗ9. 0)进行。酶量为 0. l%(w/V)，蛋壳膜量为1.0%(w/v)，反应`温度为60°C，进行孵育，测定完全溶解所需的时间。在分解模式的确认中，以BIOSORK和PROLEATHER FG-F为对象酶制剂，在各pH条件下以最终浓度成为ImM的方式向反应后的溶液中添加PMSF，从而使反应停止，将各样品提供给SDS-PAGE分析。图3表示试验还原剂的种类和添加所致的蛋壳膜溶解(分解)的有无。在食品添加物中，亚硫酸盐和亚硫酸氢盐在IOOmM的浓度条件下显示出显著的效果。使用亚硫酸钠时，在PH6. O 8. O下看到蛋壳膜被效率良好地溶解。使用L-半胱氨酸时，看到部分溶解。接着，在亚硫酸钠存在的条件下，进行基于pH变化的分解能力的比较。图4表示使用BIOSORK时的结果，横轴表示反应pH，纵轴表示蛋壳膜完全溶解所需的时间。横轴的反应pH不是调整时的pH,而是表示实际反应时的pH。表I示出调整时的pH与反应时的pH的对应表。[表I]
权利要求
1.一种蛋壳膜溶解方法，其特征在于，将蛋白质分解酶和还原剂联用。
2.如权利要求1所述的蛋壳膜溶解方法，其中，包括在还原剂共存的条件下使蛋白质分解酶作用于蛋壳膜的工序。
3.如权利要求1所述的蛋壳膜溶解方法，其中，包括以下工序(I)和(2): (1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序； (2)向所述溶剂添加还原剂和蛋白质分解酶，使之反应的工序。
4.如权利要求3所述的蛋壳膜溶解方法，其中，工序(2)的反应溶液的pH为4.5 9. 5。
5.如权利要求3或4所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂的浓度为5mM 1M。
6.如权利要求3 5中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，继续所述工序(2)的反应，直至确认不到固态物。
7.如权利要求3 6中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，还包括以下的工序(3) (3 )将工序(2 )后的溶液过滤、除去固态物的工序。
8.如权利要求1 7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶为碱性蛋白酶或中性蛋白酶。
9.如权利要求1 7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、金属内肽酶、氨基肽酶以及天冬氨酸内肽酶中的一种以上的酶。
10.如权利要求1 7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、茎菠萝蛋白酶、亮氨酰氨基肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的一种以上的酶。
11.如权利要求1 7中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述蛋白质分解酶是选自 BIOSORK、PROLEATHER FG — F、PAPAINW40、PROTEASE N、BROMELAIN F、UMAMIZYMEG,THERMOASE YI00、ProteAX、PROTEASE S、S UMIZ Y ME LP500,DESKIN C、PR0TIN NY10,PROTINPC 10, SUMIZYME MP、PROTIN AY以及蛋白酶K中的一种以上的酶。
12.如权利要求1 11中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂是选自亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、L 一半胱氨酸、N —乙酰基一 L 一半胱氨酸、2 —巯基乙醇、谷胱甘肽以及DTT中的一种以上的还原剂。
13.如权利要求1 11中任一项所述的蛋壳膜溶解方法，其中，所述还原剂为亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。
14.如权利要求1所述的蛋壳膜溶解方法，其中，包括以下的工序(I)和(2’) (1)在溶剂中准备蛋壳膜的工序； (2’)向所述溶剂添加还原剂而使之反应后，除去还原剂，接着添加蛋白质分解酶，使之反应的工序。
15.一种蛋壳膜溶解剂，是将蛋白质分解酶和还原剂组合而成的。
16.如权利要求15所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，含有蛋白质分解酶和还原剂。
17.如权利要求15所述的蛋壳膜溶解剂，其特征在于，是由含有蛋白质分解酶的第I构成组分、以及含有还原剂的第2构成组分构成的试剂盒。
18.—种蛋壳膜溶解物，是通过权利要求1 13中任一项所述的蛋壳膜溶解方法得到的。
19.如权利要求18所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有选自溶菌酶、β— N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的一种以上的成分。
20.如权利要求18所述的蛋壳膜溶解物，其中，显示选自抗氧化活性和血管紧张素转化酶抑制活性中的一种以上的活性。
21.一种蛋壳膜溶解物，是通过权利要求14所述的蛋壳膜溶解方法得到的。
22.如权利要求21所述的蛋壳膜溶解物，其中，含有赖氨酰氧化酶。
23.如权利要求18 22中任一项所述的蛋壳膜溶解物，其中，是蛋壳膜的完全溶解物。
24.一种组合物，含有权利要求18 23中任一项所述的蛋壳膜溶解物。
25.如权利要求24所述的组合物，其中，是医药品、准医药品、食品或化妆品。
26.一种蛋壳膜有用成分的提取方法，包括以下的工序(i)和(ii) (i)利用权利要求1 13中任一项所述的方法的溶解工序； ( )将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。
27.如权利要求26所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被纯化的成分是选自溶菌酶和β — N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶中的酶，或者选自透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的酸性粘多糖。
28.通过权利要求27所述的方法得到的溶菌酶、β— N—乙酰基氨基葡萄糖苷酶、透明质酸、硫酸软骨素或硫酸皮肤素。
29.一种蛋壳膜有用成分的提取方法，其特征在于，包括以下的工序(i’)和(ii) (i’)利用权利要求14所述的方法的溶解工序； (ii)将在所述溶解工序中得到的蛋壳膜溶解物纯化的工序。
30.如权利要求29所述的蛋壳膜有用成分的提取方法，其中，工序(ii)中被纯化的成分为赖氨酰氧化酶。
31.通过权利要求30所述的方法得到的赖氨酰氧化酶。
32.通过权利要求26或29所述的蛋壳膜有用成分的提取方法得到的蛋壳膜提取物。
全文摘要
本发明的课题是提供一种蛋壳膜溶解方法，其能够解决利用酸和/或碱的处理、利用蛋白质分解酶的现有处理方法所具有的问题中的至少一个，即，(1)需要粉末化、超声波处理、沸腾处理之类的前处理；(2)需要长时间的处理；(3)分解率低(约20％)。通过将蛋白质分解酶和还原剂联用，将蛋壳膜有效率地溶解。
文档编号A61K35/54GK103069000SQ20118004000
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月12日 优先权日2010年8月31日
发明者田中俊一 申请人:天野酶株式会社