专利名称：脑功能改善用组合物及改善脑功能的方法
技术领域：
本发明涉及用于改善脑功能的组合物及改善脑功能的方法。
背景技术：
由脑功能的下降引起的症状及疾病有忧郁症、综合失调症、谵妄、痴呆(脑血管性痴呆、阿尔茨海默病等)等。伴随着现代社会的高龄化，特别是痴呆患者的增加成为很大的社会问题。痴呆的症状因人而异，但作为共同见到的症状，可列举出记忆障碍、方向障碍、判断力 思考力的下降等。痴呆中患者数较多的是脑血管性痴呆和阿尔茨海默病。例如，脑血管性痴呆由于因脑血流障碍，大脑皮质、海马体的神经细胞受到损伤，所以出现认知.记忆障碍。因此，除了治疗有可能产生脑血管障碍的高血压、糖尿病、高胆固醇血症等基础疾病以外，还适用改善脑血流的药物、保护脑神经细胞的药物。另一方面，阿尔茨海默病的原因尚未弄清楚，但由于在其患者中观察到脑内的神经递质即乙酰胆碱的水平的下降，所以认为胆碱能神经的功能下降是原因之一(例如、Science, 217，408-414 (1982))。因此，在阿尔茨海默病中，以提高乙酰胆碱的浓度来防止胆碱能神经的功能下降为目的的治疗方法成为主流。
目前，作为阿尔茨海默病的治疗药，例如盐酸多奈哌齐等乙酰胆碱酯酶抑制剂正被市售。但是，盐酸多奈哌齐等乙酰胆碱酯酶抑制剂存在由于具有肝脏毒性、强的副作用而无法长期服用以及高价的问题。
此外，作为关于肽显示健忘改善效果的报道，例如报道了 XPLPR (X为L、1、M、F、W)(序列号I)通过300mg/kg的侧脑室内投与或经口投与而显示对东茛菪碱诱发健忘的改善效果，作为其机制之一，暗示了利用脑内C3a受体的乙酰胆碱的释放(日本专利第3898389号公报)。但是，所有肽为了显示作用均需要大量的经口投与、或腹腔内投与、脑室内投与等投与，而不能作为经口摄取的物质显示充分的效果。此外，没有对本发明中的肽及其类似物进行评价的报道，关于脑功能改善的作用并不清楚。
因此，伴随着高龄化社会的发展，越发强烈期望开发预防由脑功能的下降引起的症状或疾病、进而显示改善效果那样的医药品、以及在食品中的适用优异的更安全的化合物。
东茛菪碱被认为作为蕈毒碱`受体拮抗药而引起胆碱能神经的功能下降，由于作为脑功能障碍诱发剂起作用，所以用于阿尔茨海默病治疗药开发时的模型动物制作。关于预防和/或改善由于该东茛菪碱的作用而引起的脑功能障碍的作用，可以通过例如Y字迷宫试验、八方向迷宫试验、被动逃避试验等行为药理试验来证实效果。此夕卜，通过使用正常动物的同样的行为药理试验，可以证实脑功能的改善和/或强化的效果。关于 Val-Pro-Pro-Phe (VPPF)(序列号 2)、Ile-Pro-Pro-Leu (IPPL)(序列号 3)、Asn-1le-Pro-Pro-Leu (NIPPL)(序列号4)及其类似物的功能，作为报道，例如已知有以Val-Pro-Pro-Phe、11 e-Pro-Pro-Leu、Asn-1 I e-Pro-Pro-Leu 作为有效成分的皮肤老化抑制齐U(国际公开第2010/071132号公报)。但是，所有肽均没有评价脑功能改善作用的例子，无法推测作用。发明内容
本发明提供用于改善脑功能的、低用量且能够经口摄取的组合物。此外，本发明提供改善脑功能的方法。
(1)本发明为一种脑功能改善用组合物，其以X-Pro-Pro-Y (式中，X表示Val或Ile或Asn-1le中的任一者,式中，Y表示Phe或Leu中的任一者)(序列号2 7)或其盐作为有效成分。
(2)本发明为一种脑功能改善用组合物，其以Val-Pro-Pro-Phe或其盐作为有效成分。
(3)本发明为一种脑功能改善用组合物，其以Ile-Pro-Pro-Leu或其盐作为有效成分。
(4)本发明为一种脑功能改善用组合物,其以Asn-1le-Pro-Pro-Leu或其盐作为有效成分。
(5)本发明也为根据(1) (4)中任一项所述的组合物，其用于经口摄取。
(6)本发明也为一种改善脑功能的方法，包括对非人动物投与X-Pro-Pro-Y(式中，X表示Val或Ile或Asn-1le中的任一者,式中，Y表示Phe或Leu中的任一者)或其盐的步骤。
(7)本发明也为一种改善脑功能的方法，包括对非人动物投与Val-Pro-Pro-Phe或其盐的步骤。
(8)本发明也为一种改善脑功能的方法,包括对非人动物投与Ile-Pro-Pro-Leu或其盐的步骤。
(9)本发明也为一种改善脑功能的方法，包括对非人动物投与Asn-1le-Pro-Pro-Leu 或其盐的步骤。
(10)本 发明也为根据(6) (9)中任一项所述的方法，其中，投与为经口投与。
图1表示肽Val-Pro-Pro-Phe (VPPF)的东茛菪碱诱发健忘预防效果。将水(对照)、或东茛菪碱单独、或VPPF500nmol/kg体重或VPPF5000nmol/kg体重与东茛菪碱一起给小鼠投与，分别通过实施例1记载的方法来评价健忘预防效果。图1的纵轴表示自发变换行为变化率。为了确认是否诱发健忘，通过student t检验来进行水投与对照组和单独投与东茛菪碱的东茛菪碱对照组间的差异显著性检验。**表示相对于水投与对照组P〈0.01。VPPF投与组与东茛菪碱对照组的差异显著性检验通过Dunnett型多重比较检验来进行。#表示相对于东茛菪碱对照组P〈0.05。
图2表示肽Ile-Pro-Pro-Leu (IPPL)的东茛菪碱诱发健忘预防效果。将水(对照)、或东茛菪碱单独、或IPPL500nmol/kg体重或IPPL5000nmol/kg体重与东茛菪碱一起给小鼠投与，分别通过实施例2记载的方法来评价健忘预防效果。图2的纵轴表示自发变换行为变化率。为了确认是否诱发健忘，通过student t检验来进行水投与对照组和单独投与东茛菪碱的东茛菪碱对照组间的差异显著性检验。**表示相对于水投与对照组P〈0.01。IPPL投与组与东茛菪碱对照组的差异显著性检验通过Dunnett型多重比较检验来进行。##表示相对于东茛菪碱对照组P〈0.01。
图3表示肽Asn-1Ie-Pro-Pro-Leu (NIPPL)的东茛菪碱诱发健忘预防效果。将水(对照)、或东茛菪碱单独、或NIPPL500nmol/kg体重或NIPPL5000nmol/kg体重与东茛菪碱一起给小鼠投与，分别通过实施例3记载的方法来评价健忘预防效果。图3的纵轴表示自发变换行为变化率。为了确认是否诱发健忘，通过student t检验来进行水投与对照组和单独投与东茛菪碱的东茛菪碱对照组间的差异显著性检验。**表示相对于水投与对照组P〈0.01。NIPPL投与组与东茛菪碱对照组的差异显著性检验通过Dunnett型多重比较检验来进行。#表示相对于东茛菪碱对照组P〈0.05。
具体实施方式
本发明的组合物以肽X-Pro-Pro-Y (式中，X表示Val或Ile或Asn-1le中的任一者，式中，Y 表示 Phe 或 Leu 中的任一者)、即肽 Val-Pro-Pro_Phe、或肽 Ile-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1Ie-Pro-Pro-Leu、或妝 Val-Pro-Pro-Leu (序列号 5)、或妝 Ile-Pro-Pro-Phe (序列号6)或肽Asn-1le-PiO-PiO-Phe (序列号7)作为有效成分。特别是本发明的组合物以妝 Val-Pro-Pro-Phe、或妝 Ile-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 作为有效成分。作为有效成分的肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或肽11 e-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1le-Pro-Pro-Leu可以是通过有机化学方式合成的肽,此外也可以是天然物来源的肽。作为这些肽的有机化学合成法，可以采用固相法(t-Boc法、Fmoc法)或液相法等一般的方法，例如，也可以是采用岛津制作所制的肽合成装置(PSSM-8型)等肽自动合成装置而合成的肽。关于肽合成的反应条件等，可以基于本领域技术人员的技术常识，任意地设定选择的合成方法、适合的反应条件等。化学合成的肽的精制方法对于本领域技术人员来说也是熟知的。
本说明书中，当言及肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或肽11 e-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1le-Pro-Pro-Leu时，除去特别明示的情况及上下文明显除外的情况，“X-Pro-Pro-Y、特别是 Val-Pro-Pro-Phe、或 Ile-Pro-Pro-Leu、或 Asn-1Ie-Pro-Pro-Leu” 及“妝 X-Pro-Pro-Y、特别是妝 Val-Pro-Pro-Phe、或妝11 e-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1 I e-Pro-Pro-Leu ”中包括其盐。这样的盐中包括例如钠盐、钾盐、盐酸盐等可在生理条件下存在的盐。此外，本发明的组合物中，除了作为本发明的组合物的有效成分的肽X-Pro- Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或肽11 e-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1le-Pro-Pro-Leu以外，也可以包含其它的肽及游离氨基酸或其盐。另外，与本发明的关联中，氨基酸的三字母标记及一字母标记以及肽的标记按照本领域技术人员所熟知的一般的规则。
本发明的组合物或肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或肽11 e-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1le-Pro-Pro-Leu的脑功能改善作用可以采用利用例如Y字型迷宫的基于阿尔茨海默病治疗药的评价体系的体系来确认。具体而言，对大鼠或小鼠单独投与通过使用东茛菪碱那样的蕈毒碱受体拮抗药而引起胆碱能神经的功能下降、引起脑功能障碍从而诱发健忘症的药剂或将本发明的组合物或肽X-Pro-Pro-Y、特别是妝 Val-Pro-Pro-Phe、或妝 Ile-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 与那样的药剂同时投与、或在投与那样的药剂之前投与本发明的组合物或肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或妝 IIe-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1Ie-Pro-Pro-Leu,在利用 Y 字型迷宫的试验中以向不同的臂中的自发变换行为变化率或向迷宫中的总进入次数为指标，可以确认本发明的组合物的健忘预防作用。
在这些试验中作为阴性对照，可以使用例如仅投与水的动物。在确认肽 X-Pro-Pro-Y、特别是肽 Val-Pro-Pro-Phe、或肽 Ile-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1le-Pro-Pro-Leu对通过药剂诱导的健忘的预防作用的实验时，仅投与东茛菪碱那样的通过引起脑功能障碍而诱发健忘症的药剂的动物也可以作为对照加入。
本发明的组合物其有效成分为肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或肽11 e-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1le-Pro-Pro-Leu,通过经口投与或经口摄取可以达成上述的所期望的效果。本发明的组合物的投与或摄取期间可以考虑投与或摄取的对象、例如人或非人动物的年龄或该对象的健康状态等进行各种调整。非人动物中包括非人高等脊椎动物、特别是非人哺乳类，包括狗、猫等宠物、牛、马、猪、羊等家畜，但并不限于这些。本发明的组合物即使是I次的投与也见到效果，但通过I天I次以上、持续摄取可以期待持续的效果。使用本发明的组合物作为医药时的形态可以制成经口投与用的制剂的形态。例如可列举出片剂、丸剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊、散剂、颗粒剂、液剂等。在作为医药制造的情况下，例如，可以适当根据需要，使用制药上容许的载体、赋型剂、补形剂、防腐剂、稳定化齐U、结合剂、PH调节剂、缓冲剂、增稠剂、凝胶化剂、保存剂、抗氧化剂等，以一般认可的制剂投与所需要的单位用量形态来制造。
本发明的组合物也可以作为饮食品用原材料或动物用饲料原材料使用，例如，可以将本发明的组合物或作为本发明的组合物的有效成分的肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或妝 Ile-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 制成具有改善脑功能的效能的特定保健用食品等功能性食品。
关于用于得到所期望的效果的本组合物或肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe> 或妝 Ile-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 的投与或摄取量，每I次以作为有效成分的肽Χ-Ρι.0-Ρι.0-Υ、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或肽IIe-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 的量ii 般优选为 0.lmg/kg 体重 10mg/kg体重。根据每I天的摄取次数，也可以将食品、例如功能性食品中的每I次的摄取量设定为比上述量更低。适合的摄取量可以如上所述考虑各种因素进行进一步调整。
包含本发明的组合物或作`为其有效成分的肽Χ-Ρι.0-Ρι.0-Υ、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe> 或妝 Ile-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 的食品、例如功能性食品也可以根据需要添加食品中使用的其它的成分如糖类、蛋白质、脂质、维生素、矿物质、调味料，例如各种碳水化物、脂质、维生素类、矿物质类、甜味料、香料、色素、组织改善剂等或它们的混合物等添加物，以改善营养的平衡、风味等。包含本发明的组合物或作为其有效成分的肽X-Pro-Pro-Y、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或肽11 e-Pro-Pro-Leu、或肽Asn-1le-Pro-Pro-Leu的动物用饲料也可以与人用食品同样地进行调制。
例如前述的功能性食品可以制成固形物、凝胶状物、液状物中的任一形态，例如可列举出各种加工饮食品、干燥粉末、片剂、胶囊剂、颗粒剂等，进而可以制成各种饮料、酸乳酪、流食、果冻、糖果、蒸煮袋食品、压片糖果、小甜饼、蛋糕、面包、饼干、巧克力等。
在制造包含本发明的组合物的特定保健用食品等功能性食品时，虽然根据添加形态、产品形态而异，但按照相对于最终产品，所含有的作为有效成分的肽X-Pro-Pro-Y、特别是妝 Val-Pro-Pro-Phe、或妝 IIe-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 的含量在每IOOg中达到I μ g 10g、优选10 μ g lg、进一步优选100 μ g IOOmg的方式调制。
本发明的组合物或作为其有效成分的肽Χ-Ρι.0-Ρι.0-Υ、特别是肽Val-Pro-Pro-Phe、或妝 Ile-Pro-Pro-Leu、或妝 Asn-1le-Pro-Pro-Leu 可以通过改善脑功能而预防健忘，增强记忆能力。此外，也可以期待治疗由脑功能的下降引起的症状及疾病即忧郁症、综合失调症、谵妄、痴呆(脑血管性痴呆、阿尔茨海默病等)等的效果。
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明的范围不限定于实施例。
实施例1
Val-Pro-Pro-Phe (VPPF)的健忘预防作用
使用ddY系雄性小鼠(约7周龄)(n=15),使其自由摄取饵食及水。作为待评价物质，使用 VPPF500nmol/kg 体重(230 μ g/kg 体重)、5000nmol/kg 体重(2300 μ g/kg 体重)。待评价物质在实施用于评价自发变换行为的Y字迷宫试验的60分钟前对小鼠进行单次经口投与。此外，在实施Y字迷宫试验的30分钟前，为了对小鼠诱发脑功能障碍(记忆障碍和/或认知障碍)，按照lmg/kg体重的方式对背部皮下投与东茛菪碱。在Y字迷宫试验中，使用一根臂的长度为40cm、壁的高度为12cm、地板的宽度为3cm、上部的宽度为IOcm且3根臂分别以120度的角度连接而成的Y字迷宫作为实验装置。将小鼠放置在Y字迷宫中的任一个臂的前端，使其在迷宫内自由探索8分钟，依次记录小鼠进入的臂。计算小鼠在测定时间内进入各臂中的次数，将其作为总进入数，调查其中连续地选择不同的三个臂的组合(例如，设3根臂分别为A、B、C时，在所进入的臂的顺序为ABCBACACB的情况下也包括重复地计算为4)，将该数作为自发变换行为数。将自发变换行为数除以由总进入数减去2的数，将其乘以100，将求得的值作为自发变换行为变化率，将其作为自发变换行为的指标。本指标越为高值，则表示短期记忆越被保持。测定值以每组平均值土标准误差表示。对照组与东茛菪碱对照组的差异显著性检验通过Student (Student )t检验来进行。此外，东茛菪碱对照组与VPPF投与组的差异显著性检验在单因素方差分析后通过Dunnett (Dunnett)型多重比较检验来进行。将结果示于图1中。表明:￥ 在5000_01/1^体重(230(^8/1^)下具有健忘预防作用。
实施例2
Ile-Pro-Pro-Leu (IPPL)的健忘预防作用
使用ddY系雄性小鼠(约7周龄)(n=15),使其自由摄取饵食及水。作为待评价物质，使用 IPPL500nmol/kg 体重(220 μ g/kg 体重)、5000nmol/kg 体重(2200 μ g/kg 体重)。待评价物质在实施用于评价自发变换行为的Y字迷宫试验的60分钟前对小鼠进行单次经口投与。此外，在实施Y字迷宫试验的30分钟前，为了对小鼠诱发脑功能障碍(记忆障碍和/或认知障碍)，按照lmg/kg体重的方式对背部皮下投与东茛菪碱。在Y字迷宫试验中，使用一根臂的长度为40cm、壁的高度为12cm、地板的宽度为3cm、上部的宽度为IOcm且3根臂分别以120度的角度连接而成的Y字迷宫作为实验装置。将小鼠放置在Y字迷宫中的任一个臂的前端，使其在迷宫内自由探索8分钟，依次记录小鼠进入的臂。计算小鼠在测定时间内进入各臂中的次数， 将其作为总进入数，调查其中连续地选择不同的三个臂的组合(例如，设3根臂分别为A、B、C时，在所进入的臂的顺序为ABCBACACB的情况下也包括重复地计算为4)，将该数作为自发变换行为数。将自发变换行为数除以由总进入数减去2的数，将其乘以100，将求得的值作为自发变换行为变化率，将其作为自发变换行为的指标。本指标越为高值，则表示短期记忆越被保持。测定值以每组平均值土标准误差表示。对照组与东茛菪碱对照组的差异显著性检验通过Student (Student)t检验来进行。此外，东茛菪碱对照组与IPPL投与组的差异显著性检验在单因素方差分析后通过Dunnett (Dunnett)型多重比较检验来进行。将结果示于图2中。表明:1 1^在50001111101/1^体重(220(^8/1^)下具有健忘预防作用。
实施例3
Asn-1le-Pro-Pro-Leu (NIPPL)的健忘予页防作用
使用ddY系雄性小鼠(约7周龄)(n=15),使其自由摄取饵食及水。作为待评价物质，使用 NIPPL500nmol/kg 体重(280 μ g/kg 体重)、5000nmol/kg 体重(2800 μ g/kg 体重)。待评价物质在实施用于评价自发变换行为的Y字迷宫试验的60分钟前对小鼠进行单次经口投与。此外，在实施Y字迷宫试验的30分钟前，为了对小鼠诱发脑功能障碍(记忆障碍和/或认知障碍)，按照lmg/kg体重的方式对背部皮下投与东茛菪碱。在Y字迷宫试验中，使用一根臂的长度为40cm、壁的高度为12cm、地板的宽度为3cm、上部的宽度为IOcm且3根臂分别以120度的角度连接而成的Y字迷宫作为实验装置。将小鼠放置在Y字迷宫中的任一个臂的前端，使其在迷宫内自由探索8分钟，依次记录小鼠进入的臂。计算小鼠在测定时间内进入各臂中的次数，将其作为总进入数，调查其中连续地选择不同的三个臂的组合(例如，设3根臂分别为A、B、C时，在所进入的臂的顺序为ABCBACACB的情况下也包括重复地计算为4)，将该数作为自发变换行为数。将自发变换行为数除以由总进入数减去2的数，将其乘以100，将求得的值作为自发变换行为变化率，将其作为自发变换行为的指标。本指标越为高值，则表示短期记忆越被保持。测定值以每组平均值土标准误差表示。对照组与东茛菪碱对照组的差异显著性检验通过Student (Student )t检验来进行。此外，东茛菪碱对照组与NIPPL投与组的差异显著性检验在单因素方差分析后通过Dunnett (Dunnett)型多重比较检验来进行。将结果示于图3中。表明41 1^在5000_01/1^体重(280(^8/1^)下具有健忘预防作用。
(参考文献)
1.Science, 217，40`8-414 (1982)
2.日本专利第3898389号公报
3.国际公开第2010/071132号公报
权利要求
1.一种脑功能改善用组合物，其以X-Pro-Pro-Y或其盐作为有效成分，式中，X表示Val或Ile或Asn-1le中的任一者,式中，Y表示Phe或Leu中的任一者。
2.一种脑功能 改善用组合物，其以Val-Pro-Pro-Phe或其盐作为有效成分。
3.一种脑功能改善用组合物，其以Ile-Pro-Pro-Leu或其盐作为有效成分。
4.一种脑功能改善用组合物，其以Asn-1le-Pro-Pro-Leu或其盐作为有效成分。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的组合物，其用于经口摄取。
6.一种改善脑功能的方法，包括对非人动物投与X-Pro-Pro-Y或其盐的步骤，式中，X表示Val或Ile或Asn-1le中的任一者,式中，Y表示Phe或Leu中的任一者。
7.—种改善脑功能的方法,包括对非人动物投与Val-Pro-Pro-Phe或其盐的步骤。
8.—种改善脑功能的方法,包括对非人动物投与Ile-Pro-Pro-Leu或其盐的步骤。
9.一种改善脑功能的方法,包括对非人动物投与Asn-1le-Pro-Pro-Leu或其盐的步骤。
10.根据权利要求6 9中任一项所述的方法，其中，投与为经口投与。
全文摘要
本发明提供用于改善脑功能的低用量且能够经口摄取的组合物及方法。本发明为一种脑功能改善用组合物，其以X-Pro-Pro-Y(式中，X表示Val或Ile或Asn-Ile中的任一者，式中，Y表示Phe或Leu中的任一者)或其盐作为有效成分。
文档编号A61K38/00GK103108646SQ20118004431
公开日2013年5月15日 申请日期2011年9月14日 优先权日2010年9月16日
发明者大泽一仁, 内田直人, 大木浩司 申请人:可尔必思株式会社