专利名称：细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法
技术领域：
本发明涉及在医学、生物、药物发现、药学等领域有用的细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法。本申请是主张2010年9月14日提出的日本申请(日本特愿2010-225201)为基础的优先权的申请。
背景技术：
今天，动物细胞培养技术显著进步，以动物细胞为对象的研究开发也广泛在各种领域被实施。成为对象的动物细胞的使用方法也不仅是开发当初的将细胞本身制品化、将其产生物制品化，现在通过分析细胞和/或其细胞表层蛋白质来设计有效的药物、将患者本人的细胞在活体外再生、或者提高其功能然后送回活体内进行治疗等方式也在逐渐被实施。现在，动物细胞的培养技术、以及评价、分析、利用的技术是研究者关注的一个领域。但是，包含人细胞在内，动物细胞大多是附着依赖性的。即，要在活体外培养动物细胞时，需要使它们一次性附着于基材表面。并且，不能将培养的细胞剥离成一个一个，还需要保持在该基材表面上培养的形态使其剥离。特别对于使患者本人的细胞在活体外再生的技术而言，近年来，将治疗困难的脏器替换成他人的脏器的脏器移植已经一般化。成为对象的脏器也实际上多样化为皮肤、角膜、肾脏、肝脏、心脏等，另外，术后恢复也特别良好，作为一种医疗技术已经逐渐被确立。作为一例列举角膜移植，约50年前日本也设立眼库开始了移植活动。然而，据说供体数尚且少，仅国内每年需要角膜移植的患者约由2万人，与此相对，实际进行移植治疗的患者仅为约1/10的2000人左右。虽然有角膜移植这样基本确立的技术，但由于供体不足这样的问题，现状是要求其他的医疗技术。基于这样的背景，开发了要将患者本人的正常细胞培养至所需大小将其移植的技术。基于这样的背景，日本特开平02-211865号公报(专利文献I)显示了在用对水的上限或者下限临界溶解温度为O 80°C的聚合物包覆了基材表面而得的细胞培养支撑体上，将细胞在上限临界溶解温度以下或下限临界溶解温度以上培养，然后调整到上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，从而无酶处理而剥离培养细胞的新的细胞培养法。另外，日本特开平05-192138号公报(专利文献2)记载了，通过利用该温度应答性细胞培养基材将皮肤细胞在上限临界溶解温度以下或者下限临界溶解温度以上培养，然后调整至上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，从而以低损伤剥离培养皮肤细胞。通过利用温度应答性细胞培养基材，可以对现有的培养技术谋求各种新的展开。进而，日本再表02-008387号公报(专利文献3)中发现，在用温度应答性聚合物包覆了基材表面的细胞培养支撑体上培养心肌组织的细胞，得到心肌样细胞片，然后，使培养基温度为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，使培养的多层化细胞片粘附于聚合物膜，直接与聚合物膜一起剥离，并且用规定的方法使其3维结构化，从而可以构建结构缺陷少、作为体外(in vitro)的心肌样组织具有数种功能的细胞片、 和3维结构。然而,在上述的现有技术中，心肌样细胞片的叠层化不能无限进行，3层左右为极限，强烈要求能够简便地多次叠层化的技术。为了解决如上问题，FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)(非专利文献I)中尝试了在活体内将细胞片叠层化，显示得到了厚的心肌片叠层化物。其中，已知为了获得有厚度的细胞片叠层化物，必须向被叠层化的各细胞或者各细胞片供给营养和/或氧，但在FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)(非专利文献I)的方法中，需要反复向活体内移植细胞片，其必须相应于其次数地将移植部位开口，是被移植侧的负担大的方法，强烈要求解决该课题的、能够简便地多次叠层化的技术。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开平02-211865号公报专利文献2:日本特开平05-192138号公报专利文献3:日本再表02-008387号公报非专利文献非专利文献1:FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的是解决如上所述的关于细胞片的叠层化的问题。即，本发明提供基于与现有技术完全不同想法创造的新的细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法。用于解决课题的方法本发明者们为了解决上述课题而从各种角度实施研究而进行了研究开发。其结果发现，通过在凝胶内部设置用于灌注培养基的流路，诱导血管内皮细胞，制作在凝胶内构建了血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，可以在细胞片内构建血管网，从而简便地将细胞片较厚地叠层化。本发明基于该见解而完成了本发明。S卩，本发明提供一种细胞片叠层化物的制造方法灌注，其特征在于，通过制作从设置在凝胶内部的用于灌注培养基的流路向表面构建了血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，从而在细胞片内构建血管网。进而，本发明提供由该方法得到的细胞片叠层化物。进而，本发明提供利用该细胞片叠层化物的方法。认为本发明是使用由利用血管床而能够在活体外制作有厚度的细胞片叠层化物这样的在世界上没有类似的新的想法而获得的细胞结构物而首次实现的极为重要的发明。发明的效果根据本发明所示的制造方法，只要在细胞片内构建血管网，将该细胞片叠层化，就可以简便地制作有厚度的细胞片叠层化物。这样的有厚度的细胞片叠层化物可期待作为活体内组织样的物质，在各种组织的再生医疗有用。
图1是显示实施例1的血管床制作时的步骤的概要的图。
图2是显示实施例1的血管床制作时的概要的图。图3是显示实施例1的血管床制作时的概要的图。图4是显示向实施例1的血管床灌注培养基的装置的概要的图。图5是显示血管内皮细胞向实施例1的血管床的流路游走的状态的图。㈧显示细胞片叠层化物的剖面图。用虚线表示的区域显示胶原凝胶中的流路，箭头显示血管内皮细胞从细胞片游走而形成的毛细血管网。(B)显示从流路注入丙烯酸系树脂，固化后除去凝胶和细胞片。图6是显示使实施例1的细胞片叠层化时的厚度的图。(A)是显示I次操作而叠层化的细胞片的片数(横轴)、和灌注培养后的细胞片的厚度(纵轴)的图。(B)是显示将3片细胞片在血管床上叠层化，灌注培养一定时间后，再次将3片细胞片叠层化，重复该操作时的细胞片的厚度的图。横轴显示叠层化的细胞片的片数、次数与厚度的关系。图7是显示实施例1的细胞片叠层化次数与厚度的关系的图。图8是显示在实施例2的细胞片叠层化物的上下具有流路的血管床的概要的图。图9是显示用实施例2的在细胞片叠层化物的上下具有流路的血管床制作细胞片叠层化物时的概要的图。(A)是显示从流路流出红血球的图，(B)是显示用在细胞片叠层化物的上下具有流路的血管床制作的细胞片叠层化物的剖面图的图。图10是显示用实施例1和实施例2的血管床制作细胞片叠层化物时的概要的图。
具体实施方式
`本发明的目的是简便地制作有厚度的细胞片叠层化物。为此，优选如上所述在细胞片叠层化物中构建血管网。已知在本发明中，通过在凝胶内部设置流路，向该流路灌注培养基，从而简便地在凝胶内的流路与表面之间构建血管网。作为其一种技术，可列举例如，如果向凝胶表面粘贴包含血管内皮细胞的细胞片，向凝胶内的流路灌注培养基，则细胞片内的血管内皮细胞在凝胶内向着流路排列，作为结果而可以在凝胶内构建血管网。作为其他技术，可列举:如果在灌注于凝胶内的流路中的培养基中悬浮血管内皮细胞，则可在凝胶内的流路与表面之间构建血管网。在凝胶内部设置流路时，只要做出未填充凝胶的区域即可，对为此所利用的物质不特别限定，例如，不锈钢丝、硅树脂线、金属、高分子化合物等，不特别限定。血管床是在活体组织、脏器中可见的结构，是指合并了毛细血管与其周围的组织的结构。血管床介由在血管床内无数延伸的毛细血管的薄壁，实现交换活体组织内的氧、葡萄糖、其他营养素的功能。像二氧化碳这样的老废物向血管床的毛细血管内渗出。在活体组织中组织液相对保持一定是因为存在通过毛细血管的物质交换。本发明中，在活体外人工地制作、利用在细胞片内有效地进行交换氧、葡萄糖、其他营养素的功能的血管床。制作具有在凝胶内部灌注培养基等的流路的血管床时，可以在凝胶中混合细胞来制作。此时对于与凝胶混合的细胞种、细胞数、比例等没有任何限定，根据移植的活体的组织、脏器、部位、用途等来适宜选择或调整即可。例如，在以心肌组织的再生、或者评价心肌功能的方法为目的的情况下，作为使用的细胞，可列举心肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、间充质系干细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肝组织的再生、模拟肝组织的人工肝脏的制作、或者评价肝组织的功能的方法等为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肝实质细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞(Kupffer cell)、陷窝细胞(pit cell)、胆管上皮细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾组织的再生、模拟肾组织的人工肾脏的制作、或者评价肾功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾细胞、颗粒细胞、集合管上皮细胞、壁层上皮细胞、足细胞、系膜细胞、平滑肌细胞、尿细管细胞、中间细胞、肾小球细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾上腺组织的再生、模拟肾上腺的人工肾上腺的制作、或者评价肾上腺功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾上腺髓质细胞、肾上腺皮质细胞、球状带细胞、束状带细胞、网状带细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以皮肤的再生、或者评价皮肤功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举表皮角质形成细胞、黑素细胞、竖毛肌细胞、毛囊细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以粘膜组织的再生、或者评价粘膜组织的功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，使用从构成粘膜的组织采取的细胞。作为粘膜的种类，可列举颊粘膜、胃粘膜、肠管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宫粘膜等。可列举从粘膜组织采取的细胞中任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。对本发明中使用的凝胶不特别限定，在以将所得的细胞片叠层化物向活体内用于移植治疗的情况下，优选由生物降解性聚合物形成的凝胶。另外，这种情况下，生物降解性聚合物部在活体内消失，从而本发明的细胞片叠层化物与活体通过血管而连接起来。对这样的生物降解性聚合物的种类不特别限定，可列举胶原、纤维蛋白、凝胶、多糖类、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、壳多糖、脱乙酰壳多糖等的单独物质、或者2种以上的混合物。可列举等。本发明利用这样所得的具 有血管网的凝胶，将其作为血管床并向在其上生着的细胞片构建血管网。即，本发明提供即使利用凝胶这样的人工物也能在细胞片内构建血管网的技术。此时，在血管床内循环的为培养基、血液、血清等，不特别限定，作为操作简便的物质可列举培养基。对于该培养基的种类不特别限定，优选适合构成在血管床上培养的细胞片的细胞的培养基。例如，如果将由心肌细胞形成的细胞片在血管床上叠层化，则优选培养心肌细胞的M199培养基等。对本发明的细胞片中使用的细胞的种类不特别限定，只要使用所得的细胞片叠层化物，并使用来自要移植的部位的细胞、或要评价的脏器或者来自组织的细胞即可。例如，在以心肌组织的再生、或者评价心肌功能的方法为目的的情况下，作为使用的细胞，可列举心肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、间充质系干细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肝组织的再生、模拟肝组织的人工肝脏的制作、或者评价肝组织的功能的方法等为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肝实质细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞、陷窝细胞、胆管上皮细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾组织的再生、模拟肾组织的人工肾脏的制作、或者评价肾功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾细胞、颗粒细胞、集合管上皮细胞、壁层上皮细胞、足细胞、系膜细胞、平滑肌细胞、尿细管细胞、中间细胞、肾小球细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾上腺组织的再生、模拟肾上腺的人工肾上腺的制作、或者评价肾上腺功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾上腺髓质细胞、肾上腺皮质细胞、球状带细胞、束状带细胞、网状带细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以皮肤的再生、或者评价皮肤功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举表皮角质形成细胞、黑素细胞、竖毛肌细胞、毛囊细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以粘膜组织的再生、或者评价粘膜组织的功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，使用从构成粘膜的组织采取的细胞即可。作为粘膜的种类，可列举颊粘膜、胃粘膜、肠管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宫粘膜等。可列举从粘膜组织采取的细胞中的任I种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。对于上述的细胞的含有比率不特别限定。此时，优选细胞片内血管内皮细胞、血管内皮前体细胞等一被混合，就在细胞片内高效地进行血管网的构建。本发明中使用的细胞可列举从活体组织直接采取的细胞、直接采取并用培养系等使其分化后的细胞、或者细胞株，对其种类没有任何限制。对这些的细胞的来源不特别限制，可列举例如，人、或者大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、猫、绵羊、猪、山羊、猴、黑猩猩或它们的免疫缺陷动物等，在将本发明的细胞片叠层化物用于人的治疗的情况下，优选使用来自人、猪、猴、黑猩猩的细胞。对本发明中所利用的细胞不特别限定，例如可以是将细胞通过试剂、蛋白质、基因等的至少I种以上方法进行荧光染色和/或色素染色而得的细胞。在利用导入了报告基因的细胞时，只要检测由报告基因表达而形成的报告蛋白产生的荧光、或报告蛋白与特异性底物反应时放出的荧光，就可以知道细胞片或细胞片叠层体的活性。对利用的报告基因、或报告蛋白质不特别限定，可列举例如，绿色荧光蛋白质(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、DsReD, β -葡糖醛酸糖苷酶、LacZ、力工于''、荧光素酶、碱性磷酸酶等。向细胞导入基因的方法只要按照常规即可，不特别限定，可列举例如，脂质体转染法、病毒载体法、磷酸钙法、电穿孔法、DEAE葡聚糖法、微注射法等。另外，可以利用这些基因导入法，也可以利用来自报告基因已经被导入宿主基因组内的基因导入动物(转基因动物)的细胞。对于调节报告基因的表达的启动子序列不特别限定，根据报告 基因表达的检测目的适宜选择即可。本发明中的细胞片可以如下得到的:在表面包覆了水合力在O 80°C的温度范围变化的聚合物的细胞培养支撑体上，在聚合物的水合力弱的温度域培养细胞，然后，将培养基变化至聚合物的水合力强的状态的温度，从而将培养的细胞剥离成片状。此时，细胞在表面包覆了水合力在O 80°C的温度范围变化的聚合物的细胞培养支撑体上，在聚合物的水合力弱的温度域被培养。该温度通常优选作为培养细胞的温度的37°C。本发明中使用的温度应答性高分子可以使均聚物、共聚物的任一者。作为这样的高分子，可列举例如，日本特开平2-211865号公报所记载的聚合物。具体例如，可通过以下单体的均聚或共聚来获得。作为可使用的单体，可列举例如，(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或乙烯基醚衍生物，在共聚物的情况下，可以使用其中任意2种以上。进而，还可以使用与除了上述单体以外的单体类的共聚物、聚合物彼此的接枝或共聚、或聚合物、共聚物的混合物。另外，在不损害聚合物本来的性质的范围内还可以进行交联。此时，由于被培养、剥离的是细胞，因而分离在5°C 50°C的范围进行，因此作为温度应答性聚合物，可列举聚-N-正丙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度21°C )、聚-N-正丙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度27V )、聚-N-异丙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度32°C )、聚-N-异丙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度430C )、聚-N-环丙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度45°C )、聚-N-乙氧基乙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约35V )、聚-N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约45°C )、聚-N-四氢糠基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约280C )、聚-N-四氢糠基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约35°C )、聚-N，N-乙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度56°C )、聚-N，N- 二乙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度32°C )等。作为用于本发明中使用的共聚的单体，可列举聚丙烯酰胺、聚-N，N-二乙基丙烯酰胺、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚丙烯酸及其盐、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚丙烯酸羟基乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、羧甲基纤维素等含水聚合物等，但不特别限制。对本发明中使用的、向上述各聚合物的基材表面的包覆方法不特别限制，可以通过例如，将基材和上述单体或聚合物通过电子线照射(EB)、Y射线照射、紫外线照射、等离子体处理、电晕处理、有机聚合反应的任一方法，或者涂布、混炼等物理性吸附等来进行。向培养基材表面的温度应答性聚合物的包覆`量可以为1.1 2.3yg/cm2的范围，优选为1.4 1.9 μ g/cm2,进一步优选为1.5 1.8 μ g/cm2。当包覆量少于1.1 μ g/cm2时，即使给予刺激也难以剥离该聚合物上的细胞，操作效率显著变差，因而不优选。相反如果为2.3 μ g/cm2以上，则细胞难以附着到该区域，使细胞充分附着变得困难。这种情况下，如果在温度应答性聚合物包覆层之上进一步包覆细胞粘附性蛋白质，则基材表面的温度应答性聚合物包覆量也可以为2.3 μ g/cm2以上，此时的温度应答性聚合物的包覆量可以为
9.0 μ g/cm2以下,优选为8.0 μ g/cm2以下,最优选7.0 μ g/cm2以下。如果温度应答性聚合物的包覆量为9.0 μ g/cm2以上，则即使在温度应答性聚合物包覆层之上进一步包覆细胞粘附性蛋白质，细胞也难以附着，因而不优选。对这样的细胞粘附性蛋白质的种类没有任何限定，可列举例如，胶原、层粘连蛋白、层粘连蛋白5、纤连蛋白、基质凝胶(Matrigel)等的单独、或者2种以上的混合物。另外，这些细胞粘附性蛋白质的包覆方法按照常规方法即可，通常采取将细胞粘附性蛋白质的水溶液涂布在基材表面，然后除去该水溶液淋洗的方法。本发明是利用温度应答性培养皿尽可能利用细胞片本身的技术。因此，温度应答性聚合物层上的细胞粘附性蛋白质的包覆量极度多是不优选的。温度应答性聚合物的包覆量、以及细胞粘附性蛋白质的包覆量的测定按照常规方法即可，可列举例如，使用FT-1R-ATR直接测量细胞附着部的方法、将预先标记化的聚合物用同样的方法固定化而通过固定化于细胞附着部的标记化聚合物量来推测的方法等，可以使用任一方法。在本发明的方法中，培养时接种的细胞数根据使用细胞的动物种不同而不同，一般可以为0.4 X IO6 2.5 X IO6个/cm2，优选为0.5 X IO6 2.1 X IO6个/cm2，进一步优选为
0.6X106 1.7X106个/cm2。接种浓度为0.4 X IO6个/cm2以下时，一般细胞的增殖差，所得的细胞片的功能的表达程度恶化，在实施本发明的方面不优选。在本发明中，为了从温度应答性基材剥离回收培养的细胞片，通过使培养的细胞附着的培养基材的温度为培养基材上的包覆聚合物的上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，而可以使其剥离。此时，可以在培养基中进行，也可以在其他等渗液中进行，可以根据目的选择。更快、更高效地剥离、回收细胞，可以单独或合并使用轻敲、摇晃基材的方法、以及使用移液器搅拌培养基的方法等。除温度以外的培养条件按照常规方法即可，不特别限制。例如，对于使用的培养基，可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培养基，另外，也可以是未添加这样的血清的无血清培养基。作为温度应答性聚合物，以聚(N-异丙基丙烯酰胺)为例来说明以上内容。聚(N-异丙基丙烯酰胺)作为在31°C具有下限临界溶解温度的聚合物被已知，在游离状态下，在水中在31°C以上的温度发生脱水合而聚合物链凝集、白浊。相反在31°C以下的温度下聚合物链水合，变成溶于水的状态。在本发明中，将该聚合物包覆、固定于培养皿等的基材表面。因此，在31°C以上的温度下，基材表面的聚合物也同样地脱水合，由于聚合物链包覆、固定于基材表面，因而基材表面显示疏水性。相反，在31°C以下的温度下，基材表面的聚合物水合，由于聚合物链被包覆、固定于基材表面，因而基材表面显不亲水性。这时的疏水表面是细胞能够附着、增殖的适度的表面，另外，亲水表面成为细胞不能附着程度的表面，培养中的细胞、或者细胞片也仅通过冷却就可以使其剥离。作为被施加了包覆 的基材，可以使用通常细胞培养中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物，以及一般能够赋予形态的物质，例如，可以使用除上述以外的聚合物化合物、陶瓷类等所有物质。对本发明中的培养基材的形状不特别限制，可列举例如在皿、多板、烧瓶、多孔膜上培养的细胞插入样形态的基材、或者平膜状的基材等。作为被施行包覆的基材，可以使用通常细胞培养中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物，以及一般能够赋予形态的物质，例如，可以使用除上述以外的高分子化合物、陶瓷类等所有物质。本发明中的细胞片在培养时不会受到由以分散酶(Dispase)、胰蛋白酶等为代表的蛋白质分解酶所产生的损伤。因此，从基材被剥离的细胞片具有粘附性蛋白质，在使细胞剥离成片状时以某种程度保持细胞-细胞间的桥粒结构。由此，可以在向血管床上装载时良好地粘附，高效生着。一般关于作为蛋白质分解酶的分散酶，已知对于细胞-细胞间的桥粒结构可以以10 40%保持的状态剥尚,但由于基本破坏了细胞-基材间的基底I旲样蛋白质等，因而所得的细胞片强度弱。与此相对，本发明的细胞片是桥粒结构、基底膜样蛋白质共同60%以上残存的状态，因而可以获得如上所示的各种效果。对于制作本发明中的细胞片的叠层体的方法不特别限定，例如，可通过将培养细胞以片状剥离，根据需要使用培养细胞移动夹具使培养细胞片彼此叠层化来获得。此时，关于培养基的温度，在包覆于培养基材表面的上述聚合物具有上限临界溶解温度的情况下，为该温度以下，另外在上述聚合物具有下限临界溶解温度的情况下，只要为该温度以上就不特别限制。但是，自不待言，培养细胞不增殖那样的低温域、或培养细胞死灭那样的高温域下培养是不合适的。除温度以外的培养条件按照常规方法即可，不特别限制。例如，对于使用的培养基，可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培养基，另外，也可以是未添加这样的血清的无血清培养基。另外，根据需要，还可以利用用于使细胞片移动的夹具。作为这样的夹具，只要能够捕捉剥离的细胞片，则对材质、形状都没有任何限定，作为这些材质，通常，聚1，1-二氟乙烯(PVDF)、硅、聚乙烯基醇、聚氨酯、纤维素及其衍生物、壳多糖、脱乙酰壳多糖、胶原、凝胶、纤维蛋白胶等材料制成膜状、多孔膜状、无纺布状、机织布状使其与细胞片接触来使用。这样通过本发明，可得到有厚度的细胞片叠层化物。未像本发明这样构建血管网的情况下，为了叠层化的细胞片继续生存，只能叠层3层左右。根据本发明，可以将细胞片4层以上叠层化。此时，对叠层化方法不特别限定，与一次叠层化细胞片相比，优选将3层以下的细胞片分多次叠层化。另外，其叠层化时间优选为与血管床联系的血管网被充分构建时。叠层化次数适宜根据细胞片叠层化物的使用目的即可，不特别过问，优选为5层以上，更优选为10层以上，进一步优选为15层以上。如果细胞片叠层化物的厚度增加，则可以显著获得本发明的效果，另外可以在被移植位置移植大量的细胞，因而优选。另外，在本发明中，通过使2片的细胞片叠层化物的顶面彼此重合，可以获得在细胞片叠层化物的上面侧和下面侧双方具有 流路的结构体，通过将该流路与活体侧连接，还可以在高效细胞片叠层物内导入营养、氧。作为其他方法，可以通过在向血管床上叠层化的细胞片上，进一步叠层设有流路的凝胶，从而得到在细胞片叠层化物的上面和下面的双方具有流路的结构体。制作的细胞片叠层化物具有在上面和下面与细胞片内部连接的血管样结构的流路。通过该流路与活体侧的血管连接，还可以在高效细胞片叠层物内导入营养、氧。在本发明中，对于该血管网的构建方法没有任何限定。此时，对在凝胶中灌注的培养基的流速不特别限定，将凝胶内的流路不被破坏的程度的流速作为最大流速，灌注的培养基向凝胶内浸出，将培养基能够到达凝胶表面的流速作为最小流速即可。作为其数值受流路的大小和/或凝胶的性质等因子较大影响，因此不能具体显示。在向血管床上叠层化的细胞片上，进一步叠层设有流路的凝胶，从而制作在上面和下面的双方具有流路的细胞片叠层化物时，还可以在细胞片叠层化物的上下的流路中改变培养基的流速而进行灌注。在细胞片叠层化物的上下的流路中改变培养基的流速而进行灌注培养的情况下，向着培养基更快地灌注的侧的流路可见血管内皮细胞游走的现象。因此，通过血管内皮细胞的游走被促进，可得到具有成熟的毛细血管网的细胞片叠层化物。由于血管内皮细胞在细胞片叠层化物的上侧和下侧的两方的流路中游走，因而还可以是将灌注的培养基的流速每一定时间上下切换的方法。灌注培养细胞片叠层化物时的温度、湿度、气氛按照培养细胞时所利用的常规即可，无任何限定。此时，在血管床上叠层化的细胞片叠层化物可以采用从形成于血管床中的凝胶的流路灌注培养基而培养的方法，也可以采用使其浸溃在充满于温度、湿度、气氛保持一定的密闭容器的培养基中浸溃而培养的方法，还可以是在浸溃于培养基的状态下从形成于血管床中的凝胶中的流路灌注培养基而培养的方法。在浸溃于培养基中的状态下，如果通过从形成于血管床中的凝胶中的流路灌注培养基方法培养，则血管床中的血管形成、和/或细胞片叠层体内的血管形成被促进，是优选的。如果一边将温度、湿度、气氛保持一定的密闭容器加压，一边培养在血管床上叠层化的细胞片叠层化物，则培养基的溶存氧浓度上升，血管形成被促进，是优选的。加压力根据容器的大小、培养的细胞片叠层化物的大小、培养基的量不同而受到各种因子较大影响，因而只要适宜最适化即可。在本发明中，可以为5mmHg以上,优选为IOmmHg以上,最优选为15mmHg 以上。作为促进细胞片叠层化物内、和细胞片叠层化物与血管床之间的毛细血管网的构建的方法，可列举在灌注于血管床的培养基、或浸溃血管床全体的培养基、或者这两方的培养基中添加促进血管新生的因子的方法。作为这里添加的因子，只要是诱导血管新生的因子即可，不特别限定。例如，血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促血管生成素、转化生长因子-β (TGF-β)、胎盘生长因子(PIGF)、ΜΜΡ、或上述因子的家族蛋白等。作为在培养基中添加的促进血管新生的因子，可以从上述中选择一种，也可以二种以上组合。在培养基中添加的促进血管新生的因子的浓度受到细胞片所含的细胞的种类、数、细胞片的大小、血管床的种类以及各种因子较大影响，因而只要适宜最适化即可，这里不能具体显示。将细胞片叠层化物进行灌注培养时的温度、湿度、气氛按照培养细胞时所利用的常规即可，无任何限定。此时，细胞片叠层化物可以从在血管床中的凝胶中形成的流路灌注培养基来培养，也可以在满足温度、湿度、气氛保持一定的密闭容器的培养容器中充满培养基，在其中浸溃来培养。作为最优选的方法，是在满足温度、湿度、气氛保持一定的密闭容器的培养容器中充满培养基，在其中一边浸溃，一边从形成于血管床中的凝胶的流路灌注培养基来培养的方法。作为在本发明所制作的细胞片叠层化物上构建成熟的血管网的方法，可列举将在凝胶的血管床上叠层化 的细胞片叠层体，从凝胶的血管床剥离，再移植到来自从包含人的动物的活体切除的活体组织片的具备血管床、皮瓣、或动脉和静脉的人工血管床上的方法。来自活体组织片的具备血管床、皮瓣、或动脉和静脉的人工血管床保有来自活体的动脉和静脉，介由这些动脉和静脉，本发明中得到的细胞片叠层化物通过毛细血管网连接，从而可获得能够移植到活体内的规定部位的细胞片叠层化物。此外，对制作来自活体的血管床的方法不特别限定，可列举将分别连接着动脉和静脉的活体组织片用电子手术刀等切开，制成活体组织片与动脉、静脉各I根连接的状态，维持该状态，在活体内留置一周左右的方法。另外，人工血管床是指构建了毛细血管网，并将毛细血管网之间用凝胶和/或细胞填充而得的血管床样结构物。对制作人工血管床的方法不特别限定，例如，在用无菌的容器内划界的区域内，内包与活体内的动脉和静脉吻合的动脉一静脉环，在划界后区域内填充凝胶，留置在活体内，从而构建毛细血管网的方法。对人工血管床所含的细胞不特别限定，可根据移植的部位、用途适宜选择。可以将本发明所得的细胞片叠层化物移植到活体内的规定部位。对其方法不特别限制，可列举将设置在本发明的细胞片叠层化物中的流路与活体侧的血管连接的方法、使细胞片叠层化物表面向活体附着的方法等，此时，也可以在移植部位预先进行血管诱导，不特别限定。这里，对施行血管诱导的方法也不特别限定，可列举例如:将作为血管增殖因子的FGF包埋于微球，一边改变该微球的组成、大小、注入范围，一边对活体作用8 10天的方法；将聚对苯二甲酸乙二醇酯筛网切割成任意大小，制成袋状，在该袋的内侧加入溶解于高浓度琼脂糖溶液的FGF，8 10天后，除去该袋，从而制作血管诱导的空间的方法等。如果对人利用本发明的细胞片叠层体，则移植的细胞片叠层体在人的活体内长时间表达功能。而且，可以通过剥离的细胞片叠层体的大小、形状、或者两者来控制功能的表达量。这样的细胞片叠层体,例如如果构成的细胞为心肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、间充质系干细胞，则可以用于伴有选自心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、月巴厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病和扩张型心肌病中的疾患或障害的各疾患的治疗，可根据使用的细胞种不同而适宜特定移植位置，不特别限定。如果对动物移植本发明的细胞片及其三维结构体，则可制成药物评价用动物。并且，可以通过剥离的细胞片叠层体的大小和/或形状来控制功能的表达量。这里使用的动物可列举大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、猪、黑猩猩或它们的免疫缺陷动物等，不特别限定。这样的移植动物，例如，可以将被检物质施与该动物，用于判定该被检物质对心功能的影响的心功能评价系统等，不特别限定。
实施例以下，基于实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例任何限制。实施例1(心肌细胞片的制作方法)本实验使用从出生后O天的SD系大鼠的心脏分离培养的心肌细胞。从仔大鼠摘出心脏后，使用作为分解组织主要构成要素胶原的酶的II型胶原酶(Worthington社制)，分离心肌细胞。将分离的心肌细胞以320X IO4细胞/皿的浓度接种于温度应答性培养皿(Φ 35mm、Dish Upcell Type-E (CellSeed社制))。4天后,心肌细胞在培养皿表面形成汇合状态，使温度下降到20°C，从而回收片状的心肌细胞群。在本实验中，使用通过移液器叠层为3层的组织。(设有流路的凝胶的制作方法)如图1所示，在丙烯酸系框中设置不锈钢丝，向该框内注入胶原凝胶溶液使其固化而凝胶化。然后，取出不锈钢丝，得到具有微流路的凝胶。说明使用相当于图1的E的装置的图片和该装置在细胞片内构建血管网的方法的示意图示于图2。图3显示通过胶原凝胶形成流路的图。另外，用于向此物中灌注培养基的装置概要的示意图(左)和装置的一例的图片(右)示于图4。图4(左)所示的箭头表示培养基流动的方向。(胶原凝胶上的细胞片的叠层化)使细胞片多叠层而粘附于胶原凝胶。作为具体的方法，使培养皿上浮游2 6层心肌细胞片，用Pipet-Aid使培养基出入而在培养皿上一次堆积之后,温育30分钟而使其粘附一体化。然后，粘附在胶原凝胶上。在图5(右)所示的灌注培养生物反应器中，一边将叠层化于血管床的细胞片叠层化物浸溃在培养基中，一边从流路灌注培养基而进行培养。(细胞片与胶原凝胶血管床之间的血管新生)
在血管床上灌注培养细胞片，则从大鼠的心脏分离的细胞中所含的血管内皮细胞向流路游走，在血管床与细胞片的之间形成毛细血管网(图5A)。在流路中注入丙烯酸系树脂使其固化，从而观察新生的血管的样子。其结果可知，在血管床与细胞片之间形成了无数的毛细血管网(图5B)。(胶原凝胶血管床上细胞片的加压灌注培养法)随着细胞片的叠层化片数的增加，细胞代谢所需的氧量也增加。于是，为了增加灌注培养的溶存氧量，在设置血管床的密闭容器中增加具备加压机构的装置，在上述方法的基础上进行加压灌注培养。在以20mmHg加压的情况下，与不加压培养时相比，培养基中的溶存氧量也增加，细胞片内的血管网构建以及血管床与细胞片叠层化物之间的血管网形成被促进(数据未显示)。在以后的实验中，以20mmHg的加压培养进行实验。(一次叠层化的方法)在胶原凝胶血管床上将细胞片灌注培养5天后，从灌注装置卸下带有叠层心肌细胞片的胶原凝胶，用4%低聚甲醛进行组织固定后，用石蜡切成切片。将石蜡切片通过HE染色观察而得的各层的剖面的图像示于图5(A)。图5的(A)中显示的黑色箭头表示细胞片所含的血管内皮细胞向凝胶的血管床中的流路游走而形成的毛细血管。图5(B)显示在凝胶的流路中注入丙烯酸系树脂使其固化，然后除去凝胶和细胞片而得的图。各层的组织的厚度的测定方法为将HE染色图像2值化而测定10处的厚度。其结果是，2层、3层的厚度与叠层数成比例地厚度增加，但4层以上则组织厚不增加、无厚度变化。测定值为I层:约7 μ m、2层:约18 μ m、3层:约24 μ m、4层:约23 μ m、5层:约26 μ m、6层:约23 μ m这样的结果。即，到3层位置与叠层数成比例地组织的厚度增加，但3层以上叠层的组织厚全部与3层的厚度基本同样(图6A)。认为其原因是，依靠细胞片内的扩散的氧及营养的供给、老废物的除去仅能到达3层，第4层以上的细胞片坏死。(多阶段的叠层化方法)因此，考察了通过胶原凝胶内人工流路和细胞片来血管网，然后进行反复叠层。初代培养心肌细胞片中除了心肌细胞以外还含有成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞，因而期待细胞片内具有血管并且一进行凝胶培养就进行血管新生。因此，考虑在胶原凝胶内制作灌注培养基的流路，在该胶原凝胶流路上培养初代培养心肌细胞片，则如果从细胞片新生血管而与人工流路连接，则即使在厚的组织中也能给心肌细胞供给新鲜的培养基。于是构建了供给的血管，然后反复进行细胞片的叠层。通过上述实验，参照灌注培养时I次叠层的极限数为3层的事实，和人工流路与细胞片之间血管网构建连接需要5天的事实反复进行了实验。其结果示于图6B。具体地，进行了以5天的间隔叠层数以3片以内累加下去的方法。这次，观察:(I) 3层+3层:6层计10天培养而得的组织、(2) 3层+ 3层+ 2层:8层计15天培养而得的组织、以及(3) 3层+ 3层+ 3层:9层计15天灌注培养而得的组织，与单次叠层(3层、5天)的组织相比，厚度怎样变化。培养后，样 本用4%低聚甲醛固定，将石蜡切片用HE染色。将染色的各组织示于图7。3层+3层+3层以5天的间隔设置培养时间，进行计15天的反复叠层。其结果观察到78±11μπι的厚度。而且，将3层+3层+3层经15天进行灌注培养的结果是9层无坏死，维持了 115±10μπι的厚度。该厚度超过由从表面的扩散实现的氧及营养的供给厚度，因而显示构建血管而向上部供给培养基然后反复进行细胞片叠层的方法的有效性。显示如果使用本实验的培养装置，则构建可移植的组织构建是可能的。实施例2(设有流路的凝胶的制作方法)如图8所示，制作以在细胞片叠层化物的上下制作流路的方式设计的血管床形成容器。在丙烯酸系框中设置不锈钢丝，向该框内注入胶原凝胶溶液使其固化而凝胶化，取出下部的不锈钢丝，得到具有微流路的凝胶。然后，通过实施例1的方法将3层心肌细胞片叠层化。然后，在细胞片叠层化物的上部设置不锈钢丝，向该框内注入胶原凝胶溶液使其凝胶化，取出上部的不锈钢丝，在上部的流路中也制作流路。本实验中，以下部的流路的流速为500 μ L/分钟(图8 (左)、微流路Α)、上部的流路的流速为250 μ L/分钟(图8 (左)、微流路B)进行培养，在图4的生物反应器中进行5天的灌注培养。灌注培养后，为了确认细胞片内的毛细血管网与血管床的流路是否连接，从下部的流路灌注血液(图9Α)。其结果可知，细胞片的上部的颜色变化，在凝胶与细胞片叠层化物的之间形成了流路。进而，确认上下的流路的形成的血管样结构(图9Β)。其结果可知，血管内皮细胞向着流速快的下部的流路游走而形成血管网(图9Β)。在将细胞片叠层化物的上下的流速与上述相反的情况下，血管内皮细胞向着流速快的上部的流路游走。由此启示，利用血管内皮细胞的血管网构建受培养基的流速这样的物理特性影响而构建血管网。进而其实，如果细胞片与流路之间的距离为100 μ m以内，则血管内皮细胞有效地游走,从而构建血管样组织。(细胞片叠层化物的血管新生模型)图10是显示使用血管床制作细胞片叠层化物时所诱导的血管网的构建的概要的图。血管内皮细胞从安放于胶原凝胶上的细胞片(图10A)向着流路游走(图10B)，血管内皮细胞覆盖流路的内壁，形成管腔结构(图10C)。然后，进一步在上层移植细胞片叠层体(图10D)，则与凝胶流路连接的管腔结构、与新叠层化的细胞片内的血管内皮细胞连接，进行血管形成(图10E)。可以通过 重复该过程来制作有厚度的细胞片叠层物(图10E)。产业可利用性根据本发明所示的制造方法，在细胞片内构建血管网，将该细胞片叠层化，则可以简便地制作有厚度的细胞片叠层化物。这样的有厚度的细胞片叠层化物作为活体内组织样的物质，在各种组织的再生医疗中是有用的。
权利要求
1.胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，在凝胶内部设置用于灌注培养基的流路，诱导血管内皮细胞，制作在凝胶内构建了血管网的血管床，通过向该血管床上叠层细胞片，从而在细胞片内构建血管网。
2.根据权利要求1所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，在凝胶内构建血管网的方法，是使包含血管内皮细胞的细胞片附着于凝胶表面的方法。
3.根据权利要求1或2所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，凝胶是生物降解性聚合物和/或细胞。
4.根据权利要求3所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，生物降解性聚合物是胶原凝胶和/或纤维蛋白凝胶。
5.根据权利要求1 4的任I项所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，在能够将温度、气氛保持一定的密闭容器的培养基中，浸溃叠层化了细胞片的血管床。
6.根据权利要求5所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，对密闭容器内部进行加压。
7.根据权利要求1 6的任I项所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，培养基包含促进血管新生的因子，是提高毛细血管密度的培养基。
8.根据权利要求1 7的任I项所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，细胞片是将如下培养后的细胞以片状剥离而得的:在表面包覆有水合力在O 80°C的温度范围变化的聚合物的细胞培养支撑体上，在 聚合物的水合力弱的温度域培养细胞，然后，使培养基变化到聚合物的水合力强的状态的温度培养细胞。
9.根据权利要求1 8的任I项所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，水合力在O 80°C的温度范围变化的聚合物是聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
10.根据权利要求1 9的任I项所述的细胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，使2片细胞片叠层化物的顶面彼此重合。
11.根据权利要求1 10的任I项所述的细胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，在向血管床上叠层化的细胞片上，进一步叠层设有流路的凝胶。
12.根据权利要求11所述的细胞片叠层化物的制造方法，其中，在细胞片叠层化物的上下的流路中，灌注的培养基的流速不同。
13.有血管网的细胞片叠层化物，其是由权利要求1 12的制造方法得到的。
14.根据权利要求13所述的细胞片叠层化物，其中，细胞片被叠层化的次数为4以上。
15.根据权利要求13或14所述的细胞片叠层化物，其中，细胞是心肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞和间充质系干细胞中的任I种，或者2种以上的细胞混合而成的混合物。
16.根据权利要求15所述的细胞片叠层化物，其中，包含血管内皮细胞。
17.根据权利要求13 16的任I项所述的细胞片叠层化物的利用方法，其特征在于，将所得的细胞片叠层化物向活体内移植。
18.根据权利要求17所述的细胞片叠层化物的利用方法，其目的是向心肌组织移植，治疗选自心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病和扩张型心肌病中的至少I种心脏疾患或障害。
全文摘要
灌注灌注一种细胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，制作从设置在凝胶内部的用于灌注培养基的流路向表面构建了血管网的血管床，通过向该血管床上叠层细胞片，而在细胞片内构建血管网。根据制造方法，可以在细胞片内构建血管网，如果将该细胞片叠层化，则可以简便地制作有厚度的细胞片叠层化物。这样的有厚度的细胞片叠层化物作为活体内组织样的物质，在各种组织的再生医疗中是有用的。
文档编号A61K35/34GK103097518SQ201180044349
公开日2013年5月8日 申请日期2011年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者坂口胜久, 清水达也, 关根秀一, 梅津光生, 冈野光夫 申请人:学校法人东京女子医科大学