结合肌肉生长抑制素的抗体、组合物和方法

专利名称：结合肌肉生长抑制素的抗体、组合物和方法
技术领域：
本申请一般而言涉及肌肉生长抑制素及与其结合的蛋白质。特别地，本发明涉及肌肉生长抑制素抑制剂及其用途。
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背景技术：
也被称为肌肉生长抑制素的生长/分化因子8(⑶F-8)是TGF-β家族成员，其大部分在发育中的和成人骨骼肌组织的细胞中表达。肌肉生长抑制素看起来在对骨骼肌生长的负控制中发挥关键作用(McPherron等,Nature (London) 387,83-90 (1997))。肌肉生长抑制素基因中的突变已被展示于多个物种中，包括牛、猪、狗和人，并且已导致产生增加的肌肉组织(Kocamis 和 Killefer,Domestic Animal Endocrinology 23:447 ;2002)。此外，已显示，拮抗肌肉生长抑制素能在动物中增加瘦肌肉的质量(McFerron等,见上文；Zimmers等，Science 296:1486(2002))。已在人临床试验中评估了肌肉生长抑制素拮抗剂。在具有多种形式的肌营养不良症的患者中评估了被称为MY0-29的人抗体。使用该肌肉生长抑制素拮抗剂的早期临床结果展示出良好的安全性和耐受性，而在肌肉强度或功能方面没有显著的改善(但该研究没有被推动以展示疗效)；在有限数量的受试者中注意到趋向于肌肉尺寸增加的趋势(Wagner等，Ann.Neurol.63:561 ;2008)。在随后的报道中，经治疗的患者中总的定量肌肉强度测量没有改善，但是若干患者显示出单根肌纤维收缩特性的改善(Krivickas等，Muscle Nerv.39:3 ；2009)。

人们相信，对肌肉生长抑制素途径的调控需要将潜在肌肉生长抑制素复合体加工为成熟肌肉生长抑制素。潜在复合体是切割的前肽结构域形成的，其与成熟C-末端二聚体非共价连结并且没有生物活性。认为组织特异性因子负责将无活性复合体转化为生物活性形式。肌肉生长抑制素还与卵泡抑素相关基因(FLRG)和生长及分化相关的因子相关的血清蛋白-1(GASP-1)形成复合体，这两种复合体均已在血清中被鉴定。成熟的肌肉生长抑制素以高亲和性与活性IIB型受体(ActRIIB)结合，并以较低的亲和性与激活素(activin)受体(ActRIIA)结合。细胞内信号传递通过二聚肌肉生长抑制素与ActRIIB的结合接着募集低亲和性I型受体(激活素样激酶4(ALK4)或激活素样激酶5(ALK5))而启动。I型受体的磷酸化导致负责肌肉生长抑制素生物作用的细胞内信号传递途径的启动。肌肉生长抑制素拮抗剂的体内利用已不仅被牵连于肌肉生长抑制素途径的调控和信号传递本质，还被牵连于肌肉生长抑制素与生长和分化因子IlteDF-1l ;也被称为骨形态形成蛋白11或BMP-11)的高度相似性，该因子在活性结构域中在氨基酸水平上与肌肉生长抑制素90 %相同。虽然在信号传递机制中的高度序列同一性和相似性暗示肌肉生长抑制素和⑶F-1I共享某些功能，但对这两种TGF-β家族成员的靶向基因破坏却显示非常不同的结果。肌肉生长抑制素敲除小鼠显示肌纤维的增生和肥大，而GDF-1l敲除小鼠则在出生后很快死亡并且具有大量的异常；双敲除动物显示在单敲除小鼠中未观察到的额外异常(McPherron 等，BMC Dev Biol.9:24 ；2009)。因此，本领域中仍需要结合肌肉生长抑制素并且拮抗其活性、同时消除或最小化抑制其和相关途径的不利作用的试剂。附图简述

图1描述了给予肌肉生长抑制素抑制剂(抗肌肉生长抑制素抗体12Α5-5，实心菱形)的小鼠与对照(PBS ;空心圆)相比的总体重，如实施例4所示。图2展示了通过核磁共振(NMR)测定的第4周的瘦体质量的改变。图3展示了具有指定的分子内和分子间二硫键的成熟形式的人肌肉生长抑制素的氨基酸序列。二硫键Cysl5-Cys74、Cys43_Cysl06和Cys47_Cysl08形成胱氨酸结(knot)结构。图4描述了肽G —级结构，其显示二硫键将四个LycC肽连接到一起形成胱氨酸结，另一个二硫键将两个55-78序列在Cys73连接到一起。肽G显示与抗体结合。图5展示了肽N—级结构，其显示二硫键将四个糜蛋白酶肽连接到一起形成胱氨酸结，另一个二硫键将两个63-82序列在Cys73连接到一起。肽N不结合抗体。图6代表了针对非还原和TCEP还原肽样品的BIAcore 竞争检验的结果。肽A、C、E、G、0和P全部能结合抗体12A5-5由此防止12A5-5结合成熟肌肉生长抑制素。测试的其他肽(包括来自肽G和肽N的TC EP还原的那些，胱氨酸结糜蛋白酶肽)均不显示与抗体
彡口口 、图7描述了针对肽A、C、E和G以及肌肉生长抑制素的直接BIAcore 结合检验的结果。图8代表了源于肌肉生长抑制素/卵泡抑素复合体的共结晶结构的肌肉生长抑制素二聚体和单体的结构(Cash等，见下文)。示出了参与二硫键的Cys残基，以及被认为对于12A5-5的结合来说重要的区域中的另外的氨基酸残基(以阴影长菱形示出)。

发明内容
本发明提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其以小于IOOpM的Kd结合肌肉生长抑制素。在一种实施方式中，本发明提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其以小于IOOpM的Kd结合肌肉生长抑制素并且以高于IOnM的Kd结合⑶F-1I。在另一实施方式中，本发明提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其以是其对GDF-1l的亲和性至少5000倍高的亲和性结合肌肉生长抑制素。在又一实施方式中，本发明提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其展示出针对肌肉生长抑制素的选择性，该选择性是针对⑶F-1I的至少5000倍高。在本发明的一个方面，提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其结合肌肉生长抑制素并且阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互作用。在另一方面，提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其结合肌肉生长抑制素并阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互作用但是与肌肉生长抑制素/ActRIIA复合体和/或肌肉生长抑制素/ActRIIB复合体共结合。在本发明的另一方面，提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其结合肌肉生长抑制素，其中肌肉生长抑制素中对于肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的结合所需的两个区域位于成熟肌肉生长抑制素(SEQ ID NO:25)的第21至31位和第50至60位附近的序列。还提供了一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，其与肌肉生长抑制素中位于成熟肌肉生长抑制素的第21至31位和第50至60位附近的序列的两个区域相互作用，以防止这些区域内肽键的糜蛋白酶切割。在本发明的一种实施方式中，肌肉生长抑制素特异性拮抗剂是包含至少一条轻链和至少一条重链的抗体，其中轻链包含恒定区和含有三个互补性决定区(CDRs)的可变区，并且重链包含恒定区和含有三个互补性决定区(⑶Rs)的可变区。该实施方式可并入本发明的前述实施方式和/或方面中的一种或多种。在某些实施方式中，重链和轻链CDRs的序列是如本文中所公开的。 在一种实施方式中，轻链⑶Rs是SEQ ID NO:10中公开的那些，并且重链⑶Rs是SEQ ID NO:20中公开的那些。在另一实施方式中，轻链⑶Rs选自SEQID NO:1中公开的轻链CDRs、SEQ ID NO:2中公开的轻链CDRs、SEQ ID NO:3中公开的轻链 CDRs、SEQ ID NO:4 中公开的轻链 CDRs、SEQ ID NO:5 中公开的轻链 CDRs、SEQ ID NO:6中公开的轻链CDRs、SEQ ID NQ:7中公开的轻链CDRs、SEQ ID NO:8中公开的轻链CDRs和SEQ ID NO:9中公开的轻链CDRs构成的组；以及重链CDRs选自SEQ ID N0:11中公开的重链CDRs、SEQ ID NO:12中公开的重链CDRs、SEQ ID NO:13中公开的重链CDRs、SEQ IDNO:14中公开的重链CDRs、SEQ ID NO: 15中公开的重链CDRs、SEQ ID NO:16中公开的重链CDRs、SEQ ID NO:17 中公开的重链 CDRs、SEQ ID NO:18 中公开的重链 CDRs 和 SEQ ID NO:19中公开的重链⑶Rs构成的组。在某些实施方式中，重链可变区和轻链可变区的序列是如本文所公开的。在一种实施方式中，轻链可变区包含SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列，重链可变区包含SEQ IDNO:20中示出的氨基酸序列。在另一实施方式中，轻链可变区选自SEQ ID NO:1中公开的轻链可变区、SEQ ID NO:2中公开的轻链可变区、SEQ ID NO:3中公开的轻链可变区、SEQID NO:4中公开的轻链可变区、SEQ ID NO:5中公开的轻链可变区、SEQ ID NO:6中公开的轻链可变区、SEQ ID NO:7中公开的轻链可变区、SEQ ID NO:8中公开的轻链可变区和SEQID NO:9中公开的轻链可变区构成的组，并且重链可变区选自SEQ ID NO:11中公开的重链可变区、SEQ ID NO:12中公开的重链可变区、SEQ ID NO:13中公开的重链可变区、SEQ IDNO:14中公开的重链可变区、SEQ ID NO: 15中公开的重链可变区、SEQ ID NO:16中公开的重链可变区、SEQ ID NO:17中公开的重链可变区、SEQ ID NO:18中公开的重链可变区和SEQ ID NO:19中公开的重链可变区构成的组。还提供了前述抗体的变体。在一种实施方式中，变体抗体与抗体之一(例如抗体12A5-5)90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同。在另一实施方式中，变体抗体与前述抗体(例如12A5-5)在一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸残基处不同(通过氨基酸的取代或缺失)。在另一实施方式中，一个(或多个)氨基酸被翻译后修饰(例如通过环化或转化为另外的氨基酸；和/或通过脱酰胺化、异构化、糖化和/或氧化)。在本发明的又一方面，抗体轻链恒定区选自K和λ轻链构成的组，并且重链恒定区选自μ、δ、Υ、α和ε重链恒定区构成的组。又一实施方式提供了一种抗体，所述抗体属于选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4构成的组的亚类。应当理解，本发明的这些方面可同等应用于之前描述的方面和实施方式。本发明还提供了编码任何前述肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的分离的核酸、以及包含此类核酸的载体、用此类载体转染或转化的分离的宿主细胞和用于生产肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的方法，所述方法包括在促进表达的条件下培养此类宿主细胞以及从培养基中回收肌肉生长抑制素特异性拮抗剂。还提供了包含前文描述的肌肉生长抑制素特异性拮抗剂和生理上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂的组合物，以及抑制肌肉生长抑制素的至少一种活性的方法，所述方法包括将此类组合物施用至个体使得肌肉生长抑制素的至少一种活性被部分或完全抑制。在本发明的另外一些实施方式中，个体患有选自下述病况构成的组的病况:性功能减退(包括雄激素剥夺疗法导致的性功能减退，和年龄相关的性腺机能减少导致的性功能减退)，恶病质；心源性恶病质；肾源性恶病质，心脏萎缩；心发育不良；心衰(heatfailure);肌肉减少症；外伤性骨折；骨质疏松性骨折；骨损失(例如骨质疏松症或骨质减少)；阿狄森氏病；肌萎缩性侧索硬化或运动神经元病(ALS ;MND ;卢格里格病)；贝尔麻痹(和/或面部神经问题)；肉毒杆菌中毒；脑性麻痹；进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)和其它外周神经病；库欣综合征；糖尿病性神经病；格林-巴利综合征；多发性硬化；肌萎缩(包括进行性肌萎缩和脊髓性肌萎缩)；肌营养不良症(其有多种形式；包括Becker型肌营养不良，先天性肌营养不良，Duchenne型肌营养不良，远端型肌营养不良，Emery-Dreifuss型肌营养不良，面肩肱型肌营养不良症，肢带型肌营养不良症，强直性肌营养不良症，眼咽型肌营养不良，脊髓性肌萎缩，Brown-Vialetto-Van Laere 综合征(BVVL)、Fazio-Londe (FL)综合征和特征在于进行性骨骼肌无力的其它综合征，肌肉蛋白质中的缺陷，以及肌肉细胞和组织的死亡)；重症肌无力；脊髓灰质炎；多肌炎；肌肉、肌腱和/或韧带的扭伤和拉伤；中风(和其他导致肌肉消耗的病况，例如长期不活动或卧床，肢固定(例如通过打石膏和/或上夹板)和太空飞行)；和可通过生长激素、胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、生长激素促分泌素和与激素-1GF-1轴相关的其他试剂治疗的病况。

发明详沭本发明提供了与和肌肉生长抑制素结合(例如抗肌肉生长抑制素抗体、抗体片段和抗体衍生物)并且至少抑制肌肉生长抑制素的生物活性的分子相关的组合物、试剂盒和方法。在本文中使用时，术语“肌肉生长抑制素拮抗剂”与“肌肉生长抑制素抑制剂”可互换使用。根据本发明的肌肉生长抑制素拮抗剂抑制或阻碍肌肉生长抑制素的至少一种活性，或者，阻碍肌肉生长抑制素或其受体的表达。可实现对肌肉生长抑制素活性的抑制或阻碍，例如通过利用一种或多种干扰肌肉生长抑制素与其受体的结合和/或阻碍肌肉生长抑制素与其受体的结合导致的信号传导的抑制性试剂来实现。拮抗剂包括与肌肉生长抑制素自身结合的试剂，或者与肌肉生长抑制素受体结合的试剂。例如，肌肉生长抑制素拮抗剂包括但不限于:卵泡抑素、肌肉生长抑制素前结构域(prodomain)、生长和分化因子Il(GDF-1l)前结构域、前结构域融合蛋白质、与肌肉生长抑制素结合的拮抗性抗体、与激活素IIB型受体结合的拮抗性抗体或抗体片段、可溶性激活素IIB型受体、可溶性激活素IIB型受体融合蛋白质、可溶性肌肉生长抑制素类似物(可溶性配体)、寡核苷酸、小分子、肽性模拟物和肌肉生长抑制素结合试剂。这些在下文中被更详细地描述。本发明还提供了包含编码与肌肉生长抑制素结合的多肽的全部或部分的核苷酸序列的核酸及其衍生物和片段，例如，编码抗肌肉生长抑制素抗体、抗体片段或抗体衍生物的全部或部分的核酸；包含此类核酸的质粒和载体，以及包含此类核酸和/或载体和质粒的细胞或细胞系。提供的方法包括，例如，制造、鉴定或分离与肌肉生长抑制素结合的分子(例如抗肌肉生长抑制素抗体)的方法，测定分子是否与肌肉生长抑制素结合的方法，制造包含与肌肉生长抑制素结合的分子组合物例如药物组合物的方法，以及用于将结合肌肉生长抑制素的分子施用至受试者的方法，例如，用于治疗由肌肉生长抑制素介导的病况或用于体内或体外拮抗(或抑制)肌肉生长抑制素的生物活性的方法。肌肉生长抑制素的一种此类生物活性是与肌肉生长抑制素受体的结合；另一种此类活性是对骨骼肌生长的负调控。使用标准的单字母或三字母缩写来示出多核苷酸和多肽序列。除非另有指明，每条多肽序列具有左边的氨基末端和右边的羧基末端；每条单链核酸序列以及每条双链核酸序列的第一链(top strand)在左边具有5’末端以及在右边具有3’末端。还可通过解释与参照序列有何不同来描述特定的多肽或多核苷酸序列。除非另有指明，用于本发明的科学和技术术语将具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语将包括多数，并且复数术语将包括单数。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学和杂交相关使用的命名法和技术是本领域中公知和常用的那些。

除非另有指明，本发明的方法和技术通常是根据本领域中公知的常规方法进行的，并且如在本申请文件中通篇提到和讨论的多篇一般性和更具体的参考文献所述。见例如 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)，和 Harlow 和Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor7N.Y.(1990),其通过引用并入本文。酶反应和纯化技术按照厂商说明、如本领域通常进行的那样或如本文所述来进行。本文所述的与分析化学、合成有机化学和医药和制药化学相关使用的术语是本领域公知和常用的那些。可使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配方和递送以及对患者的治疗。除非另有指明，下述术语应当被理解为具有下述含义。术语“分离的分子”(其中分子例如是多肽、多核苷酸或抗体)是由于其来源或衍生的来源而(I)不与在其天然状态下伴随其的天然连结的组分连结，(2)基本上不含来自相同物种的其它分子，(3)通过来自不同物种的分子表达或(4)没有人工干预时在自然界不存在的分子。因此，化学合成的、或在不同于其天然来源的细胞的细胞体系中合成的分子将是与其天然连结的组分分离的。还可使用本领域公知的纯化技术通过分离而是分子基本上不含天然连结的组分。可通过本领域公知的多种手段来检验分子纯度或同质性(homogeneity)。例如,可使用本领域公知的技术,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳以及对凝胶染色以观察多肽，来检验多肽样品的纯度。就某些目的而言，可通过使用HPLC或本领域公知用于纯化的其它手段来提供更高的分辨力。术语“肌肉生长抑制素抑制剂”和“肌肉生长抑制素拮抗剂”可互换使用。每种均为可检测到抑制肌肉生长抑制素的至少一种功能的分子。相反，“肌肉生长抑制素激动剂”是可检测到增加肌肉生长抑制素的至少一种功能的分子。肌肉生长抑制素抑制剂导致的抑制无须是完全的，只要其可检测到即可，例如通过使用检验来检测。可使用对肌肉生长抑制素功能的任何检验，其例子提供于本文。可被肌肉生长抑制素抑制剂抑制(或可被肌肉生长抑制素激动剂增加)的肌肉生长抑制素的功能的例子包括与肌肉生长抑制素受体(或表达此类受体的细胞)的结合，和对骨骼肌生长的负调控。肌肉生长抑制素抑制剂和肌肉生长抑制素激动剂的类型的例子包括但不限于:肌肉生长抑制素结合多肽，例如抗原结合蛋白质(例如肌肉生长抑制素抗原结合蛋白质)、抗体、抗体片段和抗体衍生物。术语“肽”、 “多肽”和“蛋白质”均表示包含通过肽键互相相连的两个或多个氨基酸残基的分子。这些数据包括例如天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(例如突变蛋白质、变体和融合蛋白质)以及经翻译后修饰或共价修饰或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是单体或聚合的。术语“多肽片段”在本文中使用时表示较之相应的全长蛋白质具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。片段可以例如为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150 或 200 个氨基酸长。片段还可以例如至多 1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11 或 10 个氨基酸长。片段还可在其末
端之一或两者处包含一个或多个额外的氨基酸，例如，来自不同的天然存在的蛋白质的氨基酸序列(例如Fe或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列(例如人工接头序列或标签蛋白质)。本发明的多肽包括已经以任何方式及因任何理由而被修饰的多肽，例如，以(I)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变亲和性以形成蛋白质复合体，⑷改变结合亲和性，和⑷赋予或修饰其它物理化学性质或功能性质。类似物包括多肽的突变蛋白质。例如，可在天然存在的序列中(例如在形成分子间接触的结构域之外的多肽的部分中)制造单个或多个氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。可使用共有序列来选择氨基酸残基以进行取代；本领域技术人员知道还可取代额外的氨基酸残基。“保守氨基酸取代”是基本上不改变亲本序列的结构特征的取代(例如，替代氨基酸不应趋向于打破亲本序列中存在的螺旋或破坏表征亲本序列或对其功能性来说是必要的其它类型的二级结构)。本领域认可的多肽二级结构和三级结构的例子被描述于Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., ff.H.Freeman andCompany,New York(1984)) !Introduction to Protein Structure(C.Branden和 J.Tooze,eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991))和 Thornton et at.Nature 354:105(1991)中，它们通过引用并入本文。本发明还提供了肌肉生长抑制素结合多肽的非肽类似物。非肽类似物通常作为具有与那些模板肽类似的性质的药品用于药物工业。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物(peptide mimetics) ” 或“肽性模拟物(peptidomimetics) ”，见例如 Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29 (1986) ；Veber and Freidinger TINS ρ.392 (1985)和 Evans etal.J.Med.Chem.30:1229 (1987)，它们通过引用并入本文。与治疗上有用的肽结构相似的肽模拟物可用于产生等同的治疗或预防效果。通常，肽性模拟物与模本(paradigm)多肽(即，具有想要的生物化学性质或药理学活性的多肽)例如人抗体结构上相似，但具有通过本领域公知的方法任选被选自一CH2NH—、一CH2S—、一CH2—CH2—、一CH = CH-(顺和反)、一COCH2—、-CH(OH)CH2-和--CH2SO-构成的组的连接替换的一个或多个肽连接。用相同类型的D-氨基酸对共有序列中一个或多个氨基酸进行系统性取代(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)也可用于产生更稳定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变化的受限肽(constrained peptides)可通过本领域已知的方法来产生(Rizo andGierasch Ann.Rev.Biochem.61:387 (1992),通过引用并入本文)，例如通过添加能形成使肽环化的分子间二硫键的内部半胱氨酸残基来产生。多肽(例如抗体)的“变体”包含下述氨基酸序列，其中相对于另外的多肽序列，一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列、从氨基酸序列缺失和/或取代进氨基酸序列。本发明的变体包括融合蛋白质。

多肽的“衍生物”是已经化学修饰的多肽(抗体)，例如通过与另外的化学基元(例如，聚乙二醇或清蛋白，例如人血清清蛋白)缀合、磷酸化和/或糖基化。除非另有指明，术语“抗体”除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体之外还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白质，它们的例子在下文中描述。“抗原结合蛋白质”是包含与抗原结合的部分以及任选地以允许抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白质与抗原结合的构象的骨架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白质的例子包括抗体、抗体片段(例如抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白质可包含例如具有移植的CDRs或CDR衍生物的备选的蛋白质骨架或人工骨架。此类骨架包括但不限于，包含引入其中的突变例如用于稳定抗原结合蛋白质的三维结构的抗体衍生骨架，以及完全合成的、包含例如生物相容聚合物的骨架。见例如Korndorfer等，2003,Proteins !Structure,Function,and Bioinformatics,Volume 53,Issuel:121-129;Roque 等，2004，Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可使用肽抗体模拟物(“PAMs”)以及基于抗体模拟物的骨架，其利用纤连蛋白组分作为骨架。抗原结合蛋白质可具有例如天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”(大约25kDa)链和一条“重”链(大约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括大约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分界定主要负责效应器功能的恒定区。人轻链被分类为K或λ轻链。人重链被分类为μ、δ、γ、α或ε ,并且将抗体的同种型分别界定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG抗体在人类中可进一步分入四个亚类(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过大约12个或更多个氨基酸的“J”区相连，重链还包括大约10或更多个氨基酸的“D”区。一般参见 Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, ff.，ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.(1989))(就所有目的而言，其整体通过引用并入)。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，从而完整免疫球蛋白具有两个结合位点。天然存在的免疫球蛋白链的可变区展现相同的一般结构的相对保守的框架区(FR)，它们通过三个也成为互补性决定区或CDRs的高度可变区相连。从N-末端到C-末端，轻链和重链包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配是按照 Kabat 等人在 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd., US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication n0.91-3242，1991中的定义来进行的。用于免疫球蛋白链中的氨基酸的其他编号系统包括頂GT (国际 ImMunoGeneTics 信息系统；Lefranc 等，Dev.Comp.1mmunol.29: 185-203 ；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun, J.Mol.Biol.309(3):657-670 ;2001)。可从含有具有变化的抗原特异性的免疫球蛋白的来源例如血清或血浆中获得抗体。如果此类抗体经历亲和纯化，它们可针对特定的抗原特异性而富集。抗体的此类富集制剂通常由少于大约10%的具有针对特定抗原的特异性结合活性的抗体制成。将这些制剂进行若干轮的亲和纯化可增加具有针对抗原的特异性结合活性的抗体的比例。以这种方式制备的抗体通常被称为“单特异性”。单特异性抗体制剂可由大约
50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或 99.9% 的具有针对特定抗原的
特异性结合活性的抗体制成。除非另有指明，“抗体”表示完整免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整抗体来产生。抗原结合部分包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fb、结构域抗体(dAbs)和互补性决定区(OTR)片段、可变区片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双链抗体(diabodies)、三链抗体、四链抗体和至少含有免疫球蛋白的足以赋予针对多肽的特异性抗原结合的部分的多肽等等。Fab片段是具有'、VH、(^和ChI结构域的单价片段；F(ab' )2片段是具有在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段具有Vh和ChI结构域；Fb片段具有抗体单臂的'和Vh结构域；以及dAb片段具有Vh结构域、'结构域、或Vh或'结构域的抗原结合片段(美国专利 N0.6，846，634,6, 696，245，美国申请公开 N0.05/0202512,04/0202995,04/0038291,04/0009507,03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546,1989)。单链抗体(s cFv)是下述抗体，其中VL和VH区经由接头(例如氨基酸残基的合成序列)相连，形成连续的蛋白质链，其中接头足够长到允许蛋白质链在其自身上折回并形成单价抗原结合位点(见例如Bird等，1988, Science 242:423-26和Huston et al.,1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-83)。双链抗体是二价抗体，其包含两条多肽链，其中每条多肽链包含通过接头相连的VH和VL结构域，接头很短因此不允许相同链上的两个结构域之间配对，由此允许每个结构域与另一多肽链上的互补结构域配对(见例如Holliger 等，1993, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-48 和 Poljak 等，1994, Structure2 =1121-23)。如果双链抗体的两条多肽链相同，则来自它们的配对的双链抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制造具有两个不同抗原结合位点的双链抗体。类似地，三链抗体和四链抗体是分别包含三条和四条多肽链并且分别形成三个和四个抗原结合位点(其可以相同或不同)的抗体。可使用上文Kabat等、上文Lefranc等和/或上文Honegger和Pluckthun等描述的系统，来鉴定给定抗体的互补性决定区(CDRs)和框架区(FR)。可将一个或多个CDRs共价或非共价并入分子使其成为抗原结合蛋白质。抗原结合蛋白质可并入了一个或多个CDR作为更大的多肽链的一部分，可将一个或多个CDR共价连接至另外的多肽链，或者可非共价并入一个或多个CDR。CDRs允许抗原结合蛋白质特异性结合感兴趣的特定抗原。抗原结合蛋白质可具有一个或多个结合位点。如果有超过一个结合位点，结合位点可互相相同或者可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白典型地具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。术语“人抗体”包括具有源于人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的所有抗体。在一种实施方式中，所有可变和恒定结构域都源于人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以以多种方法来制备，其例子如下文所述，包括通过用感兴趣的抗原免疫经遗传修饰以表达源于人重链和/或轻链编码基因的小鼠。人化抗体具有通过一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而与源于非人物种的抗体的序列不同的序列，从而当施用给人受试者时，较之非人物种的抗体，人化抗体较不可能诱导免疫应答和/或诱导较为不严重的免疫应答。在一种实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸被突变，以产生人化抗体。在另一实施方式中，来自人抗体的一个或多个恒定结构域与非人物种的一个或多个可变结构域融合。在另一实施方式中，非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基被改变，以降低当施用给人受试者时非人抗体的可能免疫原性，其中被改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不关键，或者进行的对于氨基酸序列的改变是保守改变，使得人化抗体对抗原的结合并不比非人抗体对抗原的结合显著更差。如何制造人化抗体的例子可见美国专利 Nos.6，054，297,5, 886，152 和 5，877，293。术语“嵌合抗体”指 含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一个或多个其他抗体的一个或多个区域的抗体。在一种实施方式中，一个或多个CDRs源于人抗肌肉生长抑制素抗体。在另一实施方式中，所有CDRs源于人抗肌肉生长抑制素抗体。在另一实施方式中，来自超过一种人抗肌肉生长抑制素抗体的CDRs混合并匹配于嵌合抗体中。例如，嵌合抗体可包含来自第一人抗肌肉生长抑制素抗体的轻链的CDRl、来自第二人抗肌肉生长抑制素抗体的轻链的⑶R2和⑶R3、和来自第三抗肌肉生长抑制素抗体的重链的⑶Rs。其他组合也是可能的并且包括在本发明的实施方式中。此外，框架区可源于相同的抗肌肉生长抑制素抗体之一、源于一种或多种不同的抗体例如人抗体、或源于人化抗体。在嵌合抗体的一个例子中，重链和/或轻链的部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体相同、同源或源于来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体，但链的其余部分与来自另外的物种或属于另外的抗体类别或亚类的抗体相同、同源或源于来自另外的物种或属于另外的抗体类别或亚类的抗体。还包括此类抗体的展现出想要的生物活性(即，特异性结合肌肉生长抑制素的能力)的片段。见例如美国专利 N0.4，816，567 和 Morrison, 1985，Science 229:1202_07。“中和抗体”或“一致性抗体”是抑制肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的相互作用的抗体，此时过量的抗肌肉生长抑制素抗体将相互作用的量降低至少大约20%，这是使用检验例如本文实施例中描述的那些检验来测量的。在多种实施方式中，抗原结合蛋白质将肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的相互作用降低至少3060%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%和 99.9% 抗体的片段或类似可通过本领域普通技术人员遵循本申请文件的教导和使用本领域公知的技术容易地制备。片段或类似物的氨基末端和羧基末端出现在功能性结构域的边界附近。结构和功能结构域可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公众或私有序列数据库进行比较而坚定。计算机比较方法可用于鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白质中存在的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。用于鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的，见例如Bowie等，1991, Science 253:164。“CDR移植抗体”是下述抗体，其包含源于特定物种或同种型的抗体的一个或多个CDRs、以及相同或不同物种或同种型的另外的抗体的框架。“多特异性抗体”是识别一种或多种抗原上的超过一种表位的抗体。该类型的抗体的亚类是“双特异性抗体”，其实别相同或不同抗原上的两种不同的表位。抗原结合蛋白质如果以I纳摩尔或更低的解离常数(Kd)结合至抗原，则其“特异性结合”至抗原(例如人肌肉生长抑制素)。当针对第一抗原的解离常数显著低于针对第二抗原的解离常数时，抗原结合蛋白质可还较之第二抗原而“选择性”或“优先”结合至一种抗原。“选择性”表示与抗原结合蛋白质结合至第二抗原(例如高度相关的抗原)相比较的程度而言其结合至特定抗原的程度。例如，“肌肉生长抑制素特异性拮抗剂”是以I纳摩尔或更低的Kd结合肌肉生长抑制素、且以IOnM或更高的Kd结合⑶F-1I的抗体。因此，较之针对GDF-1I，肌肉生长抑制素拮抗剂针对肌肉生长抑制素的选择性可以是十倍或更高。“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是含有与抗原相互作用并贡献于抗原结合蛋白质对抗原的特异性和亲和性的氨基酸残基(或其他基元)的抗原结合蛋白质部分。对于特异性结合其抗原的抗体而言，这将包括其至少一个⑶R结构域的至少一部分。“表位”是被抗原结合蛋白质(例如抗体)结合(或与之相互作用)的分子部分。表位可包含分子的非连续部分(例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续、但在多肽的三级和四级结构范畴 下互相足够接近从而可被抗原结合蛋白质结合或与抗原结合蛋白质相互作用的氨基酸残基)。两条多核苷酸或多肽序列的“百分比同一性”是通过使用GAP计算机程序(GCGWesconsin软件包,版本10.3 (Accelrys, San Diego, CA)的一部分)、使用其缺省参数来比较序列而测定的。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在通篇中可互换使用，其包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA) ,RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA类似物、及其杂交体(hybrids)。核酸分子可以是单链或双链的。在一种实施方式中，本发明的核酸分子包含连续的开放读码框，其编码本发明的抗体或其片段、衍生物、突变蛋白质或变体。对两条单链多核苷酸而言，如果其序列可以以反平行的定向比对使得一条多核苷酸中的每个核苷酸均与另一多核苷酸中其互补核苷酸相反而没有引入缺口并且在任一序列的5’或3’端没有未配对核苷酸的话，这两条单链多核苷酸互相是“互补体”。如果两条多核苷酸在中等严格条件下互相杂交，则多核苷酸与另一多核苷酸“互补”。由此，多核苷酸可与不是其互补体的另外的多核苷酸互补。“载体”是可用于将与其连接的另一核酸引入细胞中的核酸。一种类型的载体是“质粒”，其指其中可连接进额外的核酸片断的线性或环状的双链DNA分子。另一类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中额外的DNA片断可被引入病毒基因组。某些载体能在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如包含病毒复制起点的病毒载体和游离的哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合进宿主细胞基因组，并且由此随宿主基因组一起复制。“表达载体”是能指导所选的多核苷酸复制的一类载体。如果调控序列影响该核苷酸序列的表达(例如表达的水平、时机或位点)，则核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”。“调控序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如表达的水平、时机或位点)的核酸。调控序列可例如直接在被调控的核酸上施加其影响，或通过一种或多种其他分子(例如与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用来施加其影响。调控序列的例子包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷化信号)。调控序列的其他例子被描述于例如Goeddel, 1990,Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 和 Baron 等，1995, Nucleic AcidsRes.23:3605-06 中。“宿主细胞”是可用于表达核酸(例如本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如，大肠杆菌，或者其可以是真核细胞，例如单细胞的真核细胞(例如酵母或其他真菌)、植物细胞(例如烟草或西红柿植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括猴肾细胞的C0S-7系(ATCC CRL 1651)(见 Gluzman et al.，1981，Cell 23:175)，L 细胞，C 127 细胞，3T3 细胞(ATCC CCL 163)、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物，例如Veggie CHO和生长于无血清培养基中的相关细胞系(见Rasmussen等，1998, Cytotechnology 28:31),或DHFR缺陷的 CHO株系 DX-Bll (见 Urlaub 等，1980，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 77:4216-20)，Hela细胞，BHK(ATCC CRL 10)细胞系，源于非洲绿猴肾细胞系CVl (ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(见McMahan 等，1991，EMBO J.10:2821)，人胚胎肾细胞例如 293、293EBNA 或MSR 293，人表皮A431细胞，人Colo205细胞，其它经转化的灵长类细胞系，正常二倍体细胞，源于原生组织的体外培养物的细胞株系，原生外植体，HL-60，U937，HaK或Jurkat细胞。典型地，宿主细胞是可被编码多肽的核酸转化或转染的培养的细胞，其然后可表达于宿主细胞中。短语“重组宿主”可用于指已经被待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是下述细胞，其包含核酸但是并不以想要的水平表达该核酸，除非向宿主细胞中引入了调控序列使得其与核酸可操作地连接。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试者细胞，其还指此类细胞的后代或 潜在后代。因为由于例如突变或环境影响，在以后的传代中可能发生某些修饰，故而此类后代可能事实上不与亲本细胞相同，但仍包括在本文使用的术语的范围内。抗原结合蛋白质在一个方面，本发明提供了结合肌肉生长抑制素(例如人肌肉生长抑制素)的抗原结合蛋白质(例如抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白质和抗体变体)。根据本发明的抗原结合蛋白质包括抑制肌肉生长抑制素生物活性的抗原结合蛋白质。此类生物活性的例子包括肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的结合以及与表达此类肌肉生长抑制素受体的细胞的结合。其它生物活性包括肌肉生长抑制素体内介导的那些，例如对骨骼肌生长的负调控。不同的抗原结合蛋白质可结合肌肉生长抑制素的不同结构域或表位或者通过不同的作用机制发挥作用。粒子包括但不限于干扰肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素受体的能力的抗原结合蛋白质或其亚单位。抗原结合蛋白质无须完全抑制肌肉生长抑制素诱导的活性来在本发明中应用；而也可考虑降低肌肉生长抑制素的特定活性的抗原结合蛋白质(本文关于结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质在治疗特定疾病中的特定作用机制仅用于阐述，本文给出的方法并非限定性的)。本发明范围的抗肌肉生长抑制素抗体的其它衍生物包括抗肌肉生长抑制素抗体与其它蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物或其片段，例如通过表达包含融合至抗肌肉生长抑制素抗体多肽的N-末端或C-末端的异源多肽的重组融合蛋白质来获得。例如，缀合肽可以是异源信号(或前导序列)多肽，例如酵母α-因子前导序列，或肽例如表位标签。含有抗原结合蛋白质的融合蛋白质可包括添加来协助对抗原结合蛋白质的纯化或鉴定的蛋白质(例如标签蛋白质，例如多聚His)。抗原结合蛋白质还可连接至Hopp等,Bio/Technology6:1204,1988和美国专利5，011，912所述的FLAG 肽。FLAG 肽是高度抗原性的，并且提供被特异性单克隆抗体(HlAb)可逆结合的表位，使得能够进行快速检验并且容易对表达的重组蛋白质进行纯化。可用于制备其中FLAG 肽融合至给定多肽的融合蛋白质的试剂是可商业获得的(Sigma-Aldrich, St.Louis MO)。含有一种或多种抗原结合蛋白质的寡聚物可用作为肌肉生长抑制素拮抗剂。寡聚物可以是共价连接或非共价 连接的二聚体、三聚体或更高聚的寡聚物。考虑使用包含两种或多种抗原结合蛋白质的寡聚物，一个例子是同源二聚体。其它寡聚物包括异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等等。一种实施方式涉及包含经由融合至抗原结合蛋白质的肽基元之间的共价或非共价相互作用相连的多个抗原结合蛋白质的寡聚物。此类肽可以是肽接头(间隔序列)或具有促进寡聚化的性质的肽。亮氨酸拉链和源于抗体的某些多肽属于能促进与之连结的抗原结合蛋白质的寡聚化的肽，如下文更详细描述的。在一些特别地实施方式中，寡聚物包含两个或四个抗原结合蛋白质。寡聚物的抗原结合蛋白质可以是任何形式的，例如上文所述的任何形式，例如变体或片段。优选地，寡聚物包含具有肌肉生长抑制素结合活性的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，使用源于免疫球蛋白质的多肽来制备寡聚物。已经描述了对包含融合至源于抗体的多肽的多种部分(包括Fe结构域)的某些异源多肽的融合蛋白质的制备，例如，由 Ashkenazi 等，1991, PNAS USA 88:10535、Byrn 等，1990, Nature 344:677 和 Hollenbaugh 等，1992 " Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins " , inCurrent Protocols in Immunology, Supp1.4,10.19.1-10.19.11 页描述。本发明的一种实施方式涉及包含两个融合蛋白质的二聚体，所述融合蛋白质是通过将抗肌肉生长抑制素抗体的肌肉生长抑制素结合片段融合至抗体的Fe区制造的。可通过下述方式来制造二聚体:例如将编码融合蛋白质的基因融合子插入合适的表达载体，在经重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因，以及允许表达的融合蛋白质装配得很像抗体分子，由此在Fe基元之间形成链间二硫键，以产生二聚体。术语“Fe多肽”在本文中使用时包括源于抗体的Fe区的多肽的天然和突变蛋白质形式。此类多肽的含有促进二聚化的铰链区的截短形式也包括在内。包含Fe基元的融合蛋白质(和由其形成的寡聚体)提供了易于通过在蛋白质A或蛋白质G柱上进行亲和色谱来纯化的优点。PCT申请WO 93/10151 (其通过引用并入本文)中描述的一种合适的Fe多肽是单练多肽，其从N-末端铰链区延伸至人IgGl抗体的Fe区域的天然C-末端。另一有用的Fe多肽是美国专利5，457，035和Baum等，1994，EMBO J.13:3992-4001中描述的Fe突变蛋白质。该突变蛋白质的氨基酸序列除了第19位氨基酸从Leu变为Ala、第20位氨基酸从Leu变为Glu以及第22位氨基酸从Gly变成Ala之外与WO 93/10151中呈现的天然Fe序列相同。突变蛋白质显示出针对Fe受体的降低的亲和性。在其它一些实施方式中，抗肌肉生长抑制素抗体的重链和/或轻链的可变部分可取代抗体重链和/或轻链的可变部分。或者，寡聚物是包含多个抗原结合蛋白质、有或没有肽接头(间隔肽)的融合蛋白质。其中合适的肽接头是美国专利4，751，180和4，935，233描述的那些。用于制备寡聚抗原结合蛋白质的另一方面涉及亮氨酸拉链的使用。亮氨酸拉链结构域是促进其中发现有它们的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初被鉴定于若干DNA结合蛋白质中(Landschulz等，1988, Science 240:1759),此后还被发现于多种不同的蛋白质中。已知的亮氨酸拉链包括天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。适用于生产可溶寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的例子被描述于PCT申请WO 94/10308中，源于肺表面活性蛋白质D(SPD)的亮氨酸拉链被描述于Hoppe et al., 1994,FEBS Letters 344:191中，上述文献通过引用引用并入 本文。允许融合至其的异源蛋白质稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的用途被描述于Fanslow等，1994, Semin.1mmunol.6:267-78中。在一种方法中，包含融合至亮氨酸拉链肽的抗肌肉生长抑制素抗体片段或衍生物的重组融合蛋白质被表达于合适的宿主细胞中，从培养物上清液中回收形成的可溶寡聚抗肌肉生长抑制素抗体片段或衍生物。在一个方面，本发明提供了干扰肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的结合的抗原结合蛋白质或其亚单位。例如，抗原结合蛋白质可阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互作用，但还可以共结合与ActRIIB复合的肌肉生长抑制素和/或与AcRIIA复合的肌肉生长抑制素。此类抗原结合蛋白质可针对肌肉生长抑制素或其片段、变体或衍生物来制造，并在传统检验中针对干扰肌肉生长抑制素受体(或表达此类受体的细胞)的能力对其加以筛选。合适的检验的例子是测试抗原结合蛋白质的抑制肌肉生长抑制素与表达肌肉生长抑制素受体的细胞结合的能力的测试、或测试抗原结合蛋白质的降低此类受体和肌肉生长抑制素相互作用导致的生物或细胞应答的能力的测试(即基于细胞的检验、体外结合检验，例如本文在实施例中描述的那些)。测试抗原结合蛋白质的额外检验包括对抗原结合蛋白质与肌肉生长抑制素多肽的结合和已知的抗原结合蛋白质与肌肉生长抑制素多肽的结合进行定性或定量比较，其若干例子公开于本文中。在又一方面，本发明提供了展示出物种选择性的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质结合一种或多种哺乳动物肌肉生长抑制素，例如结合人肌肉生长抑制素、和小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类肌肉生长抑制素中的一种或多种。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质结合一种或多种灵长类肌肉生长抑制素，例如结合人肌肉生长抑制素、和猕猴、狨猴、恒河猴、絹毛猴和黑猩猩肌肉生长抑制素中的一种或多种。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质特异性结合人、猕猴、狨猴、恒河猴、絹毛猴或黑猩猩肌肉生长抑制素。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不结合小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类肌肉生长抑制素中的一种或多种。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不结合新世界猴(New Worldmonkey)物种例如绒猴。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不显示出对除了肌肉生长抑制素之外的任何天然存在的蛋白质的特异性结合。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不显示出对除了哺乳动物肌肉生长抑制素之外的任何天然存在的蛋白质的特异性结合。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不显示出对除了灵长类肌肉生长抑制素之外的任何天然存在的蛋白质的特异性结合。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不显示出对除了人肌肉生长抑制素之外的任何天然存在的蛋白质的特异性结合。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质特异性结合来自至少一种非人灵长类(例如猕猴)的肌肉生长抑制素和人肌肉生长抑制素。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质以相似的结合亲和性特异性结合非人灵长类、猕猴和人肌肉生长抑制素。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质阻碍非人灵长类、猕猴和人肌肉生长抑制素的活性。在又一实施方式中，在本文所述的检验中，抗原结合蛋白质针对非人灵长类、猕猴和人肌肉生长抑制素具有相似的IC5tl或EC5tlt5可以使用本领域公知的方法，以及按照本说明书的教导，来测定抗原结合蛋白质对肌肉生长抑制素的选择性。例如，可以使用Western印迹杂交、FACS, ELISA、RIA或通过允许测定结合常数的任何合适的方法，例如Biacore㊣(其利用表面等离子共振)或 KinexA (动力学排斥检验(kinetic exclusion assay),见例如 Ohmura 等，，Anal.Chem.73:3392-3399,2001)来测定选择性。在又一方面，本发明提供了具有下述特征中一种或多种的结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质(例如抗肌肉生长抑制素抗体):既结合人肌肉生长抑制素又结合非人灵长类肌肉生长抑制素，抑制肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的结合，抑制肌肉生长抑制素与ALK4的 结合，与肌肉生长抑制素/ActRIIB共结合，与肌肉生长抑制素/ActRIIA共结合，抑制肌肉生长抑制素负调控肌肉质量的能力。本发明的抗原结合蛋白质的抗原结合片段可通过传统技术来生产。此类片段的例子包括但不限于Fab和F(ab' )2片段。通过遗传工程技术产生的抗体片段和衍生物也包括在内。另外的实施方式包括嵌合抗体，例如非人(例如鼠)单克隆抗体的人化版本。此类人化抗体可通过已知技术来制备，并且当抗体施用给人时提供降低的免疫原性的优点。在一种实施方式中，人化单克隆抗体包含鼠抗体的可变区(或者其抗原结合位点的全部或部分)和来自人抗体的恒定结构域。或者，人化抗体片段可包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点和源于人抗体的可变结构域片段(缺少抗原结合位点)。用于产生嵌合及经进一步工程化的单克隆抗体的流程包括 Riechmann 等，.，1988, Nature 332:323, Liu 等，，1987, Proc.Nat.Acad.Sc1.USA 84:3439,Larrick 等，.，1989,Bio/Technology 7:934 和 Winter 等，.，1993，TIPS 14:139中描述的那些。在一种实施方式中，嵌合抗体是⑶R移植的抗体。用于人化抗体的技术被讨论于例如美国专利申请N0.10/194，975 (2003年2月27日公开)、美国专利 N0.s5, 869，619,5, 225，539,5, 821，337,5, 859，205、Padlan 等，，1995，FASEBJ.9:133-39 和 Tamura 等，，2000，J.1mmunol.164:1432-41 中。已经开发了用于在非人动物中产生人或部分人抗体的流程。例如，已制备了其中一种或多种内源免疫球蛋白基因已被多种手段失活的小鼠。人免疫球蛋白基因已被引入小鼠以代替失活的小鼠基因。动物中产生的抗体掺入了弓I入动物的人遗传材料编码的人免疫球蛋白多肽链。在一种实施方式中，用肌肉生长抑制素多肽对非人动物例如转基因小鼠进行免疫，使得在动物中产生针对肌肉生长抑制素多肽的抗体。合适的免疫原的一个例子是可溶的人肌肉生长抑制素，例如包含肌肉生长抑制素的蛋白质切割位点的多肽，或其它免疫原性片段肌肉生长抑制素。合适的免疫原的另一例子是表达高水平肌肉生长抑制素的细胞或来自其的细胞膜制备物。用于生产和使用用于产生人或部分人抗体的转基因动物的技术的例子被描述于美国专利 5，814，318,5, 569，825 和 5，545，806，Davis 等，，2003，Production ofhuman antibodies from transgenic mice,于 Lo, ed.Antibody Engineering:Methodsand Protocols 中，Humana Press, NJ: 191-200, Kellermann 等，，2002, Curr OpinBiotechnol.13:593-97, Russel 等，，2000, Infect Tmmun.68:1820-26, Gallo 等，，2000,Eur J Tmmun.30:534-40, Davis 等，,1999, Cancer Metastasis Rev.18:421-25, Green,1999,J Tmmunol Methods.231:11-23,Jakobovits,1998,Adv Drug Deliv Rev 31:33-42,Green等，，1998,J Exp Med.188:483-95,Jakobovits A,1998,Exp.0pin.1nvest.Drugs.7:607-14，Tsuda 等，，1997，Genomics 42:413-21, Mendez 等，，1997，Nat Genet.15:146-56,Jakobovits,1994，Curr Biol.4:761-63, Arbones 等，，1994，Immunity.1:247-60, Green等，，1994, Nat Genet.7:13-21, Jakobovits 等，，1993, Nature 362:255-58, Jakobovits等，，1993，Proc Natl Acad Sci U S A.90:2551-55, Chen, J.等，，1993，Int Immunol 5:647-656,Choi等，，1993,Nature Genetics 4:117-23,Fishwild等，，1996,Nat Biotechnol14:845-51, Harding et al., 1995, Ann NY Acad Sci, Lonberg 等，，1994, Nature 368:856-59, Lonberg,1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies,于Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 中，Lonberg 等，，1995, Int RevTmmunol 13:65-93, Neuberger, 1996, Nat Biotechnol 14:826, Taylor 等，，1992, NucleicAcids Research 20:6287-95, Taylor 等，，1994, Int Tmmunol 6:579-91, Tomizuka 等，，1997, Nat Gen 16:133-43, Tomizuka et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A.97:722-27,Tuaillon et al.,1993,Proc Natl Acad Sci U S A.90:3720-24 和 Tuaillon etal.，1994，J Immunol 152:2912-20中。这些和其它例子也被讨论于2007年5月3日公开的美国专利申请公开 文本2007-0098715中。在又一方面，本发明提供了结合肌肉生长抑制素的单克隆抗体。可使用本领域已知的任何技术来生产单克隆抗体，例如通过在完成免疫程序之后永生化收获自转基因动物的脾细胞。可使用本领域已知的任何技术来永生化脾细胞，例如通过将它们与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合流程的骨髓瘤细胞优选不产生抗体、具有高融合效率，使得它们不能在仅支持想要的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基上生长的酶缺陷。用于小鼠融合的合适的细胞系的粒子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210_Agl4、F0、NS0/U、MPC-1U MPC11-X45-GTG1.7 和S194/5XX0 Bul ;用于大鼠融合的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3_Ag 1.2.3、IR983F和4B210。可用于细胞融合的其它细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2和UC729-6。在一种实施方式中，通过下述方式产生杂交瘤细胞系:用肌肉生长抑制素免疫原免疫动物(例如具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)、从经免疫的动物收获脾细胞、将收获的脾细胞融合至骨髓瘤细胞系由此产生杂交瘤；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系以及鉴定产生结合肌肉生长抑制素多肽的抗体的杂交瘤细胞系。此类杂交瘤细胞系和通过它们产生的抗肌肉生长抑制素单克隆抗体是本发明所包括的。
可以使用本领域已知的任何技术来纯化通过杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。可进一步筛选杂交瘤或mAbs，以鉴定出具有特定性质(例如阻碍肌肉生长抑制素诱导的活性)的mAbs。此类筛选的例子提供于下文实施例中。还可使用被称为遗传免疫的工艺来生产单克隆抗体。例如，编码感兴趣的抗原的核酸可被掺入病毒载体(例如腺病毒载体)。然后使用得到的载体在合适的宿主动物(例如非肥胖性糖尿病，或NODdn^)中发展出针对感兴趣的抗原的免疫应答。该技术被Ritter等，，Biodrugsl6(l) =3-10(2002)详细描述，其公开内容通过引用并入本文。抗体结合位点中央的互补性决定区(CDRs)的分子进化也已被用于分离具有增加的亲和性的抗体，例如，具有增加的针对c-erbB-2的亲和性的抗体，如Schier等，，1996，J.Mol.Biol.263:551所述。因此，此类技术可用于制备针对肌肉生长抑制素的抗体。针对肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质可用于例如检验中以体外或体内检测肌肉生长抑制素多肽或表达肌肉生长抑制素的细胞的存在。抗原结合蛋白质还可用于通过免疫亲和色谱来纯化肌肉生长抑制素蛋白质。另外还能阻碍肌肉生长抑制素和肌肉生长抑制素受体(或其亚单位)的相互作用的抗原结合蛋白质可用于抑制此类相互作用导致的生物活性。阻碍抗原结合蛋白质可用于本发明的方法。作为肌肉生长抑制素拮抗剂发挥功能的此类抗原结合蛋白质可用于治疗任何肌肉生长抑制素诱导的病况，包括但不限于肌肉减少症、恶病质和肌肉消耗的病况。在一种实施方式中，通过涉及对转基因小鼠进行免疫的流程产生的人抗肌肉生长抑制素单克隆抗体被用于治疗此类病况。在另一实施方式中，人化的抗肌肉生长抑制素单克隆抗体被用于治疗此类病况。抗原结合蛋白质可用于体外流程，或体内施用，以抑制肌肉生长抑制素诱导的生物活性。肌肉生长抑制素导致或恶化(直接或间接)的病症(其例子提供于本文中)由此可被治疗。在一种实施方式中，本发明提供了一种治疗性方法，所述方法包括以有效降低肌肉生长抑制素诱导的生物活性的量向需要其的哺乳动物体内施用阻碍肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质。本发明的抗原结合蛋白质包括抑制肌肉生长抑制素的生物活性的部分人单克隆抗体或完全人单克隆抗体。一种实施方式涉及至少部分阻碍人肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体(或其亚单位)的相互作用的单克隆抗体。在一种实施方式中，通过用肌肉生长抑制素免疫原免疫转基因小鼠来产生抗体。在又一实施方式中，免疫原是人肌肉生长抑制素多肽(例如经转化或转染以表达肌肉生长抑制素的细胞，或天然表达肌肉生长抑制素的细胞)。源于此类经免疫的小鼠的杂交瘤细胞系(其中所述杂交瘤分泌结合肌肉生长抑制素的单克隆抗体)也是本文提供的。虽然人抗体、部分人抗体或人化抗体对于很多应用(特别是对涉及将抗体施用给人受试者的那些应用)来说是合适的，但其他类型的抗原结合蛋白质将适合于某些应用。本发明的非人抗体可以例如源于任何产生抗体的动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人灵长类(例如猴(例如猕猴或恒河猴)或猿(例如黑猩猩))。本发明的非人抗体可用于，例如，体外应用或基于细胞培养的应用，或者其中对本发明的抗体的免疫应答将不发生、不显著、可被预防、不成为问题或者是需要的任何其他应用。在一种实施方式中，本发明的非人抗体施用给非人受试者。在又一实施方式中，非人抗体在非人受试者中不引发免疫应答。在又一实施方式中，非人抗体来自与非人受试者相同的物种，例如，本发明的小鼠抗体施用给小鼠。可例如通过用想要的免疫原(例如表达肌肉生长抑制素的细胞或可溶肌肉生长抑制素多肽)免疫该物种的动物、或者使用产生该物种的抗体的人工系统(例如用于产生特定物种的抗体的基于细菌或噬菌体的系统)、或者通过将来一种物种的抗体转化为来自另一物种的抗体(通过例如用来自其他物种的恒定区替换抗体的恒定区)、或通过替换抗体的一个或多个氨基酸残基以使得其更接近来自其他物种的抗体的序列，来制造来自特定物种的抗体。在一种实施方式中，抗体是包含源于两种或多种不同物种的抗体的氨基酸序列的嵌合抗体。可通过大量传统技术中的任何来制备抗原结合蛋白质。例如，可适用本领域已知的任何技术，从天 然表达它们的细胞中纯化它们(例如，可从产生其的杂交瘤纯化抗体)，或在重组表达系统中生产抗体。见例如，Monoclonal Antibodies, Hybridomas:A NewDimension in Biological Analyses, Kennet 等，(eds.), Plenum Press, New York(1980)和 Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow and Land(eds.) , Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)。本领域已知的任何表达系统可用于制造本发明的重组多肽。通常，用包含编码想要的多肽的DNA的重组表达载体来转化细胞。可利用的宿主细胞包括原核生物、酵母或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或杆菌(bacilli)。高级真核生物细胞包括昆虫细胞和建立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞系的例子包括猴肾细胞的C0S-7系(ATCC CRL 1651) (Gluzman等，，1981，Cell23:175)兄细胞、293细胞、(:127细胞、3了3细胞(六了0: CCL 163)、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK (ATCC CRL 10)细胞系和源于非洲绿猴肾细胞系CVI (ATCC CCL 70)的CVI/EBNA细胞系，如McMahan et al.,1991,EMBO J.10:2821所述。关于使用细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适克隆和表达载体由Pouwels等，(Cloning Vectors:A LaboratoryManual, Elsevier, New York, 1985)所述。可在促进多肽表达的条件下培养转化的细胞，并通过传统的蛋白质纯化流程来回收多肽。一种此类纯化流程包括使用亲和色谱，例如在具有结合至其的肌肉生长抑制素的全部或一部分的基质上。被考虑用于本文的多肽包括基本上不含污染的内源材料的基本上均质的重组哺乳动物抗肌肉生长抑制素抗体多肽。可通过大量已知技术中的任何来制备抗原结合蛋白质，并且针对想要的性质加以筛选。某些技术涉及分离编码感兴趣的抗原结合蛋白质(例如抗肌肉生长抑制素抗体)的多肽链(或其部分)的核酸以及通过重组DNA技术操作核酸。可将核酸融合至另外的感兴趣的核酸，或对其进行改造(例如通过诱变或其它传统技术)以例如添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基。在一个方面，本发明提供了本发明的抗肌肉生长抑制素抗体的抗原结合片段。此类片段可完全由源于抗体的序列构成或者可包含额外的序列。抗原结合片段的例子包括Fab、F(ab' )2、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和结构域抗体。其它例子被提供于Lunde 等，,2002, Biochem.Soc.Trans.30:500-06 中。
单链抗体可通过下述方式形成:将重链和轻链可变结构域(Fv区)片段经由氨基酸桥联(短肽接头)连接起来，产生单多肽链。已通过融合编码下述肽接头的DNA制备了此类单链FVS(SCFVS)，所述肽接头是编码两个可变结构域多肽('和Vh)的DNA之间的。得到的多肽可折叠回到它们自身上，以形成抗原结合单体，或者它们可形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)，这取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等，,1997, Prot.Eng.10:423 ；Kortt等，,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合不同的包含VJPVh的多肽，可形成与不同表位结合的多聚scFvs (Kriangkum等，，2001, Biomol.Eng.18:31-40)。开发来用于产生单链抗体的技术包括美国专利 N0.4，946，778,Bird, 1988，Science 242:423,Huston 等，，1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879、Ward等，，1989，Nature 334:544、de Graaf 等，，2002，Methods MolBiol.178:379-87中描述的那些。本发明的抗原结合蛋白质(例如抗体、抗体片段和抗体衍生物)可包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是例如K或λ型轻链可变区，例如人K或λ型轻链可变区。重链恒定区可以是例如α、δ、ε、Y或μ型重链可变区,例如人α、δ、ε、γ或μ型重链可变区。在一种实施方式中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白质 。已知有用于从感兴趣的抗体获得不同的亚类或不同的同种型的抗体的方法，SP，亚类迁移(subclass switching)。由此,例如，IgG抗体可源于IgM抗体,并且反之亦然。此类技术允许制备具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合性质但也显示出与不同于亲本抗体的抗体同种型或亚类相关的生物学性质的新抗体。可利用重组DNA技术。编码特定抗体多肽的克隆的DNA可用于此类流程，例如，编码想要的同种型的抗体的恒定区的DNA。还见Lantto 等，，2002, Methods Mol.Biol.178:303_16。此外，如果想要 IgG4 的话，还可能希望在铰链区引入点突变(CPSCP->CPPCP)，如 Bloom 等，，1997，Protein Science 6:407 所述(其通过引用并入本文)，以减轻形成H链内二硫键(可导致IgG4抗体中的异质性)的趋势。此外，还已知用于获得具有不同性质(即，针对其结合的抗原的变化的亲和性)的抗原结合蛋白质的技术。一种此类技术被称为链重排，其涉及在丝状细菌噬菌体表面上展示免疫球蛋白可变结构域基因库，其也被称为噬菌体展示。链重排已被用于制备针对半抗原2-苯基恶唑-5-酮的高亲和性抗体,如Marks等，,1992, BioTechnology, 10:779所述。在又一实施方式中，本发明提供了具有从肌肉生长抑制素解离的低解离常数的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质具有200pM的Kd，或IOOpM或更低的Kdo在又一实施方式中，Kd为IOpM或更低；在又一实施方式中，其为5pM或更低，或者其为4pM、3pM或2pM或更低。在又一实施方式中，Kd与本文在实施例中描述的抗体基本上相同。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质以与本文在实施例中描述的抗体基本上相同的Kd结合肌肉生长抑制素。在又一实施方式中，本发明提供了具有比其针对GDF-1l的解离常数实质上更低的针对肌肉生长抑制素的解离常数(Kd)的抗原结合蛋白质。在又一实施方式中，针对肌肉生长抑制素的解离常数比针对⑶F-1l的低1000倍，或者其针对肌肉生长抑制素比⑶F-1l低 2，500,5, 000,7, 500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900 或 10，000 倍。在又一实施方式中，较之与GDF-1l的结合，与肌肉生长抑制素结合的选择性为1，000、2，500,5,000,7，500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900 或 10，000 倍。在又一实施方式中，针对⑶F-1I的&为IOnM或更高，在又一实施方式中，其为25nM或更高，或者其为50nM、100nM、150nM、175nM或180nM或更高。在又一实施方式中，较之结合至⑶F-1l而言结合至肌肉生长抑制素的选择性为 I, 000,2, 500,5, 000,7, 500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900或 10，000 倍。在又一实施方式中，本发明提供了具有实质上高于其针对GDF-1l的结合亲和性的针对肌肉生长抑制素的结合亲和性的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质针对肌肉生长抑制素的亲和性是针对GDF-1l的500倍高。在又一实施方式中，针对肌肉生长抑制素的亲和性是针对GDF-1l的1000倍高，或者其针对肌肉生长抑制素是针对GDF-1l 的 2，500,5, 000,7, 500,8, 000,9, 000,9, 500,9, 700,9, 800,9, 900 或 10，000 倍高。在又一方面，本发明提供了抑制肌肉生长抑制素的活性(例如，结合至肌肉生长抑制素受体(或其亚单位)、结合至表达肌肉生长抑制素受体的细胞、或肌肉生长抑制素与ALK4的结合)的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质具有IOOOpM或更低的IC5(I。在又一实施方式中，IC5tl为500pM或更低；在又一实施方式中，IC5tl为300pM或更低，或者其为200pM或更低，或者其为IOOpM或更低。在又一实施方式中，IC5tl与本文在实施例中描述的抗体的IC5tl基本上相同。在又一实施方式中,抗原结合蛋白质以与本文在实施例中描述的抗体的IC5tl基本上相同的IC5tl抑制肌肉生长抑制素的活性。在一种实施方式中，本发明的抗原结合蛋白质具有IOOOpM或更低的针对肌肉生长抑制素(或表达肌肉生长抑制素的细胞)的表观亲和性。在其它一些实施方式中，抗原结合蛋白质展示出500pM或更低、300pM或更低、200pM或更低、IOOpM或更低、或80pM或更低的表观亲和性。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质展示出与本文在实施例中描述的抗体的表观亲和性基本上相同的表观亲和性。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质具有与本文在实施例中描述的抗体的 表观亲和性基本上相同的表观亲和性。在又一实施方式中，本发明提供了与本文公开的抗体竞争结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质。此类竞争能力可通过本领域公知的方法来测定，例如通过使用荧光活化细胞分选(FACS)技术或其他类似技术观察到的在结合表达肌肉生长抑制素的细胞中的竞争、通过在检验例如BIACore⑧或KinExA 检验中的竞争、或通过在本文描述的另外的检验中的竞争。在一个方面，与本文公开的抗体竞争结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质与所述抗体结合相同的表位或者重叠(或附近)表位。在又一方面，与本文公开的抗体竞争结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质抑制肌肉生长抑制素的活性。在又一方面，本发明提供了体外或体内(例如当施用给人受试者时)具有至少一天半寿期的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质具有至少三天的半寿期。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质具有四天或更长的半寿期。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质具有八天或更长的半寿期。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质被衍生或被修饰，使得其较之未经衍生或为经修饰的抗原结合蛋白质具有更长的半寿期。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质含有一处或多处点突变，以增加血清半寿期，例如2000年2月24日公开的WO 00/09560中描述的，其通过引用并入本文。本发明还提供了多特异性抗原结合蛋白质，例如双特异性抗原结合蛋白质，例如通过两个不同抗原结合位点或区域结合肌肉生长抑制素的两个不同表位、或结合肌肉生长抑制素的表位以及另一分子的表位的抗原结合蛋白质。此外，本文公开的双特异性抗原结合蛋白质可包含来自本文所述的抗体之一的肌肉生长抑制素结合位点以及来自本文描述的另外的抗体的第二肌肉生长抑制素结合区，包括本文通过引用其他公开文献而描述的那些。或者，双特异性抗原结合蛋白质可包含来自本文描述的抗体之一的抗原结合位点以及来自本领域已知的另外的肌肉生长抑制素抗体、或来自通过已知方法或本文描述的方法制备的抗体的第二抗原结合位点。制备双特异性抗体的大量方法是本领域已知的，并被讨论于2001年4月20日提交的美国专利申请09/839，632(通过引用并入本文)中。此类方法包括使用Milstein等，，1983，Nature 305:537和其它(美国专利4，474，893、美国专利6，106，833)描述的杂交体_杂交瘤，和化学偶联抗体片段(Brennan等，.，1985, Science 229:81 ；Glennie等，,1987，J.1mmunol.139:2367 ;美国专利6，010，902)。此外，可通过重组手段来产生双特异性抗体，例如通过使用亮氨酸拉链基元(即来自Fos和Jun蛋白质，其优先形成异源二聚体；Kostelny等，，1992, J.1mmnol.148:1547)或其它锁匙相互作用结构域结构，如美国专利U.S.Patent 5，582，996所述。另外的有用技术包括上文Kortt et al.，1997 ;美国专利5，959，083和美国专利5，807，706中描述的那些。在又一方面，本发明的抗原结合蛋白质包含抗体的衍生物。衍生化抗体可包含向抗体赋予想要的性质(例如特定用途中增加的半寿期)的任何分子或物质。衍生化的抗体可包含例如可检测(或标记)基元(例如放射活性、发色、抗原性或酶分子、可检测珠粒(例如磁性或电子致密(例如金)珠粒)或结合另外的分子的分子(例如生物素或链亲和素))，治疗性或诊断性基元(例如放射活性、细胞毒性或药物活性基元)或增加抗体对于特定用途的适合性(例如施用给受试者，例如人受试者，或者其它体内或体外用途)。可用于衍生化抗体的分子的例子包括清蛋白(例如人血清清蛋白)和聚乙二醇(PEG)。抗体的连接清蛋白和PEG化的衍生物可使用本领域公知的技术来制备。在一种实施方式中，抗体与转甲状腺蛋白质(TTR)或TTR变体缀合或连接。可用例如选自右旋糖酐、聚(η-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧丙烯/聚氧乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylate d polyols)和聚乙烯醇构成的组的化学品修饰TTR或TTR变体。美国专利申请 N0.20030195154。本发明的另一方面包括本文描述的抗体的变体。某些变体被本文所述的共有序列包括，例如SEQ ID N0s:10和20中。另外的变体包括一个或多个氨基酸不同于本文公开的抗体的抗体，例如，变体抗体的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸不同于公开的抗体序列。在有益实施方式中，变体与公开的抗体之一在氨基酸序列上90%相同。在又一实施方式中，变体抗体序列与本文公开的抗体之一 91%、92%、93%、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同。变体还包括其中一个或多个氨基酸已被缺失的抗体序列，例如一个、两个、三个、四个或五个氨基酸可从抗体多肽的末端缺失，或者此类缺失可在内部进行。另外的实施方式也包括术语“抗体”中。例如，氨基酸残基可经历翻译后修饰，包括但不限于，谷氨酰胺(特别是N-末端的谷氨酰胺)可被环化或转化为焦谷氨酸；此外或或者，氨基酸可经历脱氨、异构化、糖化和/或氧化。本发明的多肽可经历额外的翻译后修饰，包括糖基化，例如N-连接或O-连接的糖基化，其在本领域公知的位点进行。由此，可在多肽的氨基酸序列中产生变化，以排除或最小化上述改变，或在此类加工是有益的情况下协助它们。在又一方面，本发明提供了使用本发明的抗原结合蛋白质筛选结合肌肉生长抑制素的分子的方法。任何合适的筛选技术可以使用。在一种实施方式中，将本发明的抗原结合蛋白质结合的肌肉生长抑制素分子或其片段与本发明的抗原结合蛋白质以及与另一分子接触，其中所述另外的分子如果降低了抗原结合蛋白质与肌肉生长抑制素的结合的话，则另外的分子结合肌肉生长抑制素。可使用任何合适的方法Hf^BELISA)来检测抗原结合蛋白质的结合。检测抗原结合蛋白质与肌肉生长抑制素的结合可通过可检测地标记抗原结合蛋白质而简化，如上文所讨论的。在又一实施方式中，肌肉生长抑制素结合分子被进一步分析，以确定其是否抑制肌肉生长抑制素活化和/或信号传递。本发明还包括药物组合物，其包含有效量的本发明的多肽产品与可用于肌肉生长抑制素疗法的可药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。此类组合物包括多种缓冲成分(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，例如去垢剂和增溶试剂(例如Tween 80，聚山梨醇酯80)，抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)，防腐剂(例如硫柳萊(Thimersol)、苯甲 醇)和填充剂(bulking agent)(例如乳糖、甘露糖醇)，基元例如聚合物(例如聚乙二醇或其他基元)与蛋白质的共价连结(如上文所讨论的，还见例如美国专利4，179，337，其通过引用并入本文)；将材料掺入聚合化合物(例如聚乳酸、聚乙醇酸等等)的特定制剂或掺入脂质体。此类组合物将影响肌肉生长抑制素的物理状态、稳定性、体内释放速率以及体内清除率。见，例如Remington' s PharmaceuticalSciences, 18th Ed.(1990,Mack Publishing C0.,Easton,PA 18042) 1435-1712 页，其通过引用并入本文。通常，本发明的肌肉生长抑制素抑制性多肽的有效量将通过接受者的年龄、体重和疾病的病况或严重性来确定。见Remingtons Pharmaceutical Sciences,上文，697-773页，其通过引用并入本文。典型地，可使用大约0.001g/kg提供至大约lg/kg体重之间的剂量，但是医师将认识到可以使用更多或更少。对于局部(即，非全身性)应用而言，例如对于局部性应用，给剂量可在大约0.001g/cm2至大约lg/cm2之间。给剂量可以一天一次或多次，或者频次更少，并且可以与本文所述的其他组合物联合。应当注意，本发明不限于本文提到的剂量。本发明提供了药物组合物和治疗多种病症的方法，其中使用肌肉生长抑制素拮抗齐U，包括肌肉生长抑制素结合试剂(或肌肉生长抑制素结合多肽，包括抗体)。本发明提供了在需要其的受试者中治疗性功能减退的作用的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。在一种实施方式中，性功能减退是雄激素剥夺疗法导致的。在第二实施方式中，性功能减退是年龄相关的性腺机能减少导致的。本发明还提供了在受试者中治疗恶病质的方法，所述受试者正遭受此类病况，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。所述病况可以是原发恶病质或继发恶病质。在一种实施方式中，受试者患有风湿病恶病质或作为自身免疫病况或炎性病况(包括慢性阻塞性肺病或COPD)的并发症或结果而发生的恶病质。本发明还提供了在需要其的受试者中治疗由于烧伤导致的恶病质的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了在遭受特征在于过量TNF-α的炎性病况的受试者中降低肿瘤坏死因子(TNF)-Ci的方法。本发明还提供了对需要下述治疗的受试者治疗由于用化学试剂(例如化疗剂)治疗导致的恶病质的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了当恶病质是由于癌症或肿瘤病况导致时、由针对癌症或肿瘤病况的任何治疗导致时或是所述病况和所述治疗的组合作用时，在患有癌症或肿瘤病况的个体中治疗恶病质的方法。本发明还提供了在需要下述治疗的受试者中治疗由于糖尿病导致的恶病质的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用 载剂作为混合物施用。本发明还提供了在遭受糖尿病性神经病的患者中治疗糖尿病性神经病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了治疗心源性恶病质和/或肾源性恶病质的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。恶病质是慢性心衰(CHF)的常见并发症，其与炎性细胞因子例如TNF-α的增加的血浆水平和分解代谢/合成代谢途径的不平衡相关联。患有慢性肾衰(CRF)和/或终末期肾病(ESRD)的受试者通常也患有到恶病质，这也可归因于促炎性试剂的升高的水平。本文还提供了治疗心脏萎缩和/或心脏发育不良的方法。心脏萎缩在患有癌症的个体中发生，也在长期卧床或在导致随意肌(voluntary muscle)萎缩的其他状况或病况的个体中发生。此外，本发明的选择性肌肉生长抑制素拮抗剂还可用于治疗其中心肌效率降低的其他病况，例如，心衰(例如，充血性心衰)。本发明还可用于治疗在饮食病症或饥饿中发生的心脏异常。本发明还提供了治疗以前通过生长激素、胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、生长激素促分泌素和与生长激素-1GF-1轴相关的其他试剂来治疗的疾病或病况的备选方法。肌肉生长抑制素拮抗剂提供了治疗此类病症并且没有这些试剂的潜在危险副作用的方法。肌肉生长抑制素拮抗剂还提供了治疗生长激素抗性(被认识到的衰老中的疾病)的方法。在一种实施方式中，本发明提供了治疗Prader-Wi 11 i综合征的作用的方法，所述方法在遭受此类病况的受试者中进行，包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了治疗肌肉减少症(包括老年人的肌肉减少症)以及其他肌肉疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗齐U，所述肌肉生长抑制素拮抗剂与可药用载剂作为混合物施用。本发明还提供了治疗老年人的虚弱的方法，包括用于复健疗法，以及与力量和/或平衡训练联合，以及用于降低或预防跌倒。本发明还提供了协助外伤性骨折的治愈和骨质疏松性骨折的修复以及对一般性的骨损失(例如骨质疏松症和/或骨质减少)或伴随长期不运动或卧床和/或肢固定的结果的骨损失的治疗的方法。针对病况施用肌肉生长抑制素拮抗剂能证明有益的其他病况包括阿狄森氏病；肌萎缩性侧索硬化或运动神经元病(ALS ；MND ;卢格里格病)；贝尔麻痹(和/或面部神经问题)；肉毒杆菌中毒；脑性麻痹；进行性神经性腓骨肌萎缩症和其它外周神经病；库欣综合征；糖尿病性神经病；格林-巴利综合征；多发性硬化；肌萎缩(包括进行性肌萎缩和脊髓性肌萎缩)；肌营养不良症(其有多种形式；包括强直性肌营养不良症)；重症肌无力；脊髓灰质炎；多肌炎；肌肉、肌腱和/或韧带的扭伤和拉伤冲风(和其他导致肌肉消耗的病况，例如长期不活动或卧床，肢固定(例如通过打石膏和/或上夹板)和太空飞行)。本发明的肌肉生长抑制素结合蛋白质还可用于诊断方法。例如，可通过与可检测标志物物质的连结来“标记”本发明的抗原结合蛋白质(例如用125I进行放射性标记或与另外的可检测基元缀合)，以提供可用于在固体组织和液体(例如血液或尿液)样品中检测和定量肌肉生长抑制素的试剂。本发明还包括含有此类经标记的材料的试剂盒。下述实施例是阐述本发明的特定实施方式或特定的目的而提供的，其并不限制本发明的范围。实施例1抗肌肉生长抑制素抗体制备了若干变体抗肌肉生长抑制素抗体，针对活性进行了测试；它们的序列如下表I和2所示。表1:抗肌肉生长抑制素抗体重链序列

权利要求
1.一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体包含至少一条轻链和至少一条重链，其中所述轻链包含恒定区和含有三个互补性决定区(CDRs)的可变区，并且所述重链包含恒定区和含有三个互补性决定区(CDRs)的可变区，其中所述轻链⑶Rs是SEQ ID NO:10中公开的那些，并且所述重链⑶Rs是SEQ ID NO:20中公开的那些。
2.权利要求1所述的抗体，其中所述轻链CDRs选自 a)SEQ ID NO:1中公开的轻链CDRs ； b)SEQID NO:2中公开的轻链CDRs ； c)SEQID NO:3中公开的轻链CDRs ； d)SEQ ID NO:4中公开的轻链CDRs ； e)SEQID NO:5中公开的轻链CDRs ； f)SEQ ID NO:6中公开的轻链CDRs ； g)SEQ ID NO:7中公开的轻链CDRs ； h)SEQ ID NO:8中公开的轻链CDRs ;和 i)SEQID NO:9中公开的轻链CDRs 构成的组； 并且其中所述重链⑶Rs选自 a，)SEQ ID NO:11中公开的重链CDRs ； b，)SEQ ID NO:12中公开的重链CDRs ； c，)SEQ ID NO:13中公开的重链CDRs ； d，)SEQ ID NO:14中公开的重链CDRs ； e，)SEQ ID NO:15中公开的重链CDRs ； f，)SEQ ID NO:16中公开的重链CDRs ； g’ )SEQ ID NO:17中公开的重链CDRs ； h，)SEQ ID NO:18中公开的重链CDRs ;和 i’)SEQ ID NO:19中公开的重链CDRs 构成的组。
3.权利要求1所述的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQID NO:10中示出的氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:20中示出的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的抗体，所述轻链可变区选自 a)SEQ ID NO:1中公开的轻链可变区； b)SEQID NO:2中公开的轻链可变区； c)SEQID NO:3中公开的轻链可变区； d)SEQ ID NO:4中公开的轻链可变区； e)SEQID NO:5中公开的轻链可变区； f)SEQ ID NO:6中公开的轻链可变区； g)SEQ ID NO:7中公开的轻链可变区； h)SEQ ID NO:8中公开的轻链可变区；和 i)SEQID NO:9中公开的轻链可变区 构成的组；并且其中所述重链可变区选自 a’ )SEQ ID NO:11中公开的重链可变区； b’ )SEQ ID NO:12中公开的重链可变区； c’ )SEQ ID NO:13中公开的重链可变区； d’ )SEQ ID NO:14中公开的重链可变区； e’ )SEQ ID NO:15中公开的重链可变区； f’ )SEQ ID NO:16中公开的重链可变区； g’ )SEQ ID NO:17中公开的重链可变区； h’ )SEQ ID NO:18中公开的重链可变区；和 i’)SEQ ID NO:19中公开的重链可变区 构成的组。
5.一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体以小于IOOpi^AKd结合肌肉生长抑制素。
6.权利要求5所述的分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体以高于IOnM的Kd结合⑶F-1I。
7.一种分离的肌肉 生长抑制素特异性抗体，所述抗体以其针对GDF-1l的亲和性至少5000倍的亲和性结合肌肉生长抑制素。
8.一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体展示出针对肌肉生长抑制素的选择性，所述选择性是针对⑶F-1I的至少5000倍。
9.一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体结合肌肉生长抑制素并且阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互作用。
10.权利要求9所述的分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体结合肌肉生长抑制素并阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互作用，但是与肌肉生长抑制素/ActRIIA复合体和/或肌肉生长抑制素/ActRIIB复合体共结合。
11.一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体结合肌肉生长抑制素，其中肌肉生长抑制素中肌肉生长抑制素与所述肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的结合所需的两个区域位于成熟肌肉生长抑制素(SEQ ID NO:25)的第21至31位和第50至60位附近的序列。
12.—种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体与肌肉生长抑制素中位于成熟肌肉生长抑制素的第21至31位和第50至60位附近的序列的两个区域相互作用，以防止对这些区域内肽键的糜蛋白酶切割。
13.权利要求1-12中任意一项所述的抗体，其中所述轻链恒定区选自K轻链和λ轻链构成的组，并且所述重链恒定区选自μ重链恒定区、δ重链恒定区、Υ重链恒定区、α重链恒定区和ε重链恒定区构成的组。
14.权利要求13所述的抗体，其中所述抗体属于选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4构成的组的亚类。
15.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-14中任意一项所述的肌肉生长抑制素特异性拮抗剂。
16.—种包含权利要求15所述的核酸的载体。
17.—种经权利要求16所述的抗体转染或转化的分离的宿主细胞。
18.一种用于生产肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的方法，所述方法包括在促进表达的条件下培养权利要求17的宿主细胞以及从培养基中回收所述肌肉生长抑制素特异性拮抗剂。
19.一种组合物，其包含权利要求1-16中任意一项所述的肌肉生长抑制素特异性拮抗剂和生理上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂。
20.一种抑制肌肉生长抑制素的至少一种活性的方法，所述方法包括将根据权利要求19所述的组合物施用至个体，使得肌肉生长抑制素的至少一种活性被部分或完全抑制。
21.权利要求20所述的方法，其中所述个体患有选自下述病况构成的组的病况:性功能减退(包括雄激素剥夺疗法导致的性功能减退，和年龄相关的性腺机能减少导致的性功能减退)，恶病质；心源性恶病质；肾源性恶病质，心脏萎缩；心发育不良；心衰；肌肉减少症；外伤性骨折；骨质疏松性骨折；骨损失(例如骨质疏松症或骨质减少)；阿狄森氏病；肌萎缩性侧索硬化或运动神经元病(ALS ；MND ;卢格里格病)；贝尔麻痹(和/或面部神经问题)；肉毒杆菌中毒；脑性麻痹；进行性神经性腓骨肌萎缩症和其它外周神经病；库欣综合征；糖尿病性神经病；格林-巴利综合征；多发性硬化；肌萎缩(包括进行性肌萎缩和脊髓性肌萎缩)；肌营养不良症(包括Becker型肌营养不良，先天性肌营养不良，Duchenne型肌营养不良，远端型肌营养不良，Emery-Dreifuss型肌营养不良，面肩肱型肌营养不良症，肢带型肌营养不良症，强直性肌营养不良症，眼咽型肌营养不良，脊髓性肌萎缩，Brown-Vialetto-Van Laere 综合征(BVVL)、Fazio-Londe (FL)综合征和特征在于进行性骨骼肌无力的其它综合征，肌肉蛋白质中的缺陷，以及肌肉细胞和组织的死亡)；重症肌无力；脊髓灰质炎；多肌炎；肌肉、肌腱和/或韧带的扭伤和拉伤；中风(和其他导致肌肉消耗的病况，例如长期不活动或卧床，肢固定(例如通过打石膏和/或上夹板)和太空飞行)；和可通过生长激素、胰岛 素生长因子-1 (IGF-1)、生长激素促分泌素和与激素-1GF-1轴相关的其他试剂治疗的病况。
全文摘要
本发明公开了选择性肌肉生长抑制素拮抗剂(包括抗体)、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法。还公开了识别第21至31位附近和第50至60位附近的构象表位的中和抗体。
文档编号A61P21/00GK103221426SQ201180044739
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月15日 优先权日2010年8月16日
发明者韩汇泉, T·阿罗拉, 陈清, 卢瀗鍹, 周小岚 申请人:安姆根公司