专利名称：疱疹性口炎病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备和使用疱疹性口炎病毒的方法和材料。例如，本发明涉及疱疹性口炎病毒、核酸分子、制备疱疹性口炎病毒的方法、以及使用疱疹性口炎病毒来治疗癌症的方法。
背景技术：
疱疹性口炎病毒(VSV)是弹状病毒科的成员。VSV基因组是负义RNA的单分子，编码五种主要多肽:核衣壳(N)多肽，磷蛋白⑵多肽，基质(M)多肽，糖蛋白(G)多肽和病毒聚合酶(L)多肽。
发明内容
本发明提供涉及疱疹性口炎病毒的方法和材料。例如，本发明提供疱疹性口炎病毒、编码VSV多肽的核酸分子、制备疱疹性口炎病毒的方法、以及使用疱疹性口炎病毒来治疗癌症的方法。如本文所述，疱疹性口炎病毒可以设计成具有如下所述的核酸分子，该核酸分子编码VSV N多肽、VSV P多肽、VSV M多肽、VSV G多肽、VSV L多肽、干扰素(IFN)多肽(例如人IFN-β多肽)、以及钠碘同向转运体(NIS)多肽(例如人NIS多肽)。编码IFN多肽的核酸可以位于编码VSV M多肽的核酸和编码VSV G多肽的核酸之间。这样的位置可以让病毒表达出一定量的IFN多肽，该量的IFN多肽能有效地激活非癌组织中的抗病毒先天性免疫应答，从而减轻潜在病毒毒性，但不会阻碍癌细胞内的有效病毒复制。编码NIS多肽的核酸可以位于编码VSV G多肽和VSV L多肽的核酸之间。这样的位置可以让病毒表达出一定量的NIS多肽，该量的NIS多肽(a)能有效地促进受感染的细胞内的碘的选择性蓄积，从而使其不仅能用放射性同位素进行病毒分布的成像，而且也能进行以受感染的癌细胞为靶点的放疗，并且(b)不会过高而对受感染的细胞产生毒性。在疱疹性口炎病毒基因组中，将编码IFN多肽的核酸设置在编码VSV M多肽的核酸和编码VSV G多肽的核酸之间，并且使编码NIS多肽的核酸位于编码VSV G多肽和VSV L多肽的核酸之间，能够产生如下所述的疱疹性口炎病毒，该疱疹性口炎病毒是活的，具有复制和扩散能力，表达合适水平的功能性IFN多肽，并且表达合适水平的 功能性NIS多肽来吸收成像和放射性病毒治疗所用的放射性碘。
在一些情况下，本发明的特征是一种包含RNA分子的疱疹性口炎病毒。所述RNA分子在3’ -5’方向上包含以下核酸序列或基本上由以下核酸序列构成:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSVL多肽的正义转录物的模板。所述IFN多肽可以是人IFN-β多肽。所述NIS多肽可以是人NIS多肽。所述病毒感染哺乳动物细胞时表达IFN多肽。所述病毒感染哺乳动物细胞时表达NIS多肽。另一方面，本发明的特征是一种包含疱疫性口炎病毒或基本上由疱疫性口炎病毒构成的组合物，所述疱疹性口炎病毒包含RNA分子。所述RNA分子在3’ -5’方向上包含以下核酸序列或基本上由以下核酸序列构成:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板。所述IFN多肽可以是人IFN-β多肽。所述NIS多肽可以是人NIS多肽。所述病毒感染哺乳动物细胞时表达IFN 多肽。所述病毒感染哺乳动物细胞时表达NIS多肽。另一方面，本发明的特征是一种包含核酸链的核酸分子，所述核酸链在3’-5’方向上包含以下核酸序列或基本上由以下核酸序列构成:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板。所述IFN多肽可以是人IFN-β多肽。所述NIS多肽可以是人NIS多肽。另一方面，本发明的特征是一种治疗癌症的方法。该方法包括以下步骤或基本上由以下步骤构成:将包含疱疹性口炎病毒的组合物给予具有癌细胞的哺乳动物。所述疱疹性口炎病毒包含如下所述的RNA分子，该RNA分子在3’ -5’方向上包含以下核酸序列或基本上由以下核酸序列构成:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板；其中，所述组合物向所述哺乳动物的给药在如下条件下进行:所述疱疹性口炎病毒感染所述癌细胞而形成受感染的癌细胞，所述受感染的癌细胞表达所述IFN多肽和所述NIS多肽，所述哺乳动物中的癌细胞的数量在所述给药后减少。所述哺乳动物可以是人。所述IFN多肽可以是人IFN-β多肽。所述NIS多肽可以是人NIS多肽。另一方面，本发明的特征是一种在哺乳动物中诱导肿瘤消退的方法。该方法包括以下步骤或基本上由以下步骤构成:将包含疱疹性口炎病毒的组合物给予患有肿瘤的哺乳动物。所述疱疹性口炎病毒包含如下所述的RNA分子，该RNA分子在3’ -5’方向上包含以下核酸序列或基本上由以下核酸序列构成:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板；其中，所述组合物向所述哺乳动物的给药在如下条件下进行:所述疱疹性口炎病毒感染所述肿瘤的肿瘤细胞而形成受感染的肿瘤细胞，所述受感染的肿瘤细胞表达所述IFN多肽和所述NIS多肽。所述哺乳动物可以是人。所述IFN多肽可以是人IFN-β多肽。所述NIS多肽可以是人NIS多肽。除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是，下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他文献都全文参考结合于本文。在抵触的情况，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和例子都只是说明性的，并不构成限制。在附图和下述描述中详细描述了本发明的一种或多种实施方式。通过说明书和附图以及权利要求书，不难了解本 发明的其它特征、目的和优点。
图1A是包含编码IFN多肽(例如人或小鼠IFNP多肽)的核酸和编码NIS多肽(例如人NIS多肽)的核酸的示范性的疱疹性口炎病毒的基因组排列的示意图。图1B是使用以Μ0Ι1.0被感染的BHK细胞测定的、包含编码绿色荧光蛋白(GFP)多肽(VSV-GFP ；(.))、VSV-mIFN-NIS( ■)或VSV_hIFN_NIS( )的核酸的疱疹性口炎病毒的病毒效价的图。图1C是在存在和不存在NIS抑制剂(+inh.)KCLO4的条件下，被VSV-mIFN_NIS或VSV-hlFN-NIS感染的细胞对放射性碘的摄取的图。VSV-GFP用作对照。图1D显示用ELISA测得的假感染细胞、VSV-mlFN-NIS(VmN)感染细胞和VSV_hIFN_NIS(VhN)感染细胞的鼠或人IFNβ分泌水平的直方图。图1E显示用100U/mL鼠IFNβ预处理细胞12小时后再用VSV-GFP(Μ0Ι1.0)感染的方法来评价的、5TGM1和MPC-1l鼠骨髓瘤细胞与Β-16鼠黑色素瘤细胞之间的IFN反应性的比较的直方图。图1F显示感染48小时后通过MTT试验来评价活细胞增殖的结果(以相对于未处理细胞的百分比(％ )作图)。用VSV-mlFN-NIS或VSV-hlFN-NIS(MOIl.0)感染后，以12小时的间隔用MTT试验测定细胞活力，如此监测5TGM1和MPC-1l癌细胞溶解。图2A显示48小时监测所得VSV-mlFN-NIS感染的BHK细胞和VSV_mIFN感染的BHK细胞中IFN多肽释放水平。用ELISA来测定上清液中的小鼠IFN多肽水平，将该ELISA设计成检测小鼠IFN多肽表达水平。图2B显示在所标明的时间(小时)VSV-mlFN-NIS感染的BHK细胞和VSV-mlFN感染的BHK细胞的1-125摄取水平。图3显示静脉内给药的VSV-1FN-NIS在肿瘤内扩散的监测结果。通过IOOyLPBS(对照)或I X 108TCID5(lVSV-mIFN-NIS的单次静脉内(IV)给药对荷载有皮下同系5TGM1骨髓瘤肿瘤的雌性6 10周龄C57B16/KaLwRij小鼠进行处理。(A)给药后，用0.5mCi Tc-99m处理，然后以24小时的间隔实施SPECT-CT成像。在经PBS处理的小鼠(n=2)和经VSV-mlFN-NIS处理的小鼠(n=5)中对肿瘤特异性Tc_99m摄取进行定量。(B)在SPECT-CT成像后收获肿瘤,通过放射自显影进行相邻肿瘤切片的结果分析(corollaryanalysis)，从而监测肿瘤内的病毒分布，并且进行了 IF。每隔24小时，用IF检测VSV抗原(染成红色)和TUNEL染色的发生细胞死亡的细胞(染成绿色)。(C)采用来源于n=3个肿瘤(在72小时为n=2)的4张照片，用ImageJ软件来定量肿瘤内的VSV和TUNEL，以相对于肿瘤区域的百分比表示。采用t检验发现，与处理后24小时相比，在处理后48小时，VSV (+)和TUNEL (+)均有显著增加(分别为P=0.0455及P=0.0163)。图4显示静脉内递送后的肿瘤内的病毒进入、扩散和癌细胞溶解的结果。(A)在静脉内VSV-mlFN-NIS给药后的(i)6小时、(ii)12小时、(iii)18小时和(iv_vi) 24小时，收获5TGM1肿瘤并通过IF进行分析，显示被VSV感染的细胞(染成绿色)和CD31染色的肿瘤血管(染成红色)。放大倍数100X。(B)经处理的肿瘤的高倍放大图，显示完整的肿瘤血管(染成红色)，该肿瘤血管紧邻于(i)被VSV感染的肿瘤细胞(染成绿色)和(ii)具有经Hoescht染色的细胞核(染成蓝色)的、发生细胞死亡的TUNEL阳性细胞(染成绿色)。(C)以6小时的间隔收获肿瘤，用ImageJ软件来测定来源于该肿瘤的肿瘤内病灶(n=8)，以平均直径对时间作图。通过t检验来测定直径增长的显著性，P值示于图片顶部。用直径衡量平均病灶体积与时间的关系。(D)VSV-mlFN-NIS处理48小时后的肿瘤照片，用于对受感染的细胞的活组织边缘进行定量，以获得细胞死亡前每一轮感染中受到感染的细胞的平均值，结果为约10个细胞。图5显示一套来源于同一小鼠的3张肿瘤照片，对小鼠实施全身SPECT-CT成像来监测病毒的分布(左上)，实施肿瘤放射自显影来显示放射性同位素摄取的特定区域(右上)，并且实施抗VSV和DAPI染色来显示与肿瘤内VSV染色相对应的表达NIS的区域(下方)。图6中的结果显示VSV-1FN-NIS全身给药具有良好的疗效。通过PBS、VSV-mlFN-NIS或VSV_hIFN_NIS的单次静脉内给药对荷载有皮下5TGM1肿瘤的小鼠进行处理。(A)通过连续卡尺测量来测定肿瘤负荷，从而计算肿瘤体积与时间的关系。(B)肿瘤应答分类为肿瘤进展、肿瘤消退或肿瘤消退但有复发。通过菲希尔精确检验(Fischer Exacttest)来测定发生肿瘤消退的小鼠的复发比例的统计学差异，表明相对于经VSV-mlFN-NIS处理的小鼠，经VSV-hlFN-NIS处理的小鼠的肿瘤复发率明显更高(P=0.009)。(C)在处理后的前5天，在n=2只(PBS处理)小鼠和n=3只(VSV-1FN-NIS处理)小鼠的血清中测定VSV中和抗体的产生，并以保护其免受500TCID5(iVSV感染的最小稀释倍数来作图。图7中的结果显示，免疫介导的肿瘤细胞消除能防止肿瘤复发。(A)接受PBS、VSV-mlFN-NIS或VSV-hlFN-NIS静脉给药处理的荷载有皮下5TGM1肿瘤的小鼠血清中鼠IFN^的ELISA定量。(B)VSV-mlFN-NIS处理后肿瘤完全消退的小鼠以及未免疫(naive)的同龄同系小鼠(分别n=6)，用I X IO7个5TGM1细胞在皮下进行刺激，并示出刺激后21天的肿瘤发生率。(C)在肿瘤植入前5天或植入后I天(在右胁皮下植入5 X IO6的5TGM1细胞)，VSV感染5TGM1细胞皮下单次给药(在左 胁植入I X IO7个以M0I10被VSV-mlFN-NIS感染的5TGM1细胞)的免疫治疗效果。对数秩(Log)存活率分析比较显示，与未经接种的小鼠相t匕，在第-5天接种能延长肿瘤植入后的小鼠的存活时间(P=0.0253)。(D)在存在或不存在去⑶4+T细胞抗体和去⑶8+Τ细胞抗体的条件下，通过(i)PBS、(ii)VSV-mlFN-NIS或(iii)VSV-mlFN-NIS的单次静脉内给药对荷载有皮下5TGM1肿瘤的小鼠进行处理。通过连续卡尺测量来测定肿瘤负荷。(E)图7D中描述的小鼠的肿瘤应答分类为肿瘤进展、肿瘤消退或肿瘤消退但有复发。通过菲希尔精确检验来比较复发率，表明相对于单独的VSV-mlFN-NIS处理，VSV-mIFN-NIS+Τ细胞消耗显示出更高的肿瘤复发率(P=0.0498)。图8A和图8B是肿瘤内感染病灶的详细免疫荧光照片。在静脉内注射VSV-mlFN-NIS后24小时收获5TGM1肿瘤，在OCT中冷冻并切片。进行IF来检测VSV (染成红色)、TUNEL染色的死细胞(染成绿色)以及Hoescht染色的肿瘤细胞细胞核(染成蓝色)。独特的大致呈球形的肿瘤内VSV感染病灶具有发生细胞死亡的VSV感染细胞中心区域、以及位于周边的受感染的活细胞的边缘区域。图9中的照片显示，功能性NIS活性局限在被VSV感染的活细胞区域。在静脉内注射VSV-1FN-NIS后48小时㈧或72小时⑶收获5TGM1肿瘤并切片。对相邻的切片进行(i)放射自显影、(ii) 20倍放大的IF和(iii) 100倍放大的IF，如此检测VSV (染成红色)和TUNEL染色的死细胞(染成绿色)。图10是包含插入转基因的疱疹性口炎病毒的示范性基因内区段的示意图。所述转基因位于参与转录的病毒起始序列和终止序列之间。将所述IFN核酸插入至NotI克隆位点，将该位点设置在VSV M和VSV G核酸序列之间。将所述NIS核酸插入至XhoI和NheI限制性位点，将所述位点设置在VSV G和VSV L核酸序列之间。
具体实施例方式本发明提供涉及疱疹性口炎病毒的方法和材料。例如，本发明提供疱疹性口炎病毒、编码VSV多肽的核酸分子、制备`疱疫性口炎病毒的方法、使用疱疫性口炎病毒来治疗癌症的方法。如本文所述，疱疹性口炎病毒可以设计成具有如下所述核酸分子，该核酸分子编码VSV N多肽、VSV P多肽、VSV M多肽、VSV G多肽、VSV L多肽、IFN多肽、以及NIS多肽。应理解，本文所述的疱疹性口炎病毒相关序列结合在质粒中，该质粒编码病毒基因组的正义cDNA，由此产生疱疹性口炎病毒的负义基因组。因此应理解，编码VSV多肽的核酸序列可以是例如RNA序列，该RNA序列是编码(例如通过指导翻译)所述多肽的正义转录物的模板。编码IFN多肽的核酸可以位于编码VSV M多肽的核酸的下游(图1A)。例如，编码IFN多肽的核酸可以位于编码VSV M多肽的核酸和编码VSV G多肽的核酸之间。这样的位置能让病毒表达出一定量的IFN多肽，该量的IFN多肽能有效地激活非癌组织中的抗病毒先天性免疫应答，从而减轻潜在病毒毒性，但不会阻碍癌细胞内的有效病毒复制。任何合适的编码IFN多肽的核酸均可插入至疱疹性口炎病毒的基因组中。例如，可将编码IFN-β多肽的核酸插入疱疹性口炎病毒的基因组中。可插入疱疹性口炎病
毒基因组中的编码IFN-β多肽的核酸的例子包括但不限于:序列如GenBankk'登录号
NM_002176.2(GI编号50593016)所示编码人IFN-β多肽的核酸，序列如GenBankκ'登录号 NM_010510.1 (GI 编号 6754303)、BC119395.1 (GI 编号 111601321)或 BC119397.1 (GI编号111601034)所示编码小鼠IFN- β多肽的核酸，以及序列如GenBanP登录号NM_019127.1 (GI编号9506800)所示编码大鼠IFN-β多肽的核酸。可将编码NIS多肽的核酸设置在编码VSV G多肽的核酸的下游(图1Α)。例如，可将编码NIS多肽的核酸设置在编码VSV G多肽的核酸和编码VSV L多肽的核酸之间。这样的位置可以让病毒表达出一定量的NIS多肽，该量的NIS多肽(a)能有效地促进受感染的细胞内的碘的选择性蓄积，从而使其不仅能用放射性同位素进行病毒分布的成像，而且也能进行以受感染的癌细胞为靶点的放疗，并且(b)不会过高而对受感染的细胞产生毒性。任何合适的编码NIS多肽的核酸均可插入至疱疹性口炎病毒的基因组中。例如，可将编码人NIS多肽的核酸插入疱疹性口炎病毒的基因组中。可以插入疱疹性口炎病毒基因组的编码NIS多肽的核酸的例子包括但不限于:序列如GenBankft登录号NM_000453.2 (GI 编号 164663746)、BC105049.1 (GI 编号 85397913)或 BC105047.1 (GI 编号85397519)所示编码人NIS多肽的核酸，序列如GenBank^登录号NM_053248.2 (GI编号162138896)、AF380353.1 (GI 编号 14290144)或 AF235001.1 (GI 编号 12642413)所示编码小鼠NIS多肽的核酸，序列如GenBankli登录号XM_524154(GI编号114676080)所示编码黑猩猩NIS多肽的核酸，序列如GenBankfc登录号XM_541946 (GI编号73986161)所示编码犬NIS多肽的核酸，序列如GenBank"疗汆号XM_581578(GI编号297466916)所示编码牛NIS多肽的核酸，序列如GenBankK:登录号NM_214410(GI编号47523871)所示编码猪NIS
多肽的核酸，以及序列如GenBank*登录号NM_052983(GI编号158138504)所示编码大鼠NIS多肽的核酸。可将插入疱疹性口炎病毒基因组中的核酸(例如编码NIS多肽的核酸和/或编码IFN多肽的核酸)设置在如下所述病毒基因内区段之间，这些基因内区段包含通过病毒聚合酶来转录插入的核酸序列时所需的基因转录起始密码子和终止密码子。这样的病毒基因内区段的例子包括但不限于图10中所列的例子。本发明提供的 编码VSV N多肽、VSV P多肽、VSV M多肽、VSV G多肽和VSV L多肽的疱疹性口炎病毒核酸序列可以来源于GenBanf登录号NC_001560 (GI编号9627229)的VSV印第安纳株，或者也可以来源于VSV新泽西株。另一方面，本发明提供一种包含核酸分子(例如RNA分子)的疱疹性口炎病毒，所述核酸分子在3’ -5’方向上具有以下序列:一种核酸序列，其是编码VSVN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板。这种疱疹性口炎病毒能感染细胞(例如癌细胞)，并指导受感染的细胞表达IFN多肽和NIS多肽。任何合适的方法均可用于将核酸(例如编码IFN多肽的核酸和/或编码NIS多肽的核酸)插入至疱疹性口炎病毒的基因组中。例如，它处所描述的方法(Obuchi等，J.Virol.，77(16):8843-56(2003)) ;Goel 等,Blood, 110(7):2342-50(2007));和 Kelly 等，J.Virol., 84 (3):1550-62(2010))可以用于将核酸插入至疱疹性口炎病毒的基因组中。任何合适的方法均可用于鉴定包含本文所述的核酸分子的疱疹性口炎病毒。这种方法包括但不限于:PCR以及核酸杂交技术如Northern和Southern分析。在一些情况下,可用免疫组化和生化技术检测特定核酸分子所编码多肽的表达来确定疱疹性口炎病毒是否包含该特定核酸分子。另一方面，本发明提供这样一些核酸分子，这些核酸分子编码VSV N多肽、VSV P多肽、VSV M多肽、IFN多 肽、VSV G多肽、NIS多肽和VSV L多肽。例如，本发明提供的核酸分子可以是包含以下核酸序列的单个核酸分子:编码VSV N多肽的核酸序列、编码VSV P多肽的核酸序列、编码VSV M多肽的核酸序列、编码IFN多肽的核酸序列、编码VSV G多肽的核酸序列、编码NIS多肽的核酸序列、以及编码VSV L多肽的核酸序列。本文所用的术语“核酸”包括RNA (例如病毒RNA)和DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成(例如化学合成的)DNA。核酸可以是双链或单链。单链核酸可以是正义链或反义链。另外，核酸可以是环状或线性。本发明还提供一种治疗癌症的方法(例如减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、或减少活肿瘤细胞的数量)。例如，本发明提供的疱疹性口炎病毒可以给予罹患癌症的哺乳动物，以减小肿瘤尺寸、抑制癌细胞或肿瘤的生长和/或减少该哺乳动物中的活癌细胞的数量。本发明提供的疱疹性口炎病毒可以在宿主细胞内增殖，以增加该病毒的可用拷贝数，典型的是增加至少2倍(例如增加5至10倍、增加50至100倍、增加500至1000倍、或者甚至增加5000至1000倍)。在一些情况下，本发明提供的疱疹性口炎病毒可以在标准细胞培养基中(例如在补充有5 10%胎牛血清的DMEM或RPM1-1640中于37°C在5% CO2下)扩增，直至达到所需的浓度。病毒效价一般通过将细胞(例如BHK-21细胞)接种至培养基中来测定。本发明提供的疱疹性口炎病毒可以通过例如直接注射至癌细胞团(例如肿瘤)中或静脉内递送给癌细胞的方法给予癌症患者。本发明提供的疱疹性口炎病毒可以用于治疗不同类型的肿瘤，包括但不限于:骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、黑色素瘤、胶质瘤、淋巴瘤、间皮瘤以及肺癌、脑癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌和头颈癌。本发明提供的疱疹性口炎病毒可以包含在生物相容性溶液或药学上可接受的递送载体中、通过癌细胞团中的直接给药(例如肿瘤内)或全身给药(例如静脉内)来给予患者。合适的药物制剂部分取决于用途和进入途径，例如是经皮肤还是通过注射。剂型不应阻碍组合物或制剂到达靶细胞(例如希望病毒递送至的细胞)和发挥其效果。例如，注射至血流中的药物组合物应当为可溶性。各患者的给药剂量彼此不同(例如取决于肿瘤的尺寸)，有效剂量可以通过下述方法确定:将已证明安全的病毒浓度设为下限，递增至最高IO12Pfu的剂量，同时监测癌细胞生长的衰减和不良副作用。治疗有效剂量一般能致癌细胞数量减少至少10%或肿瘤尺寸减小至少10%。可用剂量递增研究来探索给定病毒治疗方案的理想效果(参照例如Nies和 Spielberg, “治疗学原理(Principles of Therapeutics)，” 见 Goodman&Gilman’ s治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics), Hardman 等著，McGraw-Hill, NY, 1996，43-62 页)。本发明提供的疱疹性口炎病毒可以以例如约IO3Pfu至约IO12Pfu(例如约105pfu至约IO12PfuJ^ 106pfu至约IO11Pfu或约106pfu至约101Qpfu)的剂量来递送。可以重复给予治疗有效剂量。重复给药在下述情况下是合适的:临床症状或肿瘤尺寸观察或监测试验表明，癌细胞团或肿瘤已停止萎缩，或病毒活性程度正在下降而肿瘤仍然存在。重复给药可以采用与最初所用相同的途径或改用其它途径来给药。治疗有效剂量可以通过多个非连续剂量(例如隔天或隔周)来递送，并且在一个实施方式中提供I 12个剂量。或者，本发明提供的疱疹性口炎病毒的治疗有效剂量可以通过缓释制剂来递送。在一些情况下，本发明提供的疱疹性口炎病毒可与促进病毒在癌细胞内复制和扩散的药剂或与保护非癌细胞不受病毒毒性影响的药剂一起组合递送。这些药剂的例子如它处所述(Alvarez-Breckenridge等，Chem.Rev.，109(7):3125-40 (2009))。本发明提供的疱疹性口炎病毒可以使用缓释装置来给药。例如，疱疹性口炎病毒的缓释制剂可包括聚合物赋形剂(例如溶胀性或非溶胀性凝胶，或胶原)。可将治疗有效剂量的疱疹性口炎病毒包含在聚合物赋形剂中，将该赋形剂/病毒组合物植入癌细胞位点(例如紧邻于肿瘤或在肿瘤内)。在体液的作用下，赋形剂逐渐溶解，有效剂量的病毒在一段时间内持续释放。或者 ，缓释装置中可以包含一系列的交替的活性层和间隔物层。各活性层一般含有包埋在赋形剂中的一定剂量的病毒，而各间隔物层一般仅含有赋形剂或含有低浓度(例如低于有效剂量)的病毒。随着装置的各层的依次溶解，可递送脉冲式剂量的病毒。间隔物层的大小/配方决定剂次间的时间间隔，可根据现用治疗方案来优化。本发明提供的疱疹性口炎病毒可以直接给药。例如，可将病毒直接注射至可透过皮肤触及的肿瘤内(例如乳腺癌肿瘤)。这种方法还可以采用超声引导。或者，病毒的直接给药可以通过导管线或其它医用接入装置来实现，并且可以与用于定位癌细胞团的成像系统联用。根据该方法，一般可使用插入医用接入装置内的导丝将可植入的给药装置置于紧邻于癌细胞团的位置。可将有效剂量的本发明疱疹性口炎病毒直接给予外科手术开放区域内可见的癌细胞团。在一些情况下，本发明提供的疱疹性口炎病毒可以全身递送。例如，全身递送可以是静脉递送，例如静脉注射或采用设计成能给予多个剂量药物的静脉递送装置。这种装置包括但不限于:带翼输液针、外周静脉内导管、中线导管、经外周静脉置入中心静脉导管、以及通过外科手术置入的导管或注射口。本发明疱疹性口炎病毒治疗过程可以通过评价临床症状的改变或通过直接监测癌细胞数量或肿瘤尺寸来监测。对实体瘤而言，病毒治疗的有效性可以通过测定治疗前后的肿瘤的尺寸或重量来评价。肿瘤尺寸可以直接测量(例如用卡尺)，或者采用成像技术(例如X光、磁共振成像或计算机断层扫描)或根据非成像光学数据(例如光谱数据)的评价来测量。对于癌细胞团(例如白血病细胞)而言，病毒治疗的有效性可以通过测定治疗前后的患者的循环中的白血病细胞的绝对数量来确定。病毒治疗的有效性也可以通过监测癌症特异性抗原的水平来评价。癌症特异性抗原例如包括癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CA125、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原15_3和糖类抗原19-4。以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。实施例实施例1-使用表达IFN多肽和/或NIS多肽的疱疹性口炎病毒的单剂静脉内病毒治疗介导癌细胞溶解性肿瘤减灭和残留病的免疫治疗根除采用与它处所述方法(Obuchi等，J.Virol.,77(16):8843-56(2003)) ;Goel 等，Blood, 110(7):2342-50(2007)) ;Kelly 等,J.Virol., 84(3): 1550-62 (2010);和 Lawson等，Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA, 92 (10): 4477-81 (1995)勘误于:Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA, 92 (19):9009(1995))类似的方法，制备表达小鼠IFN β多肽(VSV-mlFN)的疱疹性口炎病毒和同时表达小鼠IFNP多肽和人NIS多肽(VSV-mlFN-NIS;图1A)的疱疹性口炎病毒。类似的，制备表达人IFNP多肽和人NIS多肽(VSV-hlFN-NIS;图1A)的疱疹性口炎病毒。简要来说，采用PCR产生具有特定的限制性位点的所需转基因的核酸序列。将转基因插入质粒中的特定插入位点，该质粒在5’ -3’方向上编码VSV基因组的正义链联合编码所需T7聚合酶的牛痘病毒感染和VSV病毒蛋白N、P、L转染，扩增以上经修饰的质粒并回收感染性病毒。藉此生成所需的病毒多肽，籍这些病毒多肽产生负义病毒基因组并组装成感染性病毒颗粒。扩增回收的病毒，用合适的细胞系(例如BHK-21细胞)培养物来测定感染
性剂量。用于制造这些疱疹性口炎病毒的小鼠IFNP多肽的核酸序列如GenBank :登录号NM_010510.KGI编号6754303)所列。用于制造这些疱疹性口炎病毒的人IFNP多肽的核酸序列如GenBanku''登录号NM_002176.2(GI编号50593016)所列。用于制造这些疱疹性
口炎病毒的人NIS多肽的核酸序列如GenBankli登录号NM_000453.2 (GI编号164663746)所列。 将编码人NIS多肽的核酸插入在编码VSV G多肽的核酸的上游时，没有产生功能性病毒颗粒，这是因为NIS表达水平对细胞保持活力和促使病毒增殖而言过高。将编码NIS多肽的核酸插入在编码VSV G多肽的核酸的下游能够导致产生表达功能性NIS的病毒颗粒，其原因在于，NIS多肽产量较小，由此不仅允许高效的病毒增殖，还提供了对受感染细胞内功能性碘摄取而言足量的NIS多肽。将编码IFN多肽的核酸插入至编码VSV M多肽的核酸和编码VSV G多肽的核酸之间获得了能感染细胞的病毒，并且在受感染细胞的上清液中检测到明显更高水平的IFN多肽表达(图2A)。在体外，VSV-1FN-NIS能在受感染的细胞内高效地复制，还能表达高水平的功能性NIS，这可以通过受感染的细胞摄取放射性碘的能力看出来(图2B)。用BHK(仓鼠)细胞测定两种VSV-1FN-NIS病毒的纯化原种的效价(图1B)，收获细胞上清液以确认病毒编码的IFNβ的分泌。在分别被VSV-hlFN-NIS和VSV-mlFN-NIS感染的BHK细胞的上清液中检测到高浓度的人或鼠IFNii (图1D)，放射性碘摄取研究确认到病毒感染细胞内的高氯酸盐敏感的(例如NIS介导的)放射性碘的富集(图1C)，在高复数感染后24小时达到最大值。为了评价VSV-1FN-NIS病毒的体内活性，选择5TGM1和MPC-1l鼠骨髓瘤细胞系，这是因为它们在免疫健全的同系小鼠中可靠地形成皮下或原位的肿瘤(Lichty等，Hum.Gene Ther.，15:821-831 (2004)和 Turner 等，Human Gene Therapy, 9:1121-1130 (1998)) 确认两种细胞系都容易受到VSV-1FN-NIS的感染(图1E)，导致功能性NIS表达、IFN^释放，进而导致细胞杀伤。为了确定静脉内给药的VSV-1FN-NIS病毒是否能从肿瘤血管中渗出并扩散至整个肿瘤实质，使皮下5TGM1或MPC-1l肿瘤在同系小鼠内生长(直径约5mm)，进行108TCID5(iVSV-1FN-NIS病毒的单剂静脉内给药，并使用99mTc04(半衰期6小时)作为示踪剂，通过每天的SPECT/CT来无创监测病毒编码的NIS表达的生物分布(图3A)。这些示踪剂摄取研究表明，病毒能高效地从肿瘤血管中渗出，并表明其可以在皮下肿瘤中迅速地扩散。为了确认病毒真正地在肿瘤实质中复制和扩散，在VSV-1FN-NIS病毒给药后24、48和72小时进行SPECT/CT成像，然后立即收获选定的肿瘤，实施(i)放射自显影来检测活的表达NIS的肿瘤细胞；(ii)免疫荧光(IF)来检测VSV抗原；以及(iii) TUNEL染色来鉴定死亡或濒死的细胞。对图3B所示的数据的细致分析表明，存在一个近似球形的VSV感染大区域,该区域内，位于中心的肿瘤细胞发生凋亡,而位于周边的肿瘤细胞仍然存活(也见图8)、表达NIS (图5)并富集99mTc04(图9)。IF和TUNEL数据的定量分析表明，与病毒给药后24小时相比,在病毒给药后48小时,被病毒感染的细胞和凋亡细胞的数量显著增加(图3C)。在感染后72小时，不断扩大的VSV感染区域大幅融合，导致大规模的肿瘤坏死(图3B和图8)。在病毒给药后的前24小时内，在非常早的时间点进行其它实验来鉴定病毒扩散动力学(图4A)。在病毒IV给药后6小时收获肿瘤切片，VSV和⑶31阳性血管染色显示散布的各个被VSV感染的细胞，它们大都靠近肿瘤血管。在12小时，可见被病毒感染的细胞的小团簇，在18小时，它们显著生长，直至24小时，它们表现出上文中描述的典型表象——中心凋亡而周边存活。这些⑶31/VSV双重染色的切片(图4A，图1 vi)的分析表明，衬有内皮细胞的肿瘤血管不受VSV感染，即使其完全被受VSV感染的肿瘤细胞包围，如高倍放大的图4B所示。在6、12、18和24小时的时间点对感染中心的平均直径(以穿过的细胞数计)作图(图4C)，显示病毒以恒定的速率离心扩散，约2小时即可感染逐渐扩大球体内顺次排列的每一细胞层。因此，进入各`感染中心的新细胞自然增长率随着感染的进展而提高，可以估计，在病毒递送后24小时，各中心包含约10000个细胞。为了确定在体内从感染到受感染的肿瘤细胞死亡的大致时间，在肿瘤内感染不断推进的前缘处测定被VSV感染的活(例如TUNEL阴性、VSV阳性)细胞外缘的平均直径，结果为约10个细胞(图4D)。因此，病毒离心扩散，用约2小时传染至相邻的细胞(图4C)，但直至受感染细胞外缘推进到10个细胞直径时才发生细胞死亡(图4D)。综合这些观测结果可以得出结论，受感染的细胞需经约20小时变为凋亡状态。为了确定病毒的高效渗出和迅速的肿瘤内扩散是否与肿瘤消退相关，用18Tcid50VSV-1FN-NIS的单剂静脉内给药来处理具有皮下5TGM1肿瘤的另一组C57KaLwRi j小鼠，然后进行更长期的每日健康状况检查和肿瘤测量。大多数经VSV-mlFN-NIS和VSV-hlFN-NIS处理的动物的肿瘤迅速消退(图6A)。偶见的非常早的死亡与神经毒性无关，推测其原因在于快速肿瘤溶解综合征，尚待正式证明。有趣的是，病毒治疗的给药后两至三周，在大多数经VSV-hlFN-NIS处理的动物中可见肿瘤复发，而在经VSV-mlFN-NIS处理的动物中未见肿瘤复发(图6A和6B)，这表明在该同系免疫健全小鼠模型中，病毒编码的小鼠IFNP能激活完全根除残留病的机制，而人IFNP不能。并未尝试用VSV-1FN-NIS来进行复发肿瘤的复治，其原因在于，此时所有小鼠均已发展出高效价的抗VSV抗体(图6C)。
经病毒处理的动物的血清IFN0水平的测定表明，在病毒给药后的很早的时间，被病毒感染的肿瘤细胞就已将该病毒编码的细胞因子释放至血流中(图7A)。干扰素β的抗肿瘤作用包括直接抑制肿瘤细胞增殖、激活天然杀伤细胞、抗血管发生、以及抗肿瘤T细胞应答的增强。然而，体外的5TGM1和MPCll骨髓瘤细胞的增殖甚至在高浓度的IFNP下也未受到不利影响(图1F)。另外，CD31或CD3染色的经病毒处理的肿瘤切片的分析并未显示任何抗血管发生活性抑制迹象，也未显示任何宿主T淋巴细胞的肿瘤浸润迹象(图4Β)。然而我们发现，经病毒处理且肿瘤未复发的动物对使用5TGM1肿瘤细胞的再次刺激有抗性(图7Β)，表明小鼠已发展出5TGM1特异性抗肿瘤免疫力。为了确定同系VSV感染骨髓瘤细胞是否能引发特异性的抗骨髓瘤免疫应答，在皮下植入肿瘤细胞前5天或植入后I天，通过IO7个VSV感染5TGM1细胞的单次皮下注射来免疫同系小鼠。肿瘤生长迟滞，使得在肿瘤刺激前5天接受了免疫的小鼠的存活率显著提高(图7C)，表明被VSV感染的肿瘤细胞引发了适度的抗肿瘤免疫应答。然而，被VSV感染的肿瘤细胞疫苗即使在荷载同样小的已确立的肿瘤的小鼠中也未显示出可检测的抗肿瘤活性，这表明抗肿瘤免疫只对最小疾病负荷有效。为了确定经VSV-mlFN-NIS处理的小鼠中的低肿瘤复发率是否可归因于病毒编码的IFN β增强抗肿瘤T细胞应答，使用抗CD4抗体和抗CD8抗体的组合来去除T细胞。无论T细胞去除情况如何，肿瘤对VSV-mlFN-NIS静脉给药治疗的应答都同样良好，但在去T细胞小鼠中，肿瘤复发率明显更高(图7D和7E)。这些结果表明，VSV-mlFN-NIS的癌细胞溶解性肿瘤减灭后的残留肿瘤细胞的根除由肿瘤特异性T细胞介导，病毒编码的小鼠IFN3的刺激这些肿瘤特异性T细胞的扩增。Goel 等的参考文献(Blood, 110(7):2342-50(2007))中描述了 VSV-Λ 51-NIS病毒，该VSV- Δ 51-NIS病毒在免疫健全5TGM1同系多发性骨髓瘤小鼠模型(C57B1/KalwRijHsd)中显示出较弱的癌细胞溶解功效，与该VSV-Λ 51-NIS病毒相比，VSV-1FN和VSV-1FN-NIS病毒显示出更好的复制动力。另外，与VSV-Λ 51-NIS病毒相比，VSV-1FN-NIS病毒在体外诱导出更高的NIS多肽表达。体内治疗研究证明，VSV-1FN和VSV-1FN-NIS病毒的单剂静脉内给药都能促进肿瘤消退，显著延长荷载有皮下或原位5TGM1骨髓瘤肿瘤的免疫健全小鼠的存活时间。在经VSV-1FN-NIS病毒处理的小鼠中进行的Tc-99m成像研究显示，在病毒肿瘤内扩散的同时，肿瘤特异性病毒NIS多肽表达和放射性同位素摄取增力口。而且，用VSV-1FN和VSV-1FN-NIS病毒处理后，没有神经毒性的迹象。这些结果表明，VSV-1FN-NIS病毒可以用作肿瘤(例如多发性骨髓瘤)的治疗剂，该治疗剂可以与放射性同位素组合用于病毒生物分布的无创成像及放射性病毒治疗。本发明提供的结果证明，编码人IFNP和人NIS的疱疹性口炎病毒在多发性骨髓瘤的免疫健全小鼠模型的体内显示出癌细胞溶解功效。全身给药的病毒能在肿瘤内复制，表达足够高水平的功能性NIS多肽，发挥出癌细胞溶解活性来诱导肿瘤消退并提高存活率，并且显示出比VSV Δ 51-NIS病毒更好的NIS表达和癌细胞溶解活性。细胞培养和病毒在补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的培养基中培养细胞系。从美国典型细胞培 养物保藏中心(ATCC)获得的BHK-21和MPC-1I细胞在杜尔贝科改良的伊格培养基(Dulbecco Modified eagles medium(DMEM))中生长。从 BabatundeOyajobi 博士(UT 卫生科学中心(UT Health Sciences Center),圣安东尼奥，TX)处获得5TGM1细胞，在伊可夫改良的杜尔贝科培养基(Iscove，s modified Dulbeccomedium(IMDM))中生长。从R.Vile处获得B-16鼠黑色素瘤细胞，在DMEM中生长。经试验，所有细胞系均无支原体污染。在包含VSV正义链互补基因组的PVSV-XN2质粒中的Μ/G和G/L基因接头处设置限制性位点，该接头之前是功能性转基因表达所需的推定VSV基因间序列(TATG (A) ,CTAACAG)(Schnell等，J.Virol.，70:2318-2323 (1996))。通过PCR产生侧接限制性位点的编码鼠IFNL人IFNP和NIS基因的cDNA。将鼠或人IFNP插入NotI位点(Μ/G接头)，而NIS插入XhoI和NheI位点(G/L接头)，从而生成VSV-1FN-NIS质粒。采用它处所描述的方法(Whelan 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:8388-8392(1995))来拯救 VSV-1FN-NIS 病毒。然后将病毒在BHK-21细胞中扩增，通过细胞上清液的过滤进行纯化，用10% w/v蔗糖离心沉淀。在BHK-21细胞中测定病毒效价，使用连续稀释的病毒原种进行感染，测定半数组织培养感染剂量(TCID5tl),该半数组织培养感染剂量用斯皮尔曼和寇氏方程(Spearman andKarber equation)算出。体外病毒鉴定感染BHK-21细胞(M0I1.0，1小时，37°C )后，测定上清液中的病毒效价。为了测定体外放射性碘摄取，将细胞在放射性标记的NaI (I125，1xlO5Cpm)+/-100 μ M高氯酸钾(KClO4)的存在下，在含1OmM HEPES (Ν-2-羟基乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸，ρΗ7.3)的汉克斯缓冲盐溶液(HBSS)中培育。采用针对鼠或人IFNii的酶联免疫吸附试验(ELISA) (PBL干扰素源公司(PBL Interferonsource))来测定受感染细胞上清液中的IFNβ分泌。为了比较IFN反应性，将细胞用100U/mL鼠IFNP预培育12小时，然后用VSV-GFP感染。通过MTT试验(ATCC)来评价活细胞的增殖。在感染后的特定时间点，类似地通过MTT试验来监测VSV-1FN-NIS(Μ0Ι1.0)对5TGM1和MPC-1l的杀伤，以相对于未处理细胞的百分比表示。体内研究分别在6 10周龄同系雌性C57B16/KaLwRij (Harlan,荷兰)或Balb/c小鼠(Taconic)的右胁皮下植入5X IO6个5TGM1或MPC-11鼠骨髓瘤细胞。通过连续卡尺测量来测定肿瘤负荷。通过尾静脉注射对小鼠进行IX 108/0.1mL VSV-1FN-NIS或等体积PBS的单次静脉内给药。在腹膜内(IP)给予0.5mCi Tc-99m后，实施SPECT-CT成像，并如它处所述进行定量(Penheiter 等,AJR Am.J.Roentgenol., 195:341-349 (2010))。高分辨率肿瘤分析以24小时为间隔收获肿瘤，在OCT中冷冻待切片。通过放射自显影和免疫荧光(IF)来分析肿瘤切片:(i)使用Mayo诊所的病毒载体制备实验室内部生产的多克隆兔抗VSV抗体、然后使用Alexa标记的抗兔IgG第二抗体(英杰公司(Invitrogen),分子探针(Molecular Probes))来分析 VSV 抗原；(ii)通过 TUNEL 染色(DeadEnd FluorometricTUNEL试剂盒，普洛麦格公司(Promega))来分析细胞死亡；(iii)使用HoeSCht33342 (英杰公司)来分析细胞核。用n=3个经VSV-mlFN-NIS处理的肿瘤(在处理后72小时为n=2个肿瘤)的4张随机照片进行成像定量，用ImageJ软件获取VSV或TUNEL (+)区域，以相对于肿瘤区域的百分比表示。以6小时为间隔收获肿瘤，通过该肿瘤的IF分析，使用大鼠抗小鼠⑶31抗体(BD法明基公司(BD Pharmingen))来检测VSV抗原和肿瘤血管。肿瘤内病灶尺寸如下所述测定:测量来源于2个肿瘤的7 8个病灶，用直径除以平均肿瘤细胞尺寸(基于50个独立细胞的直径测量值)，从而获得以细胞数为单位的病灶直径。用公式v=4/3 (Ji *r3)来估算近似球状的病灶的体积。根据来源于VSV-1FN-NIS给药后48小时收获的n=3个肿瘤的IF照片，类似地进行被VSV感染的活细胞外缘的平均宽度的测定。免疫活性小鼠中的免疫研究为了测定抗病毒抗体的产生，将连续2倍稀释的热灭活血清和500TCTID5(iVSV_GFP一起预培育，然后用于感染BHK-21细胞。对产生VSV诱导的CPE的最小血清稀释度作图。在血清中通过ELISA来测定体内IFNP分泌。在同系小鼠的左胁皮下注射IXlO7个被VSV-mlFN-NIS感染的细胞(M0I10.0)，如此进行5TGM1接种。在C57B16/KaLwRi j小鼠中，按照3次/周进行抗CD4抗体和抗CD8抗体(各50yg)的腹膜内给药，然后每周给予维持剂量，从而进行T细胞消耗研究。统计方法目测评价异常值或显著偏离正常值的数值，如前所述按需进行t检验。在所有情况下，都给出未经多重比较校正的双尾P值。根据卡普兰生存曲线(Kaplan meier survivalcurves)，使用对数秩检验来进行存活率差异的比较。因为样本量小，所以采用菲希尔精确检验来比较动物研究中的肿瘤复发率。其它实施方式应理解，虽然结合详述描述了本发明，但上述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明范围由所附权利要求书的范围确定。 其它方面、优点和修改属于所附权利要求书的范围。
权利要求
1.一种疱疹性口炎病毒，其包含如下所述的RNA分子，所述RNA分子在3’ -5’方向上包含以下核酸序列:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板。
2.如权利要求1所述的病毒，所述IFN多肽是人IFN-β多肽。
3.如权利要求1所述的病毒，所述NIS多肽是人NIS多肽。
4.如权利要求1所述的病毒 ，当所述病毒感染哺乳动物细胞时，所述病毒表达所述IFN多肽。
5.如权利要求1所述的病毒，当所述病毒感染哺乳动物细胞时，所述病毒表达所述NIS多肽。
6.一种包含疱疹性口炎病毒的组合物，所述疱疹性口炎病毒包含如下所述的RNA分子，所述RNA分子在3’ -5’方向上包含以下核酸序列:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板。
7.如权利要求6所述的组合物，所述IFN多肽是人IFN-β多肽。
8.如权利要求6所述的组合物，所述NIS多肽是人NIS多肽。
9.如权利要求6所述的组合物，当所述病毒感染哺乳动物细胞时，所述病毒表达所述IFN多肽。
10.如权利要求6所述的组合物，当所述病毒感染哺乳动物细胞时，所述病毒表达所述NIS多肽。
11.一种包含核酸链的核酸分子，所述核酸链在3’ -5’方向上包含以下核酸序列:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSVM多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板。
12.如权利要求11所述的核酸分子，所述IFN多肽是人IFN-β多肽。
13.如权利要求11所述的核酸分子，所述NIS多肽是人NIS多肽。
14.一种治疗癌症的方法，所述方法包括将包含疱疹性口炎病毒的组合物给予具有癌细胞的哺乳动物的步骤；其中，所述疱疹性口炎病毒包含如下所述的RNA分子，所述RNA分子在3’-5’方向上包含以下核酸序列:一种核酸序列，其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板；其中，所述组合物向所述哺乳动物的给药在如下条件下进行:所述疱疹性口炎病毒感染所述癌细胞而形成受感染的癌细胞，所述受感染的癌细胞表达所述IFN多肽和所述NIS多肽，所述哺乳动物中的癌细胞的数量在所述给药后减少。
15.如权利要求14所述的方法，所述哺乳动物是人。
16.如权利要求14所述的方法，所述IFN多肽是人IFN-β多肽。
17.如权利要求14所述的方法，所述NIS多肽是人NIS多肽。
18.—种在哺乳动物中诱导肿瘤消退的方法，所述方法包括将包含疱疹性口炎病毒的组合物给予患有肿瘤的哺乳动物的步骤；其中，所述疱疹性口炎病毒包含如下所述的RNA分子，所述RNA分子在3’-5’方向上包含以下核酸序列:一种核酸序列,其是编码VSV N多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV P多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV M多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码IFN多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码VSV G多肽的正义转录物的模板；一种核酸序列，其是编码NIS多肽的正义转录物的模板；以及一种核酸序列，其是编码VSV L多肽的正义转录物的模板；其中，所述组合物向所述哺乳动物的给药在如下条件下进行:所述疱疹性口炎病毒感染所述肿瘤的肿瘤细胞而形成受感染的肿瘤细胞，所述受感染的肿瘤细胞表达所述IFN多肽和所述NIS多肽。
19.如权利要求18所述的方法，所述哺乳动物是人。
20.如权利要求18所述的方法，所述IFN多肽是人IFN-β多肽。
21.如权利要 求1 8所述的方法，所述NIS多肽是人NIS多肽。
全文摘要
本发明提供涉及疱疹性口炎病毒的方法和材料。例如，本发明提供疱疹性口炎病毒、编码VSV多肽的核酸分子、制备疱疹性口炎病毒的方法、使用疱疹性口炎病毒来治疗癌症的方法。
文档编号A61K31/7088GK103180446SQ201180050698
公开日2013年6月26日 申请日期2011年9月1日 优先权日2010年9月2日
发明者S·J·拉赛尔, S·奈克 申请人:梅约医学教育与研究基金会