分泌的热休克蛋白-90α（Hsp90α）片段作为用于对抗一系列人类实体肿瘤的单克隆抗体药 ...的制作方法
【专利摘要】本发明提供利用针对来自肿瘤的Hsp90α的不同类型抑制剂来治疗HIF-1α过表达人类癌症、抑制HIF-1α过表达肿瘤侵袭和防止肿瘤转移和/或促进肿瘤预防的方法。
【专利说明】分泌的热休克蛋白-90a (Hsp90a )片段作为用于对抗一系列人类实体肿瘤的单克隆抗体药物的疫苗或表位或小分子药物的靶点
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求2010年10月11递交的US61/391，776的优先权，其内容通过引用并入本文。
[0003]政府特许权
[0004]本发明是在美国国家卫生研究院授予的批准号R01GM066193、R01GM067100、GMAR67100-01、AR33625和R01AR46538的政府资助下完成的。美国政府享有本发明的一定权利。
【技术领域】
[0005]本发明涉及利用Hsp90 a或其片段的抑制剂治疗HIF-1 a过表达(即结构性存在)肿瘤。·
【背景技术】
[0006]本文引用的所有出版物通过引用方式全文并入，其并入程度如同每个单独的出版物或专利申请被专门且单独地通过引用方式并入一样。下面的描述包括对于理解本发明可能有用的信息。不承认本文中提供的任何信息是要求保护的本发明的现有技术或与之相关，也不承认任何明确或隐含引用的出版物是现有技术。
[0007]在常氧(约8%的组织氧含量)正常细胞中，组织氧平衡主转录因子的一个关键亚单位即缺氧诱导因子-1 a (HIF-1 a )不断地合成，然后立即进行O2依赖性脯氨酰羟化。该变性使HIF-1 a蛋白靶向到泛素化蛋白酶体降解机制(23，29)。结果，HIF_1 a的整体稳态水平保持在低水平，防止HIF-1 a与HIF-1 β 二聚。然而，在缺氧条件下，HIF_1 α的羟化反应和随后的降解受到抑制，导致细胞中的HIF-1 a快速增加。增加的HIF-1 a蛋白随后与稳态的HIF-1 β (ARNT)二聚形成主转录复合蛋白HIF-1。HIF-1进而转位到细胞核中并以p300/CBP依赖方式调节包含缺氧反应元件(HRE)的基因的表达(I)。
[0008]与此相反，在许多实体肿瘤中发现的组织缺氧是由于快速增殖的肿瘤细胞在周围血管网上过度生长导致的，这种过度生长产生比从最近的血液循环的氧供应的范围更远的距离(3，29)。据推测，在持续缺血的情况下，肿瘤细胞进行基因改变以适应继续生存、扩张和发展的替代和自支持机制，直到在其周围构建起新生血管。HIF-1 α的去调控表达是肿瘤细胞中明确表征的变化(23)，其归因于HIF-1 a泛素化和降解的癌基因活化、肿瘤抑制基因灭活或酶失活的作用(26)。在动物模型中，去调控的HIF-1 a对于肿瘤发生具有关键作用。HIF-1a表达下调或去调控HIF-1 a活动的抑制减缓了肿瘤生长并使肿瘤更容易通过放疗和化疗杀死(28)。在人体中，结构性表达的HIF-1 a与大肿瘤体积、高品位的淋巴结阴性转移相关，这使得肿瘤不对放疗和化疗易感(18)。因此，肿瘤中的HIF-1 a表达水平已经成为预测肿瘤转移患者的可能结果的标志。虽然破坏肿瘤细胞中的去调控HIF-1 a在概念上可以防止肿瘤发展，但是直接靶向位于细胞内的HIF-1 α或调控HIF-1 α稳定性的酶被证明是具有挑战性的(26，28)。
[0009]人Hsp90伴侣蛋白族包括四个确认的成员，即由不同基因编码的胞质Hsp90a和Hsp90P、内质网GRP74和线粒体TRAPl (6)。与肿瘤细胞中的HIF-1 a —样，Hsp90a也被发现在多种肿瘤中定量过表达或定性过度活化(18)。这些“额外”或“过度活化”的Hsp90 a蛋白被认为结合和保护细胞内的癌基因产物的稳定性(17，25，41)。这种Hsp90a在肿瘤细胞中比其原癌基因蛋白对应物在周围正常细胞中看似更高程度的保护被用作开发抗癌药物的策略(42)。结合并抑制Hsp90的ATP结合和ATP水解功能的格尔德霉素(GM或苯醌安沙霉素(benzoquinone ansamycin))及其衍生物成为药物开发重点已超过十年(25)。GM本身即使在动物模型(36)也被证明毒性过大。一种GM的改性形式17-AAG (苯醌安沙霉素17-烯丙基氨基格尔德霉素)在临床前研究中表现出在毒性可耐受的剂量范围内的有前途疗效并已自1999年起进入了多个阶段I和阶段2/3的临床试验(33，37)。正在进行的临床试验正在开发几种新一代的化学改性减毒的GM相关药物。然而，主要障碍仍在于如何选择性地靶向肿瘤中的Hsp90癌基因保护活动以及保住Hsp90在正常细胞中的生理功能。
[0010]表述“细胞总蛋白的1-2%”已被广泛用于描述大部分细胞类型中Hsp90蛋白的不寻常丰度。以每细胞约7000蛋白计，Hsp90蛋白的含量会是任何其余细胞蛋白的70-150倍。Csermely和他的同事认为，如果分子伴侣是大自然分配给Hsp90的唯一功能,则这样的单一蛋白在细胞中的过度产生不可能得到良好的进化耐受(9)。因此，他们推测Hsp90的主要细胞功能是需要这样的丰富蛋白存储的另一尚未确认的功能。过去数年的研究已经发现，正常细胞对于分泌“存量过多”的Hsp90 α进行组织修复或者肿瘤细胞对于结构性分泌Hsp90 α进行侵袭和转移的出乎意料的需求(7，38)。更重要的是，Hsp90a分泌的关键上游调控因子是缺氧诱导的H IF-1 a。在肿瘤细胞中，使用专门靶向分泌Hsp90 a的不透过细胞膜的Hsp90a抑制剂和显示出分泌Hsp90a的两个组是胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤的体外侵袭和黑色素瘤细胞体内肺定植所需要的(39，42)。由于HIF-1a的去调控表达在许多实体肿瘤中常见，所以本发明人推测，在这些肿瘤中HIF-1 a触发进行迁移、侵袭和转移的Hsp90a分泌。在本研究中，本发明人已经确认一种在分泌Hsp90 a中的新的115-氨基酸表位(F-5)，其可能代表一种用于HIF-1 a-阳性的乳腺癌等的新治疗靶点。
【发明内容】
[0011]本发明提供使用Hsp90 a或其片段的抑制剂来治疗有此需要的对象中的HIF_1 a过表达癌症的方法。该方法包括提供包含Hsp90a或其片段的抑制剂的组合物以及将治疗有效量的该组合物施用于所述对象以治疗所述对象中的HIF-1 a过表达癌症。
[0012]本发明还提供使用Hsp90a或其片段的抑制剂来抑制有此需要的对象中的HIF-1a过表达癌症的方法。该方法包括提供包含Hsp90 a或其片段的抑制剂的组合物以及将治疗有效量的该组合物施用于所述对象以抑制所述对象中的HIF-1 a过表达癌症。
[0013]本发明还提供用于防止在有此需要的对象中的HIF-1 a过表达癌症转移的方法。该方法包括提供包含Hsp90 a或其片段的抑制剂的组合物以及将治疗有效量的该组合物施用于所述对象以防止所述对象中的HIF-1 a过表达癌症转移。
[0014]本发明还提供用于促进在有此需要的对象中的HIF-1 a -过表达癌症的预防。该方法包括提供包含Hsp90 α或其片段的抑制剂的组合物以及将治疗有效量的该组合物施用于所述对象以促进在所述对象中的HIF-1 α过表达癌症的预防。
[0015]本发明还提供用于识别Hsp90a抑制剂的方法。该方法包括将Hsp90 a阳性细胞中的Hsp90a或在LRP-1阳性细胞中的LRP-1接触目标分子(molecule of interest),以及确定所述接触是否降低或抑制Hsp90 a或其片段与其受体的结合，结合的降低或抑制是目标分子为Hsp90a或其片段的抑制剂的指示。作为替代方案，也可以测试Hsp90a的分泌，其中在目标分子存在下Hsp90a分泌的减少或抑制指示该目标分子为Hsp90 a的抑制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]在参考附图中示出示例性实施方案。其意图在于本文公开的实施方案和附图被认为是说明性的而不是限制性的。
[0017]图1示出去调控的HIF-1 a是乳腺癌细胞迁移和侵袭的关键。(A)在非转化的乳腺上皮细胞HBL-100 (面板a和b)和乳腺癌细胞MDM-MB-231 (面板c及d)在常氧(21 %
O2，道1)或缺氧(1% O2，道2-5)条件下在指定时间点处的HIF-1a水平的Western印迹分析。注:并列的(side-by-site)所有样品和所有程序相等负载。(B)在MDA-MB-231细胞中的FG-12慢病毒感染的效率，如通过in-cis CMV启动的GFP基因的表达，接着进行FACS分析来指示。利用相衬(左)或荧光透镜(右)示出相同的区段。(C)FG-12-衍生shRNA对HIF-1a (面板a)或HIF-Ιβ (面板d)的特定下调，如通过Western蛋白质印迹法分析指示。(D)用I型胶原预涂布12孔组织培养板(20yg/ml，2小时)。在无血清培养基中涂布血清饥饿细胞(250000细胞/孔)，2小时内附着的细胞>90 %。拍摄伤口闭合，并量化为平均间隙(AG) (40), (η=3, ρ〈0.05)。(E)根据制造商方案，HIF-1 α或HIF-1 β的下调抑制MDA-MB-231细胞侵袭通过基底膜屏障(面板b和c对面板a)。注:仅对渗透细胞进行0.D.读取(590nm处Bio-Rad蛋白 质分析)。数据表示为平均值土s.d.(n=4, p〈0.05)。
[0018]图2示出去调控的HIF-1 α利用分泌的Hsp90 α进行迁移和侵袭。(A)对在常氧(N)或低氧(H)下孵育14小时的HBL-100 (道I和2)或MDA-MB-231细胞(道3和4)的无血清条件培养基(CM)(25y 1，10X浓缩)进行western印迹分析Hsp90a蛋白的存在。(B)对HIF-1 a或HIF-1 β的下调细胞的CM分析Hsp90 α的存在(道2，3对道I )。将1.0ml的Ix CM浓缩20倍并进行酶谱电泳分析(方法)(b，道1-3)。(C)重新引入HIF-1a基因的wt和CA突变体(道2，3)而不是DN突变体(b，道4)，挽救在HIF-1 a下调的MDA-MB-231细胞中的Hsp90a分泌(c，道2和3相对道I和4)。(D)胶体金迁移实验表明，抗Hsp90 a中和抗体以剂量依赖方式阻断单独MDA-MB-231的细胞迁移性(面板c，d，e对a，b)。加入过量的重组Hsp90a逆转抗体的抑制(面板f)。MI，迁移率(％) (40)。(E)抗_Hsp90a中和抗体以剂量依赖方式阻断MDA-MB-231细胞侵袭通过基底膜(面板c，d，e对a，b)。加入过量的重组Hsp90 α逆转抗体的侵袭抑制(面板f)。
[0019]图3示出在正常细胞对肿瘤细胞中细胞Hsp90a储存的对比。在指定的不同细胞类型中Hsp90a蛋白相对于总细胞蛋白的百分比(％)是估计的(参见上下文)。A)四种正常细胞类型对重组(recom.)Hsp90 a蛋白的抗Hsp90a抗体印迹(Western)和B)4种肿瘤细胞对重组Hsp90a蛋白的Western印迹。注:含有重组Hsp90a的给定细胞类型中的条带强度而不是在不同细胞类型之间的条带强度是相同条件的结果(包括胶片曝光时间)，因而是可对比的。将溶胞产物中Hsp90a条带的光密度扫描读数转换为蛋白的μ g数，根据从并列负载的重组Hsp90a的已知μ g数读数制备的标准曲线进行转换。最后，在相同体积的溶胞产物中的给定体积的溶胞产物中的Hsp90 α /总蛋白(μ g) ( μ g) X 100=在给定的细胞类型中的Hsp90a %。多对溶胞产物对重组Hsp90 a的定量结果和三个独立实验的结果不于表I。
[0020]图4示出分泌的Hsp90 a中的F_5表位(epitope,抗原决定基)介导肿瘤细胞的迁移和侵袭。(A)仍保留全长Hsp90 a的全部或部分的促迁移活性(pro-motility activity)的Hsp90a截断肽的总结。细胞迁移数据是胶体金迁移和“划痕”试验组合(n=3时，每个试验，p〈0.05)的总结(％)。(B)用考马斯亮蓝染色的SDS凝胶中观察FPLC纯化的全长度、F-2、F-5、F-7 (道1-4)，用指定量的BSA (牛血清白蛋白)作为对照(道5_7)。F-9是合成肽。(C)测试具有最优浓度的五个肽用于挽救HIF-1 α -下调的MDA-MB-231细胞的侵袭缺陷。(D)侵袭数据的定量化(n=3，p〈0.05)。(E)利用抗LRP-1抗体通过Western分析单独用载体(vector)感染的(道I)或携带抗LRP-1受体的shRNA的慢病毒感染的(道2)MDA-MB-231细胞的溶胞产物。(F) LRP-1-下调的细胞不能如对照细胞那样侵袭(面板b对a)，并且Hsp90a不能挽救LRP-1下调细胞的侵袭缺陷(n=4，p〈0.05)。
[0021]图5示出Hsp90 a信号对于MDA_MB_231细胞肺定植和体内肿瘤形成是必不可少的。(A)慢病毒系统、FG-12、介导shRNA-LRP-Ι递送和MDA-MB-231细胞内源性LRP-1下调(道2对道I)。(B)Western印迹筛查LRP-1受体表达的正常和肿瘤细胞株。(C)在常氧(N)或缺氧(H)条件下MDA-MB-468细胞中HIF-1 a的结构性表达(面板a)。MDA-MB-468细胞的Hsp90 α的结构性表达(面板C)。(D)将单独用载体感染的(a)或携带shRNA-LRP-Ι的载体感染的(b) I X 106荧光素酶工程化的MDA-MB-231细胞或LRP-1-/-MDA-MB-468细胞(c)注入SCID小鼠尾静脉(n=7/组)。每周一次进行小鼠整个身体的生物发光成像。小鼠的代表性图像(2张/组)显示注入细胞在1、14、28、56和70天的肺定植。(E)在70天至75天(将死于肿瘤的对照MDA-MB-231细胞注入7只小鼠中的4_5只)，小鼠在强制睡眠下移除整个肺并切片进行H & E染色分析。蓝色 和绿色箭头分别指示侵袭的肿瘤结节与正常肺组织。T，肿瘤结节山，肺实质；比例尺如图所示。(F)对图5E所示染色进行单向方差分析(AN0VA)，以比较携带MDA-MB-231-载体、MDA-MB-231-LRP-1RNAi和MDA-MB-468细胞的小鼠肺中的肿瘤数量。*ρ〈0.05, **ρ〈0.003。
[0022]图6示出作为HIF-1 α阳性癌的潜在靶点的分泌Hsp90 α的模型。在肿瘤中心处经常发现的严重缺氧导致HIF-Ια结构性积累。去调控的HIF-Ια经由外来体触发Hsp90 α的分泌。分泌的Hsp90 α通过F-5表位结合至细胞表面LRP-1受体，并以自分泌方式促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。虽然目前的临床试验集中在细胞内HIF-1 α，但是本 申请人:认为靶向分泌Hsp90 α的F-5表位对于治疗癌症患者更有效且更安全。
[0023]图7示出wt-HIF-Ι α和CA-HIF-1 α能够挽救内源性HIF-1 α耗尽的细胞的细胞迁移性缺陷。在十二孔组织培养板上不涂布或涂布I型胶原(40 μ g/ml，2小时)。用HBSS缓冲液洗涤除去未附着的胶原。涂布血清饥饿(18小时)的MDA-MB-231 (25万个细胞/孔)。在无血清培养基中，使细胞密度在2小时内达到90%汇合。用p-200移液管尖端制造“伤口”。拍摄伤口闭合并进行定量化(平均间隙，AG)，如文献所述(Li等人，2004，MBC,15:294-309))。这里示出的这些结果在三个独立实验中是可重复的(n=3，p〈0.05)。
[0024]图8示出利用DMA治疗细胞，DMA是阻断Hsp90 α分泌的特异性蛋白分泌抑制剂。(A)?5 X IO6个MDA-MB-231细胞培养于三个含4ml无血清培养基的IOcm皿中。向培养基中加入15 μ I的PBS或含BFA (30ηΜ)或DMA (15ηΜ)的PBS。经过12小时孵育，收集培养基，浓缩10倍并利用抗HSP90a抗体进行Western印迹分析。(B)在不存在(a和b)和存在BFA (c)或DMA (d, e，f)的条件下对MDA-MB-231细胞进行侵袭实验。DMA以浓度依赖方式抑制侵袭(n=3, p=0.044, ±s.d.)。
[0025]图9示出F-5挽救细胞的侵袭缺陷。测试F-5肽的挽救内源性HIF-Ιβ下调MDA-MB-231细胞的侵袭缺陷的能力。面板:(a) Lac-Z-RNAi感染细胞；(b)添加BSA的HIF-1 β -RNAi感染细胞；(c至e)在HIF-1 β -RNAi感染细胞中加入逐渐增加的F-5肽。以0.D.示出定量侵袭数据(η=4, ρ〈0.05)。
[0026]图10示出在迁移和侵袭实验中，Hsp70、gp96和CRT表现出有限的效果。(A)测试具有最优浓度的指定重组蛋白的促进人角质细胞迁移(在生理条件下不分泌Hsp90 α )的能力(η=4，*ρ〈0.05)。(B)通过指定的肽/蛋白挽救内源性HIF-1 α -下调的MDA-MB-231细胞的侵袭缺陷。两个侵袭挽救试验(n=2)中的一个代表性实验。*p〈0.05基于三个孔，每个条件，每个实验，使用作为基线。
【具体实施方式】
[0027]本文引用的所有文献均通过引用方式全文并入如同完全阐述。除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有本发明所述【技术领域】的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3rded., J.Wiley & Sons (New York,NY2001) ;March, Advanced Organic ChemistryReactions, Mechanisms and Structure5th ed., J.Wiley & Sons(New York, NY2001);和Sambrook and Russel, Molecular Cloning:A Laboratory Manual3rd ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press (C`old Spring Harbor, NY2001)为本领域技术人员提供本申请中所用的许多术语的一般指南。
[0028]本领域技术人员将认识到许多的方法和材料类似或等同于本文所述的那些，它们可以用来实施本发明。事实上，本发明决不限于所描述的方法和材料。针对本发明的目的，下列术语定义如下。
[0029]“有利的结果”可以包括，但决不限于，减轻或缓解疾病的严重程度，防止疾病恶化，消除疾病，防止疾病发展，降低患者疾病发展的几率以及延长患者的寿命或预期寿命。
[0030]“病症”和“疾病”在本文中可以包括，但决不限于，任何形式的癌症。
[0031]本文所用的“哺乳动物”是指哺乳类的任何成员，包括但不限于:人类和非人类的灵长类动物如黑猩猩和其他猿类和猴物种；家畜，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物如小鼠、大鼠、豚鼠等。该术语并不指定特定的年龄或性别。因此，无论雄性还是雌性，成年的和新生的对象以及胎儿均意图包含在该术语的范围内。
[0032]本文所用的“治疗”是指医疗性治疗以及预防性或防备措施，其中目标是防止或减慢(减轻)目标的病理状态，防止病理状态，追求或取得有益的结果，或即使治疗最终不成功也降低个体病症发展的几率。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及易于患上病症的那些或者意图防止病症的那些。
[0033]“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中的生理病症，其典型特征是细胞生长失调。癌症的实例包括，但不局限于:脑瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、头颈癌、脑癌和前列腺癌，包括但并不限于雄激素依赖性前列腺癌、雄激素非依赖性前列腺癌。
[0034]本文所用的“肿瘤”是指所有的肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性或良性的，以及所有的癌前期和癌性细胞和组织。
[0035]本文所用的“HIF-1”是指缺氧诱导因子-1。HIF-1a-过表达癌症是指肿瘤细胞中HIF-1a过表达的癌症。在至少15个器官中的人类共同癌症的大多数过表达HIF-1 a(参见 G.L.Semenz a(2007)Drug Discovery Today, Vol.12，Page853_859 中的完整列表)。
[0036]本文所用的“LRP-1”或“LRP1”是指低密度脂蛋白受体相关蛋白1，也称为α -2-巨球蛋白受体(A2MR)、载脂蛋白E受体(APOER)或分化簇91 (CD91)。LRP-1是一种Hsp90 α受体。
[0037]本文所用的HSP90 α或Hsp90 α是指热休克蛋白90 α。
[0038]本文所用的“分离的Hsp90 α ”、“纯化的Hsp90 α ”、“分离的Hsp90 α片段”或“纯化的Hsp90 α片段”是指从非Hsp90 α或其片段表达的或移除的和/或从关联或损害Hsp90 α或其片段的活性的细胞结构中移除的Hsp90 α蛋白或其片段。
[0039]缺氧诱导因子-1a (HIF-1 a )的去调控过表达是许多实体肿瘤的标志。然而，直接靶向HIF-1 a被证明是具有挑战性的。本 申请人:已经预先表明分泌的热休克蛋白-90 a是HIF-1 a的关键下游效应子，提高了使靶向HIF-1 a-过表达肿瘤的分泌Hsp90 a的动作更容易且更特异性的令人激动的可能性。本 申请人:已经测试了在HIF-1 a -过表达和转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231中的这种可能性。HIF-1a的下调阻断Hsp90a分泌和细胞侵袭。将活性的而不是非活性的HIF-1 a基因重新引入内源性HIF-1 a耗尽的MDA_MB_231细胞挽救Hsp90a的分泌和侵袭。直接抑制Hsp90a分泌、中和分泌的Hsp90 a的功能或移除分泌的Hsp90 a的细胞表面LRP-1受体均大大减少体外细胞侵袭以及在裸鼠中的肺定植和肿瘤形成。最重要的是，本 申请人:已经定位了分泌的Hsp90a中的关键表位，称为F-5。单独补充F-5肽足以绕过MDA-MB-231细胞中HIF-1 a耗尽的阻断并恢复侵袭。因为正常细胞只在压力下分泌Hsp90a，靶向F-5表位将使得人HIF-1 a阳性肿瘤的治疗更加有效且毒性下降。
[0040]本发明的核酸和蛋白质
[0041]本发明提供Hsp90a的核酸序列，其可靶向治疗HIF_1 a -过表达癌症、抑制HIF-1 a -过表达癌症、防止HIF-1 a -过表达癌症的转移和/或促进HIF_1 a -过表达癌症的预防。本文提供的核酸序列也可以靶向减轻HIF-1 a-过表达癌症的影响、降低HIF-1 a -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 a -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 a-过表达癌症的进程。核酸分子可以是DNA或RNA。在一个实施方案中，全长度Hsp90 a的DNA序列是分离的cDNA序列，如SEQ ID N0:1所示。在另一实施方案中，编码Hsp90 a的cDNA序列描述在SEQ ID NO:1中，在位置I处以腺苷开始并且在位置2199处以腺苷终止。[0042]本发明还提供Hsp90a片段的核酸序列，其可靶向治疗HIF_1 α -过表达癌症、抑制HIF-1 α -过表达癌症、防止HIF-1 α -过表达癌症的转移和/或促进HIF-1 α -过表达癌症的预防。本文提供的核酸序列也可以靶向减轻HIF-1 α -过表达癌症的影响、降低HIF-1 α -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 α -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1a-过表达癌症的进程。核酸分子可以是DNA或RNA。在一个实施方案中，Hsp90 α片段的DNA序列是分离的cDNA序列，如SEQ ID N0:3所示。在另一实施方案中，Hsp90 a片段的DNA序列是分离的cDNA序列，如SEQ ID NO:5所示。
[0043]本文的核酸分子能够分离Hsp90a同源物，交替分割Hsp90 a蛋白的异形体、等位基因变异和突变形式以及它们的编码和基因序列。在一个实施方案中，Hsp90a同源物的来源是哺乳动物有机体。本文所述的人Hsp90a或其片段的同源物和天然产生的等位基因变异可与其它哺乳动物、酵母、细菌或植物的Hsp90 a共享高度同源性。相对于SEQID NO:
1、3和/或5中描述的人Hsp90a或其片段，该序列包含至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，最优选至少90 %的同源性。
[0044]本文还提供编码具有在SEQ ID NO:1、3和/或5的任意一种或更多种中描述的序列的Hsp90 a或其片段的载体。
[0045]本发明还提供Hsp90 a及其片段的氨基酸序列，其可以靶向治疗HIF_1 a -过表达癌症、抑制HIF-1 a -过表达癌症和/或防止HIF-1 a -过表达癌症的转移。在一个实施方案中，全长度Hsp90a的氨基酸序列描述在SEQ ID NO:1和2中。在另一实施方案中，编码Hsp90 a片段的氨基酸序列描述在SEQ ID NO:3和4中。在又一实施方案中，编码Hsp90 a片段的DNA序列描述在SEQ ID NO:5和6中。这些序列可以靶向用于例如诱变，以便改变序列并由此改变Hsp90a或其片段的功能。
[0046]本发明还提供Hsp90a蛋白或其片段，其可以靶向治疗HIF_1 a -过表达癌症、抑制HIF-1 a -过表达癌症 、防止HIF-1 a -过表达癌症的转移和/或促进HIF_1 a -过表达癌症的预防。本文提供的Hsp90a蛋白或其片段也可以靶向减轻HIF-1 a-过表达癌症的影响、降低HIF-1 a -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 a -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 a-过表达癌症的进程。在一个实施方案中，Hsp90a蛋白包括732个氨基酸，如SEQID NO:1和2所示，在位置I处以蛋氨酸开始并且在位置732处以天冬氨酸终止。在另一实施方案中，Hsp90a片段包括115个氨基酸，如SEQ ID No:3和4所示，在位置I处以谷氨酸开始并且在位置115处以天冬氨酸终止。在另一实施方案中，Hsp90a片段包括27个氨基酸，如SEQ ID No:5和6所示，在位置I处以丝氨酸开始并且在位置27处以谷氨酸终止。
[0047]本发明还提供Hsp90a突变体或Hsp90 a片段的突变体。在Hsp90 a或其片段中的突变可能来源于插入、缺失、移码、基因敲除和/或替代突变。Hsp90a或其片段的突变形式可治疗HIF-1 a -过表达癌症、抑制HIF-1 a -过表达癌症、防止HIF_1 a -过表达癌症的转移、促进HIF-1 a -过表达癌症的预防、减轻HIF-1 a -过表达癌症的影响、降低HIF-1 a -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 a -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 a -过表达癌症的进程。
[0048]Hsp90a蛋白和/或其片段，例如由SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的任意一个或多个编码的那些，可以是分离形式。这些蛋白质可以在体内或体外表达。可以使用多种方法分离和纯化Hsp90a蛋白或其片段，这些为本领域技术人员所容易知晓。
[0049]本发明还提供生产Hsp90a和/或其片段的方法。在一个实施方案中，将Hsp90 a或其片段克隆在与宿主细胞相容的载体中。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。该方法涉及用编码Hsp90 a、其衍生物或其片段的载体转染的宿主-载体体系的生长，以在宿主中生产HSp90a分子、其衍生物或其片段，随后回收Hsp90 a分子、其衍生物或其片段。
[0050]本发明的治疗方法
[0051]本发明描述使用Hsp90 a抑制剂治疗HIF_1 a -过表达癌症、抑制HIF_1 a -过表达癌症和/或防止HIF-1 a -过表达癌症转移的方法和试剂盒。尽管不希望被任何特定理论所约束，但是本发明人认为他们对于Hsp90 a抑制剂特别是靶向SEQ ID N0.:3、4、5和/或6中所列出的序列的那些抑制肿瘤细胞迁移、侵袭和进展的发现支持了在临床设置中施用这些化合物可实现HIF-1 a -过表达癌症的治疗、抑制、防止转移和/或促进预防的观点。
[0052]本发明提供使用Hsp90a或其片段的抑制剂治疗在有此需要的对象中的HIF-1 a-过表达癌症的方法。该方法包括提供包含Hsp90a抑制剂的组合物以及向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以治疗所述对象中的HIF-1 a过表达癌症。所述组合物还可包括其他药物，包括但不限于:癌症疫苗和/或其它化学治疗剂。在一个实施方案中，所述抑制剂祀向分泌的Hsp90 a。在另一个实施方案中，所述抑制剂防止Hsp90 a的分泌。在又一实施方案中，所述抑制剂靶向如SEQ ID NO:1和/或2中所列出的全长度Hsp90 a。在一个优选实施方案中，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一实施方案中，Hsp90a抑制剂是Hsp90a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0053]本发明还提供使用Hsp90 a抑制剂抑制在有此需要的对象中的HIF_1 a -过表达癌症的方法。该方法包括提供包含Hsp90a抑制剂的组合物以及向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以抑制所述对象中的HIF-1 a过表达癌症。所述组合物还可包括其他药物，包括但不限于:癌症疫苗和/`或其它化学治疗剂。在一个实施方案中，所述抑制剂靶向分泌的Hsp90a。在另一个实施方案中，所述抑制剂防止Hsp90 a的分泌。在又一实施方案中，所述抑制剂靶向全长度Hsp90 a JnSEQ ID NO:1和/或2中所列出的。在一个优选实施方案中，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一实施方案中，Hsp90 a抑制剂是Hsp90 a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0054]本发明还提供防止在有此需要的对象中的HIF-1 a -过表达癌症转移的方法。该方法包括提供包含Hsp90 a抑制剂的组合物以及向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以防止所述对象中的HIF-1 a过表达癌症转移。所述组合物还可包括其他药物，包括但不限于:癌症疫苗和/或其它化学治疗剂。在一个实施方案中，所述抑制剂靶向分泌的Hsp90 a。在另一个实施方案中，所述抑制剂防止Hsp90 a的分泌。在又一实施方案中，所述抑制剂靶向全长度Hsp90a，如SEQ ID NO:1和/或2中所列出的。在一个优选实施方案中，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一实施方案中，Hsp90 a抑制剂是Hsp90 a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0055]本发明还提供促进在有此需要的对象中的HIF-1 a -过表达癌症的预防的方法。该方法包括提供包含Hsp90 a抑制剂的组合物以及向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以促进在所述对象中的HIF-1 a过表达癌症的预防。所述组合物还可包括其他药物，包括但不限于:癌症疫苗和/或其它化学治疗剂。在一个实施方案中，所述抑制剂靶向分泌的Hsp90a。在另一个实施方案中，所述抑制剂防止Hsp90 a的分泌。在又一实施方案中，所述抑制剂靶向全长度Hsp90a，如SEQ ID NO:1和/或2中所描述的。在一个优选实施方案中，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所描述的序列。在另一实施方案中，Hsp90 a抑制剂是Hsp90 a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0056]本发明还提供减轻HIF-1 a -过表达癌症的影响、降低HIF_1 a -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 a -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 a -过表达癌症的进程的方法。该方法包括提供包含Hsp90a抑制剂的组合物以及向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以减轻HIF-1 a -过表达癌症的影响、降低HIF-1 a -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 a -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 a -过表达癌症的进程。所述组合物还可包括其他药物，包括但不限于:癌症疫苗和/或其它化学治疗剂。在一个实施方案中，所述抑制剂祀向分泌的Hsp90 a。在另一个实施方案中，所述抑制剂防止Hsp90 a的分泌。在又一实施方案中，所述抑制剂靶向全长度Hsp90 a，如SEQ ID NO:1和/或2中所列出的。在一个优选实施方案中，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一实施方案中，Hsp90a抑制剂是Hsp90a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0057]Hsp90 a抑制剂可靶向如SEQ IDN0.:1和/或2中所描述的Hsp90 a。Hsp90 a可以是分泌的或非分泌的Hsp90a。在一个优选实施方案中，Hsp90a抑制剂靶向如SEQ IDN0.:3、4、5或6中所列出的Hsp90a的氨基酸。在另一实施方案中，Hsp90 a抑制剂靶向Hsp90 a的受体LRP-1，使得Hsp90a和/或其片段和/或其衍生物不能结合LRP-1，或者可以表现出减少的结合或没有结合。Hsp90a还可以结合其它靶点，包括MMP2 (基质金属蛋白酶-2)和受体酪氨酸激酶。Hsp90 a抑制剂还可以靶向MMP2和受体酪氨酸激酶。
[0058]在另一实施方案中，Hsp90a抑制剂选自小分子、肽、抗体或其片段和核酸分子。抑制Hsp90a的核酸分子可以是例如siRNA分子。抑制Hsp90 a的抗体可以是单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或单链抗体中的任意一种或多种。根据特定方面，HSp90a抑 制剂可以与其它药物组合使用，所述药物包括但不限于癌症疫苗和/或其它化学治疗剂。
[0059]在另一实施方案中，Hsp90a抑制剂抑制Hsp90a的受体并且选自小分子、肽、抗体或其片段和核酸分子。抑制Hsp90a受体的核酸分子可以是例如siRNA分子。抑制Hsp90 a受体的抗体可以是单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或单链抗体中的任意一种或多种。根据特定方面，Hsp90a抑制剂可以与其它药物组合使用，所述药物包括但不限于癌症疫苗和/或其它化学治疗剂。
[0060]本发明的其它实施方案提供导致Hsp90 a抑制的Hsp90a突变。Hsp90a的突变可导致Hsp90a分泌的防止/抑制。作为替代方案，Hsp90a的突变可例如使分泌的Hsp90 a不稳定或无法结合其受体LRPl。其它实施方案提供Hsp90 a受体LRPl的突变，使得LRPl不再能够结合Hsp90 a，从而抑制Hsp90 a。使Hsp90 a失活和/或受抑制的Hsp90 a或其受体的突变包括但不限于插入、缺失、移码、敲除和/或取代。
[0061]本发明还提供利用致敏抗原呈递细胞进行在有此需要的对象中的HIF-1 a -过表达癌症的治疗、抑制，防止转移和/或促进预防的方法。该方法包括提供包括致敏抗原呈递细胞的组合物，其中所述抗原呈递细胞被具有在SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的任意一种或多种肽所敏化，并且向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以进行在所述对象中的HIF-1 α -过表达癌症的治疗、抑制，防止转移和/或促进预防。在一个实施方案中，抗原呈递细胞的例子包括树突细胞、巨噬细胞和B细胞。在另一实施方案中，抗原呈递细胞的例子包括:成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞和血管内皮细胞，所有这些都可通过细胞因子如干扰素Y (IFN Y)共刺激。根据特定方面，Hsp90a抑制剂可与其它药物组合使用，所述其它药物包括但不限于癌症疫苗和/或其它化学治疗剂。
[0062]本发明还提供利用活化T细胞进行在有此需要的对象中的HIF-1 a -过表达癌症的治疗、抑制，防止转移和/或促进预防的方法。该方法包括提供包含活化T细胞的组合物，其中所述活化T细胞被具有在SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的任意一种或多种肽所活化，并且向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以进行在所述对象中的HIF-1 a -过表达癌症的治疗、抑制，防止转移和/或促进预防。在一个实施方案中，所述活化T细胞是CD8+T细胞。
[0063]本发明还提供减轻HIF-1 a -过表达癌症的影响、降低HIF-1 a -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 a -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 a -过表达癌症的进程的方法。该方法包括提供包含活化T细胞的组合物,其中所述活化T细胞被具有在SEQ IDNO:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6中描述的氨基酸序列的任意一种或多种肽所活化，并且向所述对象施用治疗有效量的所述组合物以减轻HIF-1 a -过表达癌症的影响、降低HIF-1 a -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 a -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 a -过表达癌症的进程。
[0064]Hsp90 a抑制剂和Hsp90 a受体抑制剂可以静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、口服或经吸入服用。
[0065]在要求保护的本发明中的对象可以是人、非人类灵长类动物、猴、猿、狗、猫、牛、马、兔、小鼠和大鼠中的任何一种或多种。
[0066]本发明的剂量
[0067]在本发明的一些实施方案中，组合物中Hsp90a抑制剂的有效量可以为l_5mg/天、5-lOmg/ 天、10_50mg/ 天、50_100mg/ 天、100-150mg/ 天、150_200mg/ 天、100_200mg/ 天、200_300mg/ 天、300-400mg/ 天、400-500mg/ 天、500-600mg/ 天、600-700mg/ 天、700-800mg/天、800-900mg/ 天、900-1000mg/ 天、1000-1 IOOmg/ 天、1100_1200mg/ 天、1200_1300mg/ 天、1300-1400mg/ 天、1400_1500mg/ 天、1500_1600mg/ 天、1600_1700mg/ 天、1700_1800mg/ 天、1800-1900mg/ 天、1900_2000mg/ 天、2000_2100mg/ 天、2100_2200mg/ 天、2200_2300mg/ 天、2300-2400mg/ 天、2400-2500mg/ 天、2500-2600mg/ 天、2600-2700mg/ 天、2700-2800mg/ 天、2800-2900mg/天或2900_3000mg/天的范围。在一个优选实施方案中，前述剂量的抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。在另一实施方案中，Hsp90a抑制剂是Hsp90a衍生物和/或其片段的衍生物，并且以任何上述剂量给药。Hsp90a抑制剂可靶向分泌的Hsp90 a或非分泌的Hsp90 a。
[0068]在本发明的其它实施方案中，与要求保护的方法一起使用的Hsp90 a抑制剂的有效量可以为 l-5mg/kg、5_10mg/kg、10-50mg/kg、50_100mg/kg、100_150mg/kg、150_200mg/kg、100-200mg/kg、200-300mg/kg、300-400mg/kg、400-500mg/kg、500-600mg/kg> 600-700mg/kg> 700-800mg/kg> 800-900mg/kg> 900-1000mg/kg>1000-1100mg/kg、I100_1200mg/kg、1200_1300mg/kg、1300_1400mg/kg、1400_1500mg/kg、1500_1600mg/kg、1600-1700mg/kg>1700-1800mg/kg>1800-1900mg/kg>1900-2000mg/kg>2000-2100mg/kg>2100-2200mg/kg>2200-2300mg/kg>2300-2400mg/kg>2400-2500mg/kg>2500-2600mg/kg>2600-2700mg/kg、2700-2800mg/kg、2800-2900mg/kg 或 2900_3000mg/kg 的范围。在一个优选实施方案中，前述剂量的抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。在另一实施方案中，Hsp90 α抑制剂是Hsp90 α衍生物和/或其片段的衍生物，并且以任何上述剂量给药。Hsp90 α抑制剂可祀向分泌的Hsp90 α或非分泌的Hsp90 α。
[0069]在本发明的其它实施方案中，组合物中的Hsp90a受体抑制剂的有效量可以为约 l_5mg/ 天、5-lOmg/ 天、10_50mg/ 天、50_100mg/ 天、100_150mg/ 天、150_200mg/ 天、100_200mg/ 天、200_300mg/ 天、300_400mg/ 天、400_500mg/ 天、500_600mg/ 天、600_700mg/天、700-800mg/ 天、800-900mg/ 天、900_1000mg/ 天、1000-1 IOOmg/ 天、1100_1200mg/ 天、1200-1300mg/ 天、1300_1400mg/ 天、1400_1500mg/ 天、1500_1600mg/ 天、1600_1700mg/ 天、1700-1800mg/ 天、1800_1900mg/ 天、1900_2000mg/ 天、2000_2100mg/ 天、2100_2200mg/ 天、2200-2300mg/ 天、2300-2400mg/ 天、2400-2500mg/ 天、2500-2600mg/ 天、2600-2700mg/ 天、2700-2800mg/ 天、2800_2900mg/ 天或 2900_3000mg/ 天的范围。
[0070]在其它实施方案中，与要求保护的方法一起使用的Hsp90 a受体抑制剂的有效量可以为 l_5mg/kg、5_10mg/kg、10-50mg/kg、50_100mg/kg、100_150mg/kg、150_200mg/kg、100-200mg/kg>200-300mg/kg>300-400mg/kg>400-500mg/kg>500-600mg/kg>600-700mg/kg、700-800mg/kg、800-900mg/kg、900-1000mg/kg、1000-1100mg/kg、I100-1200mg/kg、1200-1300mg/kg>1300-1400mg/kg>1400-1500mg/kg>1500-1600mg/kg>1600-1700mg/kg>1700_1800mg/kg、1800-1900mg/kg、1900-2000mg/kg、2000-2100mg/kg、2100-2200mg/kg、2200-2300mg/kg、2300-2400mg/kg、2400-2500mg/kg、2500-2600mg/kg、2600-2700mg/kg、2700-2800mg/kg、2800-2900mg/kg 或 2900_3000mg/kg 的范围。
[0071]当使用已知的治疗化合物时，Hsp90a抑制剂有效量的典型剂量可以在生产商所推荐的范围内，也可以如 本领域技术人员通过体外应答或动物模型中的响应所指示的。根据本发明的各个实施方案，可以使用相同或相似的剂量，或者对于本发明的可选实施方案可以使用可选的剂量。实际剂量可取决于医生的判断、患者的病情以及治疗方法的有效性，其基于例如相关培养细胞或组织培养的组织样本的体外响应性或在合适的动物模型中观察到的反应。
[0072]本发明的筛选方法
[0073]本发明的另一方面涉及识别抑制Hsp90 a和/或Hsp90 a受体的化合物的检测和方法。在一个实施方案中，该方法包括使Hsp90 a阳性细胞中的Hsp90a接触目标分子以及确定所述接触是否减少或抑制Hsp90 a与其受体的结合。Hsp90a与Hsp90 a受体的结合的减少或抑制指示目标分子是Hsp90 a抑制剂。在另一实施方案中，该方法包括分别接触多个待检测样品中的每一个，其中所述多个样品可以是例如超过约IO4个样本或超过约5X104个样本。所述抑制剂可靶向如SEQ ID N0.:1或2中所示的Hsp90 a。优选地，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。此外，Hsp90a抑制剂是Hsp90 a衍生物(例如突变体)和/或其片段的衍生物。
[0074]在另一实施方案中，用于识别Hsp90 a抑制剂的方法包括使LRP-1阳性细胞中的LRP-1接触目标分子并确定所述接触是否减少或抑制Hsp90 α与LPR-1的结合。Hsp90 α与LRP-1的结合的减少或抑制指示目标分子是Hsp90a抑制剂。在另一实施方案中，该方法包括分别接触多个待检测样品中的每一个，其中所述多个样品可以是例如超过约IO4个样本或超过约5 X IO4个样本。在一个实施方案中，所述抑制剂是LRP-1衍生物(例如突变体)，使得Hsp90 a不能结合LRP-1或表现出与LRP-1结合的减少。
[0075]在另一实施方案中，用于识别Hsp90a抑制剂的方法包括使Hsp90 a阳性细胞中的Hsp90a接触目标分子以及确定所述接触是否减少或抑制Hsp90 a的分泌。Hsp90 a的分泌的减少或抑制指示目标分子是Hsp90 a抑制剂。在另一实施方案中，该方法包括分别接触多个待检测样品中的每一个，其中所述多个样品可以是例如超过约IO4个样本或超过约5X IO4个样本。所述抑制剂可靶向如SEQ ID N0.:1和2中所示的Hsp90 a。优选地，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。此外，Hsp90a抑制剂是Hsp90 a衍生物(例如突变体)和/或其片段的衍生物。
[0076]抑制Hsp90 a和/或LRP-1的目标化合物可以是小分子、肽、抗体或其片段和核酸分子中的任何一个或多个。
[0077]可用于识别抑制Hsp90 a和/或其片段的化合物的试验分析包括但不限于:微阵列分析、定量PCR、Northern印迹分析、Southern印迹分析、Western印迹分析、免疫组织化学分析、结合分析、凝胶阻滞分析或利用酵母双杂交系统的分析。本领域技术人员可容易地采用本领域已知的大量方法来确定特定试剂是否抑制Hsp90 a和/或其片段。
[0078]药物组合物
[0079]在多个实施方 案中，本发明提供药物组合物，其包括药学可接受的赋形剂以及治疗有效量的Hsp90a抑制剂。所述抑制剂可靶向如SEQ ID N0.:1或2中所示的Hsp90 a。优选地，所述抑制剂靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。此外，Hsp90a抑制剂是Hsp90 a衍生物(例如突变体)和/或其片段的衍生物。
[0080]“药学上可接受的赋形剂”是指在制备药物组合物中有用的赋形剂，所述赋形剂一般是安全无毒并且是所需的，包括兽医使用以及人类药物使用可接受的赋形剂。这样的赋形剂可以是固体、液体、半固体或在气溶胶组合物的情况下为气体。
[0081]在多个实施方案中，根据本发明的药物组合物可以配制为经由任意给药途径递送。“给药途径”可指本领域已知的任何给药途径，包括但不限于:气溶胶、经鼻给药、口服、经粘膜给药、经皮给药或非肠道给药。
[0082]根据本发明的药物组合物还可以包含任何药学上可接受的载体。这里所用的“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或在从一个组织、器官或身体一部分至另一组织、器官或身体另一部分携带或运输目标化合物中涉及的介质。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的组合。载体的每个组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂中的其它成分相容。它还必须适合用于接触它可能接触的任何组织或器官，这意味着它必须不具有过度超过其疗效的毒性、刺激性、过敏性反应、免疫原性或任何其它并发症的风险。
[0083]根据本发明的药物组合物还可以被包封、压片或制备成口服给药的乳剂或糖浆。可添加药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定该组合物，或者便于制备该组合物。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、乙醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。该载体也可以包括缓释材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡一起使用。
[0084]该药物制剂是由以下常规制药技术制备，所述常规制药技术包括研磨、混合、造粒和压缩(必要时)以制成片剂形式；或碾磨、混合和填充以制成硬明胶胶囊形式。当使用液体载体时，制剂可以是糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水性悬液的形式。这样的液体制剂可直接口服给药或填充到软明胶胶囊中。
[0085]根据本发明的药物组合物可以治疗有效量进行递送。精确的治疗有效量是在给定对象的治疗效率方面将产生最有效结果的组合物量。这个量会有所不同，这取决于多种因素，包括但并不限于治疗化合物的特性(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、对象的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应和药物类型)、制剂中的药学上可接受载体的特性和给药途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验来确定治疗有效量，例如通过监视受试者对化合物给药的反应并相应地调整剂量。对于额外指导，请参阅Remington:The Science and Practice ofPharmacy(Gennaro ed.20th edition, Williams & Wilkins PA, USA) (2000)。
[0086]本发明的试剂盒
[0087]本发明还涉及用于治疗HIF-1 过表达癌症、抑制HIF-1 α -过表达癌症、防止HIF-1 α -过表达癌症转移和/或促进预防HIF-1 α -过表达癌症的试剂盒。本文还提供用于减轻HIF-1 α -过表达癌症的影响、降低HIF-1 α -过表达癌症的严重程度、减少HIF-1 α -过表达癌症的发展可能性和/或减缓HIF-1 α -过表达癌症的进程的试剂盒。该试剂盒是材料或组分的组合，包括本发明组合物中的至少一个。因此，在一些实施方案中，该试剂盒包含包括如上所述的Hsp90 α抑制剂的组合物。
[0088]在本发明的试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预定目的。在一个实施方案中，所述试剂盒特别配置用于人类对象。在进一步的实施方案中，该试剂盒被配置用于兽医应用，治疗对象例如但不限于家`畜、家养动物和实验室动物。
[0089]试剂盒可以包括使用说明。“使用说明”通常包括描述在使用试剂盒的组分以实现期望结果例如治疗HIF-1 α -过表达癌症、抑制HIF-1 α -过表达癌症、防止HIF-1 α -过表达癌症转移和/或促进预防HIF-1 α -过表达癌症中所采用的技术的有形表达。任选地，所述试剂盒还包含其它有用的组件，例如测量工具、稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器或本领域技术人员容易认识的其它有用的用具。
[0090]试剂盒中组装的材料或组分可提供给从业者以保持其可操作性和实用性的任何方便和合适的方式储存。例如，组分可以是溶解、脱水或冻干形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。组分通常包含在合适的包装材料中。如本文所用的术语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物例如本发明的组合物等的一个或多个物理结构。该包装材料通过公知方法构造，优选提供无菌且无污染物的环境。如本文所用术语“包装”是指能够容纳单个试剂盒组分的合适固体基质或材料，如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是用于包含适量的含Hsp90a或其片段的抑制剂的瓶子。包装材料一般具有外标签，其指示试剂盒和/或其组分的含量和/或目的。
[0091]实施例
[0092]提供以下实施例以更好地说明所要求保护的本发明，而不应被解释为限制本发明的范围。在提及的特定材料的范围内，仅仅是为了说明的目的而并非意在限制本发明。本领域技术人员可开发不运用本发明能力并且不脱离本发明范围的等同手段或反应物。
[0093]实施例1
[0094]实验方法
[0095]筛选用于去调控HIF-1 α表达的细胞系包括:HBL_100人乳腺上皮细胞、四种人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435 和 MCF_7)、M24 和 M21 人黑色素瘤细胞系、U251和U87人神经胶质瘤细胞系、A172人胶质母细胞瘤细胞系、PC3人类前列腺癌细胞株和A431人皮肤癌细胞系。原生鼠尾I型胶原蛋白来自BD Biosciences (Bedford, MA)。胶体金(氯化金，G4022)购自 SigmaCSt.Louis, MI)0 编码 HIF-1 a (wt)、HIF_1 a CA5(结构性活性)和 HIF-la ΔΝΒΔΑΒ(显性阴性)的 cDNA 是来自 Gregg Semenza 博士(Johns HopkinsUniversity)的礼物并克隆成慢病毒载体pPPLsin.MCS-Deco (20)。在慢病毒FG-12系统中克隆抗人HIF-1a和HIF-1 β的shRNA，如前所述(39)。抗HIF-1 a抗体(#610958)和抗 HIF-1 β 抗体(# 611078)来自 BD Transduction Laboratories (Lexington, KY)。用于Western印迹分析(SPA-840)和用于中和功能(SPS-771)的抗Hsp90 α抗体来自Stressgen(Victoria, BC Canada)。XL-10 金超感应细胞(XL-10 金)来自 StratageneCLa Jolla, CA)。用于在大肠杆菌中蛋白质生产的pET系统(pERT15b)购自Novagen (Madison.WI)。菌素A (BFA)和二甲基阿米洛利(DMA)均购自Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)。基底膜侵袭室(354480)和方案均购自 BD Biosciences (Bedford, MA)。无胸腺 nu/nu 小鼠(4-6 周龄，Harlan, Livermore, CA)用于肿瘤形成实验。
[0096]无血清条件培养基的缺氧处理及制备
[0097]使用来自BioSpherix, Ltd.(Redfield,NY)的 OxyCycler C42 作为整个本次研究中的氧含量控制器。该设备允许创建任意的氧浓度曲线，具有全范围的氧(0.1% -99.9%)或CO2控制(0.1% -20.0%)。更重要的是，用于缺氧实验的所有培养基均在具有指定氧含量的低氧室预孵育16小时， 然后将其用来替代常氧培养基。无血清条件培养基的制备如先前所述进行(8)。
[0098]上调或下调靶基因的慢病毒系统
[0099]使用pRRLsinhCMV系统来过表达外源性HIF-1 α。使用FG_12RNAi传递系统来递送对抗HIF-1的shRNAs，如前所述(20)。为了测量内源性或外源性基因产物的蛋白质水平，对等量(50 μ g总细胞蛋白质/样品)的细胞溶解产物蛋白质(由Bio-Rad Protein Assay测定)进行抗体Western印迹分析。结果通过ECL反应进行可视化。使用不饱和曝光的胶片进行扫描光密度分析。计算相同实验的三种不同曝光的平均值(42)。
[0100]三个细胞迁移试验和无血清条件培养基
[0101]胶体金细胞迁移试验的更新方案包括数据和统计分析，用于体外伤口愈合试验的修改方案包括ECM预涂布、涂覆细胞、刮伤和量化迁移数据，二者均如前所述(29)。根据我们在先公开的方案(21)进行内皮细胞试验。无血清条件培养基的制备已在先具体描述
(29)。酶谱法凝胶分析如前所述进行(43)。
[0102]侵袭试验
[0103]如BD BioCoatTM Matrigel Invasion Ch amb e r (3 5 4 4 8 O ) (BDBiosciences, Bedford, MA)的制造商说明书所详细描述的。[0104]用Alpha Innotech Fluorchem SP 进行密度测量
[0105]Alpha Innotech Fluorchem SP是专业用于突光、化学发光或可见光成像的400万像素 CCD。在 MultiImage FC Light Cabinet (DE-500FC)中，12 位和 400 万像素制冷摄像机连接到手动定焦镜头，具有干涉滤波器和ML-26双波长紫外透射器。它采用FluorChemAlphaEase FC32位软件进行图像采集、增强、存档、文件编制和分析。采用一分钟曝光，光圈设定在1.2，变焦20倍，焦距1.9，使用开放式滤光器和正常的灵敏度和高分辨率。
[0106]重组Hsp90a的生产和纯化
[0107]利用基于PCR的克隆技术将8个不同域中的7个域的编码区(5个即N’、M_1、M_2、C’ -1和C’ -2如先前报道，文献8)亚克隆到在BamHl位的组胺酸标记的pET15b载体(EMDbiosciences, Inc., San Diego, CA)。第八个27-氨基酸肽P-9是合成肽。根据制造商提供的方案，将 pET15b_hsp90 α 结构转化成 BL21_codonPlus (DE3) -RP 感应细胞(Stratagene )。通过将0.25mM IPTG (Sigma, 15502-09)加入细菌培养物(0.D.2 0.8)中并在25 °C下再孵育5小时来诱导蛋白质合成。首先根据制造商程序通过具有HisBind纯化试剂盒(EMDbiosciences, Inc .)的N1-NTA柱纯化这些组胺酸标记的蛋白质。纯化的蛋白质在AmiconUltra (IOx 或 50x) (Millipore, Billerica, MA)中浓缩至?4ml,过滤(0.22 μ m),接着装载到 Superdex-200 或 75HiLoad 凝胶过滤柱(GE healthcare, Piscataway, NJ)上，通过 FPLC进行分离。该肽用DPBS缓冲液(1.2ml/分钟)洗脱，在Centricon YM-50或YM-1O中浓缩至lmg/ml并贮存在_70°C的10%甘油-DPBS中。
[0108]小鼠中的肿瘤形成和生物发光成像
[0109]将三种不同的细胞系(N=6/细胞系)移植到无胸腺nu/nu小鼠(4_6周龄，Harlan, Livermore, CA)中以确定LRP-1/CD91信令在MDAMB肺定植中的作用，对照为shRNA(抗 Lac-Z)、MDAMB-23ILRP-1-RNAi 和 LRP-1+MDAMB-468。用 2 %异氟醚吸入麻醉气体使用蒸发器将小鼠麻醉，使用定制导管经由尾静脉静脉内注射IX IO6个细胞/小鼠来创建转移模型。所有的动物实验均根据美国机构动物照护和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。光学成像采用IVIS200成像系统(Xenogen Corporation, Alameda, CA)进行，该系统采用冷却CCD相机来进行最优灵敏度的低光水平体内成像。在整个研究过程中，用2 %异氟醚吸入气体麻醉小鼠，然后进行腹腔内注射荧光素酶底物、D-荧光素(50mg/kg, Caliper Life Sciences, Alameda, CA)。底物分布进行12分钟,接着米用以下设定进行生物发光成像:1分钟/扫描，bin=8，视场13.1cm和f-光圈=1。在生物发光信号平台阶段过程中，对小鼠进行背侧和腹侧顺序成像，使用Living Image3.1Software (XenogenCorporation, Alameda, CA)进行分析。对小鼠进行每周成像，直到满足IAOJC终点。所有图像归一化成相同图像伪彩色温标，并在胸部区域上绘制圆形关注区(ROI)以定量化发光信号。对来自MDA-MB-231载体组的数据采用Wilcoxon秩和检验进行统计显著性(p〈0.05)比较，并且定性比较来自MDAMB-231-LRP-1-RNAi和LRP-1-/-MDAMB-468组的信号分布。上述实验重复三次。
[0110]组织化学
[0111]对有或无原发肿瘤的全肺进行解剖，将全肺固定在10%福尔马林(Sigma)中，石蜡包埋，将整个肺切成6微米切片并用苏木精伊红染色(H &E)。对胶片进行分析，并利用显微镜和定量分析对胶片上的全肺切片计数肿瘤。[0112]统计分析
[0113]细胞迁移和侵袭的数据以均值标准差(s.d.)表示。所有体外细胞实验利用双尾学生t检验与Cl (置信区间)>90%来分析。使用双尾非参数Mann-Whitney检验进行肺定植实验数据(光子/秒)分析。P值小于0.05认为具有统计显著性。
[0114]实施例2
[0115]HIF-1a的结构性水平对于乳腺癌细胞侵袭是必不可少的
[0116]本 申请人:希望识别具有HIF-1 a去调控表达的肿瘤细胞系并利用该细胞模型来识别对于体外细胞侵袭和体内肿瘤形成必不可少的去调控HIF-1 a的新的下游效应物。在筛选各种肿瘤细胞系(在材料和方法部分中列举)后，本 申请人:关注于ER阴性和Ah无反应乳腺癌细胞系MDA-MB-231，其预先从得自51岁患者的胸腔积液中分离出，具有侵袭性和转移性(4)。这种选择还考虑到以下临床数据一约30%的浸润性乳腺癌样本是缺氧的(10，22)。将未转化的人类上皮细胞HBL-100 (13)归为对照。如图1A所示，在HBL-100细胞中，常氧下(面板a，道l)HIF-la水平检测不到。从缺氧细胞中检测到HIF_1 a蛋白的时间相关积累(道2-5)。然而，在相同的条件下(等蛋白质负载，并行操作和ECL过程)，即使在常氧下也可以检测出MDA-MB-231细胞中的HIF-1 a表达的结构性基础水平(面板C，道I)。虽然癌细胞的缺氧处理导致HIF-1 a进一步增加，但是这种增长是短暂的。缺氧条件下，3-6小时之间达到平台，随后经过14小时下降至基础水平(道2-5，数据未显示)。虽然在MDA-MB-231细胞中这种缺氧反应的短期HIF-1 a诱导的显著性仍然不明，但是HIF-1 a结构性存在与人类乳腺肿瘤组织样本的抗HIF-1抗体染色增加相一致(10，22)。
[0117]甚至在无血清条件下(模拟体内低氧肿瘤环境)，MDA-MB-231细胞中HIF_1 a结构性水平足以维持细胞的高 迁移性和侵袭性。本 申请人:采用慢病毒系统FG-12将抗人HIF-1a或HIF-Ιβ的U6启动子驱动shRNA递送至MDA-MB-231细胞中。如图1B所示，在同一载体中CMV启动子驱动GFP (绿色荧光蛋白)基因的表达指示在该细胞系中该系统的基因转导效率超过80% (右侧面板对左侧面板)。因此，如图1C所示，与对照的抗LacZ的shRNA(道I)相比，本 申请人:实现了几乎完全下调的HIF-1ci (面板a，道2)或HIF-1 β (面板d，道2)。此外，在HIF-1a和HIF-1 β之间没有非特异性的shRNA交叉反应(面板b和e)。当这些HIF-1 a -或HIF-1 β -下调细胞进行细胞迁移(“从头开始(scratch)，，)试验时，如图1D所示，对照的MDA-MB-231细胞即使在无血清条件下也表现出结构性高迁移性(面板b对面板a)。然而，HIF-1a或HIF-1 β的下调遏制了细胞迁移(面板d和f对面板c和e)。在相同细胞的侵袭试验中得到相似的观察结果。如图1E所示，对照的MDA-MB-231细胞在无血清条件下强烈渗透基底膜屏障(由层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白构成)(面板a)。与之相反，HIF-1a-或HIF-1 β-下调细胞表现出急剧下降的侵袭性(面板b和c对面板a)。这些结果建立了 MDA-MB-231细胞系作为充分的肿瘤细胞模型以识别去调控HIF-1a的下游效应物。
[0118]实施例3
[0119]乳腺癌中去调控HIF-1 a导致结构性Hsp90 a分泌
[0120]本 申请人:基于以下三个标准对去调控HIF-1 a的靶点进行检索:I)被MDA_MB_231细胞结构性分泌；2)在去调控HIF-1 a的直接控制下和3)对于细胞的侵袭性至关重要。本 申请人:基于以下证据关注于热休克蛋白90a (Hsp90 a )的分泌。首先,Eustace等人发现HT-1080纤维肉瘤细胞分泌Hsp90a (12)。其次，缺氧导致正常细胞分泌Hsp90 a (19)。第三，分泌的Hsp90a介导低氧驱动的细胞迁移(42)。因此，本 申请人:测试了去调控HIF_1 a导致Hsp90 a分泌进而引起MDA-MB-231细胞的迁移性和侵袭性增加的可能性。对在常氧或低氧下培养的HBL-1OO和MDA-MB-231细胞的无血清条件培养基(CM)分析Hsp90 a的存在。如图2A所示，从在低氧(道2)而不是常氧(道I)下孵育的HBL-100细胞的CM中检测到分泌的Hsp90 a。与此相反，从在常氧(道3)或低氧(道4)下培养的MDA-MB-231细胞的CM中检测到等量的分泌Hsp90 a (secreted Hsp90a)。本 申请人:发现细胞中的去调控HIF-1 a导致Hsp90 a的结构性分泌。在图2B中示出，虽然在Lac-Z-RNAi感染的MDA-MB-231细胞中结构性Hsp90 α分泌保持不受影响(a，道I )，但是从HIF-1 α -或HIF-1 β -下调的MDA_MB_231细胞的CM中无法检测到分泌的Hsp90 a (a，道2，道3)。这种抑制的出现是特异性的，因为在相同的条件下，MMP9的分泌反而增加(b，道2和3对道I)。本 申请人:指出，与细胞内蛋白质(如作为细胞内的蛋白质的肌动蛋白或GAPDH)不同，对分泌的蛋白质负载对照标记的可靠性有限。通过取出等量的来自相同条件下培养的相同数量细胞中的CM来证明CM的等负载量。为了进一步验证HIF-Ια作用的特异性，本 申请人:进行了在内源性HIF-1a-耗尽的MDA-MB-231细胞的HIF-1 α基因挽救实验。如图2C所示， 申请人:外源性重新引入野生型(wt)和结构性活性(CA)的HIF-1a到这些细胞中，通过抗_HIF_1 α抗体免疫印迹分析进行检测(面板a，道2和3对道I)。由于DN-HIF-Ια在大多数商业化抗HIF_1 a抗体识别区域中具有大的缺失(20)，所以 申请人:反而利用抗-HA标记抗体印迹法证明了 34-kDaDN-HIF-1 α的表达(面板b，道4)。从这些细胞的CM中，本 申请人:发现只有wt-HIF_l α和CA-HIF-1 α能够挽救Hsp90 α的分泌(面板c，道2和3对道I )，但不适用于DN_HIF_1 α(道4)。这些结果表明，分泌的Hsp90a是去调控HIF-1 α的直接下游靶点。更重要的是，wt-HIF-1 α和CA-HIF-1 α，但不是DN_HIF_1 α，也能够挽救内源性HIF-1 α -耗尽细胞的细胞迁移性缺陷(图7)。
[0121]接着，本 申请人:试验分泌的Hsp90a是否介导去调控HIF_1 a驱动的MDA_MB_231细胞迁移和侵袭。本 申请人:采取利用抗分泌的(非细胞内的)Hsp90a的中和抗体的途径。为了测试细胞迁移性，本 申请人:切换使用胶体金迁移试验，因为该试验测量单个细胞(而不是细胞群)的迁移，并且与自分泌信号机`制的研究特别相关。如图2D所示，MDA-MB-231细胞即使在无血清条件下也已经表现出强烈的迁移性(面板a)。加入对照IgG影响不大(面板b对面板a)。然而，在培养基中加入增加量的抗Hsp90a中和抗体以剂量依赖方式降低MDA-MB-231细胞的结构性迁移性(面板c至e)。加入过量的重组Hsp90 a蛋白逆转由中和抗体导致的细胞迁移抑制(面板f)。更令人信服的是，相同的中和抗体也阻碍MDA-MB-231细胞侵袭渗透基底膜屏障的能力。如图2E所示，与单独的培养基(面板a)和具有对照IgG的培养基(面板b)相比，加入增加量的抗体以剂量依赖方式阻止MDA-MB-231细胞的侵袭(面板c至e)。而且，加入过量的重组Hsp90a蛋白逆转由抗Hsp90a抗体导致的MDA_MB_231细胞侵袭的抑制(面板f)。这些发现通过药理学途径得到进一步确认。如图8所示，用通过外切体蛋白质交通路径(8)的蛋白质分泌特异性抑制剂二甲基阿米洛利(DMA)处理细胞，以剂量依赖方式阻止Hsp90a分泌(A，道3对道I)和MDA-MB-231细胞的侵袭(B，面板d、e、f)。与之相反,经典的ER-Golgi蛋白质交通路径抑制剂(8)布雷菲德菌素A (BrefeldinA，BFA)表现出对Hsp90a分泌(A，道2对道I)或细胞侵袭(B，面板c)几乎没有影响。总而言之，归纳为去调控HIF-1 α控制Hsp90a分泌，并且在没有任何外源性生长因子的情况下利用分泌的Hsp90 α促进乳腺癌细胞迁移和侵袭。
[0122]实施例4
[0123]肿瘤细胞与正常细胞中储存的Hsp90a的比较
[0124]从中引用了广泛使用的说法“1-2%的总细胞蛋白质”的三篇原始报告包括摘要和两篇研究论文(5，14，40)。本 申请人:无法确认该说法的由来。这些出版物均没有包含任何直接支持这种说法的数据。事实上，这些报告中甚至没有提出这种说法。因为这对于理解肿瘤细胞含有多少Hsp90a是关键的，因此本 申请人:采取多步骤方式在四种正常细胞和四种癌细胞中重建相对于总细胞蛋白质的Hsp90 a蛋白质量(％)。I)本 申请人:使用一系列已知量的牛血清白蛋白(BSA，?55kDa)建立0.D.读数对实际蛋白质量(μ g)的标准曲线。2)对增加体积的给定细胞类型的总后核提取物进行0.D.读数，然后根据标准曲线将该读数转换成蛋白质Ug数。3)对这些具有已知μ g蛋白质的细胞提取物和一系列已知Ug的重组人Hsp90a蛋白质利用单克隆抗Hsp90 a抗体并行进行SDS-PAGE和Western印迹分析。注=SDS-PAGE电泳的整个过程、转移到硝酸纤维素膜上、印迹法、一次抗体、二次抗体、洗涤和对给定细胞类型的两组样本的ECL反应均在常用的设备、容器和相同的曝光盒中操作，操作时间完全相同。4)如图3所示，对来自细胞溶解产物和重组Hsp90 a的Hsp90 a蛋白质条带进行具有相同的参数设定的光密度扫描(Alpha Innotech Fluorchem SP)。本 申请人:随后使用重组Hsp90a条带的扫描读数建立测量密度法读数对重组Hsp90 a蛋白实际量(μ g)的第二标准曲线。6)利用该标准曲线，将来自总细胞提取物的Hsp90 a条带的扫描读数转换成蛋白质的量(μ g)。7)最后，将给定体积的细胞提取物中的Hsp90 a量(μ g)除以来自相同提取物的总蛋白质(μ g)XlOO=给定细胞类型的总蛋白质中的Hsp90 a %。来自至多8组Hsp90 a的计算数平均值:采取细胞提取物对作为给定细胞类型的Hsp90 a的最终估计值％ (表I)。本 申请人:发现I)在测试的正常细胞中，Hsp90 a蛋白质占总细胞蛋白质的2-3%，并且在特定肿瘤细胞系中至多达到7%，以及2)在所有癌细胞中Hsp90 a的细胞内水平相对于其正常对应物没有 升高，例如在MDA-MB-231和HBL-100细胞之间的Hsp90 a差异。
[0125]表I在正常细胞与肿瘤细胞中Hsp90a的估计百分数*
[0126]
_ 正常细胞__癌细胞 _
名称__来源 Hsp90a%____来源 Hsp90a%
HKC 人角质形 2.35% ±SCC-12 Scrrnwm3.29% 士 °.81
成细胞0.26癌
MC 人黑素细 2.25% ±M 24人H色素 6.76% ± I 06
胞0.62、
HDF 人皮肤成 2.33% ±A4314.53% 士 0.70
/才 ^IXmm
__纤维细胞 0.16____
HBL-100 人乳腺上 3.47% ± MDA-MB-231 人孚識产 3.66% 士 0.21
_ 皮细胞0.24 ___[0127]*每个细胞系的数据(％)是三个独立实验的计算结果(即，从细胞培养到密度法)。在细胞溶解产物(含有不同分子量的蛋白质)中的总蛋白质量是估计值，因为标准曲线是用单一的55-kDa蛋白质(BSA)制备的。根据低于p〈0.05的统计显著性，HK与SCC之间和在HBL-100与MDA-MB-231之间的差异并不显著。
[0128]实施例5
[0129]对于介导去调控HIF-Ια驱动的侵袭关键的分泌Hsp90 α中治疗表位的识别
[0130]为了识别分泌Hsp90 α中的治疗祀点，本 申请人:使用系统诱变以缩小人Hsp90 α中的最小功能表位。最初，生成8个重组Hsp90a肽并在无血清条件下测试细胞迁移刺激。8个肽中的5个(FL、F-2、F-5、F-7和F-9)保留了不同程度的全长度Hsp90 α的充分促迁移性，它们示意性地示于图4Α中并且这些肽的纯度用SDS-PAGE进行分析，如图4Β所示。F-9是27个氨基酸的合成肽(太小以至在SDS凝胶上不能显示)。由于内源性HIF-Ια的下调阻止Hsp90 α的分泌和MDA-MB-231细胞的基底膜侵袭，所以本 申请人:合理地认为功能肽的补充应该绕过HIF-1下调的阻断并挽救细胞的侵袭缺陷。这种挽救方法应该使我们识别分泌Hsp90 α中的最小表位。如图4C所示，亲代和对照的LacZ-RNAi感染的MDA-MB-231细胞表现出强侵袭(面板a和b)，而HIF-1 α -下调的MDA-MB-231细胞无法侵袭(面板C)。补充BSA不能挽救该侵袭缺陷(面板d)。然而，FL、F-2和F-5在其预定最优浓度下能够部分地挽救细胞的侵袭缺陷(面板e-g)。与之相反，F-7 (面板h)和F-9 (数据未示出)表现出极少的挽救作用，即使它们仍然保有显著的促迁移活性也是如此。如图4D所示，定量的数据说明FL、F-2和F-5同等有效(条柱e、f、g)。F-7几乎不能挽救(条柱h)。在HIF-1 β -下调的MDA-MB-231细胞中获得了类似的结果，其中F-5挽救了细胞的侵袭缺陷(图9)。为了进一步确认这些肽的挽救机理是绕过HIF-1 α下调的阻断，本 申请人:发现补充F-5不能挽救具有下调LRP-1 (细胞外Hsp90 α信令的受体(8、42))的MDA-MB-231细胞的侵袭缺陷。如图4E所示，本 申请人:实现了通过FG-12系统的几乎完全的LRP-1下调(道2对道1)，这导致细胞侵袭性急剧下降(图4F，面板b对与面板a)。加入F-5不能挽救由于LRP-1下调导致的侵袭缺陷(面板C)。
[0131]实施例6
[0132]Hsp90 α自分泌信号中断阻止乳腺癌细胞的肺定植和肿瘤形成
[0133]乳腺癌对各种二级器官的定植取决于肿瘤细胞和基质微环境之间的有效相互作用。裸鼠的肺定植试验是测试肿瘤细胞的这些能力的公认模型。目前，缺乏针对体内分泌Hsp90 α活动的有效和特异性的抑制剂。整个Hsp90a的基因敲减不会区分细胞内和细胞外的Hsp90a。注射不可透过膜的葛尔德霉素(GM)类抑制剂是不稳定的并且对动物有毒，药物一旦加入循环就很难区分药物的直接与间接的影响(39)。考虑到这些限制，本 申请人:采取靶向分泌Hsp90 a的信号LRP-1受体的直接下游步骤。FG-12系统用于对MDA-MB-231细胞中的LRP-1进行永久性敲减。如图5A所示，在注射前24小时，在确切的MDA-MB-231细胞中验证几乎完全下调的LRP-l(a、道2对道I)。此外，本 申请人:发现，虽然MDA-MB-231和其它一些细胞系均显示LRP-1阳性，但是MDA-MB-468乳腺癌细胞失去了 LRP-1表达(图5B，道4)。然而，与MDA-MB-231细胞一样，MDA-MB-468细胞也保持结构性HIF-1 α表达和结构性Hsp90a分泌(图5C，面板a和C)。因此，本发明人将MDA-MB-468细胞列为天然存在的LRP-1-空细胞。这些细胞系都是预先设计的以稳定表达荧光素酶基因，并通过尾静脉注射到SCID小鼠的循环系统中。如图所示，在经过对所有三种细胞系(面板1、7和13)的最初肺回巢观察后，大部分细胞在后续4周变得可微弱检测到或检测不到(面板2和3 ;8和9，14和15)。然后，在7只小鼠/组中的6只在注射后约42天，载体感染的MDA-MB-231细胞恢复发展肺内肿瘤(面板4-6)。与之相反，LRP-1-敲减的MDA-MB-231细胞表现出大大下降的肺定植能力(面板10、11、12)，这只发生在7只小鼠/组中的2只中。MDA-MB-468细胞表现出在所有小鼠中极少的肺转移。当在70天解剖小鼠时，本 申请人:发现仅在注射有载体-MDA-MB-231的小鼠的肺中发现可见的肿瘤，但在注射有LRP-1-敲减MDA-MB-231细胞或MDA-MB-468细胞的小鼠的肺中没有发现可见的肿瘤。贯穿整个肺组织的切片的苏木精和伊红染色(H & E)，如图5E所示，示出在注射有载体-MDA-MB-231 (a和b)的小鼠的肺中具有大的侵袭肿瘤，在注射有LRP-1-敲减MDA-MB-231细胞(c和d)的小鼠的肺中肿瘤尺寸和数目远远较小，并且在注射有MDA-MB-468细胞(e和f)的小鼠的肺中没有可见的肿瘤。这些数据的定量化示于图5F中。LRP-1 (也称为⑶91)是大的异三聚体蛋白，其由515kDa的细胞外结构域和85-kDa的跨膜亚基(17)组成。除了 Hsp90a外，其它一些细胞外热休克蛋白被报道也结合LRP-1，包括分泌的钙网蛋白(CRT)、gp96和Hsp70 (2)。因此，LRP-1-敲减对肿瘤形成的作用不必然证明肿瘤形成减少是特异性地由于分泌的Hsp90 a的经LRP-1的信号阻断所致。为了解决这个问题，本 申请人:测试了重组HSP70、gp96和CRT是否促进细胞迁移，以及它们 是否能如同Hsp90 a那样挽救HIF-1 a -下调的MDA_MB_231的侵袭缺陷。在迁移和侵袭试验二者中，Hsp70、gp96和CRT表现出有限的效果(图10)。总而言之，这些发现支持以下假设，即“HIF-1〉分泌Hsp90 a >LRP_1”自分泌循环在去调控HIF-1 a -驱动的肿瘤进程中起着关键作用。
[0134]实施例7
[0135]讨论
[0136]乳腺癌影响美国约九分之一的妇女，是最常见的女性恶性肿瘤(30)。乳腺癌传统上根据其显微外观和生长行为分为几个得到确认的肿瘤类型。例如，乳腺癌的激素状态包括雌激素受体(ER)阳性(生长依赖于雌激素)、孕激素受体(PR)阳性(生长依赖于孕激素)和激素受体(HR)阴性(没有激素受体，所以它的生长并不需要激素)。疾病死亡率在过去十年中已小幅下降，这是由于有多种治疗选择:手术、放疗、内分泌治疗和化疗。然而，乳腺癌专家对目前的治疗(如激素受体阳性乳腺癌对内分泌治疗的抗性)的副作用和不可持续的结果具有越来越多的挫折感。现在很清楚，每种乳腺癌在基因上都是独一无二的。许多个体肿瘤之间的基因差异影响癌症复发的可能性。这些差异部分地与不同组别的癌症相关基因的表达相关联(27)。因此，迫切需要找出更多的共同标志物用于诊断和治疗。
[0137]Dales等人对745份乳腺癌样本冰冻切片进行了抗HIF-1 a免疫组化检测并发现在淋巴结阴性和淋巴结阳性的患者中HIF-1 a的表达水平与预后差、总存活率下降和高转移风险相关(10)。利用HIF-1 a表达作为标志物，估计所有浸润性乳腺癌样本中的约25-40%是缺氧的，这表明HIF-1 a可作为乳腺癌的更广泛标志物。在目前的研究中，本 申请人:已经识别出在乳腺癌细胞中HIF-1 a的关键下游效应物，即分泌的Hsp90a。此外，本 申请人:已确定在Hsp90a中的115-氨基酸肽F-5对于HIF-1 a-介导的乳腺癌细胞侵袭是必要的和充分的。本 申请人:提出Hsp90a的F-5区域可证明用于治疗乳腺癌患者是更有效且毒性更低的。这个假设是基于过去7年的研究。Li等人表明正常皮肤成纤维细胞在常氧下不分泌Hsp90 α并且在缺氧下分泌Hsp90 α (19)。Eustace等人表明肿瘤细胞结构性地分泌Hsp90a (12)。基于这些发现，本 申请人:进一步提出将抗癌策略从靶向细胞内Hsp90 a如通过17-AAG转移到靶向F-5区域的分泌Hsp90 a。整个假设示意性地总结在图6中。
[0138]多年来，毒性与疗效是在靶向细胞内Hsp90的ATP酶即17-AAG及其衍生物的抗癌药物的临床试验中长期存在的挑战。这些抑制剂需要选择性地伤害嵌入在正常组织中的癌细胞中的过度活性或过表达的Hsp90a，同时尽量减少对周围正常细胞中的Hsp90的生理伴侣功能的任何损害。与之相反，尚未报道需要通过细胞分泌Hsp90 a的生理过程(基因表达、代谢、增殖和发展)。相反，Hsp90a的分泌似乎是正常细胞对于环境损伤如组织损伤、缺氧和辐照的“紧急响应”。然而，癌细胞中的基因改变利用结构性表达的HIF-1 a触发Hsp90 a分泌并利用分泌的Hsp90a来处理其它对于正常细胞不适宜的环境(7)。因此，本 申请人:提出，选择性靶向F-5表位的新抗癌药物要达到更高的疗效和对癌症患者较低的毒性。
[0139]分泌的Hsp90a的下游祀点是什么？ Eustace和同事们报道，Hsp90 a而不是Hsp90 β通过结合和激活基质金属蛋白酶2 (ΜΜΡ2)来促进肿瘤细胞的迁移和侵袭(12)。Sidera和同事们表明，在乳腺癌细胞中细胞膜结合的Hsp90 α池与HER-2酪氨酸激酶受体相互作用，从而导致ΜΜΡ2活化、细胞迁移和侵袭增加(31)。近来，Gopal和同事们报道，在胶质母细胞瘤细胞侵袭过程中，细胞外Hsp90a刺激LRP-1与EphA2受体的结合(15)。Cheng等人利用四种独立方法(中和抗体、RAP抑制剂、RNAi和体细胞LRP-1阴性突变细胞系)以表明广泛表达的细胞表面受体LRP-1介导了细胞外Hsp90 a信号(8)。在目前的研究中，本 申请人:表明Hsp90 a不能刺激体外LRP-1-下调MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭，与Song等人的体外胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭需要LRP-1的报道相一致(34)。此外，LRP-1-下调MDA-MB-231或LRP-1-空MDA-MB-468细胞表现出急剧减少的肺定植和体内肿瘤形成。理解每个靶蛋白如何对Hsp90a刺激的侵袭作出贡献将需要在一个共同的细胞系统中同时研究这些分子。
[0140]尽管存在各种实验方法，但是分泌的Hsp90 a在体内肿瘤进展中的作用的揭示可能仍然需要更加稳定和特异性的抑制剂`的可用性。Tsutsumi和同事们利用DMAG-N-氧化物、葛尔德霉素/17-AAG-衍生的和不透过细胞膜的Hsp90抑制剂预处理黑色素瘤细胞，以阻止位于细胞外的Hsp90 a，然后将它们注射到裸鼠中。他们报道，经DMAG-N-氧化物处理的细胞表现出体外细胞迁移和侵袭下降以及体内肺定植减少(39)。这种方法存在几个限制。首先，17-AAG结合并抑制Hsp90的ATP酶活性。然而，Cheng等人已经证明，ATP酶结构域对于Hsp90的细胞外活动是非必要的(8)。因此，17-AAG的抑制作用不是细胞外Hsp90的功能性表位的直接抑制。其次，很难理解药物对体外细胞的单一前处理(由于药物结构在体内不稳定)如何可在细胞注射到小鼠体内后具有所报道的持久效果。Patsavoudi和同事们报道，单克隆抗体4C5在体外中和分泌的Hsp90a和Hsp90 β的发展。他们报道了黑素瘤或乳腺癌细胞与4C5在体外混合在细胞注射到小鼠体内后，相比于与对照抗体混合，表现出肺定植减少(34，38)。然而，难以想象共同注射的4C5在多周实验的整个时间段内通过连续地结合和中和肿瘤细胞持续分泌的Hsp90a和Hsp90i3来起效。更加说得通的是，在注射肿瘤细胞之前，在循环系统中注射和建立稳态量的4C5。本 申请人:表明，缺少LRP-1受体的乳腺癌细胞无法有效地在裸鼠体内形成肿瘤。如前所述，下调LRP-1的作用可能不一定是由于特异性阻断分泌的Hsp90 α的信号导致的，这是因为LRP-1可能潜在地结合其它身份不明的配体。因此，在分泌的Hsp90a中F-5表位的识别提供了用于设计新的、有效的且更特异性的抑制剂的优异靶点，该抑制剂用于研究肿瘤分泌的Hsp90a的作用，甚至是其治疗潜力。
[0141]参考文献
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[0186]在申请递交时本 申请人:已知晓本发明的各个实施方案，前文描述了该些实施方案并且旨在用于说明和描述的目的。本说明书并非意在穷举，也不将本发明限制为所公开的具体形式，在前述教导的启示下能够获得本发明的许多改进方案和变化方案。所描述的实施方案用于解释本发明的原理及其实际应用，以使本领域的其它技术人员能够以不同的实施方案来实施本发明，并针对特`定的预期应用进行各种适当的改进。因此，本发明意图不限于实施本发明所公开的特定实施方案。
[0187]虽然本发明的特定实施方案已经示出和描述，但本领域技术人员清楚的是，根据本文的教导，可以在不偏离本发明及其更宽的范围的情况下进行修改和改进。本领域技术人员将会理解，通常本文所用的术语一般意图为“开放式”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应该被解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。
【权利要求】
1.一种分离肽，包含在 SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.6 中列出的序列。
2.一种编码如权利要求1所述的肽的核酸分子。
3.如权利要求2所述的cDNA分子。
4.一种载体,包含如权利要求3所述的cDNA分子。
5.—种宿主-载体系统,包括转染到相容性宿主细胞中的如权利要求4所述的载体。
6.如权利要求5所述的宿主-载体系统,其中所述相容性宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
7.一种抗体，其识别并结合表位，所述表位包含在SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5和/或SEQ ID N0.6中列出的序列。
8.如权利要求7所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或单链抗体。
9.一种药物组合物，包括如权利要求7所述的抗体和药物载体。
10.一种疫苗,包含如权利要求1所述的分离肽。
11.一种用于治疗在有此需要的对象中HIF-1 α过表达癌症的方法，包括: Ca)提供包含Hsp90 α抑制剂的组合物；和 (b)将治疗有效量的所述组合物施用于所述对象以治疗所述对象中的HIF-1-阳性癌症。
12.—种用于抑制在有此需要的对象中HIF-1 α过表达癌症的方法，包括: Ca)提供包含Hsp90 α抑制剂的组合物；和 (b)将治疗有效量的所述组合物施用于所述对象以抑制所述对象中的HIF-1-阳性癌症。
13.一种用于防止在有此需要的对象中HIF-Ια过表达癌症转移的方法，包括: Ca)提供包含Hsp90 α抑制剂的组合物；和 (b)将治疗有效量的所述组合物施用于所述对象以防止所述对象中HIF-1-阳性癌症的转移。
14.如权利要求11、12或13所述的方法，其中所述Hsp90a抑制剂靶向如在SEQIDN0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 / 或 SEQ ID N0.6 中列出的 Hsp90 a 的氨基酸。
15.如权利要求11、12或13所述的方法，其中所述Hsp90a抑制剂选自小分子、肽、抗体或其片段以及核酸分子。
16.如权利要求11、12或13所述的方法，其中所述Hsp90a抑制剂是Hsp90a受体的抑制剂并且选自小分子、肽、抗体或其片段或核酸分子。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述核酸分子是siRNA分子。
18.如权利要求15或16所述的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和单链抗体。
19.一种用于在有此需要的对象中HIF-1a过表达癌症的治疗、抑制或防止转移的方法，包括: Ca)提供包括致敏抗原呈递细胞的组合物，其中所述抗原呈递细胞被具有在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的肽所敏化，和 (b)将治疗有效量的所述组合物施用于所述对象以实现所述对象中HIF-1 α -过表达癌症的治疗、抑制或防止转移。
20.如权利要求11、12或13任一项所述的方法，其中所述Hsp90a抑制剂经静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、口服或经吸入给药。
21.如权利要求11、12或13任一项所述的方法，其中所述Hsp90a或其片段的抑制剂的治疗有效量为大约 l_5mg/ 天、5-10mg/ 天、10_50mg/ 天、50_100mg/ 天、100_150mg/ 天、150_200mg/ 天、100-200mg/ 天、200-300mg/ 天、300-400mg/ 天、400-500mg/ 天、500-600mg/天、600-700mg/ 天、700-800mg/ 天、800_900mg/ 天、900_1000mg/ 天、1000-1 IOOmg/ 天、1100-1200mg/ 天、1200-1300mg/ 天、1300-1400mg/ 天、1400-1500mg/ 天、1500-1600mg/ 天、1600-1700mg/ 天、1700_1800mg/ 天、1800_1900mg/ 天、1900_2000mg/ 天、2000_2100mg/ 天、2100-2200mg/ 天、2200-2300mg/ 天、2300-2400mg/ 天、2400-2500mg/ 天、2500-2600mg/ 天、2600-2700mg/ 天、2700-2800mg/ 天、2800-2900mg/ 天或 2900-3000mg/ 天。
22.—种识别Hsp90a抑制剂的方法，包括: (i)使Hsp90a阳性细胞中的Hsp90a接触目标分子，以及 (ii)确定所述接触是否减少或抑制Hsp90a与其受体的结合，结合的减少或抑制指示所述目标分子是Hsp90 a抑制剂。
23.—种识别Hsp90a抑制剂的方法，包括: (i)使LPR-1阳性细胞中的LPR-1接触目标分子，以及 (ii)确定所述接触是否减少或抑制Hsp90a与LPR-1的结合，结合的减少或抑制指示所述目标分子是Hsp90 a抑制剂。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述Hsp90a抑制剂选自小分子、肽、抗体或其片段以及核酸分子。
25.根据权利要求22或23的筛选方法，其包括分别接触多个待检测样本中的每一个。
26.如权利要求25所述的筛选方法，其中所述多个样本包括超过约IO4个样本。
27.如权利要求25所述的筛选方法，其中所述多个样本包括超过约5X IO4个样本。
28.如权利要求11、12或13所述的方法，其中所述对象选自人、非人类灵长类动物、猴、猿、狗、猫、牛、马、兔、小鼠和大鼠。
29.一种用于在有此需要的对象中HIF-1a过表达癌症的治疗、抑制或防止转移的试剂盒，包括: (i)包含Hsp90a抑制剂的组合物，和 (ii)将所述组合物用于HIF-1a过表达癌症的治疗、抑制或防止转移的说明书。
【文档编号】A61K38/16GK103429254SQ201180059944
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年10月11日 优先权日:2010年10月11日
【发明者】栗卫, 戴维·T.·伍德利, 陈梅 申请人:南加利福尼亚大学