用于偶联水溶性脂肪酸衍生物与蛋白质的材料和方法发明领域本发明涉及用于偶联水溶性脂肪酸衍生物与蛋白质的材料和方法。发明背景多种分子和/或化合物已描述用于偶联于治疗蛋白质以便增加所偶联蛋白质在施用于患者后的半衰期(VeroneseFM和MeroA，BioDrugs2008；22：315-29；GregoriadisG等，IntJPharm2005；300：125-30；和ShechterY等；InternationalJournalofPeptideResearchandTherapeutics2007；第13卷：105-17)。可以将脂肪酸(FA)偶联于治疗蛋白质以形成长效衍生物。延长蛋白质或肽半衰期的此原理是基于FA可以结合人血清白蛋白(HSA；也称为白蛋白结合探针)的实情。FA与血流中人血清白蛋白的缔合可以使治疗蛋白质的半衰期获得实质性延长，这是因为其将随白蛋白一起通过新生儿Fc受体进行再循环。FA和其衍生物(例如相应甲酯)显示类似的白蛋白结合性质(SpectorAA，JLipidRes1975；16：165-79)。此长效原理的一个著名实例为来自NovoNordisk的地特胰岛素(insulindetemir)。在地特胰岛素中，FA的羧基共价偶合于胰岛素蛋白质的赖氨酸的ε-氨基(参见例如US5,866,538；US6,011,007；和US6,869,930)。其它研究组已描述了类似方法(ShechterY等，BioconjChem2005；16：913-20；和SassonK等，JControlRelease2010；142：214-20)。举例来说，这些研究组描述了含有活性NHS酯以供与蛋白质的氨基偶合的可释放FMOC系统。然而差异在于，在此构想中，FA通过ω-位上的官能团连接于蛋白质，由此使羧基保持完整。因此，可以制备与人血清白蛋白结合但随时间解离的长效前药，因为FMOC系统在生理条件下会经历缓慢水解(SassonK等，JControlRelease2010；142：214-20)。除脂肪酸外，还可以利用多种化学方法通过在水溶性聚合物与治疗蛋白质之间形成共价键来制备偶联物。多肽药物的聚乙二醇化在循环中对其进行保护并且改良其药效学和药物动力学特征(Harris和Chess，NatRevDrugDiscov.2003；2：214-21)。聚乙二醇化过程将乙二醇的重复单元(聚乙二醇(PEG))连接至多肽药物。PEG分子具有较大流体动力学体积(球状蛋白质尺寸的5至10倍)，具有高度水溶性且水合、无毒、不具免疫原性且从身体快速清除。分子的聚乙二醇化可以导致药物对酶促降解的抗性增强、体内半衰期增加、给药频率降低、免疫原性降低、物理和热稳定性增强、溶解性增强、液体稳定性增强和聚集减少。第一个聚乙二醇化药物由FDA在二十世纪九十年代早期批准。此后，FDA又批准了若干种聚乙二醇化药物用于口服、注射和局部外表施用。聚唾液酸(PSA)也称为聚乙酰神经氨酸(CA)，为天然产生的多糖。其为具有α(2→8)酮苷键的N-乙酰基神经氨酸的均聚物，并且在其非还原末端含有邻位二醇基。其带负电荷且为人体的天然成分。其可以容易地由细菌大量地以预定物理特征产生(美国专利号5,846,951)。因为细菌产生的PSA在化学上和在免疫学上与在人体中产生的PSA相同，因此细菌PSA不具免疫原性，甚至在偶合至蛋白质时也是如此。不同于一些聚合物，PSA酸可生物降解。聚乙酰神经氨酸与过氧化氢酶(catalase)和天冬酰胺酶(asparaginase)的共价偶合已显示会增强在蛋白水解酶或血浆存在下的酶稳定性。与聚唾液酸化和未修饰天冬酰胺酶的体内比较研究揭示，聚唾液酸化增加酶的半衰期(Fernandes和Gregoriadis，IntJPharm.2001；217：215-24)。PEG衍生物与肽或蛋白质的偶合由Roberts等综述(AdvDrugDelivRev2002；54：459-76)。一种用于偶合水溶性聚合物与治疗蛋白质的方法为通过蛋白质的碳水化合物部分来偶联聚合物。蛋白质中碳水化合物的邻位羟基(OH)容易被过碘酸钠(NaIO4)氧化形成活性醛基(Rothfus和Smith，JBiolChem1963；238：1402-10；vanLenten和Ashwell，JBiolChem1971；246：1889-94)。随后可以通过使用含有例如活性酰肼基的试剂将聚合物偶合至碳水化合物的醛基(WilchekM和BayerEA，MethodsEnzymol1987；138：429-42)。最近的技术为使用含有氨氧基的试剂，所述氨氧基与醛反应形成肟键联(WO96/40662、WO2008/025856)。描述水溶性聚合物与治疗蛋白质的偶联的其它实例描述于以下文献中：WO06/071801，其教导氧化冯威勒布兰德因子(vonWillebrandfactor)中的碳水化合物部分且随后使用酰肼化学与PEG偶合；美国公布号2009/0076237，其教导氧化rFVIII且随后使用酰肼化学与PEG和其它水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶合；WO2008/025856，其教导氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII和FVIIa)且随后使用氨氧基化学通过形成肟键联与例如PEG偶合；和美国专利号5,621,039，其教导氧化FIX且随后使用酰肼化学与PEG偶合。尽管存在上述用于蛋白质偶联的材料和方法，但仍需要例如允许操纵和制备稳定蛋白质偶联物的新颖材料和方法。虽然脂肪酸可以提供结合HSA的益处，但脂肪酸通常在水性环境中难以操作并且可能随时间从其蛋白质结合搭配物释放或移除。发明概述本发明提供用于偶联聚合物和水溶性脂肪酸衍生物与蛋白质的材料和方法，此举改良蛋白质的药效学和/或药物动力学性质，同时使与各种试剂相关的成本和患者接受者的健康风险降至最低，其中偶联反应是由亲核性催化剂催化。本发明提供用于在水溶液中偶联水溶性脂肪酸衍生物与蛋白质的材料和方法，由此产生稳定的蛋白质偶联物，其中脂肪酸衍生物不随时间释放。在本发明的一个实施方案中，所提供的水溶性脂肪酸衍生物包含脂肪酸或脂肪酸酯连接于水溶性连接子，所述脂肪酸衍生物稳定连接于治疗蛋白质。在另一实施方案中，脂肪酸衍生物在体外或体内结合人血清白蛋白(HSA)。在另一实施方案中，脂肪酸衍生物-治疗蛋白质偶联物相对于天然治疗蛋白质具有增加的半衰期。在另一实施方案中，前述脂肪酸衍生物包含饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。在一相关实施方案中，脂肪酸为饱和脂肪酸。在另一实施方案中，脂肪酸为支链脂肪酸。预期脂肪酸衍生物中的脂肪酸具有各种长度。在一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含C10与C24之间的链长，包括具有奇数个碳数的合成脂肪酸。在一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含选自由以下组成的组的链长：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22和C24。在另一实施方案中，脂肪酸具有选自由C14、C16和C18组成的组的链长。在另一实施方案中，脂肪酸具有选自由C13、C15和C17组成的组的链长。在另一实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸以所述脂肪酸上选自由以下组成的组的基团连接至水溶性连接子：末端羧基和ω基团。在另一实施方案中，脂肪酸以ω基团连接至水溶性连接子。在另一实施方案中，ω基团是选自由以下组成的组：羟基、氨基、硫基和羧基。在本发明的一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸为16-羟基十六烷酸。在另一实施方案中，提供一种脂肪酸衍生物，其中脂肪酸酯是选自由以下组成的组：甲酯和乙酯。在一个实施方案中，脂肪酸酯为16-羟基十六烷酸甲酯。本发明中涵盖各种水溶性连接子。在一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中水溶性连接子包含水溶性聚合物和至少一个连接至治疗蛋白质的官能团。在一个实施方案中，连接至治疗蛋白质的官能团能够赋予负电荷或正电荷，由此使连接子可溶于水。在另一实施方案中，官能团是选自由以下组成的组：磺酸基、羧基、羟基、氨基、酰氨基、马来酰亚氨基、氨氧基和酰肼基。在一个实施方案中，官能团为氨氧基。本发明中涵盖众多水溶性聚合物。在一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中作为连接子的整体部分的水溶性聚合物是选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支链淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵(MPC)。在另一实施方案中，水溶性聚合物为PEG。本文中也涵盖各种长度的水溶性聚合物。在一个实施方案中，提供一种脂肪酸衍生物，其中水溶性聚合物包含选自由以下组成的组的链长：O3、O5、O7、O9、O11、O13和O15。在一个实施方案中，提供一种脂肪酸衍生物，其中水溶性连接子是选自由以下组成的组：3-氧杂戊烷-1，5-二氧基胺3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺3，6，9，12，15-五氧杂十七烷-1，17-二氧基胺以及3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十三烷-1，23-二氧基胺在本发明的另一实施方案中，提供一种脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物通过肟键联稳定连接至治疗蛋白质。在另一实施方案中，肟键联在水溶性连接子上的肟基与治疗蛋白质上氧化的碳水化合物的醛基之间形成。在本发明的另一实施方案中，提供一种脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物通过水溶性连接子上的马来酰亚氨基连接至治疗蛋白质上的游离巯基而稳定连接至治疗蛋白质。在另一实施方案中，脂肪酸衍生物通过水溶性连接子上的N-羟基琥珀酰亚胺酯连接至治疗蛋白质上的游离氨基而稳定连接至治疗蛋白质。在本发明的一个实施方案中，提供一种脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物是选自由以下组成的组：a)下式的16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亚氨基)-十六烷酸钠盐：以及b)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯：本发明中涵盖各种治疗蛋白质。在一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中治疗蛋白质是选自由以下组成的组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白样多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白样多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白样多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白样多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白样多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白样多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白样多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子(cripto)、潜伏蛋白(cryptic)、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素(epigen)、表皮调节素(epiregulin)、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿达木单抗(adalimumab))、Prolia(迪诺赛单抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中的蛋白质、或其生物活性片段、衍生物或变异体。在另一实施方案中，治疗蛋白质为FVIIa。在另一实施方案中，治疗蛋白质为FVIII。在另一实施方案中，治疗蛋白质为FIX。本文也涵盖制备脂肪酸衍生物的方法。在一个实施方案中，提供一种制备本文所述的脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)氧化脂肪酸上的ω-羟基以在所述脂肪酸上产生醛基；和b)使包含活性氨氧基的水溶性连接子与所述醛基偶合以形成稳定肟键联，其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。在一个实施方案中，提供前述方法，其中通过选自由以下组成的组的氧化试剂氧化ω-羟基：戴斯马丁高碘烷试剂(DessMartinperiodinanereagent)、Tempo试剂、利用乙二酰氯/DMSO进行斯文氧化(Swernoxidation)、过钌酸四丙铵(TPAP)、铬VI试剂，如柯林斯试剂(Collinsreagent)、氯铬酸吡啶鎓(PCC)和重铬酸吡啶鎓。在另一实施方案中，氧化试剂为戴斯马丁高碘烷。在另一实施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。在另一实施方案中，脂肪酸为饱和脂肪酸。在本发明的另一实施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸为支链脂肪酸。根据另一实施方案，也提供前述方法，其中脂肪酸包含C10与C24之间的链长，包括具有奇数个碳数的合成脂肪酸。在一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含选自由以下组成的组的链长：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22和C24。在另一实施方案中，脂肪酸具有选自由C14、C16和C18组成的组的链长。在另一实施方案中，脂肪酸具有选自由C13、C15和C17组成的组的链长。在另一实施方案中，提供前述方法，其中水溶性连接子包含水溶性聚合物和至少一个氨氧基。本发明中预期众多水溶性聚合物用于前述方法中。在一个实施方案中，提供前述方法，其中水溶性聚合物是选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支链淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵(MPC)。在一个实施方案中，水溶性聚合物为PEG。也涵盖各种长度的水溶性聚合物。在一个实施方案中，提供前述方法，其中水溶性聚合物包含选自由以下组成的组的链长：O5、O7、O9、O11、O13和O15。在另一实施方案中，提供前述方法，其中水溶性连接子是选自由以下组成的组：a)下式的3-氧杂戊烷-1，5-二氧基胺：b)下式的3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺：c)下式的3，6，9，12，15-五氧杂十七烷-1，17-二氧基胺：以及d)下式的3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十三烷-1，23-二氧基胺：在另一实施方案中，提供前述方法，其中水溶性连接子为下式的3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺：在另一实施方案中，提供前述方法，其中水溶性连接子为下式的3，6，9，12，15-五氧杂十七烷-1，17-二氧基胺：本文中涵盖制备脂肪酸衍生物的其它方法。在一个实施方案中，提供一种制备前述脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)酯化脂肪酸上的羧基以在脂肪酸上产生酯；b)通过在步骤a)的脂肪酸上引入甲磺酰基活化脂肪酸上的ω-羟基；和c)通过取代步骤b)的甲磺酰基来偶合包含活性氨氧基的水溶性连接子，由此形成稳定的氧基胺-亚甲基键；其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。在一个实施方案中，提供前述方法，其中通过选自由以下组成的组的酯化剂酯化羧基：乙酰氯、酸存在下的甲醇、酸存在下的乙醇、重氮甲烷和碘甲烷。在另一实施方案中，酯化剂为乙酰氯。在另一实施方案中，提供前述方法，其中通过选自由以下组成的组的活化剂活化ω-羟基：甲磺酰氯、甲苯磺酰氯和硝基苯磺酰氯。在一个实施方案中，活化剂为甲磺酰氯。预期各种脂肪酸可用于前述方法中。在一个实施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。在另一实施方案中，脂肪酸为饱和脂肪酸。在另一实施方案中，脂肪酸为支链脂肪酸。在另一实施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸包含C10与C24之间的链长，包括具有奇数个碳数的合成脂肪酸。在一个实施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含选自由以下组成的组的链长：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22和C24。在另一实施方案中，脂肪酸具有选自由C14、C16和C18组成的组的链长。在另一实施方案中，脂肪酸具有选自由C13、C15和C17组成的组的链长。也预期各种水溶性聚合物可用于前述方法中。在一个实施方案中，提供前述方法，其中水溶性连接子包含水溶性聚合物和至少一个氨氧基。在另一实施方案中，水溶性聚合物是选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支链淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵(MPC)。在另一实施方案中，水溶性聚合物为PEG。在本发明的另一实施方案中，提供前述方法，其中水溶性聚合物包含选自由以下组成的组的链长：O3、O5、O7、O9、O11、O13和O15。在另一实施方案中，水溶性连接子是选自由以下组成的组：本发明中也涵盖制备偶联蛋白质的方法。在一个实施方案中，提供一种制备偶联治疗蛋白质的方法，其包括：使治疗蛋白质上氧化的碳水化合物部分与前述脂肪酸衍生物(或如本文所述的水溶性聚合物)在允许偶联的条件下接触；所述碳水化合物部分通过与包含选自由过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4)组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化；其中肟键联在氧化的碳水化合物部分与脂肪酸衍生物上的活性氨氧基之间形成；并且其中肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化：邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻甲氧基苯胺、间甲氧基苯胺和对甲氧基苯胺。在另一实施方案中，提供前述方法，其中治疗蛋白质是选自由以下组成的组：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白样多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白样多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白样多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白样多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白样多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白样多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白样多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿达木单抗(adalimumab))、Prolia(迪诺赛单抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中的蛋白质、或其生物活性片段、衍生物或变异体。在另一实施方案中，提供前述方法，其中治疗蛋白质为FVIIa。在另一实施方案中，提供前述方法，其中治疗蛋白质为FVIII。在另一实施方案中，提供前述方法，其中治疗蛋白质为FIX。在另一实施方案中，提供前述方法，其中氧化剂为过碘酸钠(NaIO4)。在另一实施方案中，提供前述方法，其中亲核性催化剂为间甲苯胺。在另一实施方案中，提供前述方法，其进一步包括纯化经过偶联的治疗蛋白质。在另一实施方案中，提供前述方法，其中通过如本文所述的方法制备脂肪酸衍生物。本发明还涵盖制备脂肪酸衍生物的其它方法。在一个实施方案中，提供一种制备前述脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)酯化脂肪酸上的羧基以在所述脂肪酸上产生酯；和b)使包含活性马来酰亚氨基的水溶性连接子与游离巯基(SH)偶合，由此形成稳定的硫醚键；其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。在另一实施方案中，提供一种制备前述脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)酯化脂肪酸上的羧基以产生脂肪酸酯；b)使由步骤a)产生的脂肪酸与叠氮试剂反应由此产生相应脂肪酸叠氮化物；c)氢化步骤b)的脂肪酸叠氮化物以产生相应脂肪酸胺；和d)使包含活性NHS基团的水溶性连接子与游离氨基偶合，由此形成稳定的键；其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。图式图1示出水溶性连接子3-氧杂戊烷-1，5-二氧基胺的合成。发明详述治疗蛋白质的药理学和免疫学性质可以通过利用聚合化合物(如本发明的脂肪酸和脂肪酸衍生物)进行化学修饰和偶联而得到改良。添加如本文所述的水溶性脂肪酸衍生物为一种改良治疗蛋白质的性质的方法，所述治疗蛋白质如凝血蛋白质因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)或ADAMTS13蛋白酶，以及其它已知蛋白质或其生物活性/治疗活性片段。治疗蛋白质在本发明的某些实施方案中，前述多肽和多核苷酸由以下治疗蛋白质示例：酶、抗原、抗体、受体、凝血蛋白、生长因子、激素和配体。在某些实施方案中，治疗蛋白质为凝血蛋白，如因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)或ADAMTS13蛋白酶。在某些实施方案中，治疗蛋白质为免疫球蛋白、细胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、血管位蛋白，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、人血管位蛋白样多肽ANGPTL1至7、玻粘蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型态发生蛋白-1、骨型态发生蛋白-2、骨型态发生蛋白-3、骨型态发生蛋白-4、骨型态发生蛋白-5、骨型态发生蛋白-6、骨型态发生蛋白-7、骨型态发生蛋白-8、骨型态发生蛋白-9、骨型态发生蛋白-10、骨型态发生蛋白-11、骨型态发生蛋白-12、骨型态发生蛋白-13、骨型态发生蛋白-14、骨型态发生蛋白-15、骨型态发生蛋白受体IA、骨型态发生蛋白受体IB、骨型态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心脏营养素-1、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、畸胎癌源性生长因子、潜伏蛋白、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、表皮素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF，包括TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白和其生物活性或免疫学活性片段。在某些实施方案中，治疗蛋白质为α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素、集落刺激因子，包括粒细胞集落刺激因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物蛋白质，如凝集素和蓖麻毒素、肿瘤坏死因子和相关等位基因、肿瘤坏死因子受体的可溶性形式、白介素受体和白介素受体的可溶性形式、生长因子，如组织生长因子，如TGFα或TGFβ和表皮生长因子、激素、生长调节素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲状腺素、组织纤溶酶原活化因子和免疫球蛋白，如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体化激素、雌激素、皮质类固醇、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、DNA酶、整合素、凝血酶、造血生长因子、瘦素、糖苷酶、Humira(阿达木单抗)、Prolia(迪诺赛单抗)、Enbrel(依那西普)和其片段，或包含任何上述蛋白质或其片段的任何融合蛋白。除前述蛋白质外，下表1也提供本发明所涵盖的治疗蛋白质：本文提供的治疗蛋白质不应视为排外的。反而是根据本文提供的揭示内容显而易见，本发明的方法适用于根据本发明需要连接水溶性脂肪酸衍生物的任何蛋白质。举例来说，治疗蛋白质描述于US2007/0026485中，所述文献以引用的方式整体并入本文。凝血蛋白在一个方面中，本发明的起始材料为凝血蛋白，其可以来源于人血浆，或通过重组工程改造技术产生，如以下专利中所述：美国专利号4,757,006；美国专利号5,733,873；美国专利号5,198,349；美国专利号5,250,421；美国专利号5,919,766；和EP306968。如凝血蛋白等治疗蛋白质由蛋白水解酶快速降解并且由抗体中和，所述凝血蛋白包括因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS13蛋白酶。这种现象缩短其半衰期和循环时间，由此限制其治疗效果。相对较高的剂量和频繁施用为达到和维持这些治疗凝血蛋白的所要治疗或预防作用所必需。因此，难以获得充分的剂量调节并且需要频繁静脉内施用对患者的生活方式造成限制。如本文所述，本发明涵盖凝血蛋白，包括(但不限于)因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS13蛋白酶。如本文所用，术语“凝血蛋白”是指显示出与特定天然凝血蛋白相关的生物活性的任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威勒布兰德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS13蛋白酶。凝血级联分为三个不同区段：内源性、外源性和共同途径(Schenone等，CurrOpinHematol.2004；11：272-7)。所述级联涉及一系列丝氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白质辅因子。需要时，非活性酶原前驱体转化为活性形式，其随后转化级联中的下一个酶。内源性途径需要凝血因子VIII、IX、X、XI和XII。内源性途径的起始发生于前激肽释放素、高分子量激肽原、因子XI(FXI)和因子XII(FXII)暴露于带负电荷的表面时。也需要由血小板分泌的钙离子和磷脂。外源性途径在血管的血管内腔受到损伤时起始。膜糖蛋白组织因子暴露且接着结合于循环的因子VII(FVII)和少量已经存在的其活化形式FVIIa。此结合促进FVII完全转化为FVIIa并且随后在钙和磷脂存在下促进因子IX(FIX)转化为因子IXa(FIXa)和因子X(FX)转化为因子Xa(FXa)。FVIIa与组织因子的缔合通过使FVII的底物(FIX和FX)结合位点更接近和通过诱导构形变化而增强蛋白水解活性，所述构形变化增强FVIIa的酶促活性。FX的活化为所述两条途径的共同点。因子Va(FVa)和Xa与磷脂和钙一起将凝血酶原转化为凝血酶(凝血酶原酶复合物)，凝血酶接着裂解纤维蛋白原形成纤维蛋白单体。所述单体聚合形成纤维蛋白股束。因子XIIIa(FXIIIa)使这些股束彼此共价键结形成刚性网状物。FVII转化为FVIIa也由多种蛋白酶催化，所述蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)和因子XIIa(FXIIa)。为抑制所述级联的早期，组织因子途径抑制剂靶向FVIIa/组织因子/FXa产物复合物。因子VIIaFVII(也称为稳定因子或前转化素(proconvertin))为维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白，其在止血和凝血中具有关键作用(Eigenbrot，CurrProteinPeptSci.2002；3：287-99)。FVII在肝脏中合成且分泌为48kD单链糖蛋白。FVII与所有维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白共享由以下组成的类似蛋白质结构域结构：负责蛋白质与脂质膜相互作用的具有9-12个残基的氨基端γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域、羧基端丝氨酸蛋白酶结构域(催化结构域)和两个含有介导与组织因子的相互作用的钙离子结合位点的表皮生长因子样结构域。γ-谷氨酰基羧化酶催化分子的氨基端部分中Gla残基的羧化。羧化酶依赖于维生素K的还原形式以便发挥其作用，维生素K被氧化为环氧化物形式。需要维生素K环氧化物还原酶来将维生素K的环氧化物形式再转化为还原形式。大部分FVII在血浆中以酶原形式循环并且此形式的活化导致精氨酸152与异亮氨酸153之间的肽键裂解。所产生的活化型FVIIa由NH2来源的轻链(20kD)与COOH端来源的重链(30kD)通过单个二硫键(Cys135至Cys262)连接而组成。轻链含有膜结合Gla结构域，而重链含有催化结构域。FVII的血浆浓度由遗传和环境因素决定，为约0.5mg/mL(Pinotti等，Blood.2000；95：3423-8)。不同FVII基因型可以导致平均FVII水平产生若干倍的差异。血浆FVII水平在健康女性中在怀孕期间升高，并且也随年龄而增加，且在女性和患有高甘油三酯血症的人中较高。在所有促凝血因子中FVII具有最短的半衰期(3-6h)。FVIIa的平均血浆浓度在健康个体中为3.6ng/mL，且FVIIa的循环半衰期与其它凝血因子相比相对较长(2.5h)。遗传性FVII缺乏为一种罕见的常染色体隐性出血性病症，发病率据估计在普通人群中为每500,000人1例(Acharya等，JThrombHaemost.2004；2248-56)。因抑制剂造成的后天性FVII缺乏也极罕见。也已报导缺乏的发生与如头孢菌素(cephalosporins)、青霉素(penicillins)和口服抗凝血剂等药物有关的病例。此外，已报导自发发生或与其它病状(如骨髓瘤、败血症、再生障碍性贫血)、白介素-2和抗胸腺细胞球蛋白疗法伴随发生的后天性FVII缺乏。参考多核苷酸和多肽序列包括例如保藏编号J02933(基因组序列)、M13232(cDNA)(Hagen等PNAS1986；83：2412-6)和P08709(多肽序列)(以引用的方式整体并入本文)。FVII的多种多态现象已有描述，例如参见Sabater-Lleal等(HumGenet.2006；118：741-51)(以引用的方式整体并入本文)。因子IXFIX为一种维生素K依赖性血浆蛋白，其通过在钙离子、磷脂和FVIIIa存在下将FX转化为其活性形式而参与内源性凝血途径。FIX的主要催化能力是作为对FX内的特定精氨酸-异亮氨酸键具有特异性的丝氨酸蛋白酶。FIX由FXIa活化，FXIa使活化肽从FIX切除从而产生包含由一个或多个二硫键保持的两条链的活化型FIX分子。FIX缺乏为隐性X-连锁血友病B的原因。血友病A和B为特征分别在于FVIII和FIX多肽缺乏的遗传性疾病。缺乏的根本原因常为FVIII和FIX基因突变的结果，所述两个基因均位于X染色体上。血友病的传统疗法通常涉及静脉内施用自正常个体汇集的血浆或半纯化的凝血蛋白。所述制剂可能受致病性病原体或病毒污染，如感染性朊病毒、HIV、细小病毒、A型肝炎和C型肝炎。因此，对不需要使用人血清的治疗剂存在迫切需要。FIX活性降低的程度与血友病B的严重程度成正比。血友病B的当前治疗由以血浆来源或重组的FIX替代缺失的蛋白质(也称为FIX取代或替代治疗或疗法)。FIX的多核苷酸和多肽序列例如可见于UniProtKB/Swiss-Prot保藏编号P00740和美国专利号6,531,298中。因子VIII凝血因子VIII(FVIII)在血浆中以极低浓度循环并且与冯威勒布兰德因子(VWF)非共价结合。在止血时，FVIII与VWF分离并且通过增强在钙和磷脂或细胞膜存在下活化的速率而充当活化型因子IX(FIXa)介导的FX活化的辅因子。FVIII合成为具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2的约270-330kD的单链前驱体。当从血浆纯化时(例如“血浆来源”或“血浆”)，FVIII由重链(A1-A2-B)和轻链(A3-C1-C2)构成。轻链的分子质量为80kD，而由于B结构域内的蛋白水解，重链在90-220kD的范围内。FVIII也合成为重组蛋白以供在治疗上用于出血病症。已设计各种体外测定来测定重组FVIII(rFVIII)作为治疗药物的潜在功效。这些测定模拟内源性FVIII的体内作用。FVIII的体外凝血酶处理导致其促凝血活性快速增强并随后降低，如通过体外测定所测量。此活化和失活与重链和轻链两者中的特异性有限蛋白水解相符，所述蛋白水解改变FVIII中不同结合表位的可用性，例如使FVIII从VWF解离和结合磷脂表面或改变与某些单克隆抗体的结合能力。FVIII缺乏或功能异常与最常出现的出血病症血友病A有关。选用于管理血友病A的治疗为利用血浆来源或rFVIII浓缩物的替代疗法。患有FVIII水平低于1％的严重血友病A的患者通常进行旨在保持FVIII在剂量之间高于1％的预防疗法。考虑到循环中各种FVIII产物的平均半衰期，此结果通常可以通过每周给予FVIII两至三次来达成。参考多核苷酸和多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-ProtP00451(FA8_HUMAN)；GitschierJ等，CharacterizationofthehumanFactorVIIIgene，Nature，312(5992)：326-30(1984)；VeharGH等，StructureofhumanFactorVIII，Nature，312(5992)：337-42(1984)；ThompsonAR.StructureandFunctionoftheFactorVIIIgeneandprotein，SeminThrombHemost，2003：29；11-29(2002)。冯威勒布兰德因子冯威勒布兰德因子(VWF)为在血浆中以大小在约500至20,000kD范围内的一系列多聚体形式循环的糖蛋白。VWF的多聚体形式由250kD多肽亚基通过二硫键连接在一起构成。VWF介导血小板与受损血管壁的内皮下层的最初粘着。仅较大多聚体显示止血活性。推测内皮细胞分泌VWF的较大聚合形式而VWF的具有低分子量的形式(低分子量VWF)由蛋白水解裂解产生。具有较大分子质量的多聚体储存于内皮细胞的Weibel-Pallade体中并且在受刺激时释放。VWF由内皮细胞和巨核细胞合成为在很大程度上由重复结构域组成的前VWF原。信号肽裂解时，前VWF通过位于其C端区域中的二硫键二聚化。二聚体用作多聚化的原体，其中多聚化受制于游离末端之间的二硫键。组装成多聚体后，前肽序列被蛋白水解移除(Leyte等，Biochem.J.274(1991)，257-261)。根据VWF的所克隆cDNA预测的初级翻译产物为2813个残基的前驱多肽(前VWF原)。前VWF原由22个氨基酸的信号肽和741个氨基酸的前肽组成，其中成熟VWF包含2050个氨基酸(RuggeriZ.A.，和Ware，J.，FASEBJ.，308-316(1993))。VWF缺乏引起冯威勒布兰德病(vonWillebranddisease；VWD)，其特征在于明显程度或高或低的出血表型。3型VWD为最严重形式，其中VWF完全缺失，而1型VWD涉及VWF的量减少并且其表型可极轻微。2型VWD涉及VWF的明显缺乏并且可如同3型VWD一样严重。2型VWD具有许多亚型，其中一些与高分子量多聚体的缺失或减少有关。2a型冯威勒布兰德病(VWD-2A)的特征在于中等和较大多聚体均缺失。VWD-2B的特征在于最高分子量的多聚体缺失。与VWF有关的其它疾病和病症在本领域中为已知的。前VWF原的多核苷酸和氨基酸序列可分别以GenBank保藏编号NM_000552和NP_000543获得。本发明的其它凝血蛋白描述于本领域中，例如MannKG，ThrombHaemost，1999；82：165-74。A.多肽在一个方面中，本发明的起始材料为蛋白质或多肽。如本文所述，术语治疗蛋白质是指显示出与治疗蛋白质有关的生物活性的任何治疗蛋白质分子。在本发明的一个实施方案中，治疗蛋白质分子为全长蛋白质。所涵盖的治疗蛋白质分子包括全长蛋白质、全长蛋白质的前驱体、全长蛋白质的生物活性亚基或片段、以及任何这些形式治疗蛋白质的生物活性衍生物和变异体。因此，治疗蛋白质包括具有以下特征者：(1)具有与由参考核酸编码的多肽或本文所述的氨基酸序列在至少约25个、约50个、约100个、约200个、约300个、约400个或更多个氨基酸的区域上的氨基酸序列同一性大于约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或更高的氨基酸序列；和/或(2)特异性结合针对包含如本文所述的参考氨基酸序列的免疫原或其免疫原性片段和/或其保守性修饰变异体产生的抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体。根据本发明，术语“重组治疗蛋白质”包括通过重组DNA技术获得的任何治疗蛋白质。在某些实施方案中，所述术语涵盖如本文所述的蛋白质。如本文所用，“内源性治疗蛋白质”包括来源于意欲接受治疗的哺乳动物的治疗蛋白质。所述术语也包括由存在于所述哺乳动物中的转基因或任何其它外来DNA转录的治疗蛋白质。如本文所用，“外源性治疗蛋白质”包括并非来源于意欲接受治疗的哺乳动物的凝血蛋白。如本文所用，“血浆来源的凝血蛋白”或“血浆”包括在获自哺乳动物的血液中发现的具有参与凝血途径的性质的蛋白质的任何形式。如本文所用，“生物活性衍生物”或“生物活性变异体”包括分子的具有与所述分子实质上相同的功能和/或生物性质(如结合性质)和/或相同结构基础(如肽骨架或基本聚合单元)的任何衍生物或变异体。“类似物”、“变异体”或“衍生物”为与天然产生的分子在结构上实质上类似并且具有相同生物活性(尽管在一些情况下有一定程度的不同)的化合物。举例来说，多肽变异体是指与参考多肽共享实质上类似的结构并且具有相同生物活性的多肽。变异体或类似物与所述类似物所来源的天然产生的多肽相比基于涉及以下方面的一个或多个突变在其氨基酸序列组成方面有所不同：(i)多肽的一个或多个末端和/或天然产生的多肽序列(例如片段)的一个或多个内部区域的一个或多个氨基酸残基缺失，(ii)在多肽的一个或多个末端(通常为“添加”或“融合”)和/或天然产生的多肽序列的一个或多个内部区域(通常为“插入”)插入或添加一个或多个氨基酸，或(iii)一个或多个氨基酸取代天然产生的多肽序列中的其它氨基酸。举例来说，“衍生物”是指已修饰(例如化学修饰)的与参考多肽共享相同或实质上类似的结构的多肽。在各种实施方案中，类似物、变异体或衍生物设计成允许例如将另一分子偶联至蛋白质类似物、变异体或衍生物，由此形成本发明的偶联的蛋白质。变异体或类似物多肽包括插入变异体，其中一个或多个氨基酸残基添加至本发明的治疗蛋白质氨基酸序列。插入可位于蛋白质的任一个或两个末端，和/或可位于治疗蛋白质氨基酸序列的内部区域中。在任一个或两个末端具有另外的残基的插入变异体包括例如融合蛋白和包括氨基酸标签或其它氨基酸标记的蛋白质。在一个方面中，凝血蛋白分子任选地含有N-端Met，尤其在分子在如大肠杆菌(E.coli)等细菌细胞中重组表达时。在缺失变异体中，如本文所述的治疗蛋白质多肽中的一个或多个氨基酸残基被移除。缺失可以在治疗蛋白质多肽的一个或两个末端实现，和/或通过移除治疗蛋白质氨基酸序列内部的一个或多个残基来实现。因此，缺失变异体包括治疗蛋白质多肽序列的片段。在取代变异体中，治疗蛋白质多肽的一个或多个氨基酸残基被移除并且被替代残基置换。在一个方面中，取代在性质上为保守性的并且此类型的保守性取代在本领域中为熟知的。或者，本发明涵盖也为非保守性的取代。示范性保守性取代描述于Lehninger，[Biochemistry，第2版；WorthPublishers，Inc.，NewYork(1975)，第71-77页]中并且紧接着在下文进行阐述。保守性取代或者，示范性保守性取代紧接着在下文进行阐述。保守性取代IIB.多核苷酸编码本发明治疗蛋白质的核酸包括例如且不限于基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多态变异体、等位基因、合成和天然产生的突变体。编码本发明治疗蛋白质的多核苷酸也包括(但不限于)具有以下特征者：(1)在严格杂交条件下与编码如本文所述的参考氨基酸序列的核酸和其保守性修饰变异体特异性杂交；(2)具有与如本文所述的参考核酸序列在至少约25个、约50个、约100个、约150个、约200个、约250个、约500个、约1000或更多个核苷酸(至多成熟蛋白质的1218个核苷酸的全长序列)的区域上的核苷酸序列同一性大于约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的核酸序列。示范性“严格杂交”条件包括在42℃下于50％甲酰胺、5×SSC、20mMNa·PO4(pH6.8)中杂交；和在55℃下于1×SSC中洗涤30分钟。应了解，这些示范性条件可以基于欲杂交序列的长度和GC核苷酸含量进行变化。本领域的标准公式适于确定适当杂交条件。参见Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)§§9.47-9.51。“天然产生”的多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物，包括(但不限于)灵长类动物，例如人；啮齿动物，例如大鼠、小鼠、仓鼠；牛、马、绵羊或任何哺乳动物。本发明的核酸和蛋白质可以是重组分子(例如异源分子和编码野生型序列或其变异体的分子，或天然产生的分子)。C.治疗蛋白质的产生治疗蛋白质的产生包括本领域中已知用于进行以下的任何方法：(i)通过遗传工程改造产生重组DNA，(ii)通过例如但不限于转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中，(iii)培养所述经过转化的细胞，(iv)表达治疗蛋白质，例如组成性表达或诱导后表达，和(v)分离所述凝血蛋白，例如从培养基或通过收集转化细胞进行分离，以便获得纯治疗蛋白质。在其它方面中，治疗蛋白质通过在特征在于产生药理学上可接受的凝血蛋白分子的适合原核或真核宿主系统中表达来产生。真核细胞的实例为哺乳动物细胞，如CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep和HepG2。多种载体用于制备治疗蛋白质且选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，如(但不限于)pRSET、pET和pBAD，其中原核表达载体中所用的启动子包括(但不限于)lac、trc、trp、recA或araBAD中的一者或多者。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达的载体，如(但不限于)pAO、pPIC、pYES或pMET，所用的启动子如(但不限于)AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体，如(但不限于)pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，所用的启动子如(但不限于)PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh；和(iii)用于在哺乳动物中表达的载体，如(但不限于)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，且在一个方面中载体来源于病毒系统，如(但不限于)痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或逆转录病毒，所用的启动子如(但不限于)CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白。在本发明的各种实施方案中，治疗蛋白质通过将水溶性脂肪酸衍生物或水溶性连接子偶联至治疗蛋白质上的一个或多个碳水化合物进行修饰。因此在一个实施方案中，治疗蛋白质为糖蛋白并且纯化自允许糖基化的宿主细胞(即，蛋白质在体内糖基化并且随后以糖蛋白形式纯化)。在各种实施方案中，治疗蛋白质为或不为糖蛋白并且在从宿主细胞纯化后在体外进行糖基化。体外糖基化方法在本领域中为熟知的(参见例如Meynial-SallesI和CombesD，JournalofBiotechnology1996，46：1-14；/SoláRJ和GriebenowK，BioDrugs2010，24：9-21)。当然，本领域的技术人员可以(1)纯化治疗蛋白质；(2)修饰治疗蛋白质以允许在体外(任选地位点特异性)糖基化(例如氨基酸缺失/插入/取代)；和(3)根据本领域中已知的程序在体外对经过修饰的蛋白质进行糖基化。D.施用在一个实施方案中，本发明的偶联治疗蛋白质可以通过注射，如静脉内、肌肉内或腹膜内注射进行施用。为向人或测试动物施用包含本发明的偶联治疗蛋白质的组合物，在一个方面中，组合物包含一种或多种药学上可接受的载剂。术语“药学上”或“药理学上可接受”是指分子实体和组合物在使用如下文所述在本领域中熟知的路径施用时稳定、抑制蛋白质降解(如聚集和裂解产物)，并且此外不产生过敏反应或其它不良反应。“药学上可接受的载剂”包括任何和所有临床上适用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等，包括上文揭示的药剂。如本文所用，“有效量”包括适于治疗疾病或病症或缓解疾病或病症的症状的剂量。在一个实施方案中，“有效量”包括适于治疗患有如本文所述的出血病症的哺乳动物的剂量。组合物可以口服、局部外用、透皮、肠胃外、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射来施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射或输注技术。也涵盖通过静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或在特定部位手术植入进行施用。一般来说，组合物基本上不含热原质以及可能会对接受者有害的其它杂质。组合物的单次或多次施用可以采用由主治医师选择的剂量水平和模式进行。为预防或治疗疾病，适当剂量将取决于如上文所述欲治疗疾病的类型、疾病的严重性和病程、药物是出于预防还是治疗的目的施用、先前疗法、患者的病史和对药物的反应，以及主治医师的判断。本发明也涉及包含有效量的如本文所定义的偶联治疗蛋白质的药用组合物。药用组合物可以进一步包含药学上可接受的载剂、稀释剂、盐、缓冲剂或赋形剂。药用组合物可用于治疗上文定义的出血病症。本发明的药用组合物可为溶液或冻干产品。药用组合物的溶液可以经受任何适合冻干过程。作为另一方面，本发明包括包含本发明的组合物以有利于用于施用至受试者的方式封装的试剂盒。在一个实施方案中，这种试剂盒包括本文所述的化合物或组合物(例如包含偶联治疗蛋白质的组合物)封装于如密封瓶或器皿等容器中，具有描述所述化合物或组合物在实施方法时的使用的标签粘附于容器上或包括于包装中。在一个实施方案中，试剂盒含有具有包含偶联治疗蛋白质的组合物的第一容器和具有用于第一容器中的组合物的生理学上可接受的复原溶液的第二容器。在一个方面中，化合物或组合物以单位剂型封装。试剂盒可以进一步包括适于根据特定施用路径施用组合物的装置。试剂盒优选含有描述治疗蛋白质或肽组合物的使用的标签。脂肪酸、脂肪酸衍生物和蛋白质-脂肪酸衍生物偶联物在一个方面中，本文提供的治疗蛋白质衍生物(即偶联的治疗蛋白质)分子结合于水溶性脂肪酸衍生物。如本文所用，“水溶性脂肪酸衍生物”包含脂肪酸(即羧酸)偶联于如本文所述的水溶性连接子(例如氨氧基连接子)。根据本发明，所述脂肪酸衍生物为稳定的(即不从蛋白质释放)，可溶于水并且能够结合人血清白蛋白。A.脂肪酸脂肪酸(即FA或FAs)包括(但不限于)根据本发明能够结合人血清白蛋白的饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、支链脂肪酸(Mukheriji等，ProgLipidRes2003；42：359-76)和其衍生物。举例来说，脂肪酸具有以下一般结构：饱和FA：一般结构饱和FA甲酯：一般结构饱和FA乙酯：一般结构根据本发明的各种实施方案，脂肪酸也包含各种替代结构(例如甲酯或乙酯)或其它结构，如在ω-位置含有末端基团(例如羟基、氨基、硫基和羧基)。在一个实施方案中，脂肪酸为天然产生的脂肪酸。在各种实施方案中，脂肪酸为短链脂肪酸(例如少于6个碳)、中链脂肪酸(例如6至12个碳)、长链脂肪酸(例如长于12个碳)或极长链脂肪酸(例如长于22个碳)。在另一实施方案中，脂肪酸的碳在4个与28个之间。在一个实施方案中，脂肪酸呈顺式构型。在另一实施方案中，脂肪酸呈反式构型。在一个实施方案中，脂肪酸为长度在12个碳与20个碳之间的饱和脂肪酸。所述脂肪酸在本领域中为已知的，例如C12(十二烷酸、月桂酸)、C14(十四烷酸、肉豆蔻酸)、C16(十六烷酸、棕榈酸)、C18(十八烷酸、硬脂酸)和C20(二十烷酸、花生酸)。不饱和脂肪酸的实例为豆蔻油酸(C14:1)、棕榈油酸(C16:1)、油酸(C18:1)、亚麻油酸(C18:2)和花生四烯酸(C20:4)。所述脂肪酸大多数可购得并且可以通过不同化学方法制备(RecentDevelopmentsintheSynthesisofFattyAcidDerivatives，编者：KnotheG和DerksenJTB，AOCSPress1999，ISBN1-893997-00-6)。在本发明的各种实施方案中，脂肪酸包含4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个碳。B.脂肪酸衍生物本发明提供可结合人血清白蛋白的一类新颖活化脂肪酸衍生物(FA衍生物)的制备。所述FA衍生物含有允许在水溶液中处理和操作FA衍生物的水溶性间隔子或连接子(即不同于本发明的脂肪酸衍生物所来源的相应脂肪酸，本发明的脂肪酸衍生物可溶于水)。在一个实施方案中，所述FA衍生物含有活性氨氧基，其允许FA衍生物与治疗蛋白质的氧化型碳水化合物部分(主要为N-聚糖)偶合形成稳定的肟键联。如本文所用，“稳定的”键联意谓所形成的共价键“不可释放”或不可水解。通过碳水化合物进行化学修饰对于如FVIII、FIX和FVIIa等凝血蛋白形成具有高残余活性的偶联物来说可能为优选选择。举例来说且不加限制，以下策略代表根据本发明制备含有活性氨氧基的水溶性FA衍生物的一个实施方案。策略1：利用戴斯马丁高碘烷对FA衍生物(例如16-羟基十六烷酸)的ω-羟基进行氧化以产生醛基。在下一步骤中，使含有水溶性PEG链的二氨氧基连接子(例如3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺)与此醛基偶合以形成稳定肟键联。以下流程代表根据策略1的一个实例：步骤1：用戴斯马丁试剂对16-羟基硬脂酸进行选择性氧化以产生16-氧代硬脂酸。粗产物通过色谱使用硅胶作为分离剂进行纯化。步骤2：使16-氧代硬脂酸钠盐的16-氧代部分与3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺反应。粗产物通过色谱使用硅胶作为分离剂进行纯化。或者，在另一实施方案中，采用以下策略来制备含有活性氨氧基的水溶性FA衍生物。策略2：利用乙酰氯对ω-羟基脂肪酸(例如16-羟基十六烷酸)的羧基进行酯化。此甲酯衍生物的ω-羟基用甲磺酰氯活化以便引入更好的离去基团。接着使甲磺酰基与含有水溶性PEG链的二氨氧基连接子(例如3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺)反应以形成稳定的氨氧基-亚甲基键。任选地，可以在碱性溶液中水解甲酯以产生游离羧基。以下流程代表根据策略2的一个实例：步骤1：16-羟基十六烷酸的羧基部分通过使用乙酰氯作为甲基化试剂形成甲酯加以保护。步骤2：通过用甲磺酰基(其为更好的离去基团)取代羟基来活化16-羟基十六烷酸甲酯的16-羟基部分。步骤3：16-甲磺酰基十六烷酸甲酯的16-甲磺酰基部分以双官能3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺的一个氨氧基部分取代。粗产物通过色谱使用硅胶作为分离剂进行纯化。本发明也涵盖另一策略。本发明例如不限于利用氨氧基化学来与氧化的碳水化合物残基的醛基偶合。如本文所述，也涵盖使用其它化学，包括(但不限于)：使用酰肼与醛基偶合、使用NHS与氨基偶合以及使用马来酰亚胺与治疗蛋白质的游离SH-基团偶合。举例来说，使如上文所述制备的脂肪酸甲酯与如本文所述的市售MAL-PEG-COOH(mal-PEG(12)-COOH/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反应。作为另一实例，使具有反应性氨基的脂肪酸酯与如本文所述的市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反应。水溶性连接子包括(但不限于)水溶性聚合物(例如PEG)。连接子可以由含有一个或多个增加水溶性的官能团的任何化学结构组成。这些官能团可具有形成负电荷或正电荷的能力，由此使得连接子可溶于水。在一个实施方案中，此官能团包括(但不限于)磺酸基或羧基。此外可以使用任何极性官能团，其使得连接子可溶于水。其实例为羟基、氨基、酰氨基、马来酰亚氨基、氨氧基和酰肼基，以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和磺酸基NHS酯。在各种实施方案中，水溶性连接子包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支链淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵(MPC)。在一个实施方案中，水溶性聚合物为PEG。在本发明的各种实施方案中，水溶性聚合物包含约3至25个氧之间的链长。举例来说，在本发明的各种实施方案中，水溶性聚合物包含3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25个氧。C.蛋白质-脂肪酸衍生物偶联物本发明涵盖氨氧基连接子系统(即其中水溶性脂肪酸衍生物包含氨氧基连接子)。举例来说，在本发明的一个实施方案中，应用羟基胺或羟基胺衍生物与醛(例如利用过碘酸钠进行氧化后碳水化合物部分上的醛)形成肟基的反应来制备蛋白质偶联物。举例来说，首先用如过碘酸钠(NaIO4)等氧化剂对糖蛋白(例如本发明的治疗蛋白质)进行氧化(RothfusJA和SmithEL.，JBiolChem1963，238，1402-10；以及VanLentenL和AshwellG.，JBiolChem1971，246，1889-94)。糖蛋白的过碘酸盐氧化是基于1928年描述的经典马拉普瑞德反应(Malapradereaction)，所述反应是利用过碘酸盐对邻二醇进行氧化形成活性醛基(MalapradeL.，Analyticalapplication，BullSocChimFrance，1928，43，683-96)。这种氧化剂的其它实例为四乙酸铅(Pb(OAc)4)、乙酸锰(MnO(Ac)3)、乙酸钴(Co(OAc)2)、乙酸铊(TlOAc)、硫酸铈(Ce(SO4)2)(US4,367,309)或过钌酸钾(KRuO4)(Marko等，JAmChemSoc1997，119，12661-2)。“氧化剂”意谓在生理学反应条件下能够氧化碳水化合物中的邻二醇由此产生活性醛基的温和氧化性化合物。第二步骤为含有氨氧基的聚合物(例如脂肪酸衍生物)与氧化的碳水化合物部分偶合形成肟键联。在本发明的一个实施方案中，此步骤可以在催化量的亲核性催化剂苯胺或苯胺衍生物存在下进行(DirksenA和DawsonPE，BioconjugateChem.2008；ZengY等，NatureMethods2009；6：207-9)。苯胺催化显著加速肟连接，从而允许使用极低浓度的试剂。在本发明的另一实施方案中，肟键联通过用NaCNBH3还原形成烷氧基胺键联而稳定化。其它催化剂在下文描述。在另一实施方案中，此步骤在间甲苯胺存在下进行。在本发明的一个实施方案中，偶联水溶性连接子(例如脂肪酸衍生物)与蛋白质的反应步骤分别且依序进行(即，起始材料(例如治疗蛋白质、水溶性连接子等)、试剂(例如氧化剂、苯胺等)和反应产物(例如治疗蛋白质上氧化的碳水化合物、活化的氨氧基水溶性连接子等)在个别反应步骤之间分离)。在另一实施方案中，完成本发明的偶联反应所必需的起始材料和试剂在单一容器中进行。在一个实施方案中，将天然蛋白质与氨氧基-聚合物试剂混合。随后，添加氧化剂且进行偶联反应。关于氨氧基技术的其它信息可见于以下参考文献中，所述参考文献各自以引用的方式整体并入本文：EP1681303A1(HAS化红血球生成素)；WO2005/014024(由肟连接基团连接的聚合物与蛋白质的偶联物)；WO96/40662(含氨氧基连接子化合物和其在偶联物中的应用)；WO2008/025856(经过修饰的蛋白质)；PeriF等，Tetrahedron1998，54，12269-78；Kubler-KielbJ和PozsgayV.，JOrgChem2005，70，6887-90；LeesA等，Vaccine2006，24(6)，716-29；和HerediaKL等，Macromolecules2007，40(14)，4772-9。水溶性连接子的偶合可以通过与蛋白质直接偶合(例如通过蛋白质上的游离巯基或游离氨基)或通过本文所述的连接子分子进行。在一个方面中，偶联是通过在形成稳定的键下使水溶性连接子与治疗蛋白质直接偶合(或通过连接子系统偶合)来进行。因此，在本发明的各种实施方案中，本文所述的脂肪酸衍生物设计成允许与治疗蛋白质偶合。举例来说，脂肪酸衍生物设计成包括各种末端反应性基团，如本文所述。在某些方面中，治疗蛋白质通过多种化学方法中的任一种偶联至水溶性脂肪酸衍生物(RobertsJM等，AdvanDrugDeliveryRev2002；54：459-76)。举例来说，在一个实施方案中，通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯使脂肪酸衍生物偶联至蛋白质的游离氨基来对治疗蛋白质进行修饰。在另一实施方案中，使用马来酰亚胺化学来使水溶性脂肪酸衍生物偶合至游离SH基团。在另一实施方案中，水溶性脂肪酸衍生物通过使用酰肼或氨氧基化学偶合至预先氧化后的治疗蛋白质的碳水化合物部分。在本发明的一个实施方案中，通过使用含有活性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的水溶性脂肪酸衍生物通过赖氨酸残基对治疗蛋白质进行修饰。所述衍生物在温和条件下通过形成稳定酰胺键与治疗蛋白质的赖氨酸残基反应。在本发明的另一实施方案中，涵盖通过蛋白质或脂肪酸衍生物中任一者之一上的羧基与蛋白质或脂肪酸衍生物的氨基之间的肽键，或蛋白质或脂肪酸衍生物的羧基与治疗蛋白质或脂肪酸衍生物的羟基之间的酯键进行连接。治疗蛋白质借以共价键结至脂肪酸衍生物的另一键联是通过席夫碱(Schiffbase)，例如蛋白质上的游离氨基与脂肪酸末端所形成的醛基之间反应形成的席夫碱。在一个方面中，所产生的席夫碱通过利用NaCNBH3特异性还原形成仲胺来稳定化。一种替代方法为通过在预先氧化后利用NH4Cl进行还原胺化而在脂肪酸衍生物中产生末端游离氨基。可以使用双官能试剂来连接两个氨基或两个羟基。举例来说，利用如BS3(双(磺酸基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯/Pierce，Rockford，IL)等试剂使含有氨基的脂肪酸衍生物偶合至蛋白质的氨基。此外，也例如使用如磺酸基-EMCS(N-ε-马来酰亚氨基己酰氧基)磺酸基琥珀酰亚胺酯/Pierce)等异双官能交联试剂来连接氨基与硫醇基。在另一方法中，制备具有活性酰肼基的脂肪酸衍生物并使其偶合至预先氧化且产生醛官能团后的蛋白质的碳水化合物部分。如上所述，治疗蛋白质的游离氨基与脂肪酸衍生物的1-羧基反应形成肽键或在1-羧酸基与蛋白质上的羟基或其它适合活性基团之间形成酯键。在各种实施方案中，治疗蛋白质与脂肪酸衍生物以化学计算量连接或缔合(例如1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10等)。在各种实施方案中，1-6、7-12或13-20个脂肪酸衍生物连接至蛋白质。在其它实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个脂肪酸衍生物连接至蛋白质。在各种实施方案中，对治疗蛋白质进行修饰以引入糖基化位点(即除天然糖基化位点以外的位点)。所述修饰可使用所属领域中已知的标准分子生物学技术来完成。此外，治疗蛋白质在通过一个或多个碳水化合物部分偶联至水溶性连接子之前可以在体内或体外糖基化。这些经过糖基化的位点可以用作偶联蛋白质与水溶性连接子的标靶(美国专利申请号20090028822，美国专利申请号2009/0093399，美国专利申请号2009/0081188，美国专利申请号2007/0254836，美国专利申请号2006/0111279，和DeFreesS.等，Glycobiology，2006，16，9，833-43)。在一个实施方案中，与天然治疗蛋白质产物相比，偶联的蛋白质保留天然治疗蛋白质产物的完整功能活性，并且提供延长的体内半衰期。在另一实施方案中，相对于天然蛋白质，偶联的蛋白质保留至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(％)生物活性。在一相关方面中，偶联的蛋白质和天然凝血蛋白的生物活性利用发色活性与凝血因子抗原值的比率进行测定(凝血因子∶Chr∶凝血因子∶Ag)。在本发明的另一实施方案中，偶联的蛋白质的半衰期相对于天然治疗蛋白质的体内半衰期减少或增加0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。亲核性催化剂如本文所述，水溶性脂肪酸衍生物与治疗蛋白质的偶联可以利用苯胺来催化。苯胺强烈催化醛和酮与胺形成如腙和肟等稳定亚胺的水相反应。下图比较未催化与苯胺催化的肟连接反应(根据KohlerJJ，ChemBioChem2009；10：2147-50改编)。然而，考虑到与苯胺相关的众多健康风险，需要替代催化剂。本发明提供苯胺衍生物作为替代肟连接催化剂。所述苯胺衍生物包括(但不限于)邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻甲氧基苯胺、间甲氧基苯胺和对甲氧基苯胺。下图比较未催化与间甲苯胺催化的肟连接反应(PCT/US2011/45873)：在本发明的一个实施方案中，使用间甲苯胺(也称为间甲苯胺、间甲基苯胺、3-甲基苯胺或3-氨基-1-甲基苯)来催化本文所述的偶联反应。间甲苯胺与苯胺具有类似物理性质和基本上相同的pKa值(间甲苯胺：pKa4.73，苯胺：pKa4.63)。本发明的亲核性催化剂适用于肟连接(例如使用氨氧基键联)或腙形成(例如使用酰肼化学)。在本发明的各种实施方案中，偶联反应中所提供亲核性催化剂的浓度为0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50mM。在一个实施方案中，所提供的亲核性催化剂在1mM至10mM之间。在本发明的各种实施方案中，偶联反应的pH范围在4.0与7.0之间、4.5与7.0之间、5.0与6.5之间、5.0与6.5之间。在各种实施方案中，偶联反应的pH为pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。在一个实施方案中，pH在5.5至6.5之间。偶联的蛋白质的纯化在各种实施方案中，需要对已与氧化剂一起孵育的蛋白质和/或已与本发明的水溶性脂肪酸衍生物偶联的治疗蛋白质进行纯化。本领域中已知众多纯化技术并且包括(但不限于)色谱法、过滤法和沉淀法(参见例如GuidetoProteinPurification，Meth.Enzymology第463卷(由BurgessRR和DeutscherMP编著)，第2版，AcademicPress2009)。以下实施例不欲对本发明造成限制，而是仅为本发明的特定实施方案的示例。实施例实施例1制备同双官能连接子NH2[OCH2CH2]2ONH2同双官能连接子NH2[OCH2CH2]2ONH2根据Boturyn等(Tetrahedron1997；53：5485-92)在两步骤有机反应中采用经过修改的伯胺的加布里埃尔合成法(Gabriel-Synthesis)合成含有两个活性氨氧基的3氧杂戊烷-1，5-二氧基胺(图1)。在第一步骤中，使一分子2，2-二氯二乙基醚与两分子内-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺在DMF中反应。通过在乙醇中进行肼解反应从所得中间体制备所要同双官能产物。实施例2制备同双官能连接子NH2[OCH2CH2]6ONH2同双官能连接子NH2[OCH2CH2]6ONH2根据Boturyn等(Tetrahedron1997；53：5485-92)在两步骤有机反应中采用经过修改的伯胺的加布里埃尔合成法合成含有两个活性氨氧基的3，6，9，12，15-五氧杂-十七烷-1，17-二氧基胺。在第一步骤中，使一分子六乙二醇二氯与两分子内N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺在DMF中反应。通过在乙醇中进行肼解反应从所得中间体制备所要同双官能产物。实施例3制备同双官能连接子NH2[OCH2CH2]4ONH2根据Boturyn等(Tetrahedron1997；53：5485-92)在两步骤有机反应中采用经过修改的伯胺的加布里埃尔合成法合成含有两个活性氨氧基的同双官能连接子NH2[OCH2CH2]4ONH2(3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺)。在第一步骤中，使一分子双-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚与两分子内N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺在DMF中反应。通过在乙醇中进行肼解反应从所得中间体制备最终同双官能产物。实施例4制备16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亚氨基)-十六烷酸钠盐根据Halligan和Nair(Arkivoc2006(ii)101-106)以及Hubbs和Heathcock(JAmChemSoc，2003；125：12836-43)在两步骤反应中合成脂肪酸-氨氧基连接子16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亚氨基)-十六烷酸钠盐。中间体1：16-氧代十六烷酸钠盐在0℃下向16-羟基十六烷酸(800mg，2.9mmol)于二氯甲烷(10ml)和四氢呋喃(20ml)中的冷溶液(0℃)中添加戴斯马丁高碘烷(1636mg，3.7mmol)。将混合物在氩气氛围下在0℃下搅拌3.5小时并且在室温下搅拌2.5小时。接着添加硫代硫酸钠于饱和碳酸氢钠溶液中的15％溶液，将混合物在室温下搅拌1.5小时。用乙醚萃取中间体1，经过硫酸钠脱水后，蒸发有机层至干燥并且通过管柱色谱使用作为分离剂的硅胶和甲苯/乙酸乙酯溶剂混合物进行纯化。产率：34％(白色固体)。产物：16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亚氨基)-十六烷酸钠盐向3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺(146mg，0.65mmol)于无水四氢呋喃(3ml)中的溶液中添加中间体1(19.1mg，0.07mmol)。将混合物在氩气氛围下在室温下搅拌1.5小时。接着将混合物蒸发至干燥并且通过管柱色谱使用作为分离剂的硅胶和二氯甲烷/甲醇/休尼格碱(Huenig’sbase)的溶剂混合物进行纯化。产率：71％(白色固体)。质谱(ESI)：[M+2H]+的m/z＝477,3529实施例5制备16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯根据Hang等(JAmChemSoc2007；129：2744-5)在三步骤反应中合成脂肪酸甲酯-氨氧基连接子16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯。中间体1：16-羟基十六烷酸甲酯在0℃下在2分钟内向16-羟基十六烷酸(3000mg，10.79mmol)于无水甲醇(27ml)中的冷(0℃)溶液中添加乙酰氯(3.837ml，53.96mmol)，接着将混合物在室温下在在氩气氛围下搅拌3.5小时。随后将混合物蒸发至干燥，残余物溶解于二氯甲烷(100ml)中，用饱和碳酸氢钠溶液(2×50ml)和盐水溶液(1×50ml)洗涤。经过硫酸钠脱水后，将收集的有机层蒸发至干燥并且在室温下真空干燥。产率：92％(白色固体)。中间体2：16-甲磺酰基十六烷酸甲酯向中间体1(2807mg，9.80mmol)于二氯甲烷(40ml)中的冷溶液(0℃)中添加三乙胺(1.502ml，10.78mmol)，接着在0℃下在10分钟内逐滴添加预先冷却(0℃)的甲磺酰氯(0.834ml，10.78mmol)于二氯甲烷(5ml)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌30分钟并且在室温下搅拌2.75小时。接着混合物用二氯甲烷(150ml)稀释，用水(1×100ml)、饱和碳酸氢钠溶液(2×100ml)和盐水溶液(1×100ml)洗涤。经过硫酸钠脱水后，将收集的有机层蒸发至干燥并且在室温下真空干燥。产率：95％(白色淡黄色固体)。产物：16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯在室温下在氩气氛围下持续1小时向3，6，9-三氧杂十一烷-1，11-二氧基胺(517mg，2.30mmol)于无水N，N-二甲基甲酰胺(22ml)中的溶液中逐滴添加中间体2(70mg，0.19mmol)于无水N，N-二甲基甲酰胺(7ml)中的溶液；将混合物在不同温度(室温，50℃，80℃)下搅拌2天以完成反应。接着将混合物蒸发至干燥，粗产物通过管柱色谱使用作为分离剂的硅胶和二氯甲烷/甲醇的溶剂混合物进行纯化。产率：31％(无色部分固化白色油状物)。质谱(ESI)：[M+H]+的m/z＝493.3824实施例616-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯与凝血因子VIII的碳水化合物部分的偶合使用两步骤程序制备FA-rFVIII。在第一步骤中，用NaIO4氧化rFVIII并且通过阴离子交换色谱(AEC)进行纯化。随后用FA-氨氧基试剂修饰氧化的rFVIII。用NaIO4(最终浓度200μM)氧化rFVIII(45mg起始材料)。30分钟(22℃)的孵育时间后，通过添加1ML-半胱氨酸水溶液(最终浓度：10mM)终止氧化反应。氧化的rFVIII通过阴离子交换色谱利用EMDTMAE(M)进行纯化。接着将25μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根据实施例3制备)于DMSO中的溶液添加至洗脱液(蛋白质浓度2mg/ml)中并且偶合反应在4℃下进行18小时。随后通过HIC利用苯基琼脂糖4FF对FA-rFVIII偶联物进一步纯化。最终通过UF/DF使用30kD膜(MILLIPORE)浓缩洗脱液。实施例716-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯与凝血因子IX的碳水化合物部分的偶合将10mgrFIX溶解于反应缓冲液(20mML-组氨酸、5mMCaCl2、150mMNaCl，pH6.0)中得到2.5mg/ml的最终浓度。向此溶液中添加5mMNaIO4水溶液以得到100μM的最终浓度。反应混合物在黑暗中在轻缓搅拌下在4℃下孵育1小时。接着将混合物装载至预平衡的PD-10脱盐管柱上以便移除过量NaIO4。向此混合物中添加8μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根据实施例3制备)于DMSO中的溶液并且偶合反应在4℃下在pH6.0下进行18小时。偶联物接着通过IEX利用Q-琼脂糖FF进一步纯化。最终，洗脱液通过UF/DF使用Vivaspin装置进行浓缩。实施例816-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯与凝血因子VIIa的碳水化合物部分的偶合将10mgrFVIIa溶解于反应缓冲液((50mMHepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中得到2.0mg/ml的最终浓度。向此溶液中添加5mMNaIO4水溶液以得到50μM的最终浓度。反应混合物在黑暗中在轻缓搅拌下在4℃下孵育1小时。接着将混合物装载至预平衡的PD-10脱盐管柱上以便移除过量NaIO4。向此混合物中添加8μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根据实施例3制备)于DMSO中的溶液并且偶合反应在4℃下在pH6.0下进行18小时。偶联物接着通过IEX利用Q-琼脂糖FF进一步纯化。最终，洗脱液通过UF/DF使用Vivaspin装置进行浓缩。实施例916-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯与凝血因子VIII的碳水化合物部分的偶合将10mgrFVIII溶解于Hepes缓冲液(50mMHepes、150mMNaCl、5mM氯化钙，pH6.0)中得到2mg/ml的蛋白质浓度。接着将10μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根据实施例3制备)于DMSO中的溶液添加至FVIII溶液中。随后制备亲核性催化剂间甲苯胺的水溶液(50mM)并且在15分钟内添加至混合物中以得到10mM的最终浓度。最终添加40mM过碘酸钠水溶液以得到400μM的浓度。反应混合物在黑暗中在轻缓搅拌下在22℃的温度下孵育120分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)以得到反应混合物中10mM的最终浓度并且孵育60分钟来终止反应。随后将反应混合物装载至填充有Q-琼脂糖FF的IEX管柱(1.6×8cm)上。管柱用20管柱体积的平衡缓冲液(20mMHepes、5mMCaCl2，pH7.4)洗涤并且FA-rFVIII偶联物用缓冲液B(20mMHepes、5.mMCaCl2、0.5MNaCl，pH7.4)洗脱。最终使用Hepes缓冲液7.4(20mMHepes、150mMNaCl、5mMCaCl2，pH7.4)作为渗滤缓冲液利用Vivaspin装置对产物进行UF/DF。实施例1016-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氨基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯与凝血因子IX的碳水化合物部分的偶合将7mgrFIX溶解于His缓冲液(20mMHis、150mMNaCl、5mMCaCl2，pH6.0)中得到2mg/ml的蛋白质浓度。接着将7μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根据实施例3制备)于DMSO中的溶液添加至FIX溶液中。随后制备亲核性催化剂间甲苯胺的水溶液(50mM)并且在15分钟内添加至混合物中以得到10mM的最终浓度。最终添加40mM过碘酸钠水溶液以得到250μM的浓度。反应混合物在黑暗中在轻缓搅拌下在22℃的温度下孵育120分钟。随后在室温下通过添加L-半胱氨酸(最终浓度：5mM)历时30分钟淬灭反应。通过阴离子交换色谱对FA-rFIX偶联物进行纯化。反应混合物用10ml缓冲液A(50mMHepes、5mMCaCl2，pH7.5)稀释并且装载至用缓冲液A平衡的5mlHiTrapQFF管柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。使用相同缓冲液用5CV洗涤管柱。接着用缓冲液B(50mMHepes、1MNaCl、5mMCaCl2，pH7.5)洗脱管柱。含有偶联物的洗脱份通过UF/DF使用由再生纤维素制成的10kD膜进行浓缩。以含有150mMNaCl和5mMCaCl2的20mMHepes缓冲液(pH7.2)进行最终渗滤步骤。实施例1116-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯与凝血因子VIIa的碳水化合物部分的偶合将10mgrFVIIa溶解于Hepes缓冲液(50mMHepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙，pH6.0)中。接着将10μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根据实施例3制备)于DMSO中的溶液添加至FVIIa溶液中。随后制备亲核性催化剂间甲苯胺的水溶液(50mM)并且在15分钟内添加至混合物中以得到10mM的最终浓度。最终添加40mM过碘酸钠水溶液以得到250μM的浓度。反应混合物在黑暗中在轻缓搅拌下在22℃的温度下孵育120分钟。随后在室温下通过添加L-半胱氨酸(最终浓度：5mM)历时30分钟淬灭反应。通过阴离子交换色谱对FA-rFVIIa偶联物进行纯化。反应混合物用10ml缓冲液A(50mMHepes，pH7.4)稀释并且装载至用缓冲液A平衡的5mlHiTrapQFF管柱(GEHealthcare，Fairfield，CT)上。使用相同缓冲液用5CV洗涤管柱。接着用缓冲液B(50mMHepes、1MNaCl、5mMCaCl2，pH7.4)洗脱管柱。含有偶联物的洗脱份通过UF/DF使用由再生纤维素制成的10kD膜进行浓缩。以含有150mMNaCl和5mMCaCl2的20mMHepes缓冲液(pH7.2)进行最终渗滤步骤。实施例12在亲核性催化剂存在下含有活性氨氧基的FA衍生物与氧化的碳水化合物部分的偶合也提供含有活性氨氧基的FA衍生物与氧化的治疗蛋白质(如本文表1中所述的蛋白质)的偶合。为偶合含有氨氧基的FA衍生物，首先用NaIO4(浓度：200μM)氧化治疗蛋白质(例如EPO、G-CSF或胰岛素；参见表1；浓度：0.5-3mg/ml)的碳水化合物部分(主要为N-聚糖)。接着通过添加L-半胱氨酸(最终浓度：5mM)终止反应，并且通过UF/DF分离试剂。渗滤后，使用25M过量添加FA氨氧基试剂(即FA衍生物)，并且偶合反应在亲核性催化剂间甲苯胺(浓度：10mM)存在下在轻缓搅拌下在室温下于pH6.0下进行1小时。随后将反应混合物装载至离子交换(IEX)管柱上。管柱用＞5CV洗涤缓冲液洗涤并且用线性NaCl梯度洗脱偶联物。最终对含有偶联物的洗脱份进行UF/DF。实施例13在亲核性催化剂存在下含有活性氨氧基的FA衍生物与氧化的碳水化合物部分的偶合为使含有氨氧基的FA衍生物与治疗蛋白质的碳水化合物部分偶合，将蛋白质(例如EPO、G-CSF或胰岛素；参见表1；浓度：0.5-3mg/ml)与NaIO4(浓度：300μM)一起在亲核性催化剂间甲苯胺(浓度：10mM)存在下在室温下在pH6.0下孵育1小时。接着通过添加L-半胱氨酸(最终浓度：5mM)终止反应，并且将反应混合物装载至离子交换(IEX)管柱上。管柱用＞5CV洗涤缓冲液洗涤并且用线性NaCl梯度洗脱偶联物。最终对含有偶联物的洗脱份进行UF/DF。实施例14在亲核性催化剂存在下含有活性氨氧基的FA衍生物与氧化的凝血蛋白的偶合可在浓度范围为2-20mM的亲核性催化剂(如间甲苯胺)存在下进行含有活性氨氧基的FA衍生物与氧化的凝血蛋白(如FIX、FVIII和FVIIa，如上述实施例中所述)的偶合。实施例15制备水溶性MAL脂肪酸连接子以两步骤合成法制备在ω位含有水溶性PEG链并且含有活性MAL基团的脂肪酸连接子：步骤1：制备16-羟基十六烷酸甲酯：根据实施例3在甲醇中在室温下用乙酰氯酯化市售16-羟基十六烷酸5小时，得到相应甲酯(Hang等，Chemicalprobesfortherapiddetectionoffatty-acylatedproteinsinmammaliancells，JACS2007；129：2744-5)。步骤2：制备MAL脂肪酸连接子：在室温下在THF中采用光延反应(Mitsunobureaction)使16-羟基十六烷酸甲酯与市售MAL-PEG-COOH(mal-Peg(12)-COOH/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反应过夜(Toyokuni等，SynthesisofaNewHeterobifunctionalLinker，N-[4-(Aminooxy)butyl]-maleimide，forFacileAccesstoaThiol-Reactive18F-LabelingAgent，BioconjugateChem2003；14：1253-9)。实施例16制备水溶性NHS脂肪酸连接子通过使用四步骤合成法制备在ω位含有水溶性PEG链并且含有末端活性NHS酯的脂肪酸连接子：步骤1：制备16-溴十六烷酸甲酯在回流温度下用甲醇和催化量的浓硫酸酯化市售16-溴十六烷酸过夜，得到相应甲酯(Zinic等，PositionallyIsomericOrganicGelators：Structure-GelationStudy，RacemicversusEnantiomericGelators，andSolvationEffects，ChemEurJ2010；16：3066-82)。步骤2：制备16-叠氮基十六烷酸甲酯使16-溴十六烷酸甲酯与叠氮化钠在乙腈中在回流温度下反应四天得到相应叠氮化物(Zinic等，PositionallyIsomericOrganicGelators：Structure-GelationStudy，RacemicversusEnantiomericGelators，andSolvationEffects，Chem.Eur.J.2010；16：3066-82)。步骤3：制备16-氨基十六烷酸甲酯在甲醇中在3巴下用钯/活性炭对16-叠氮基十六烷酸甲酯进行催化氢化三小时，得到相应胺(Zinic等，PositionallyIsomericOrganicGelators：Structure-GelationStudy，RacemicversusEnantiomericGelators，andSolvationEffects，Chem.Eur.J.2010；16：3066-82)。步骤4：制备NHS脂肪酸连接子使16-氨基十六烷酸甲酯与市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)在1，4-二噁烷中在室温下反应三天，得到NHS脂肪酸连接子(Cline等，TheAminolysisofN-HydroxysuccinimideEsters.AStructure-ReactivityStudy，JACS1987；109：3087-91)。实施例17蛋白质FA偶联物的分析表征通过使用酶联免疫吸附测定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay；ELISA)系统在体外验证根据本文的实施例制备的FA-rFVIII、rFIX或FVIIa样品的白蛋白结合性质。将96孔盘用针对人血清白蛋白(HSA)的多克隆抗体涂布。下一步骤为用PBS-明胶缓冲液阻断ELISA盘。接着使HSA结合于抗体，随后结合稀释至不同浓度的FA-蛋白质样品。最后利用过氧化物酶标记的抗VIII、抗FIX或抗FVIIa抗体检测HSA-蛋白质样品。使用四甲基-联苯胺(TMB)作为底物检测过氧化物酶活性。利用ELISA读取器在450nm下测量显色强度。通过在x轴上绘出不同样品浓度并在y轴上绘出其相应吸光度值评估FA-蛋白质与HSA的结合。实施例18制备含有氨氧基的水溶性聚乙二醇化脂肪酸连接子使用如实施例1中所述的3-氧杂戊烷-1，5-二氧基胺在三步骤合成法中制备含有水溶性PEG链并在ω位具有连接至脂肪酸羧基的氨氧基部分的脂肪酸连接子。步骤1：制备N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氧杂戊烷-1，5-二氧基胺使3-氧杂戊烷-1，5，二氧基胺与氯甲酸9-芴基甲酯在1，4-二噁烷中在环境温度下反应1小时。在减压下蒸发溶液并且粗产物采用硅胶色谱以二氯甲烷/甲醇20/1(v/v)作为溶剂混合物进行纯化，得到纯的受到单FMOC保护的二氧基胺(Boturyn等，SynthesisofFluorescentProbesfortheDetectionofAbasicSitesinDNA，Tetrahedron1997；第53卷，第15号，5485-92)。步骤2：制备十六烷酸(2-(2-(N-(9-芴基甲氧基羰基)氨氧基)乙氧基)乙氧基)酰胺使N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氧杂戊烷-1，5-二氧基胺与市售棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在THF中在环境温度下反应过夜得到受到单FMOC保护的氨氧基-脂肪酸偶联物(Jong等，SynthesisofceramidesusingN-hydroxysuccinimideesters，JournalofLipidResearch1972；第13卷，819-22)。步骤3：制备十六烷酸(2-(2-氨氧基乙氧基)乙氧基)酰胺使受到单FMOC保护的氨氧基-脂肪酸偶联物与吡啶在二氯甲烷中在环境温度下反应得到脱除保护基的氨氧基-脂肪酸连接子作为最终产物(Boturyn等，SynthesisofFluorescentProbesfortheDetectionofAbasicSitesinDNA，Tetrahedron1997；第53卷，第15号，5485-92)。实施例19MAL脂肪酸连接子与A1PI的偶合如实施例15中所述采用光延反应通过使16-羟基十六烷酸甲酯与市售MAL-PEG-COOH(mal-Peg(12)-COOH/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反应制备含有MAL基团的脂肪酸连接子。使此连接子与A1PI的游离SH基团偶合。将10mg经过纯化的A1PI(浓度：1mg/ml)溶解于反应缓冲液(20mM磷酸盐、5mMEDTA，pH7.0)中并且添加10μL5％(w/v)MAL脂肪酸连接子于DMSO中的溶液至A1PI溶液中。修饰反应在室温下进行2小时，接着使用L-半胱氨酸(最终浓度：10mM)进行淬灭步骤。添加L-半胱氨酸后，反应混合物在轻缓搅拌下在相同温度下再孵育1小时。经过修饰的A1PI用平衡缓冲液(25mM磷酸盐，pH6.5)稀释以将溶液导电率校正至＜4.5mS/cm，并装载至管柱体积(CV)为5ml的预填充HiTrapQFF(GE-Healthcare)上。接着管柱用10CV平衡缓冲液(流速：2ml/min)平衡。最终用洗脱缓冲液(25mMNa2HPO4、1MNaCl，pH6.5)以线性梯度洗脱PEG-A1PI。实施例20NHS脂肪酸连接子与凝血因子VIII的偶合如实施例16中所述通过使16-羟基十六烷酸甲酯与市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS(IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反应制备含有NHS基团的脂肪酸连接子。使此连接子与凝血因子VIII的赖氨酸残基的游离氨基偶合。将10mgrFVIII溶解于Hepes缓冲液(50mMHepes、150mMNaCl、5mM氯化钙，pH6.0)中得到2mg/ml的蛋白质浓度。接着向FVIII溶液中添加10μl10％(w/v)NHS脂肪酸连接子于DMSO中的溶液。反应混合物在黑暗中在轻缓搅拌下在22℃的温度下孵育120分钟。接着通过添加甘氨酸水溶液(1M)以得到反应混合物中20mM的最终浓度来终止反应。混合物在室温下在轻缓搅拌下孵育15分钟并随后装载至填充有Q-琼脂糖FF的IEX管柱(1.6×8cm)上。管柱用20管柱体积的平衡缓冲液(20mMHepes、5mMCaCl2，pH7.4)洗涤并且FA-rFVIII偶联物用缓冲液B(20mMHepes、5mMCaCl2、0.5MNaCl，pH7.4)洗脱。最终使用Hepes缓冲液7.4(20mMHepes、150mMNaCl、5mMCaCl2，pH7.4)作为渗滤缓冲液利用Vivaspin装置对产物进行UF/DF。