作为病原体灭活剂的二元醇的制作方法

文档序号:1238877阅读:279来源:国知局
作为病原体灭活剂的二元醇的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物成分中病原体灭活的用途、方法和成分,其中将二元醇用作病原体灭活剂。
【专利说明】作为病原体灭活剂的二元醇
发明领域
[0001]本发明涉及生物成分中病原体灭活的用途、方法以及成分。
[0002]发明背景
[0003]生物成分的使用对于开发和生产治疗剂(例如,重组蛋白的生产)来说是很重要的。生物成分,诸如血液成分,通过输血挽救了许多生命,例如挽救了患有血液病、大出血或经历外科手术的病人。然而,生物成分中病原体的存在产生了严重的健康危险。
[0004]已经开发了生物成分中病原体灭活的方法。经典的病原体灭活方法包括基于热处理、溶剂和/或清洁剂处理、伽马射线、UV处理和白细胞去除(Ieukodepletion)的方法。然而,由于病原体的不同的敏感性以及一些方法与具体的生物成分的不相容性,所述方法的效率和有效性有所不同。
[0005]需要新的病原体灭活方法和灭活剂。
[0006]发明概述
[0007]本发明涉及生物成分中病原体灭活的用途、方法、试剂以及成分。
[0008]在一个方面中,本发明涉及二元醇作为病原体灭活剂的用途。在一些实施方式中,所述二元醇是丙二醇。`
[0009]在一个方面中,本发明涉及生物成分中病原体灭活的方法,所述方法包括用二元醇接触所述生物成分。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,所述二元醇是丙二醇。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,所述生物成分是血液成分或奶成分。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,所述病原体选自病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫以及朊病毒。在一些实施方式中,所述病毒选自X-MuLV、PRV、BVDV和TGEV病毒。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,所述方法导致病原体清除等于或高于4Logl JCID (TissueCulture Infective Dose,组织培养感染剂量),其根据卡伯(KSlber)和/或斯皮尔曼-卡
伯(Spearman-Kmter)的方法测定。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,在所述
接触步骤之后,所述二元醇浓度为所述生物成分的40至50%(w/w)。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,在所述接触步骤之后,所述二元醇浓度为所述生物成分的40至50%(v/v)。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,所述方法在15至25°C的温度进行。在生物成分中病原体灭活的一些实施方式中,所述方法在PH值为7.0至8.0时进行。
[0010]在一个方面中,本发明涉及包含二元醇的生物成分,其中所述生物成分通过这里所描述的任意方法获得。在一些实施方式中,所述二兀醇浓度为40至50%。在一些实施方式中,所述生物成分是奶成分或血液成分。
【专利附图】

【附图说明】
[0011]附图构成了本说明书的一部分,且用于对本发明某些方面作进一步说明。通过参考一个或多个这些附图,结合这里所提出的【具体实施方式】的详细说明,会更好地理解本发明。附图仅仅是说明性的,并非实施本发明所必需。[0012]附图1显示了在包含45%的丙二醇的亲和色谱洗脱液中TEGV的灭活作用。
[0013]附图2显示了在包含45%的丙二醇的亲和色谱洗脱液中BVDV的灭活作用。
[0014]发明详述
[0015]在一个方面中,本发明涉及二元醇作为病原体灭活剂的用途。在一个方面中,本发明涉及生物成分中灭活病原体的方法,所述方法包括用二元醇接触所述生物成分。在一个方面中,本发明涉及包含二元醇的生物成分。在一些实施方式中,所述包含二元醇的生物成分通过这里所描述的任意方法获得。
[0016]在这里所描述的用途、方法和成分的一些实施方式中,所述二元醇是邻位二元醇。在一些实施方式中所述邻位二元醇是丙二醇或乙二醇。
[0017]术语“二元醇”(或“二醇”)是指包含两个羟基基团(-0H)的化合物。术语“邻位二元醇”是指具有连接到相邻原子(例如,在相邻位置)上的两个羟基基团的二元醇。
[0018]在一些实施方式中,用于这里所描述的方法和成分中的所述二元醇是邻位二元醇,其包括2到6个碳原子且化学式为R1R2-(C-OH)2-R3R4,其中R1, R2, R3和R4可以相同也可以不同,并且每一个或者是氢原子或者是烷基,其中R1, R2, &和R4的组合包含最多两个碳原子。邻位二元醇的例子有丙二醇、乙二醇、1,2-丁二醇和1,2-戊二醇。
[0019]在这里所描述的用途、方法以及成分的一些实施方式中,所述二元醇是丙二醇或乙二醇。
[0020]所述术语“丙二醇”,也称为“1,2_ 二羟基丙烷”或“甲基乙二醇”,是指丙烷-1,2-二醇且具有下面所列的结构式(I )。
[0021]所述术语“乙二醇 ”,也称为“ 1,2- 二羟基乙烷”,是指乙烷-1,2- 二醇以及具有下面所列的结构式(II )。
[0022]
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丙二醇乙二醇
[0023]在这里所描述的用途、方法以及成分的一些实施方式中,所述二元醇是偕二醇。偕二醇具有连接到相同碳原子上的两个羟基基团且包括1,2-甲烷二醇、1,2-乙烷二醇和1,2-丙烷二醇。在这里所描述的用途、方法以及成分的一些实施方式中,所述二元醇是二醇,其中所述羟基基团不在相同或相邻的碳原子上。这样的二元醇的例子有1,3_ 丁二醇、
I,4-戊二醇以及1,3-苯二酚。
[0024]在一个方面中,本发明涉及病原体灭活剂、包括这样灭活剂的成分及其用途。
[0025]所述术语“病原体”是指能对哺乳动物(比如人类)致病的任何生物物质(例如,任何包含核酸的物质或诸如朊粒的蛋白感染粒子)。术语病原体包括单细胞和多细胞微生物,其具有单链或双链形式的DNA或RNA作为遗传物质。所述术语特别包括病毒、细菌、真菌、原生动物以及朊病毒。细菌的例子包括但不限于链球菌、埃希氏菌和杆菌类;病毒的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)和其它逆转录病毒、疱疹病毒、副粘病毒、痘病毒、披膜病毒、巨细胞病毒以及肝炎病毒(HAV、HBV、HCV);寄生虫的例子包括但不限于疟疾寄生虫(疟原虫类)和锥虫类寄生虫。
[0026]在本发明的一些实施方式中,要被灭活的所述病原体选自病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫以及朊病毒。
[0027]在一些实施方式中,所述病原体是病毒。
[0028]在一些实施方式中,所述病毒是包膜病毒或非包膜病毒。
[0029]包膜病毒是具有类似于宿主细胞的“包膜”的病毒,例如包括但不限于哺乳动物类或禽类白血病病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝病毒、黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒(Rhadovirus)、布尼亚病毒、线状病毒以及呼肠孤病毒。非包膜病毒,也称为裸病毒,已为本领域众所周知且包括但不限于腺病毒、诺瓦克病毒(Norovirus)、轮状病毒以及人乳头瘤病毒。
[0030]在一些实施方式中,所述病毒是X-MuLV、PRV、TGEV或BVDV。用于表示“嗜异性鼠白血病病毒相关病毒”的术语“X-MuLV”是指一种Y逆转录病毒。术语“PRV”是指假狂犬病病毒。用于表示“传染性胃肠炎冠状病毒”的术语“TGEV”是指一种属于冠状病毒家族的动物病毒。用于表示“牛病毒性腹泻病毒”的术语“BVDV”是出自黄病毒家族的瘟病毒。
[0031]在一个方面中,本发明涉及生物成分中病原体灭活的方法,所述方法包括用二元醇接触所述生物成分。
[0032]如这里所用,所述术语“接触”是指使至少两个不同的成分或组分接触以使它们能够相互作用的过程。
[0033]所述术语“生物成分”是指源自生物有机体(包括哺乳动物)的组合物(或材料)。生物成分的例子包括但不限于血液成分、奶(诸如来自转基因哺乳动物的奶)、临床样本(诸如尿、汗、痰、粪便和 脊髓液、细胞和组织提取物)、细胞培养基等等。如这里所用,生物成分还包括能够像生物成分那样起作用的合成成分,比如血液代用品和经过一个或多个提纯或分离步骤的成分。
[0034]根据本发明的血液成分包括但不限于全血和血产品。所述术语“血产品”是指一或多种可以从全血中分离出来的组份,并包括血细胞组份(诸如红细胞或红血球、血小板、白细胞及其浓缩物)、血蛋白(诸如血凝因子、酶、白蛋白、血纤维蛋白溶酶原、免疫球蛋白)以及血液流体组份(诸如血衆、血衆级分(fraction)和血清)。在一些实施方式中所述血液成分为白细胞去除(例如白细胞排除)。
[0035]在一些实施方式中,要处理的所述血液成分选自全血、红细胞浓缩物、血小板浓缩物、血浆和血浆的级分。
[0036]在一些实施方式中,所述生物成分是奶成分。在一些实施方式中,要处理的所述奶成分来自转基因动物的奶,所述转基因动物产生目的蛋白并分泌于所述奶中。
[0037]在一些实施方式中,所述方法在生物成分(诸如奶成份)的提纯过程(诸如通过亲和色谱提纯)中的洗脱液中进行。
[0038]所述术语“病原体灭活”或“灭活病原体”,如这里所使用,是指抑制或阻止所述病原体的复制(或繁殖),和/或病原体的破坏或消除。典型地,病原体灭活剂严重地或至少基本上妨碍了在适当的条件下病原体复制或繁殖的能力。
[0039]确定特定的方法是否抑制或阻止了病原体复制方法已为本领域众所周知。典型地,这样的方法包括在用病原体灭活剂处理之前确定(活性)病原体的数量以及在处理之后确定(活性)病原体数量的步骤。所述确定活性病原体数量的具体方法取决于所述病原体的性质,并且包括集落形成分析(用于确定活性细菌的数量)和感染性分析(用于确定“活性”病毒的数量)。活性病毒的数量的一项指标是组织培养有效剂量(TCID),例如其可通过卡伯和/或斯皮尔曼-卡伯方法确定。(参见例如Karber, G.(1931).Arch.J.Exper.Path.u.pharmakol.,162,480;斯皮尔曼(1908).Brit.J.Psychol.,2:227-242)
[0040]在一些实施方式中,本发明的方法导致病原体清除高于或等于4LoglOTCID。如实施例中所解释,所述病原体清除可以根据卡伯和/或斯皮尔曼-卡伯的方法计算。
[0041]在一些实施方式中,所述生物成分,在所述接触步骤后,会包含一定量的二元醇,其足以灭活、清除或降低病原体的数量,例如,使之低于期望的水平。在一些实施方式中,在接触步骤之后所述生物成分中的二元醇浓度为所述成分的10%至75%(w/w),15%至70%(w/w),20% 至 65% ( w/w),25% 至 60% (w/w),30% 至 60% (w/w),35% 至 55% (w/w),或 40% 至 50% (w/W)。在一些实施方式中,在接触步骤之后所述生物成分中的二元醇浓度为所述成分的10%至 75%(v/v),15% 至 70%(v/v),20% 至 65%(v/v),25% 至 60%(v/v),30% 至 60%(v/v),35% 至55%(v/v),或 40% 至 50%(v/v)。
[0042]虽然并不要求,然而一般来说,期望通过将包含病原体的生物成分暴露给二元醇的时间长度的延长来提高所述病原体灭活作用。在一些实施方式中,将所述生物成分与所述二元醇持续接触一段时间,其使得病原体的清除大于或等于4LogTCID(组织培养感染
量)O
[0043]在一些实施方式中,所述生物成分与所述二元醇接触至少10分钟,至少20分钟,至少30分钟,至少40分钟,至少50分钟,至少60分钟,至少70分钟,至少80分钟,至少90分钟,至少1200分钟,至少150分钟,至少180分钟,至少210分钟,至少240分钟,至少300分钟,至少360分钟,至少2500分钟,至少1000分钟或更多。在一些实施方式中,所述生物成分与所述二元醇接触15至360分钟,60至240分钟或90至180分钟的一段持续的时间。在一些实施方式中,在达到具体量的病原体灭活之后所述二元醇从所述生物成分移除。在一些实施方式中,在所述病原体灭活之后所述二元醇保持在所述生物成分中。
[0044]在一些实施方式中,这里所描述的方法在10至30°C,12至28°C或15至25°C的温度进行。
[0045]在一些实施方式中,这里所描述的方法在pH值为4至11,5至10,6至9,6.5至
8.5或7至8时进行。在一些实施方式中,这里所描述的方法在pH值为约7.5时进行。在一些实施方式中,这里所描述的方法在PH值为7.5时进行。本领域普通技术人员可以根据现有文献确定对于具体生物成分来说什么样的PH值范围可以接受。
[0046]在一些实施方式中,所述方法进一步包括病毒清除步骤,诸如纳米过滤。
[0047]在一些实施方式中,所述方法在生物成分提纯(诸如亲和色谱)过程中的洗脱阶段进行。在一些实施方式中,将所述二元醇加入到亲和洗脱缓冲液中。在一些实施方式中,亲和洗脱缓冲液包含50mM tris,45%(w/w/)丙二醇和1.5M氯化钠,且pH值为7.5。在一些实施方式中,亲和洗脱缓冲液包含50mM tris,45%(v/v/)丙二醇和1.5M氯化钠,且pH值为
7.5。
[0048]在一些实施方式中,这里所描述的方法不包括用大量的十字花植物油(cruciferous oil)或精氨酸接触所述生物成分的步骤。[0049]在所述接触步骤之后,如这里所用的大量的精氨酸,对应精氨酸浓度为至少0.2M,至少0.0lM或至少0.0OlM0
[0050]在所述接触步骤之后,如这里所用的大量的十字花植物油,对应十字花植物油的浓度为至少0.1%,至少0.01%或至少0.001%。
[0051]在一个方面中,本发明涉及用于灭活病原体的包含二元醇的生物成分,其中所述生物成分通过用二元醇接触生物成分获得,例如通过这里所描述的任意方法。
[0052]在一些实施方式中,所述二元醇是丙二醇或乙二醇。
[0053]在一些实施方式中,所述生物成分中的二元醇浓度为所述成分的10%至75%(w/w),15% 至 70% (w/w),20% 至 65% (w/w),25% 至 60% (w/w),30% 至 60% (w/w),35% 至 55% (w/w),或40%至50%(w/w)。在一些实施方式中,所述生物成分中的二元醇浓度为所述成分的10%至 75%(v/v),15% 至 70%(v/v),20% 至 65%(v/v),25% 至 60%(v/v),30% 至 60%(v/v),35% 至55%(v/v),或 40% 至 50%(v/v)。
[0054]在一些实施方式中,所述生物成分还包含清洁剂(detergent),诸如TWEEN20或TWEEN80。在一些实施方式中,所述生物成分还包含溶剂,诸如TNBP (磷酸三-N- 丁基酯(Tr1-N-butyl Phosphate))。在一些实施方式中,所述生物成分在与二元醇接触之前包含清洁剂。在一些实施方式中,所述生物成分在与二元醇接触之前与清洁剂接触。在一些实施方式中,所述生物成分在与二元醇接触的同时与清洁剂接触。在一些实施方式中,所述生物成分在与二元醇接触之后与清洁剂接触。
[0055]在一些实施方式中,所述生物成分不包含大量的精氨酸。
[0056]在一些实施方式中,所述生物成分不包含大`量的十字花植物油。
[0057]在一些实施方式中,所述生物成分不包括大量的精氨酸或十字花植物油。
实施例
[0058]下面的实施例描述了本发明的方法和成分的制备和实施的一些实施方式。然而,应当理解,所述实施例仅仅是为了说明的目的而并非是要限制本发明的范围。贯穿本申请所引用的全部参考(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请以及同时待审的专利申请(co-pending patent applications))的全部内容通过引用的方式在此引入。
[0059]材料和方法
[0060]通过在亲和色谱洗脱液中以45%(v/v)存在的丙二醇(PG)对两种包膜病毒(TGEV和BVDV)的灭活作用进行评估。所述洗脱液在目标转基因蛋白(transgenic protein ofinterest)的生产过程中产生(该目标蛋白存在于奶成分中,所述奶成分源自生产所述蛋白的转基因动物,所述蛋白是在其奶中分泌的)。
[0061]细胞毒性,病毒干扰和淬灭(quenching)
[0062]培养实验之前,在PG存在下测定所述初始材料(所述洗脱液)的细胞病毒、病毒干扰和淬灭参数。所述测定细胞毒性、病毒干扰和淬灭的实验在亲和色谱的洗脱试样中完成。
[0063]细胞毒性采用表I中的条件对初始材料的细胞毒性参数进行评估:
[0064]表I用于评估细胞毒性的试样和所测试的稀释度
[0065]
【权利要求】
1.二元醇作为病原体灭活剂的用途。
2.权利要求1的用途,其中所述二元醇是丙二醇。
3.生物成分中病原体灭活的方法,所述方法包括用二元醇接触所述生物成分。
4.权利要求3的方法,其中所述二元醇是丙二醇。
5.权利要求3或4的方法,其中所述生物成分是血液成分或奶成分。
6.权利要求3-5中任一项的方法,其中病原体选自病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫以及朊病毒。
7.权利要求6的方法,其中所述病毒选自X-MuLV、PRV、BVDV和TGEV病毒。
8.权利要求3-7中任一项的方法,其中所述方法导致病原体清除等于或高于4Log10TCID (组织培养感染剂量), 其中所述TCID根据卡伯和/或斯皮尔曼-卡伯的方法确定。
9.权利要求3-8中任一项的方法,其中在接触步骤之后二元醇的浓度为所述生物成分的 40 至 50%(v/V)ο
10.权利要求3-9中任一项的方法,其中所述方法在15至25°C的温度进行。
11.权利要求3-10中任一项的方法,其中所述方法在pH值为7.0至8.0时进行。
12.包含二元醇的生物成分,其通过权利要求3-11的任一方法获得。
13.权利要求12的生物 成分,其中所述二元醇浓度为40至50%(v/v)。
14.权利要求12或13的生物成分,其中所述二元醇是丙二醇。
【文档编号】A61L2/00GK103429272SQ201180063351
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年12月23日 优先权日:2010年12月30日
【发明者】S.科托罗 申请人:法国化学与生物科技实验室
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