治疗后的乳腺癌预后的制作方法

治疗后的乳腺癌预后的制作方法
【专利摘要】本公开内容包括与患者的延长治疗和无癌存活有临床相关性的基因表达概况或模式的鉴定和用途。具体而言，本公开内容包括与在用于治疗患者的内分泌疗法的变化中的益处有关而表达的基因的身份。基因表达的水平被公开为用于预测患者的临床结果和因此预后的分子指数。本公开内容还包括用于在用抗雌激素剂起始治疗后预测癌症复发和/或预测转移性癌症发生的方法。本公开内容还包括用于根据寿命预期、癌症复发和/或癌症转移的可能性确定或选择受试者治疗的方法。
【专利说明】治疗后的乳腺癌预后
[0001]相关申请
本申请要求提交于2010年12月9日的美国临时专利申请61/421，627的优先权权益，其通过引用其整体而结合于本文中，如同在本文中完整阐明。
[0002]本申请涉及提交于2008年9月6日且指定美国的国际申请号PCT/US2008/075528(公布为WO 2009/108215 Al)，并且涉及提交于2010年3月6日的美国专利申请号12/718,973。两个申请通过引用结合于本文，如同在本文中完整阐明。
发明领域
[0003]本公开内容涉及与乳腺癌具有临床相关性的基因表达概况或模式的鉴定和用途。具体而言，本公开内容部分地基于与在用芳香酶抑制剂或其他内分泌疗法的起始治疗后癌症复发的可能性有关的表达的基因的身份。基因表达的水平形成能对用芳香酶抑制剂或其他内分泌疗法的起始治疗后的患者预测临床结果以及因此预后的分子指数。
[0004]基因表达概况，无论其具体化为核酸表达、蛋白质表达或其他表达形式，可用于预测患有乳腺癌的受试者治疗后的临床结果、预测癌症复发和/或预测转移性癌症的发生。所述概况还可用于研究受试者的预后。当用于预后时，所述概况用来根据寿命预期、癌症复发和/或癌症转移的可能性确定癌症的治疗。
[0005]发明背景
乳腺癌的治疗已为极受关注和广泛研究的领域。通过分析来自受试者的乳腺癌细胞样品初步诊断为乳腺癌后，治疗方法经常始于肿瘤细胞的手术去除。在激素依赖的乳腺癌(例如雌激素受体阳性(ER+)的乳腺癌)的情况下，手术后通过拮抗雌激素以减少肿瘤生长或再生长。在许多病例中，使用用抗雌激素他莫昔芬(tamoxifen)的治疗达5年以降低疾病复发的风险和因此乳腺癌介导的死亡率。
[0006]不幸地是,现场数据(data from the field)表明所有乳腺癌复发中超过一半在用辅药他莫昔芬治疗的5年后发生。
[0007]Goss 等(J.Clin.0ncol., 26 (12): 1948-1955，2008)报道了检查使用来曲唑的试验结果，该试验在具有原发性ER+乳腺癌的受试者中用辅药他莫昔芬5年后的3个月内开始。结果表明他莫昔芬后，用来曲唑的治疗提高无乳腺癌的存活率和无远处乳腺癌(distant breast cancer-free)的存活率。
[0008]但Goss等没有提供预测哪些用他莫昔芬治疗5年的受试者将从随后的来曲唑治疗中受益的方法。因此，没有方法将来曲唑治疗仅针对期望得到益处的受试者。因此，对没有期望获得益处的受试者施用来曲唑治疗，导致用他莫昔芬治疗5年的无乳腺癌受试者群体的治疗过度。
[0009]本文中文献的引用不应解释为反映对任何文献是相关现有技术的承认。此外，其引用并不表示是对相关公开内容的检索。关于文献的日期或内容的所有陈述基于可得到的信息，并不承认关于其准确性或正确性。
[0010]发明简述本公开内容部分地基于乳腺癌肿瘤细胞中基因表达水平的发现和测定，其与抗乳腺癌化学疗法中的受益改变相关。在某些情况下，所述改变从一种形式的内分泌治疗到另一种。表达水平可用于提供预后信息(例如癌症复发)和预测信息(例如对某些疗法的反应性)。
[0011]第一方面，本公开内容包括将起始用抗雌激素或抗芳香酶疗法治疗的受试者群鉴定或分类成至少两个亚群的方法。第一亚群预期从疗法改变中受益，例如改变成另一种抗雌激素或抗芳香酶疗法。第二亚群预期不受益。在某些情况下，起始治疗用他莫昔芬，例如辅药他莫昔芬疗法达约5年或更少的一段时期。任选地，所述改变是改变为来曲唑疗法或其他抗芳香酶疗法。本公开内容包括用于将以该方式治疗的受试者群和治疗期间无乳腺癌的受试者群分类为第一和/或第二亚群的方法。
[0012]本公开内容的方法基于在受试者的乳腺癌细胞中某些基因的表达水平，包括HoxB13的表达水平。在一些实施方案中，可使用HoxB13表达对IL17BR表达的双基因比率(或 HoxB13:1L17BR 比率)(参见 Ma 等，7； Clin.0ncol., 24:4611-9 (2006))。在备选的实施方案中，可使用HoxB13表达对CHDH表达的双基因比率。
[0013]HoxB13:1L17BR(H:1)比率基于预测超出标准预后因素的临床结果的新生物标记物的研究而发现。关于肿瘤的阶段和等级，发展为癌症复发的患者与未发展为癌症复发的患者一致。发现单一的H:1比率适于在接受辅药他莫昔芬治疗的雌激素受体阳性(ER+)的乳腺癌患者中预测癌症复发。后续的研究(Goetz等，Clin Cancer Res.12:2080-7 (2006);Jerevall 等，Rreast Grnicer Res.Treat (2007) ; Jansen 等，J.Clin.0ncol.25:662-8(2007))进一步显示该比率既是预后性的(例如通过作为肿瘤侵占性的指示剂)而且是预测性的(在可追溯的临床试验和随机化的临床试验两者中预测他莫昔芬的益处)。
[0014]在其他实施方案中，本公开内容包括与HoxB13表达组合的一个或多个其他的基因。组合可以是与下文 另外公开的基因中的任何I个、2个、3个、4个或所有的5个。
[0015]本公开内容其他的基因编码BublB (不受苯并咪唑抑制的出芽1β)或p21蛋白激活激酶6 (PAK6) ,CENPA (着丝粒蛋白A、同种型a)、NEK2 (NIMA相关激酶2或“永离有丝分裂基因a”相关激酶2)、RACGAP1 (Rac GTP酶激活蛋白I)和RRM2 (核糖核苷酸还原酶M2)。这5个基因的单独使用被称为分子级别指数(MolecularGrade Index, MGI)。本公开内容的方面包括组合物和方法，其被描述用于与上文5个所研究的基因的一个或多个的表达水平组合的BoxB13表达(与或不与IL17BR)，以提供预后信息和/或提供临床反应性的预测。
[0016]因此，本公开内容部分地基于以下发现:基因表达水平可用于给受试者提供预后性确定(例如乳腺癌局部或远处复发形式或转移形式中的癌症复发的可能性)和预测性确定(例如对治疗过程的反应性)。所有7个公开的基因的使用被称为乳腺癌指数(BCI)。
[0017]当使用实时反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析BCI的表达水平时，发现该组合提供在用5年的他莫昔芬疗法治疗的受试者中复发风险的优良分层(superiorstratification)。这反映意想不到的发现，因为这是第一次确定了乳腺癌疗法的有益改变的预测物。
[0018]在其他方面，HoxB13表达和/或BCI可用于预测在乳腺癌患者中的癌症的后期复发。后期复发的非限制性实例包括用他莫昔芬治疗的5年后，而且还包括用他莫昔芬治疗的4年、3年或2年或更少的时间后。同样地，HoxB13表达和/或BCI可用于预测在上文的时间期间后对来曲唑或其他抗雌激素治疗或抗芳香酶疗法(以抑制后期复发)的反应性。[0019]本公开内容的实施方案包括用预后值和预测值的测定方法，其用于将具有原发性ER+乳腺癌和随后的无乳腺癌治疗的受试者分层。作为预后，分层可基于与乳腺癌疗法的改变相关的差异表达水平，并因此表明需要改变乳腺癌疗法(作为非限制性实例)。作为非限制性实例，分层(基于表达水平)可用于预测内分泌敏感性(例如对来曲唑的敏感性作为非限制性实例)和/或预测自抗雌激素和/或抗芳香酶抑制剂的益处。当然可在任何合适的本文所述含有细胞的样品中进行基因表达的检测。用于本公开内容的细胞的非限制性实例包括从受试者新鲜分离的细胞、分离后冷冻的细胞和固定和/或包埋(例如福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE))的细胞。在大多数实施方案中，细胞为乳腺细胞，例如乳腺癌细胞。
[0020]在一些实施方案中，基于表达水平的方法有利地用于来自受试者的含有乳腺癌细胞的样品，例如DCIS样品。作为非限制性实例，细胞可以是来自用于诊断受试者中的癌症的手术前的组织学样品的细胞。对于这样的受试者，护理的标准是手术(相对于根治性乳房切除术，优选乳房保留手术(breast conserving surgery))去除DCIS。往往随后进行手术后的放射疗法，任选使用内分泌疗法，例如用他莫昔芬、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、选择性雌激素受体下调剂(SERD)或芳香酶抑制剂(Al)例如来曲唑治疗。在其他手术后的病例中，给予无放射的内分泌疗法，并任选使用化学疗法。
[0021]本公开内容涉及预期在起始的内分泌疗法过程期间无乳腺癌存活后从内分泌疗法改变(例如从一种类型的内分泌疗法到另一种)中受益的受试者的鉴定。在其他实施方案中，所述改变可在5年、4年、3年或2年的起始的内分泌疗法过程后进行。
[0022]本公开内容还包括检测基因表达，其中高HoxB13表达为起始的内分泌疗法(例如辅药他莫昔芬疗法)后受试者中癌症复发的可能性增加的指示剂。因此，方法可包括鉴定受试者为可能或不可能经历局部癌症复发，并且还包括改变受试者的治疗形式以得到预期的结果。作为非限制性实例，在不存在延长的起始治疗后的疗法的情况下，复发可能性的确定可用于证实延长疗法的合适性或选择延长疗法，所述延长疗法具有所用的抗-雌激素和/或抗芳香酶形式的改变。
[0023]在某些情况下，所公开的方法可用于给绝经前的女性或绝经后的女性选择或消除疗法，所述女性经历了内分泌疗法的治疗并且在该时间期间保持无癌症。绝经前的女性包括年龄低于约35岁的那些女性。所述方法可包括测定来自受试者的含有乳腺癌细胞的样品中所公开基因的表达。作为非限制性实例，细胞可以是用于诊断受试者的癌症的来自手术前组织学样品的细胞。
[0024]内分泌疗法的非限制性实例包括用SERM例如他莫昔芬、或SERD、或芳香酶抑制剂(Al)治疗。Al的非限制性实例包括非留族抑制剂(例如来曲唑和阿那曲唑)和不可逆甾族抑制剂(例如依西美坦)。
[0025]本发明实施方式的详述 本文使用的术语定义:
基因表达“模式”或“概况”或“特征”指在两个或更多个临床结果、癌症结果、癌症复发和/或存活结果之间的一个或多个基因的相对表达，其中所述表达与能够区别所述结果相关。在某些情况下，所述结果为乳腺癌结果。
[0026] “基因”是编码离散的产物(无论本质上是RNA还是蛋白质性质的)的多核苷酸。应理解超过一个多核苷酸可能能够编码离散的产物。该术语包括编码相同产物或其功能上相关(包括功能的获得、丧失或调节)的类似物的基因的等位基因和多态性，其基于染色体的位置和在正常有丝分裂期间重组的能力。
[0027]术语“相关”或“相关性”或其等同物是指一个或多个基因的表达与细胞的生理状态之间的关联，以排除通过用本文所述的方法鉴定的一种或多种其他状态。基因可以较高或较低水平表达，并还与一种或多种癌症状态或结果相关。
[0028]“多核苷酸”是任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的多聚形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA和RNA。其还包括已知类型的修饰，包括本领域已知的标记、甲基化、“帽”、一个或多个天然存在的核苷酸用类似物的取代和核苷酸间的修饰例如不带电荷的键合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，以及未修饰形式的多核苷酸。
[0029]术语“扩增”广义用于指通过DNA或RNA聚合酶酶促产生扩增产物。本文所用的“扩增”通常指产生所需序列的多拷贝(尤其是样品的多拷贝)的过程。“多拷贝”指至少2拷贝。“拷贝”并不必然指与模板序列的完全序列互补性或同一性。
[0030]所谓一致性(corresponding)是指一个核酸分子与另一个核酸分子共有基本数量的序列同一性。基本数量意指至少95%、通常至少98%和更通常至少99%，并且使用BLAST算法确定序列同一性,如在Altschul等，J.MoL Biol.215:403-410 (1990)中所述(使用公布的默认设置，即参数w=4、t=17)。扩增mRNA的方法通常为本领域已知，并包括反转录PCR (RT-PCR)和在美国专利申请10/062,857 (提交于2001年10月25日)以及美国临时专利申请60/298，847 (提交于2001年6月15日)和60/257，801 (提交于2000年12月22日)中所述的方法，上述所有文献通过引用以其整体结合于本文中，如同完全阐明。可使用的另一方法为定量PCR (或Q-PCR)。或者，可通过本领域已知的方法将RNA直接标记为相应的cDNA。
[0031]“微阵列”是优选不连续区域的线性或二维阵列，每个区域具有确定的面积，其在固体支持物(例如但不限于玻璃、塑料或合成膜)的表面上形成。在微阵列上的不连续区域的密度由在单一固相支持物的表面上待检测的固定的多核苷酸的总量决定，优选至少约50/cm2,更优选至少约100/cm2,更优选至少约500/cm2,但优选低于约1，000/cm2。优选地是，阵列总共含有少于约500、约1000、约1500、约2000、约2500或约3000种固定的多核苷酸。本文所用的DNA微阵列为置于芯片或其他表面上的寡核苷酸或多核苷酸阵列，所述芯片或其他表面用来与从样品中扩增或克隆的多核苷酸杂交。由于在阵列中各具体组的引物的位置是已知的，样品多核苷酸的身份可基于其与微阵列中具体位置的结合而确定。
[0032]由于本公开内容依赖于过表达或表达不足的基因的鉴定，因此本公开内容的一个实施方案涉及通过样品细胞的mRNA或其扩增或克隆形式与对具体的基因序列独特的多核苷酸的杂交来测定表达。优选该类型的多核苷酸含有在其他基因序列中不存在的基因序列的至少约20、至少约22、至少约24、至少约26、至少约28、至少约30或至少约32个连续的碱基对。在前述语句中使用的术语“约”意指从所述数值增加或减少I。甚至更优选在其他基因序列中不存在的基因序列的至少或约50、至少或约100、至少或约150、至少或约200、至少或约250、至少或约300、至少或约350、或至少或约400个碱基对的多核苷酸。在前述语句中使用的术语“约”意指从所述数值增加或减少10%。所述多核苷酸还可称为多核苷酸探针，其能够与本文所述的基因或其独特部分的序列杂交。优选地是，序列为由基因编码的mRNA序列、与所述mRNA对应的cDNA序列和/或所述序列的扩增形式的序列。在本公开内容优选的实施方案中，多核苷酸探针固定在阵列上、其他装置上或使探针定位的单独的点上。
[0033]在本公开内容的另一实施方案中，可扩增所公开序列的全部或部分，并通过例如聚合酶链式反应(PCR)和其变化(例如但不限于定量PCR (Q-PCR)、反转录PCR (RT-PCR)和实时PCR，任选实时RT-PCR)等方法进行检测。这类方法使用与所公开序列的部分互补的一个或两个引物，其中所述引物用于引导核酸的合成。新合成的核酸任选被标记并可被直接检测或通过与本公开内容的多核苷酸杂交来检测。新合成的核酸可与本公开内容的多核苷酸(含有序列)在允许其杂交的条件下接触。
[0034]或者，在本公开内容的另一实施方案中，可通过分析目的细胞样品中表达的蛋白质测定基因表达，所述分析使用一种或多种特异针对所述细胞样品中的单独基因产物(蛋白质)的一个或多个表位的抗体。这类抗体优选被标记以使其在与基因产物结合后容易检测。
[0035]术语“标记”指能够产生指示所标记分子存在的可检测信号的组合物。合适的标记包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁性粒子、生物发光部分等。照此，标记为通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的任何组合物。
[0036]术语“支持物”指常规的支持物例如珠粒、颗粒、浸溃片(dipsticks)、纤维、滤纸、膜和硅烷或硅酸盐支持物例如玻片。
[0037]本文所用的“癌症组织样品”或“癌症细胞样品”指分离自患有相应癌症的个体的含有细胞的组织样品。所述样品可来自经手术程序(例如活组织检查)去除的材料。这类样品为初步分离物(与培养的细胞形成对比)并且可通过本领域公认的任何合适方法收集。在一些实施方案中，可通过非侵入式的方法收集“样品”，所述方法包括但不限于擦破、细针抽吸。
[0038]“乳腺组织样品”或“乳腺细胞样品”指自怀疑患有乳腺癌或具有发展为乳腺癌的风险的个体分离的乳腺组织或流体的样品。这类样品为初步分离物(与培养的细胞形成对比)，并可通过任何非侵入式方法收集，所述方法包括但不限于导管灌洗、细针抽吸、针吸活组织检查、在美国专利号6，328，709中描述的装置和方法或本领域已知的任何其他合适的方法。或者，可通过侵入式方法收集“样品”，所述方法包括但不限于手术活组织检查。
[0039]“表达”和“基因表达”包括核酸材料的转录和/或翻译。当然该术语亦可限于仅指核酸的转录，如果如此说明的话。
[0040]本文所用的术语“包含”和其相关词在其包括的意义内使用；即，等同于术语“包括”和其相应的相关词。
[0041 ] “允许”事件发生的条件或“适于”事件发生的条件，例如杂交、链延伸等，或“适当的”条件为不阻止所述事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有益于事件。本领域已知的和本文所述的这类条件取决于例如核苷酸序列的性质、温度和缓冲液条件。这些条件还取决于所需要的事件，例如杂交、裂解、链延伸或转录。
[0042] 本文所用的序列“突变”指与参照序列比较，在本文公开的目的基因序列内的任何序列改变。序列突变包括在序列中单一核苷酸的改变或者超过一个核苷酸的改变，所述改变归因于例如取代、缺失或插入等机制。单核苷酸多态性(SNP)也是本文所用的序列突变。因为本公开内容基于基因表达的相对水平，所以本文公开的基因的非编码区的突变也可在本公开内容的实施中进行测定。
[0043]“检测”包括任何检测方法，其包括基因表达和其中的变化的直接检测和间接检测。例如，“可检测地更少”产物可直接或间接地观察到，并且该术语表示任何的减少(包括可检测信号的缺失)。同样地，“可检测地更多”产物指任何的增加，无论直接还是间接地观察到。
[0044]所公开序列表达的增加或减少以下列术语进行定义，其基于相对于正常细胞中表达的百分比或倍数变化。相对于正常细胞的表达水平，增加可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200%。或者，倍数增加可以是相对于正常细胞中表达水平的 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5 或 10 倍。相对于正常细胞的表达水平，减少可以是 10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、99 或 100%ο
[0045]除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。
[0046]概述 本文公开的基因表达模式是内分泌疗法改变中的治疗益处的预测因子。在某些情况下，作为非限制性实例，预测是在结阴性(node-negative)乳腺癌患者例如ER+结阴性患者中。
[0047]为在本公开内容的实施中测定基因的表达水平，可利用本领域已知的任何方法。在一些实施方案中，使用基于RNA检测的表达，所述RNA与本文鉴定和公开的基因杂交。这通过本领域已知的或公认等同的任何RNA检测或扩增+检测的方法容易地进行，所述方法例如但不限于反转录PCR、在美国专利申请序列号10/062，857 (提交于2001年10月25日)以及美国临时专利申请60/298，847 (提交于2001年6月15日)和60/257，801 (提交于2000年12月22日)中公开的方法、和检测RNA稳定化或脱稳定化序列的存在和不存在的方法。
[0048]或者，可使用基于DNA状态检测的表达。经鉴定为甲基化或缺失的基因的DNA检测可用于表达减少的基因。这可通过本领域已知的基于PCR的方法容易地进行，所述方法包括但不限于Q-PCR。相反地，经鉴定为扩增的基因的DNA检测可用于与具体的乳腺癌结果相关的表达增加的基因。这可通过本领域已知的基于PCR的荧光原位杂交(FISH)和染色体原位杂交(CISH)方法容易地进行。
[0049]还可使用基于蛋白质水平或活性的存在、增加或减少的检测的表达。可通过本领域已知的或公认适合于蛋白检测的任何基于免疫组织化学(IHC)、基于血液(尤其对分泌蛋白)、基于抗体(包括针对蛋白的自身抗体)、基于片状剥落细胞(exfoliate cell)(来自癌)、基于质谱和基于成像(包括标记配体的使用)的方法进行检测。基于抗体和成像的方法还可用于在癌症测定后通过使用非侵入程序(例如导管灌洗或细针抽吸)获得的细胞进行肿瘤的定位，其中癌细胞的来源是未知的。可使用标记的抗体或配体来定位患者体内的癌。
[0050]使用基于核酸的测定来检测表达的一个实施方案为通过将一个或多个本文鉴定的基因序列固定到固体支持物上，所述固体支持物包括但不限于固体基质(例如阵列)或本领域已知的基于一种或多种珠粒的技术。或者，还可使用本领域已知的基于溶液的表达测定。
[0051]固定的基因可以是对该基因独特或在其他方面特异的多核苷酸形式，以使该多核苷酸能与对应于该基因的DNA或RNA杂交。这些多核苷酸可以是基因的全长或者是基因的短序列(通过从序列的5’或3’末端缺失，比本领域已知的全长序列缩短达一个核苷酸)，其任选最低限度地被间断(例如通过错配或插入非互补碱基对)以使与对应于该基因的DNA或RNA的杂交不受影响。在某些情况下，使用的多核苷酸为来自基因的3’末端，例如自基因或所表达序列的多腺苷酸化信号或多腺苷酸化位点的约350个、约300个、约250个、约200个、约150个、约100个或约50个以内的核苷酸。还可使用含有相对于公开的基因序列的突变的多核苷酸，只要该突变的存在仍允许杂交产生可检测信号。
[0052]固定的基因可用于测定从样品的癌或乳腺、细胞中制备的核酸样品的状态，对此样品的受试者(例如从其中获得样品的患者)的结果是未知的，或用于证实已指定给样品的受试者的结果。不限制本公开内容，所述细胞可来自ER+乳腺癌的患者。固定的多核苷酸仅需要足以与源自样品的相应的核酸分子在合适的条件下特异地杂交。
[0053]如本领域技术人员所理解，上述相应的序列中的一些包括3’多聚A (或在互补链上的多聚T)延伸，其并不促成所公开序列的独特性。因此可用缺少3’多聚A(或多聚T)延伸的序列实施本公开内容。所公开序列的独特性指仅在所公开的基因的核酸中存在的序列的部分或整体，包括在基因的3’非翻译部分存在的独特序列。用于实施本公开内容的优选独特序列是其对三组中的各序列的共有序列有贡献的那些序列，以使所述独特序列可用于检测在各种个体中的表达，而不是特异地针对存在于一些个体中的多态性。或者，可使用对个体或亚群独特的序列。优选的独特序列优选具有如本文所述的本公开内容的多核苷酸长度。
[0054]为在本公开内容的实施中测定上文所述序列的表达水平(增加或减少)，可使用本领域已知的任何方法。在本公开内容的一个实施方案中，使用基于RNA检测的表达，所述RNA与含有上文所述序列的多核苷酸杂交。这通过本领域已知的或公认等同的任何RNA检测或扩增+检测的方法容易地进行，所述方法例如但不限于反转录PCR (任选实时PCR)、在美国专利申请序列号10/062,857 (题目为“核酸扩增”，提交于2001年10月25日)以及美国临时专利申请60/298，847 (提交于2001年6月15日)和60/257，801 (提交于2000年12月22日)中公开的方法、在美国专利号6，291，170中公开的方法和定量PCR。还可使用鉴定增加的RNA稳定性(导致观察到表达增加)或降低的RNA稳定性(导致观察到表达减少)的方法。这些方法包括增加或降低含有基因序列的mRNA的稳定性的序列的检测。这些方法还包括增加的mRNA降解的检测。
[0055]在本公开内容的一些实施方案中，使用具有在上文公开的序列的3’非翻译和/或非编码区存在的序列的多核苷酸，以检测在癌、或乳腺、细胞中基因序列的表达水平。这类多核苷酸可任选含有在上文公开的序列的编码区的3’部分存在的序列。含有来自编码区和3’非编码区的序列的组合的多核苷酸优选具有邻接排列的序列，不具有插入的异源序列。
[0056]或者，可用具有在癌、或乳腺、细胞中的基因序列的5’非翻译区和/或非编码区存在的序列的多核苷酸实施本公开内容，以检测其表达水平。这类多核苷酸可任选含有在编码区的5’部分存在的序列。含有来自编码区和5’非编码区的序列的组合的多核苷酸优选具有邻接排列的序列，不具有插入的异源序列。还可用在所公开的基因序列的编码区中存在的序列实施本公开内容。
[0057]非限制性的多核苷酸含有来自3’或5’非翻译区和/或非编码区的至少约20个、至少约22个、至少约24个、至少约26个、至少约28个、至少约30个、至少约32个、至少约34个、至少约36个、至少约38个、至少约40个、至少约42个、至少约44个或至少约46个连续核苷酸的序列。前述语句中使用的术语“约”是指从所述数值增加或减少I。甚至更优选含有至少或约50个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、或者至少或约400个连续核苷酸的序列的多核苷酸。前述语句中使用的术语“约”是指从所述数值增加或减少10%。
[0058]来自在本公开内容的多核苷酸中存在的上述编码区的3’或5’末端的序列具有与上述的那些序列相同的长度，除它们当然受到编码区长度的限制之外。编码区的3’末端可包括直到编码区的3’ 一半的序列。相反地，编码区的5’末端可包括直到编码区的5’ 一半的序列。当然可以其整体使用上述序列或编码区和含有其部分的多核苷酸。
[0059]组合了来自3’非翻译区和/或非编码区的序列和编码区的缔合3’末端的多核苷酸可以是至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、或者至少或约400个连续的核苷酸。优选地是，使用的多核苷酸来自基因的3’末端，例如自基因或所表达序列的多腺苷酸化信号或多腺苷酸化位点的约350个、约300个、约250个、约200个、约150个、约100个、或约50个以内的核苷酸。还可使用含有突变(相对于公开的基因序列)的多核苷酸，只要突变的存在仍允许杂交产生可检测的信号。
[0060]在本公开内容的另一实施方案中，可使用含有自上文公开的序列的5’和/或3’末端的核苷酸缺失的多核苷酸。优选从5’和/或3’末端缺失1-5个、5-10个、10-15个、15-20 个、20-25 个、25-30 个、30-35 个、35-40 个、40-45 个、45-50 个、50-60 个、60-70 个、70-80 个、80-90 个、90-100 个、100-125 个、125-150 个、150-175 个或 175-200 个核苷酸，尽管缺失的程度当然受限于所公开序列的长度和能够使用多核苷酸来检测表达水平的需要。
[0061]来自上文公开序列的3’末端的本公开内容的其他多核苷酸包括用于定量PCR的引物和任选探针的那些多核苷酸。在一些实施方案中，引物和探针为其扩增自基因或所表达序列的多腺苷酸化信号或多腺苷酸化位点的少于约350个、少于约300个、少于约250个、少于约200个、少于约150个、少于约100个、或少于约50个核苷酸的区域的那些。
[0062]在本公开内容的其他实施方案中，可使用含有上文公开的序列(包括3’末端)的部分的多核苷酸。这类多核苷酸含有自所公开序列的3’末端的至少或约50个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、或至少或约400个连续的核苷酸。
[0063]本公开内容还包括用于检测乳腺细胞中基因表达的多核苷酸。所述多核苷酸可包含较短的多核苷酸，其由在上述基因中存在的序列与异源序列的组合组成，所述异源序列非天然存在于与所述序列的组合中。非限制性实例包括来自克隆载体或存在于限制性片段中的较短序列，其用于制备本文所述的标记探针或引物。[0064]HoxB 13 和 Η/Ι
本公开内容的方法(基于受试者的乳腺癌细胞中的ΗοχΒ13的表达水平)可用作在起始内分泌疗法过程后在改变内分泌疗法中受益的预测。在一些实施方案中，可以Ma等{J.Clin.0ncol., 24:4611-9 (2006))报道的方式使用HoxB13表达对IL17BR表达的两基因比率(或HoxB13:1L17BR比率)。在备选的实施方案中，可使用HoxB13表达对CHDH表达的两基因比率。
[0065]在单独使用HoxB13表达或使用HoxB13:1L17BR (H:1)比率的情况下，可使用截止值来定义乳腺癌细胞为具有相应于表达的“高”和“低”值。在一些实施方案中，可使用截止值来定义乳腺癌细胞为具有“高H/Ι”和“低H/Ι”值。作为非限制性实例，可以Ma等的方式使用值0.06。在其他实施方案中，截止值可以是患病受试者的乳腺癌细胞中的HoxB13的平均表达。在其他可能的实施方案中，截止值可以是患病受试者的乳腺癌细胞中的Η/I的平均值，其通过平均HoxB13表达/平均IL17BR表达确定。
【权利要求】
1.一种方法，其包括: 从来自患有乳腺癌的受试者的ER+乳腺癌细胞样品的核酸中制备cDNA， 自所述cDNA测定价基因的表达水平， 确定所述受试者为已经历乳腺癌去除并且为已用第一内分泌疗法治疗一段时间且无癌症复发，和 将所述受试者分类为预期从第一内分泌疗法结束后用不同的第二内分泌疗法的治疗中受益，其中所述分类基于提高的HoxB13表达水平。
2.—种方法，其包括: 从来自患有乳腺癌的受试者的ER+乳腺癌细胞样品的核酸中制备cDNA， 自所述cDNA测定在公开的乳腺癌指数(BCI)中的7个基因的表达水平以确定BCI值，其中所述基因为价?又 IL17BR、BublB, CENPA, ΝΕΚ2、RACGAPI 和 RRM2, 确定所述受试者为已经历乳腺癌去除并且为已用内分泌疗法治疗一段时间且无癌症复发，和 由于高风险的BCI值，将所述癌症分类为可能复发。
3.权利要求1或2的方法，其中所述核酸为来自所述样品的mRNA。
4.权利要求3的方法，其中所述RNA用于PCR(聚合酶链式反应)。
5.权利要求1或2的方法，其中所述测定包括使用阵列。
6.权利要求1或2的方法，其中所述样品分割自从所述受试者去除的组织。
7.权利要求4的方法，其中所述PCR为RT-PCR(反转录-PCR)，任选为实时RT-PCR。
8.权利要求1或2的方法，其中所述样品为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品。
9.权利要求1或2的方法，所述方法还包括在他莫昔芬治疗结束后用来曲唑治疗所述受试者。
10.权利要求1或2的方法，所述方法还包括测定所述样品中的H:1比率并且其中所述比率用于表明提高的价表达水平。
11.权利要求1或2的方法，其中所述癌症为原位管癌(DCIS)并且所述癌症复发包括局部复发。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一内分泌疗法为用他莫昔芬治疗并且所述第二内分泌疗法为用来曲唑治疗。
13.一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括 从来自患有乳腺癌的受试者的ER+乳腺癌细胞样品的核酸中制备cDNA， 自所述cDNA测定价基因的表达水平， 确定所述受试者为已经历乳腺癌去除并且为已用第一内分泌疗法治疗一段时间且无癌症复发， 将所述受试者分类为预期从在第一内分泌疗法结束后用不同的第二内分泌疗法的治疗中受益，其中所述分类基于提高的HoxB13表达水平，和 在用第一内分泌疗法治疗结束后用第二内分泌疗法治疗患者。
14.权利要求13的方法，所述方法还包括测定所述样品中的H:1比率，其中所述比率用于表明提高的HoxB13表达水平。
15.权利要求13或14的方法，其中所述第一内分泌疗法为用他莫昔芬治疗并且所述第二内 分泌疗法为用来曲唑治疗。
【文档编号】A61K31/7105GK103998064SQ201180067193
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2011年12月9日 优先权日:2010年12月9日
【发明者】D.斯格罗瓦, M.G.埃尔兰德, Y.张, C.A.施纳贝尔 申请人:生物诊断治疗公司, 综合医院公司