专利名称：一种红雪茶降脂保肝活性部位的提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然药物制备技术领域，具体涉及一种红雪茶降脂保肝活性部位的提取物及其在制备防治非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
背景技术：
红雪茶(Lethariella cladoniodes)系地衣门梅衣科金丝属的一种地衣植物。形如珊瑚，水泡色红，味苦腥带甘。主要分布在西藏、四川九寨沟、玉龙雪山、牦牛山、药山、云南德钦、丽江玉龙雪山、陕西省太白山海拔数千米的高原，生长在落叶松、冷杉干枯树干上。少数民族将其作为山野菜及茶饮，国内外研究发现红雪茶具有清热、抗炎、抗疲劳、抗辐射等作用。发明人在研究中发现红雪茶水提取物具有降血脂作用。目前有关红雪茶的研究，国内仅少量关于红雪茶生药学及化学成分如挥发性成分、氨基酸组营养成分等研究。有关红雪茶降血脂保护肝脏药理药效方面的系统研究、红雪茶降脂保肝活性有效部位与有效成分方面的系统研究亦无文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红雪茶降脂保肝活性部位的提取物。本发明的目的还在于提供上述红雪茶活性部位的提取物在制备防治脂肪肝炎的药物中的应用。一种红雪茶活性部位的提取物，该提取物以以红雪茶干燥粗粉为原料，按照如下步骤提取得到(1)称取红雪茶干燥粗粉100g，加入15-25倍质量的水浸泡l_3h，加热煮沸30-60min，二次煎煮加水3_8倍质量，60-100°C条件下回流20-50min，合并水煎液，过滤，滤液在50-70°C条件下减压浓缩干燥，得到红雪茶水提取物；(2)取红雪茶水提取物加水100_300mL，溶解后加入乙醇使含醇质量百分比达到60-85%，4°C冷藏12-3 ；离心取沉淀物，烘干得到红雪茶醇沉物，将红雪茶醇沉物加200mL水溶解，依次用0. 16-0. 50g胰蛋白酶、0. 08-0. 30g木瓜蛋白酶酶解，透析后再用kvage法除去蛋白，烘干即得。该提取物按照如下步骤提取得到(1)称取红雪茶干燥粗粉100g，加入20倍质量的水浸泡池，加热煮沸45min，二次煎煮加水5倍质量，80°C条件下回流30min，合并水煎液，过滤，滤液在60°C条件下减压浓缩干燥，得到红雪茶水提取物；(2)取红雪茶水提取物加水200mL，溶解后加入乙醇使含醇质量百分比达到80%，4°C冷藏Mh ；离心取沉淀物，烘干得到红雪茶醇沉物，将红雪茶醇沉物加200mL水溶解，依次用0. 16-0. 50g的胰蛋白酶、0. 08-0. 30g木瓜蛋白酶酶解，透析后再用kvage法除去蛋白，烘干即得。上述红雪茶活性部位的提取物成分主要为糖类，占活性部位总质量的65%，主要为鼠李糖和半乳糖。上述红雪茶活性部位的提取物在制备防治脂肪肝的药物中的应用。所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。本发明的有益效果本发明的红雪茶活性部位的提取物能够显著改善脂肪肝大鼠的各项肝功能指标降低肝指数，降低血清中Tc、TG、LDL-C、ALT和AST的含量。本发明的红雪茶活性部位的提取物在防治非酒精性肝方面的效果与东宝肝泰相当，作为一种可用于防治脂肪肝的药物极具开发应用前景。
图1 大鼠肝组织病理切片(HE X 200)；图中，A-正常组、B-模型组、C-HTP低组、D-HTP高组、E-东宝甘泰组。图2为总糖标准曲线图。图3为还原糖标准曲线图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1红雪茶活性部位(HTP)的提取称取红雪茶干燥粗粉100g，加入20倍质量的水浸泡池，加热煮沸45min，二次煎煮加水5倍质量，80°C条件下回流30min，合并水煎液，过滤，滤液在60°C条件下减压浓缩干燥，得到红雪茶水提取物；取红雪茶水提取物加水200mL，溶解后加入乙醇使含醇质量百分比达到80%，4°C冷藏Mh ；离心取沉淀物，烘干得到红雪茶醇沉物，将红雪茶醇沉物加200mL水溶解，依次用0. 16-0. 50g的胰蛋白酶、0. 08-0. 30g木瓜蛋白酶酶解，透析后再用kvage法除去蛋白，烘干即得。实施例2红雪茶活性部位(HTP)含糖量的测定方法采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，3，5- 二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量，两者的差值即为HTP含量。步骤1、供试品溶液制备精密称定HTP 0. 2g，置IOmL容量瓶中，加水定容，摇勻即得HTP供试品溶液。2、对照品溶液的制备称取105°C烘干至恒重的鼠李糖对照品0. 0320mg,置50mL容量瓶中，加水溶解并定容，即得浓度为0. 64mg -πιΓ1的对照品贮存液，精密量取1. 563mL置IOmL容量瓶中，加水定容，摇勻，即得0. Img · πιΓ1对照品溶液。3、6%苯酚溶液的制备称取苯酚200g，加铝片0. 2g，碳酸氢钠0. Ig,常压油浴蒸馏，收集182°C馏分，称取该馏分80g，置于IOOmL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇勻后至棕色瓶中，即为80 %苯酚液，4°C冷藏备用。精密量取1.875mL 80%苯酚液，置25mL容量瓶中，加水定容，即得6%苯酚液，临用新制。
4、DNS试剂的制备称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g，溶于131mL浓度为2. Omol/L的氢氧化钠溶液中， 将此溶液加入到250mL含有92. 5g酒石酸钾钠的热水溶液(水温小于45°C )中，再加入 2. 5g重蒸苯酚和2. 5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后定容至500mL，贮存于棕色瓶中，一周后使用。5、测定波长的选择5. 1总HTP测定波长的选择精密吸取0. Img · mL"1对照品溶液1. OmL,蒸馏水、HTP供试品溶液各0. ImL,分别置IOmL具塞试管中，加蒸馏水至2. OmL，精密量取LOmL 6%苯酚的溶液，加入，混勻后，精密量取5. OmL浓硫酸，缓慢加入，摇勻，静置5min后，置沸水浴中，15min后取出，待冷却至常温，分别从各具塞试管中吸取300 μ L，置酶标板中，以相应试剂为空白，230 999nm范围内扫描吸收光谱，对照品及供试品在480nm处均有最大吸收，故确定最大吸收波长为480nm。6、还原糖测定波长选择分别精密吸取蒸馏水、0. 64mg -πιΓ1对照品溶液、HTP供试品溶液各0. 5mL,置IOmL 具塞试管中，加1.5mL DNS试剂，混勻后，置沸水浴中，5min后取出，待冷却至常温，加水 4mL,混勻。分别从各具塞试管中吸取300 μ L，置酶标板中，230 999nm范围内扫描，吸收曲线呈递减，无最大吸收峰，且在550nm之前，DNS试剂对测定结果有干扰，结合文献资料， 最终确定测定波长为550nm。7、标准曲线的绘制7.1总糖标准曲线分别精密吸取0. Img · mL-Ι 对照品溶液 0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. OmL,置 IOmL 具塞试管中，加蒸馏水至2mL，加1. OmL 6%的苯酚溶液，混勻，缓慢加入5. OmL浓硫酸，摇勻，静置5min，置沸水浴中加热15min后取出，以相应试剂为空白，于480nm处测定OD 值，以鼠李糖的含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为OD = 0. 0514C-0. 0146 (r = 0. 9992)，在2. 5 12. 5μ g 'mL-Ι范围内有良好的线性关系，结果如图2所示。7. 2还原糖标准曲线分别精密吸取0. 64mg · mL_l 对照品溶液 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5mL，置 IOmL 具塞试管中，加水至0. 5mL，加1. 5mL DNS试剂，混勻，置沸水浴中加热5min后取出，以相应试剂为空白，于550nm处测定OD值，以鼠李糖的含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 标准曲线方程为OD = 0. 0229C-0. 086 (r = 0. 9999)，在8 40 μ g · ml/1范围内有良好的线性关系。结果如图3。8、精密度实验精密吸取0. Img · mL—1对照品溶液6份，各0. 8mL,按总糖标准曲线连续测定6次， 计算得总糖含量，RSD为1. 98%，表明仪器精密度良好。9、稳定性实验精密吸取HTP供试溶液O.^iL，置IOmL具塞试管中，按“7. 1”项下方法每隔0. 测定1次吸光度，连续13次。计算得RSD为1. M%，表明总糖含量测定中，样品溶液在他内稳定。
10、样品测定10. 1总糖含量测定 取HTP供试品溶液，精密吸取0. 4mL,按“7. 1 ”项下条件测定总糖含量，测得含糖量 86. 9%。10. 2还原糖含量测定取HTP供试品溶液，精密吸取0. 4mL,按“7. 2”项下条件测定还原糖含量，测得含糖量 4. 28%。10. 3HTP含糖量测定由上述HTP总糖含量及还原糖含量，计算HTP有效部位的含糖量为82. 6%。实施例3红雪茶活性部位(HTP)对大鼠非酒精性脂肪肝作用一、方法(1)非酒精性脂肪性肝大鼠模型的建立选取清洁级SD大鼠(180士20) g 80只，全为雄性；每天用高糖高脂饲料(基础饲料72. 7%、胆固醇2<%、蛋黄粉5%、猪油10%、丙基硫氧嘧啶0. 2%、蔗糖10%、胆酸钠 0.1%)持续饲养6周，建立非酒精性脂肪性肝(NAFLD)大鼠模型。(2)取NAFLD模型大鼠80只和健康的大鼠20只，健康的大鼠常规饲养(正常组)， 20只NAFLD模型大鼠高糖高脂饲料饲养(模型组)，20只灌服0. 2g. kg—1, cf1的红雪茶活性部位的提取物(HTP低组)，20只灌服0. 6g. kg"1, cf1的红雪茶活性部位的水提取物(HTP高组)，20只灌服1. 2g. kg—1, cf1的东宝甘泰(东宝甘泰组)，所有大鼠连续饲养6周。(3)取培养3d和42d的各组大鼠称体重，取饲喂6周的各组大鼠，以股动脉采血处
死，称取肝脏湿重，采用(肝指数=^tim χ 100%)计算肝脏指数。
体重(4)股动脉采血血清样本按3600r ^irT1,4°C离心lOmin，分离血清及勻浆上清液， 测定血清中TC (总胆固醇)、TG (甘油三脂)、ALT (丙氨酸氨基转移酶)、AST (天门冬酸氨基转移酶)、LDLC (低密度脂蛋白胆固醇)、HDLC (高密度脂蛋白胆固醇)的含量。(5)取各组处死大鼠肝组织0. 2g加生理盐水(1 9)勻浆取上清液制作成10%肝组织勻浆，采用化学比色法对大鼠大鼠肝组织中的SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)、 TC和TG含量进行测量。(6)从各组处死大鼠的肝右叶的中部切取1块肝组织，用10%甲醛溶液固定后制备石蜡切片观察病理改变。以上实验数据的统计学处理应用SAS9. 1. 3软件进行统计学分析，计量资料用 χ 士 s表示，多组资料均数比较采用One-Way ANOVA检验及t检验。二、结果(1)对各组大鼠体重、肝湿质量和肝脏指数的统计结果表明模型组的肝湿质量与肝指数明显升高，给药组都能降低体重；给药组均可降低肝湿质量与肝脏指数而HTP高组更明显降低肝脏指数(表1)。证明红雪茶活性部位在改善肝炎大鼠的肝脏功能方面的效果与东宝甘泰相当，高剂量的HTP效果还优于东宝甘泰。表1 各组大鼠体质量、肝脏指数的变化
权利要求
1.一种红雪茶活性部位的提取物，其特征在于，该提取物以红雪茶干燥粗粉为原料，按照如下步骤提取得到(1)称取红雪茶干燥粗粉100g，加入15-25倍质量的水浸泡l_3h，加热煮沸30-60min，二次煎煮加水3-8倍质量，60-10(TC条件下回流20-50min，合并水煎液，过滤，滤液在50-70°C条件下减压浓缩干燥，得到红雪茶水提取物；(2)取红雪茶水提取物加水100-300mL，溶解后加入乙醇使含醇质量百分比达到60-85 %，4 °C冷藏12-3 ；离心取沉淀物，烘干得到红雪茶醇沉物，将红雪茶醇沉物加200mL水溶解，依次用0. 16-0. 50g胰蛋白酶、0. 08-0. 30g木瓜蛋白酶酶解，透析后再用kvage法除去蛋白，烘干即得。
2.根据权利要求1所述一种红雪茶活性部位的提取物，其特征在于，该提取物按照如下步骤提取得到(1)称取红雪茶干燥粗粉100g，加入20倍质量的水浸泡池，加热煮沸45min，二次煎煮加水5倍质量，80°C条件下回流30min，合并水煎液，过滤，滤液在60°C条件下减压浓缩干燥，得到红雪茶水提取物；(2)取红雪茶水提取物加水200mL，溶解后加入乙醇使含醇质量百分比达到80%，4°C冷藏Mh ；离心取沉淀物，烘干得到红雪茶醇沉物，将红雪茶醇沉物加200mL水溶解，依次用0. 16-0. 50g的胰蛋白酶、0. 08-0. 30g木瓜蛋白酶酶解，透析后再用kvage法除去蛋白，烘干即得。
3.权利要求1所述红雪茶活性部位的提取物在制备防治脂肪肝的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述红雪茶活性部位的提取物在制备防治脂肪肝的药物中的应用，其特征在于，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。
全文摘要
本发明公开了属于天然药物制备技术领域的一种红雪茶降脂保肝活性部位的提取物及其在制备防治非酒精性脂肪肝的药物中的应用。该提取物以红雪茶干燥粗粉为原料，经过水提取，醇沉淀，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解，透析，干燥等步骤制成。本发明的红雪茶活性部位的提取物在防治非酒精性脂肪肝方面的效果与东宝甘泰相当，作为一种可用于防治脂肪肝的药物极具开发应用前景。
文档编号A61P1/16GK102552337SQ201210042650
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者庄筱葳, 毛贵元, 蔡光明 申请人:中国人民解放军第三0二医院