专利名称：一种重组海参溶菌酶c端多肽、其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及重组海参溶菌酶C端多肽高效表达的工程菌制备方法，优化发酵工艺而获得高产率的可溶性多肽产物，以及对制备的产品进行广谱抗菌活性的研究。
背景技术：
溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β _1，4糖苷键的水解，导致细胞裂解，内容物逸出而使细菌死亡。它广泛存在于自然界动植物和微生物的组织、体液及分泌物中，在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。溶菌酶作为天然的抗菌剂、免疫增强剂和防腐剂目前广泛应用于医药、食品及饲料等行业。近年来随着海洋生物鱼类、虾类、贝类以及海珍品，如海参、鲍鱼等养殖产量的快速增长，随之而来的是海水养殖生产中的品质退化、养殖水平低、疾病泛滥及环境污染等问题。目前在水产品养殖以及畜禽生产中使用抗生素带来的问题也越来越受到人们的关注，一是耐药性问题，二是药物残留问题，其副作用是不可忽视的，人们不希望以牺牲人类健康为代价换取海产品、畜禽产品生产性能的提高。在这种严峻形势下，溶菌酶在动物养殖方面的优势以及在疾病预防治疗方面的促进作用显示了它的突出地位，它的绿色、安全、无公害的特点代表了未来的饲料添加剂和动物保健品的方向。根据溶菌酶空间结构、免疫学特性和催化活性的差异通常可分为6类C-型 (chicken-type)溶菌酶、g_ 型(goose-type)溶菌酶、i_ 型(invertebrate-type)溶菌酶； 植物源(plant lysozyme)溶菌酶；微生物源(bacterial lysozyme)溶菌酶；噬菌体(phage lysozyme)溶菌酶。近年来随着人们把开发新药和功能性食品的目光投向海洋，对i_型溶菌酶的研究兴趣也日益高涨，相继在海洋贝类、虾、海星、海胆、海参中发现了 i_型溶菌酶。目前已商品化使用的溶菌酶主要从蛋清中提取，属于C-型溶菌酶。由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量受限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。因此， 利用基因工程重组技术高效表达溶菌酶成为很重要的手段，尤其生产海参i_型溶菌酶具有非常重要的应用价值。研究发现，海参i_型溶菌酶与蛋清C-型溶菌酶不同，后者只对革兰氏阳性菌起抗菌作用，而海参i_型溶菌酶不仅对革兰氏阳性菌，并且对革兰氏阴性菌均具有显著的抗菌作用，尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌(弧菌和假单胞菌)具有明显的抗菌效果。同时，海参i_型溶菌酶具有较强的抗真菌、抗病毒、增加免疫力等能力，并具有生物相容性好、对组织无刺激、无毒性等特点。海参i-型溶菌酶(以下简称海参溶菌酶)基因于2007年在我们实验室首次被分离和鉴定(参见杨西建，等.海参i_型溶菌酶基因及其编码产物的结构特点.中国生物化学与分子生物学报；2007，23 (7) :542-547)。近年来，我们又将海参溶菌酶基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母细胞中进行重组表达，并对重组蛋白的抗菌活性进行了研究(参见王秀霞，等.海刺参i_型溶菌酶基因的重组表达及抑菌谱分析.生物工程学报，2009，25 O) 189-194;谷跃峰，等.海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化.大连工业大学学报，2010，四(5) :317-320)。但目前存在的问题，一是重组海参溶菌酶基因在大肠杆菌细胞中表达，其溶菌酶蛋白以包涵体形式存在(即酶蛋白不溶解)，后续对该蛋白的变性和复性操作繁琐，而且获得的酶产量低、活性不稳定；二是重组海参溶菌酶基因在毕赤酵母细胞中蛋白表达量很低。这两个瓶颈问题严重阻碍了海参溶菌酶研究向产业化试验的进程，并且国内外几个实验室在研究各类溶菌酶基因表达时都遇到类似问题。经过对海参溶菌酶基因结构的分析，发现海参溶菌酶的N端区域可能编码了糖苷酶活性，而C端区域可能编码了异构肽酶活性。因此，我们设计将海参溶菌酶基因分成两段，分别进行重组表达制备成海参溶菌酶N端和C端多肽，再验证其特性和功能，并与海参溶菌酶做比较和分析。本发明是关于重组海参溶菌酶C端多肽的制备方法及应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有广谱抗菌活性、高效表达海参溶菌酶C端多肽的基因工程制备方法。本发明采用的技术方案为对来源于自主分离鉴定的海刺参 (Stichopus japonicus)的溶菌酶(SjLys)基因(GenBank 注册号EF036468)进行 C 端多肽的重组表达。利用设计合成的引物，扩增海参溶菌酶C端多肽的基因；将构建的原核表达载体pET-32a_S jLys-C，转化Rosetta (DE3) pLysS细胞，获得一株高效表达重组海参溶菌酶 C端多肽的基因工程菌。用所述的基因工程菌生产的溶菌酶C端多肽，经发酵培养基及发酵条件的优化，其表达产物具有80%以上的可溶性，产品收率高。生产的重组海参溶菌酶C端多肽具有广谱抗菌活性，尤其是经100°C加热40min，该多肽产品的抗菌活性增强了 10% 25%。研究证明，海参溶菌酶C端多肽的抗菌活性、稳定性和生产效率均优于海参溶菌酶， 可无危害地应用于制备饲料添加剂、食品防腐剂、抗生素的替代药物等。本发明的另一方面在于保护一种重组海参溶菌酶C端多肽的引物序列，其引物序列分别为，正向引物=SEQ ID NO 1 ；反向引物=SEQ ID NO :2。本发明的另一方面在于保护一种重组海参溶菌酶C端多肽的质粒，其制备方法包括以海参溶菌酶SjLys基因为模板，将核苷酸序列分别为，正向引物SEQ ID NO :1 ；反向引物SEQ ID NO :2的引物序列所扩增的基因片段连接至大肠杆菌表达载体pET3h(+)中， 构建重组表达质粒。本发明的另一方面在于保护一种表达重组海参溶菌酶C端多肽的基因工程菌，其制备方法包括将上文所述的质粒转化Rosetta(DEiB)pLysS宿主细胞获得重组基因工程菌。本发明的另一方面在于保护一种重组海参溶菌酶C端多肽的制备方法，包括下述步骤①诱导表达培养上文所述的重组基因工程菌，并用IPTG诱导表达；②分离和纯化收集步骤①所得产物，经镍离子亲和层析柱纯化，并用超滤膜浓缩；再将浓缩样品脱盐后制得终产品。本发明的另一方面在于保护一种上文所述的方法，其特征在于，诱导表达和分离纯化的条件包括③诱导表达将上文所述的重组基因工程菌在优化的液体培养基中，37°C、160rpm振荡培养至0D600达0. 6 0. 8，再向培养体系中加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L, 28C, 150rpm诱导培养》1，收集发酵液；其中，优化的液体培养基是指在LB培养基中加入两种抗生素，即100mg/L氨苄青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分离和纯化将步骤③收集的发酵液离心，收集并洗涤菌体，反复冻融，用磷酸盐缓冲液重悬菌体，并加入Triton X_100至终浓度为1 %后，经冰浴超声破菌，离心收集上清液，经镍离子亲和层析柱His Trap HP column纯化，收集重组海参溶菌酶多肽的融合蛋白组分，用截留分子量为5kDa的Millipore超滤膜将蛋白浓缩至8 10mg/mL ；再将浓缩样品经kphadex G-25凝胶层析脱盐，收集融合蛋白组分，冷冻干燥，得到重组海参溶菌酶C端多肽的产品。本发明的另一方面在于保护一种利用上文所述的方法获得的重组海参溶菌酶C 端多肽产品。本发明的另一方面在于保护一种利用上文所述的重组海参溶菌酶C端多肽在制备饲料添加剂、食品防腐剂、抗生素的替代药物、海水养殖生产领域中的应用。上述本发明涉及的下列各实验操作，包括基因片段连接至大肠杆菌表达载体 pET32a(+)中、质粒转化Rosetta (DE;3)pLysS宿主细胞、镍离子亲和层析柱纯化、超滤膜浓缩、样品脱盐等实验操作方法均为本领域技术人员常用的实验技术，故再次不做赘述，具体可见本发明中具体实施例所述部分。本发明的创新特征是1.高效表达和制备可溶性重组海参溶菌酶C端多肽，解决了当前海参溶菌酶产业化遇到的蛋白溶解度低、酶活性低等关键问题。2.本发明提供的基因工程菌生产重组海参溶菌酶C端多肽，具有产量高，生产条件和步骤简单，反应条件易于控制，生产成本低的优点，因此适用于大规模的生产。3.重组海参溶菌酶C端多肽具有广谱抗菌活性，尤其经加热处理后的该产品，其抗菌活性提高了 10% 25%。因此，该产品具有很好的热稳定性和酶活稳定性，而且安全无害，可应用于制备饲料添加剂、食品防腐剂、抗生素的替代药物等。
图 1 是 PCR 扩增 SjLys-C 的基因片段；其中泳道，M :100bp DNA ladder marker ； 1 =PCR扩增产物；图2是重组海参溶菌酶C端多肽的Western blotting分析结果图；其中泳道，M 精准蛋白质分子量标准；1 =IPTG诱导前菌株发酵液的菌体；2 :IPTG诱导后菌株发酵液的菌体；3 =Western blotting检测泳道1中的样品；4 =Western blotting检测泳道2中的样
P
BFI ；图3是重组海参溶菌酶C端多肽的诱导表达及纯化的SDS-PAGE结果图；其中泳道，M 蛋白质分子量标准；1 IPTG诱导前菌株发酵液的菌体；2 :IPTG诱导后菌株发酵液的菌体；3 诱导的菌株发酵液菌体细胞被破碎后的沉淀物；4 诱导的菌株发酵液菌体细胞被破碎后的上清液；5 泳道4中的样品经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的重组蛋白。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所用的海刺参(Stichopus japonicus)，源于大连长海县地区，其海参溶菌酶(SjLys)基因的GenBank注册号为EF036468 ；引物序列合成、DNA测序是由北京华大基因研究中心完成；Western blotting 7MirMi^ TaKaRa Biotechnology ( ) ^ ] ；大肠杆菌Rosetta (DE;3)pLysS感受态细胞和表达载体pET_32a(+)购自 Novagen(美国)公司；大肠杆菌DH5a，克隆载体 pMD 18-T，RNAiso Plus 试剂，TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒，限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，DNA ladder marker禾口蛋白低分子量marker均购自TaKaRa Biotechnology (大连)公司；质粒提取和琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；HisTrap HP column 购自 GE Healthcare (美国)公司；其他试剂均为国产的分析纯。实施例1高效表达重组海参溶菌酶C端多肽的基因工程菌的制备1.海参溶菌酶C端多肽基因序列的扩增(1)根据海参溶菌酶的基因序列，设计两对特异性引物，分别在正向和反向序列里引入Nco I和EcoR I酶切位点。其序列为正向引物SEQID NO :1GAATGCCATGGTGATGGGAGGTAGTCT反向引物SEQID NO :2GTGGAATTCTGTTCAGTTGTTGCTCATGTC。PCR扩增片段范围是从海参溶菌酶氨基酸Gly 70至Asn 145，全长为228bp (含有 76aa)，即为SjLys-C的基因片段。(2)取新鲜的海刺参肠样品，根据RNAiso Plus试剂说明抽提总RNA。(3)以该海参肠总 RNA 为模板，使用 TaKafci One Step RNA PCR Kit(AMV)进行 RT-PCR基因扩增，其反应体系为
权利要求
1.重组海参溶菌酶C端多肽的引物序列，其特征在于引物序列分别为，正向引物SEQ ID NO 1 ；反向引物:SEQ ID NO :2。
2.一种重组海参溶菌酶C端多肽的质粒，其特征在于，制备方法包括以溶菌酶SjLys 基因为模板，将权利要求1所述的引物序列所扩增的基因片段连接至大肠杆菌表达载体 pET32a(+)中，构建重组表达质粒。
3.—种表达重组海参溶菌酶C端多肽的基因工程菌，其特征在于，制备方法包括将权利要求2所述的质粒转化Rosetta(DE;3)pLysS宿主细胞获得重组基因工程菌。
4.一种重组海参溶菌酶C端多肽的制备方法，其特征在于，制备方法包括①诱导表达培养权利要求3所述的重组基因工程菌，并用IPTG诱导表达；②分离和纯化收集步骤①所得产物，经镍离子亲和层析柱纯化，并用超滤膜浓缩；再将浓缩样品脱盐后制得终产品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，诱导表达和分离纯化的条件包括③诱导表达将权利要求3所述的重组基因工程菌在优化的液体培养基中，37°C、160rpm振荡培养至0D600达0. 6-0. 8，再向培养体系中加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L，、150rpm诱导培养8h，收集发酵液；其中，优化的液体培养基是指在LB培养基中加入两种抗生素，即100mg/L氨苄青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分离和纯化将步骤③收集的发酵液离心，收集并洗涤菌体，反复冻融，用磷酸盐缓冲液重悬菌体， 并加入Triton X-100至终浓度为1 %后，经冰浴超声破菌，离心收集上清液，经镍离子亲和层析柱His Trap HP column纯化，收集重组海参溶菌酶多肽的融合蛋白组分，用截留分子量为51^^的肌11丨？0仪超滤膜将蛋白浓缩至8 1011^/1^ ；再将浓缩样品经kphadex G-25 凝胶层析脱盐，收集融合蛋白组分，冷冻干燥，得到重组海参溶菌酶C端多肽的产品。
6.根据权利要求4或5所述的方法获得的重组海参溶菌酶C端多肽产品。
7.如权利要求6所述的重组海参溶菌酶C端多肽在制备饲料添加剂、食品防腐剂、抗生素的替代药物、海水养殖生产领域中的应用。
全文摘要
本发明涉及对来源于海刺参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)基因(GenBank注册号为EF036468)进行C端多肽的重组表达。首先构建出重组表达质粒pET-32a-SjLys-C，再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS细胞，获得一株高效表达重组海参溶菌酶C端多肽的基因工程菌。利用该基因工程菌生产的溶菌酶C端多肽，经发酵培养基及发酵条件的优化，其表达产物具有80％以上的可溶性，产品收率高。生产的重组海参溶菌酶C端多肽具有广谱抗菌活性，尤其是该产品经100℃加热40min处理后，它的抗菌活性增强了10％～25％，这对开发海参溶菌酶多肽作为饲料添加剂非常有利。
文档编号A61K38/47GK102559671SQ20121005548
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者丛丽娜, 常艺海 申请人:大连工业大学