专利名称：艾叶提取物及其在制备抗乙肝病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然植物提取及应用技术领域，具体涉及一种艾叶提取物及其在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
背景技术：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBv)引起的一种世界性疾病。据统计，目前全世界大约有20亿人感染过HBV，其中约有3. 5亿人是HBV携带者， 我国约有I. 2亿HBV携带者。乙型肝炎病毒是导致急性、慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病因，每年有30 50万人死于HBV引起的肝硬化或肝癌。目前临床上抗HBV药物主要为干扰素和核苷类药物。这两类药物虽然在HBV感染的治疗上取得了比较好的疗效，但是有报道称干扰素适应症范围窄，不良反应多。核苷类药物停药后易复发，长期使用会产生耐药性， 易出现肾毒性、骨髓抑制等不良反应，因此，寻找新型安全有效的抗乙肝病毒药物是临床急需解决的问题。中药具有多成分、多靶点、多途径发挥药效等特点。传统中药在长期治疗乙型肝炎过程中体现了它独有的优势，开发具有抗乙肝病毒作用的中药和天然药物是当前的研究热点。艾叶(Folium Artemisiae Argyi)是一味使用历史悠久的传统中药,在我国的很多地区均有分布。传统药学理论认为艾叶有理气血、逐寒湿等功效。近代医学研究证明艾叶还具有抗菌、平喘镇咳祛痰、止血与抗凝血等作用。目前，尚未见到有关于艾叶提取物被用于抗乙肝病毒的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种艾叶提取物，以及该艾叶提取物在制备抗乙肝病毒药物方面的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下
一种艾叶提取物，该提取物的有效成分包括黄酮类、香豆素类、内酯类、酚类、有机酸类、甾体类(如β_谷留醇等)和三萜类化合物。黄酮类化合物如5，7-二轻基-6，3 ’，4 ’ -三甲氧基黄酮(eupatilin,异泽兰黄素)、5，7，4 ’ -三轻基-6，3 ’ - 二甲氧基黄酮(jaceosidin,棕矢车菊素)、圣草酹 (eriodictyol, 5，7，3 '，4 '-四轻基黄烧酮)、鼠李素(rhamnetin, 3,5,3 ' , 4 '-四轻基-7-甲氧基黄酮)、芳:菜素(Apigenin 5，7，4，-三轻基黄酮)、山萘酹(kaempferol, 3，4, 5, 7-四轻基黄酮)、木犀草素(Iuteolin 3’，4’，5, 7-四轻黄酮)、槲皮素(quercetin, 3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮)、金合欢素(5，7- 二羟基-4’ -甲氧基黄酮)等。香豆素类化合物如伞形花内酯(umbelIiferone, 7-轻基香豆素)、瑞香素(daphnetin, 7, 8- 二轻基香豆素) 等。酚类化合物如4-甲氧基-3-羟基苯酚、尿囊素(allantoin 5-尿基乙内酰胺)等。三萜类化合物如α -香树脂醇、β -香树脂醇、无羁萜、a -及β -香树脂醇的乙酸酯、羽扇烯酮、粘霉烯酮、羊齿烯酮、24-亚甲基环木菠萝烷酮、西米杜鹃醇等。所述艾叶提取物的制备方法，其包括如下步骤将艾叶用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流结束后固液分离，所得液体浓缩后，经干燥即得。具体的，可取粉碎过的艾叶1kg，用4 IOL乙酸乙酯浸泡8h以上(用以使艾叶充分浸润)，然后将艾叶及浸泡液回流I 6h。为了获得较高的提取率，也可以按照下述步骤进行回流结束后固液分离，所得固体残渣可以再次用乙酸乙酯回流，固液分离，合并两次所得液体并浓缩成浸膏。固体残渣可如此重复提取，共回流I 3次。所述艾叶提取物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。艾叶提取物可制成多种剂型胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸、缓释制剂及纳米制剂等剂型。可以以艾叶提取物为活性物质，与医学上可接受的药用辅料、赋形剂等混配、组合，制成上述各种剂型；还可以与其他抗乙肝病毒药物共同作为活性物质，与医学上可接受的药用辅料、赋形剂等混配、组合，制成上述各种剂型。普通胶囊将艾叶提取物或与明胶等囊材制得微囊后与硬脂酸镁等以1:3的比例混匀后，填入空胶囊中即得。规格0. 2g/粒(含量50mg/粒)。临床拟用量200mg/日，2次/曰。软胶囊将艾叶提取物与明胶、甘油、蒸馏水熔融制得的胶液用轧囊机压制成囊， 即得。规格0. 2g/粒(含量50mg/粒)。临床拟用量200mg/日，2次/日。片剂将艾叶提取物或微囊化后与微晶纤维素、乳糖、硬脂酸镁等辅料混配，按公知的制片技术和装备，经过标准的凹冲压成片，制成片剂。规格0. 25g/片(含量50mg/片)。 临床拟用量200mg/日，2次/日。颗粒剂将艾叶提取物或微囊化后与蔗糖、糊精、乳糖等辅料混配制粒，整粒，灭菌分装即得。规格0. 3g/袋(含量IOOmg/袋)。临床拟用量200mg/日，2次/日。滴丸将艾叶提取物与PEG 4000以1:3混合熔融，以固体分散技术，用滴丸机滴制成丸。规格20mg/粒(含量5mg/粒)。临床拟用量200mg/日，2次/日。缓释制剂将艾叶提取物或微囊化后与羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁等充分混匀、制粒，压制成片，即得。规格0. 3g/片(含量lOOmg)。临床拟用量400mg/2日。纳米制剂将艾叶提取物与磷脂、助乳化剂和水以纳米乳化法制成纳米乳或亚微乳，再倒入冰水中冷却即得到纳米粒或亚微乳。规格50mg/10ml。临床拟用量IOOmg/日。本发明艾叶提取物的提取方法简单，所得艾叶提取物经体外细胞试验证明具有较强的抗乙肝病毒活性(这可能是提取物中包含的有效成分如黄酮类、香豆素类、内酯类、 酚类、有机酸类、留体类和三萜类化合物等作用的结果)，可用于制备抗乙肝病毒药物。
具体实施例方式以下通过优选实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。实施例I
一种艾叶提取物，该提取物的有效成分包括黄酮类、香豆素类、内酯类、酚类、有机酸类、甾体类和三萜类等化合物。所述艾叶提取物经下述方法制得取Ikg粉碎过的艾叶置于烧瓶中，加入6000ml乙酸乙酯振摇混合后浸泡12h左右，然后将艾叶及浸泡液回流2h (烧瓶中可放入数粒沸石)，回流结束后静置15min左右，然后过滤。滤渣与4000ml乙酸乙酯混合后再次回流2h，过滤；合并两次所得滤液，然后用旋转蒸发仪浓缩，浓缩至少量时转至蒸发皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h即得21. 5g墨绿色浸膏。实施例2
一种艾叶提取物，该提取物的有效成分包括黄酮类、香豆素类、内酯类、酚类、有机酸类、甾体类和三萜类等化合物。所述艾叶提取物经下述方法制得取Ikg粉碎过的艾叶置于烧瓶中，加入9000ml乙酸乙酯振摇混合后浸泡24h左右，然后将艾叶及浸泡液回流4h，回流结束后静置片刻，然后过滤。所得滤液用旋转蒸发器仪浓缩，浓缩至少量时转至蒸发皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h即得20. Og墨绿色浸膏。实施例3
一种艾叶提取物，该提取物的有效成分包括黄酮类、香豆素类、内酯类、酚类、有机酸类、甾体类和三萜类等化合物。所述艾叶提取物经下述方法制得取Ikg粉碎过的艾叶置于烧瓶中，加入5000ml乙酸乙酯振摇混合后浸泡IOh左右，然后将艾叶及浸泡液回流3h，回流结束后静置片刻，然后过滤。滤渣与5000ml乙酸乙酯混合后再次回流2h，过滤；合并两次所得滤液，然后用旋转蒸发仪浓缩，浓缩至少量时转至蒸发皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h 即得22. 6g墨绿色浸膏。艾叶提取物所含有效成分的验证试验
1、制备样品溶液 1.1样品水溶液
称取O. 2g实施例I所得艾叶提取物，置具塞锥形瓶中，加水15ml，超声振荡15分钟使溶解,过滤,收集滤液,得样品水溶液。I. 2样品乙醇溶液
称取O. 2g实施例I所得艾叶提取物，置具塞锥形瓶中，加乙醇20ml，超声振荡15分钟， 活性碳脱色两次(每次O. 5g)，过滤，收集滤液，得样品乙醇溶液。I. 3样品氯仿溶液
称取O. 2g实施例I所得艾叶提取物，置具塞锥形瓶中，加氯仿15ml，超声振荡15分钟,活性碳脱色三次(每次O. 5g)，过滤，收集滤液，得样品氯仿溶液。2、验证试验
2.I黄酮类化合物
2.I. I盐酸-镁粉试验
取样品乙醇溶液1ml，加少量镁粉后，滴加浓盐酸5-7滴，溶液颜色变红。为正反应。2. I. 2盐酸-锌粉试验
取样品乙醇溶液1ml，加少量锌粉后，滴加浓盐酸5-7滴，放置后溶液颜色变红。为正反应。2. 1.3三氯化铝荧光试验
取样品乙醇溶液适量，点于滤纸片上，晾干后，喷以I %三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯下观察，样品斑点呈现黄色荧光。为正反应。I %三氯化铝乙醇溶液的配制取O. Ig三氯化铝，加乙醇使溶解成10ml，即得。2. I. 4浓氨水荧光试验取样品乙醇溶液适量，点于滤纸片上，晾干后，置氨蒸气中熏几分钟，置紫外光灯下观察，样品斑点呈现黄色荧光。为正反应。2. 2香豆素、内酯类化合物 2. 2. I开闭环反应
取样品乙醇溶液1ml，加I %氢氧化钠溶液2-3滴，溶液为澄清，再加2%盐酸5_6滴，溶液变浑浊。为正反应。2. 2. 2异羟肟酸铁反应
取样品乙醇溶液1ml，加7%盐酸羟胺乙醇溶液和10%氢氧化钠溶液各5-6滴，置水浴上加热几分钟后，加2%盐酸溶液4-5滴,再加1%三氯化铁溶液4-5滴,溶液呈现红色。为正反应。2. 2. 3重氮盐试剂反应
取样品乙醇溶液Iml,加I %氢氧化钠溶液数滴,置水浴加热,后放至室温,加新配置的重氮对硝基苯胺试液数滴，溶液呈红色。为正反应。重氮对硝基苯胺试液的配制取对硝基苯胺O. 4 g，加稀盐酸20ml与水40ml，使溶解，冷却至15°C，缓缓加入10%亚硝酸钠溶液，至取溶液I滴能使碘化钾淀粉试纸变为蓝色， 即得。2. 3酚类化合物
2.3. I FeCl3试剂反应
取样品水溶液1ml，加l%FeCl3溶液5_6滴，放置后发现有暗绿色沉淀。为正反应。2. 3. 2三氯化铁-铁氰化钾试剂反应
取样品水溶液适量，点于滤纸片上，晾干后，喷以1%三氯化铁一 1%铁氰化钾(1:1)溶液，显蓝色斑点。为正反应。2. 4有机酸化合物
2.4. I pH试纸检查
取水溶液用pH试纸检查,与标准色版比较为4. 6。为正反应。2. 4. 2溴酚蓝试液反应
取样品水溶液适量，点于滤纸片上，晾干后，喷以O. 1%溴酚蓝乙醇溶液，呈蓝色背景黄色斑点。为正反应。O. 1%溴酚蓝乙醇溶液配制称取O. 005g溴酚蓝，加乙醇使溶解成5ml，即得。2. 5甾体、三萜化合物
2.5. I氯仿-浓硫酸反应
取样品氯仿溶液1ml，加浓硫酸1ml，使其分层，氯仿层显红色，浓硫酸层有黄绿色荧光。为正反应。2. 5. 2三氯醋酸反应
取样品乙醇溶液适量，点于滤纸片上，晾干后，滴25%三氯醋酸乙醇溶液，于干燥箱内 100°C烘烤,呈红棕色。为正反应。25%三氯醋酸乙醇溶液的配制取三氯醋酸25g，加乙醇使溶解成100ml，即得。由上述验证试验结果可知，本发明所述艾叶提取物中含有黄酮类、香豆素类、内酯类、酚类、有机酸类、留体类和三萜类化合物。
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艾叶提取物的体外试验 I. I主要试验材料
I.I. I HepG2. 2. 15细胞株由广州暨南大学生物医药研究开发基地赠予，本研究室自行传代培养供实验使用。I. 1.2主要试剂拉米夫定(3TC，贺普丁片)购自葛兰素-史克制药(苏州)有限公司产品；1640培养基购自北京索莱宝生物医药科技有限公司；胰蛋白酶购自美国Amersco 公司；MTT购自美国Sigma公司；G418,购自美国invitrogen公司；HBV核酸扩增突光定量检测试剂盒，深圳匹基生物工程股份有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ELISA诊断试剂盒(酶联免疫法)，上海科华生物技术有限公司；乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) ELISA诊断试剂盒(酶联免疫法)，上海科华生物技术有限公司；DNA提取试剂盒，美国Omega公司。1.1.3主要仪器生物安全柜Hfsafe-1200TE Class II Type B2，香港力康发展有限公司；水套式二氧化碳培养箱HF160W，香港力康发展有限公司；酶标仪168-1000XC， 美国BIO RAD ;荧光PCR检测仪，美国Roche LightCyclerl. 5 ;全自动灭菌器HVE-50，日本HIRAYAMA ；96孔培养板，24孔培养板，50ml细胞培养瓶，美国corning公司；超纯水仪为 Millipore公司产品。实施例I所得艾叶提取物对细胞的毒性试验
依据Mosmann建立的MTT比色法检测实施例I所得艾叶提取物对H印G 2. 2. 15细胞的毒性。具体为细胞长满培养瓶后，加入O. 25%胰蛋白酶，消化后加入培养液吹打成单细胞,加入细胞计数板计数，浓度为2 X IO4个/mL后接种于96孔细胞培养板(每孔ΙΟΟμΙ),每个浓度设四个孔，置CO2培养箱(37°C，5. 0%C02)中培养24h。细胞长成单层后加入含有不同浓度艾叶提取物的1640培养基，并设不含艾叶提取物的正常细胞为空白对照组。连续培养72h，每孔加入20μ1含结晶紫的MTT，于CO2培养箱(37°C，5. 0% CO2)中继续培养。4h后， 弃去上清液,每孔加入200μ1 DMS0，用微量振荡器充分震荡，使结晶紫充分溶解。用酶标仪 (检测波长490nm，参考波长630nm)读取各孔OD值，记录结果。计算不同浓度艾叶提取物对 HepG 2. 2. 15细胞的抑制百分率，结果见表I。
Γ I方八f 空白对给药孔OD埴ιηηο/
_9]抑制百分率=^空白对照toffl^Xi00%
表I、不同浓度艾叶提取物对HepG2.2.15细胞的毒性作用
权利要求
1.一种艾叶提取物，其特征在于，该提取物的有效成分包括黄酮类、香豆素类、内酯类、 酚类、有机酸类、留体类和三萜类化合物。
2.权利要求I所述艾叶提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤将艾叶用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流结束后固液分离，所得液体浓缩后，经干燥即得。
3.如权利要求2所述艾叶提取物的制备方法，其特征在于，取粉碎过的艾叶1kg，用 4 IOL乙酸乙酯浸泡8h以上，然后将艾叶及浸泡液回流I 6h。
4.权利要求I所述的艾叶提取物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种艾叶提取物，该提取物的有效成分包括黄酮类、香豆素类、内酯类、酚类、有机酸类、甾体类和三萜类化合物。所述艾叶提取物经如下步骤制得将艾叶用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流结束后固液分离，所得液体浓缩后，经干燥即得。本发明所述艾叶提取物的提取方法简单，所得艾叶提取物经体外细胞试验证明具有较强的抗乙肝病毒活性，可用于制备抗乙肝病毒药物。
文档编号A61K127/00GK102600225SQ20121011761
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月20日 优先权日2012年4月20日
发明者侯迎迎, 张壮丽, 张小俊, 张艳, 张长征, 王宁, 王庆端, 王桂芳, 赵志鸿, 邹敏, 郑立运, 陈慧平, 马方, 黄勇勇 申请人:河南省医药科学研究院