专利名称：蟑螂多肽的制备及其抗革兰氏阳性及阴性菌医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种具有防治细菌感染性疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制备方法和医药用途。该有效部位多肽类活性物质可制备成水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂等形式，用于制备治疗防治革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染相关疾病的药物、日化用品或医疗器械。
背景技术：
自然界存在大量细菌。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称“金葡菌”)是格兰氏阳性球菌，是一种最常见且是对人体健康影响极大的致病菌种，引起人的主要感染有疖子、脓疱、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血症、中毒性休克综合症、淋巴结炎、咽炎、子宫颈炎、盆腔炎，以及肌肉、皮肤、尿殖道、中枢神经系统的脓肿。抗甲基西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)是20世纪80年代开始出现的耐药菌株，它是医院内和临床上微生物流行病的主要病源。链球菌(Streptococcus species)是 成链状排列、兼性厌氧的格兰氏阳性杆菌。医学上常见的致病性链球菌大部分属于3溶血型，它们存在于人的皮肤、呼吸道、消化道以及尿殖道的黏膜上，能够引起皮肤、呼吸道以及软组织感染如肺炎、菌血症、心内膜炎、脑膜炎、泌尿道炎症以及关节炎等疾病。大肠杆菌(或称大肠埃希氏杆菌)是中等大小杆菌，革兰氏染色阴性，其大小为(1-3)微米X (0.5-0. 7)微米，有鞭毛、无芽胞，有的菌株可形成荚膜，需氧或兼性厌氧，生化反应活泼、易于在普通培养上增殖，适应性强。该菌对一般消毒剂敏感，但对抗生素及磺胺类药等极易产生耐药性。大肠杆菌病是由大肠杆菌埃氏菌的某些致病性血清型菌株引起的疾病总称，其是由一定血清型的致病性大肠杆菌及其毒素引起的一种肠道传染病。一年四季均可发生，临床症状及解剖特点以下痢为主要特征，排出黄棕色水样稀粪。急性致死性感染病例一般1-2天死亡，亚急性I周左右死亡。治疗上常采用螺旋霉素、多粘菌素E、庆大霉素、硫酸卡那霉素、恩诺沙星等肌肉注射，每天2-3次连续3-5天(以上三者交替应用或合用效果更好)。大多数革兰氏阳性菌的致病物质为外毒素，而大多数革兰氏阴性菌的致病物质为其内毒素。在抗感染药物中，抗生素占90%。其它抗真菌药物、抗病毒药物和抗寄生虫病药物仅占10%。然而，在抗生素的应用中，大多数格兰仕阳性菌对青霉素敏感，而革兰氏阴性菌则大多对链霉素和氯霉素等敏感。因此，发现既能抑制革兰氏阳性菌同时又能抑制革兰氏阴性菌生长的抗菌物质，将是光谱抗菌药物开发的重要目标之一。本世纪以来，随着随着现代社会的日益发达，细菌感染的机会越来越大，手感人群活动反而越来越频繁，造成大规模感染的几率越来越大。因此也造成了抗生素的大量使用，甚至滥用。因此，抗生素的合理应用十分重要。随着多种抗生素耐药性的出现、以及超级细菌的初现端倪，使得现有一线使用的抗生素面临不能满足临床需要而全面崩溃的局面。这使得欧美发达国家投入巨资研发新的抗生素药物。除了医师自觉抵制滥用抗生素之外，确实还需要储存一大批针对变异的耐药株的抗菌药物，以便在真正发生大规模耐药菌株流行传播时人们不至于素手无策、坐以待毙。然而，随着医院临床耐药菌的增多，以及研发出的抗生素毒性和副作用越来越大，使得人们不得不将眼光转向广谱、低毒、使用安全的“绿色抗生素”。不断研发出新的植物和动物天然绿色抗生素，是十几亿人口的人口大国必须执行的一个既定政策。本研究团队以前从植物中发现许多对革兰氏阳性菌和/或阴性菌有效的植物提取部位和有效成分，更加增添了我们研发新的“绿色抗生素”、发现新的抗菌天然药物的信心。(赵昱等，具抗病毒、抗炎、和/或抗菌作用的六棱菊属提取物及其用途，ZL200510077457. 3)、(赵昱等，生姜中单萜苷类化合物及其抗菌用途和药物组合物，CN101012255 ;蒲公英中的两个黄酮苷及其抗格兰氏阳性菌的医药用途，ZL200710067180. 5 ；蒲公英中的木质素及其抗菌活性和医药用途，ZL 200710067458. 9 ;黑紫橐吾中的含氯原子艾里莫芬烷及其抗菌和细胞毒活性，ZL200710067460.6 ;蒲公英中的倍半萜内酯及其抗格兰氏阳性菌的用途，ZL200710067776. 5 ;黑紫橐吾素A及其抑制格兰氏阳性菌的医药用途，ZL200710068539. 0 ;蒲公英木质素抑制格兰氏阳性菌的制药用途，ZL 200810165728. 4)
本研究团队另外一个开发的重点领域是昆虫类抗菌肽资源。抗菌肽是自上世纪80年代以来兴起的新的抗菌药物开发领域。其是指从生物体内发现的宿主产生的一类能够抵御外界病原体感染的小分子多肽，由动物体内的分泌物、血液、淋巴组织等分离得到的大量抗菌肽，其与传统抗生素的作用机制不同，且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有不同的选择性。该研究方向引起了我们的兴趣，本研究团队着力于从抗感染能力强的种群中发现绿色抗生素，诸如抗菌肽类物质和其他有成药可能的小分子物质基础。蟑螂，为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，最常见为美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)。蟑螂入药始载于《神农本草经》,其中把它列为中品,谓“味咸、寒；治血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”(孙星衍等，《神农本草经》，商务印书馆，1955:90)。“蟑螂”为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称其为石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如偷油婆、茶婆子、灶蚂子等。蜚蠊科(Blattidae)是一个庞大的昆虫家族，在地球上已生存了 3.2亿年，与恐龙属同一时代出现的生物。无疑它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。1960年Princis曾报道蜚蠊在世界范围内约有3500种，我国已有记录的共253种(冯平章，郭予元，吴福祯，中国蟑螂种类及防治，北京中国科学技术出版社，1997年4月)。蜚蠊主要分布于热带、亚热带地区的室内或野外，而美洲大蠊是其中少数几种家居蜚蠊品种之一。美洲大蠊作为室内害虫主要栖息于厨房、食堂、仓库等处损害食物、衣服、书籍等，取食并污染人的食物，传播痢疾、伤寒、蛔虫、蛲虫等多种疾病。从厨房和仓库等收集到的226只蟑螂体表及肠道内检出致病菌25种，感染率高达 99. 9% (Pai H. H.等，Isolation of bacteria with antibiotic resistancefrom household cockroaches(Periplaneta americana and Blattella germanica),ActaTropica, 2005,93 (3) :259)。蟑螂作为害虫是城市卫生防疫部门和海关检疫部门重点防治对象之一。然而，在科技日新月异的今天，面对上千种针对它的各种杀灭剂，这一昆虫群体依然十分活跃，这表明其体内必应具有某些特殊的物质和其特有的作用机制，这一现象引起了国内外一些学者的关注。近几年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者对这一几千年来无法根绝的害虫进行了应用开发方面的研究，并取得了可喜的成就，发掘出了这一传统意义上的害虫的正面价值。我们研究团队以美洲大蠊醇提物制成的产品“康复新”，在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效。以美洲大蠊醇提物精制而成的“心脉龙注射液”，具强心升压，改善微循环，兴奋呼吸，利尿，增加心、脑、肺、肾的血流量。“心脉龙注射液”主治右心衰，也可治急慢性心衰、失血性休克、低血压、室性早博、病窦性综合症、心脑缺血性疾病，为2004年通过中国国家食品与药品监督管理局SFDA审批的国家二类新药(中药)。蓝江林等利用大肠杆菌、溴氢菊酯、昆虫生理盐水、紫外线、超声波作为诱导源进行诱导，获得具有抗菌活性的血淋巴，在经诱导的美洲大蠊血淋巴中提取分离得到抗菌肽成分。对经大肠杆菌诱导的美洲大蠊的血淋巴进行抑菌作用测试，结果发现大肠杆菌的数量在一定的测试时间内逐渐减少。该研究还通过电镜观察表明经诱导的美洲大蠊学血淋巴中的抗菌肽首先使细菌的外层及细胞质膜损伤，形成开口，导致内容物外泄而死亡，最后菌体崩解成碎片。因此认为美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌不是一般的抑菌作用，而是直接杀灭作用。(蓝江林，周先治，卓侃等，美洲大蠊(Peripla neta americana L.)抗菌肽杀菌作用初步观察，福建农林大学学报(自然科学版)，2004，33(2) :166)。对蜚蠊科昆虫澳洲大蠊(Periplaneta australasie Fabricus)全虫(去翅及足)的油状醇提取物进行的体内筛选证明澳洲大蠊提取物对S-180及人食管癌小鼠异种移植均有显著的抗癌作用(黄厚聘，程才芬，李淑芳，蟑螂油的抗癌作用，中草药，1981，12(1) :35)。陈利铭发现蟑螂提取物AT2能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，并能使脾脏重量增加，在体外可增加T淋巴细胞对Con A的转化反应。AT2治疗原发性肝癌49例，临床观察表明，本品具有缓解症状，使甲胎蛋白下降，延长患者生存期的功效(陈利铭，蟑螂提取物AT2抗癌作用的临床及实验研究，中西医结合杂志，1986，(11):648)。在临床应用方面，蟑螂活虫提取物治疗原发性肺癌有良好效果。廖剑英以“康复新”治疗恶性纤维组织细胞瘤，取得良好效果(廖剑英，康复新治疗恶性纤维组织细胞瘤I例，大理学院学报，2003，2 (3) :92)。有相关报道表明蟑螂提取物在抗肿瘤的同时具有一定的增强免疫功能的作用(罗志宏，占汉章，李艳红等，中药康复新在头颈部恶性肿瘤治疗中的作用观察，中国中西医结合耳鼻咽喉科杂，1998,6(3) :132 ;严奉祥等，中药康复新的在体免疫药理学特征，大理医学院学报，1991，3(1):21)。对美洲大蠊在制药方面的研究多集中于美洲大蠊中的粗提物，李树楠等从美洲大蠊的醇提物中除去油脂，用二氧化碳吸附后除去色素和过敏成分，用于治疗心血管疾病(国家发明专利CN 1067243C);刘耀北等用乙酸提取蟑螂提取物，对肝癌细胞BEL7404和BEL7721进行癌细胞增殖抑制试验，发现粗提物可以有明显抑制癌细胞生长的作用(国家发明专利CN 1199991C);廖吉等报道了用6号提取液从蜚蠊虫体中制备降脂、调节胆固醇、调节血糖、防治肿瘤和预防心血管疾病、抗风湿作用的保健食品(国家发明专利CN1230183C)；严少宏等阐述了一种美洲大蠊粗浸膏的优化提取方式(国家发明专利CN1255117C);徐燕和公开了一种类似的粗浸膏制备方法(国家发明专利CN 1548058A);严少宏等公开了一种美洲大蠊粗浸膏综合利用的的提取方式(国家发明专利CN 1593467A)。以上专利都未公开美洲大蠊抗菌药用有效部位的方面的应用。发明人所在研究团队对蟑螂进行了十余年的研究；所研发的“康复新”、“心脉隆注射液”、“肝龙注射液”取得了 3只国家新药证书，产品已经上市销售。在我们对美洲大蠊的后续研究中；我们还发现用醇水混合溶剂溶剂提取美洲大蠊虫体具有体外抗单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的功效(王晓雨，刘光明，宋丽艳等，“美洲大蠊有效部位的用途”，ZL200810060885.9)。但是，该专利中使用的是大孔树脂作为分离材料；对于多肽类分子量并无选择性；而对于化学实体应用于制备药物时的质量控制，希望得到分子量在一定范围内的多肽，以便利于质量控制。而蓝江林等研究的美洲大蠊抗菌肽是以大肠杆菌诱导美洲大蠊，使其血淋巴中产生抗菌物质，然后再从血淋巴中提取分离抗菌肽。该过程复杂，且无法提供足量的抗菌肽作为进一步研究开发的物质基础。因此，寻找美洲大蠊体内固有的抗菌物质以便进一步开发利用仍十分必要。我们为了寻找抗菌活性更强和质量更易于控制的总多肽类有效部位，尝试应用先进的膜分离法对美洲大蠊提取物进行了活性筛选下的抗菌有效活性部位研究；并同时用革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌予以测试，最终发现了用<5KDa的生物膜进行分离，能得到新的广谱抗菌活性有效部位；产率比用大孔树脂法得到提高，且质量控制更为精准。同时，我们还针对该活性部位进行抗菌实验，最终发现用<5KDa的生物膜分离法得到的既能抗革兰 氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌)、又能抗革兰氏阴性菌(大肠杆菌)双重抗菌活性的蟑螂多肽类有效部位。经查新发现，以往均无由美洲大蠊醇提物经膜分离法得到的提取物作为主药进行配制的药物制剂的相关报道，更无运用上述制剂用于广谱抗菌的文献报道。从而构成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供了一种蟑螂中提取的分子量小于5000道尔顿的活性物质有效部位；本发明的另一目的是提供了一种制备蟑螂中提取的分子量小于5000道尔顿的活性物质有效部位的方法；本发明的另一目的是提供了将美洲大蠊提取物有效部位用于制备既能抗革兰氏阳性菌又能抗革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物、日化用品、医疗器械的用途；本发明的又一目的是提供了一种含有美洲大蠊提取物有效部位用于制备防治细菌感染的多种制剂形式，包括水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂。根据本发明人深入的研究，发现美洲大蠊的抗菌活性成分可以通过工艺优化得到富集，本发明人采用水或水醇溶剂提取得到的美洲大蠊醇提物辅以孔径大小一定的超滤膜进行超滤，得到分子量小于5000道尔顿的有效部位(即<5KDa部位)，具体而言，本发明中美洲大蠊具抗菌活性的有效部位的制备方法如下用水或有机溶剂及缓冲溶剂提取经粉碎或未粉碎的美洲大蠊虫体，浓缩提取回收溶剂，特定浓缩比/特定转速和PH值下进行超滤膜分离纯化；得到的分子量小于5KDa的多肽类活性有效部位经减压浓缩至无醇味，减压浓缩或冷冻干燥，粉碎得产品。本发明中的动物药材可以是蟑螂任一部位，即可以是美洲大蠊(Periplanetaamericana)头、身、翅，也可以是它们的混合物，优选全虫。可以是干燥全虫，也可以是未经干燥的全虫或活体全虫。本发明得到的美洲大蠊醇提物经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位具有重要的生物活性，体外具有明显的抑制革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌)以及抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的活性；其抑制革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的活性高于粗提物。急性毒性试验进一步证实，ICR小鼠口服该有效部位具有相当的安全性。以上均说明美洲大蠊醇提物经经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位有可能发展成为新的广谱抗菌类药物、日化用品或医疗器械。说明本发明所提供的以超滤膜分离制备方法得到分子量小于5000道尔顿的多肽类有效部位具有创造性和新颖性,据此完成本发明。本发明中所述及的美洲大蠊醇提物经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位可以与药学上 常用的辅料或载体结合，制备得到具有广谱抗菌功效的水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂、泡沫凝胶，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明的美洲大蠊醇提物经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位或其可药用盐还可以与现已上市的金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌抑制剂和/或其他治疗类似革兰氏阳性菌感染相关病症的治疗药物及其原料药如头孢类、大环内酯类、以及磺胺类如沙星等药物品种联合使用或交叉使用，制备得到具有抗病菌感染的组合物或复方制剂，可预期成为治疗革兰氏阳性菌感染疾病药品、保健品、日化用品和医疗器械。上述各类药物组合物或者药品、保健品、日化用品和医疗器械可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。本发明的美洲大蠊醇提物经超滤膜分离得到的分子量小于5KDa的多肽类有效部位或其可药用盐还可以与现已上市的大肠杆菌抑制剂和/或其他治疗类似革兰氏阴性菌感染相关病症的治疗药物及其原料药如螺旋霉素、多粘菌素E、庆大霉素、硫酸卡那霉素、恩诺沙星等药物品种联合使用或交叉使用，制备得到具有抗病菌感染的组合物或复方制剂，可预期成为治疗革兰氏阴性菌感染疾病药品、保健品、日化用品和医疗器械。上述各类药物组合物或者药品、保健品、日化用品和医疗器械可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓齐U、膜剂、滴丸剂、水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。本发明的有益之处在于本发明使用超滤膜分离法制备出美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽类有效部位，其原料来源方便易得、制备步骤简便、利于产业化。超滤膜分离法产率高，且生理活性更为广泛，该多肽有效部位具有显著的抑制的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的药效活性，对于开发市场广大的广谱抗菌药物、日化用品和医疗器械提供了新的物质基础，通过规范化养殖蟑螂又能给连片特困地区的农民增加收入、脱贫，具有潜在的社会效益和经济效益。
具体实施方案为了更好地理解本发明的实质，下面分别用实施例说明采用超滤膜分离法制备出美洲大蠊醇提物中分子量小于5KDa的多肽类有效部位，及其对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌抑制作用的药理实验结果，说明其在抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌研究领域中的新用途。本发明还用该活性提取物进行了 ICR小鼠的口服灌胃急性毒性试验，说明该有效部位对动物的毒性，由此来反映在人体使用时的安全性。若无特别说明，本发明的百分比指的是重量百分比。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例I :美洲大蠊水提物经超滤膜分离法富集分子量小于5KDa的多肽类有效部位(样品A)的制备I. I美洲大蠊水提物的制备美洲大蠊药材3公斤，加双蒸水10000毫升，45° C浸泡提取I次，24小时；50° C浸泡提取I次，24小时；55°C浸泡提取I次，24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊水提物。I. 2采用5KDa超滤膜过滤正交试验制备样品A经对影响膜分离效果的因素进行单因素试验，确定影响因素是转速、时间、pH值、 浓缩比，并最终确定影响因素范围。根据单因素实验结果，设计正交实验方案，确定最佳工艺。I. 2. I不同pH值对超滤效果的影响将I. 2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，采用一定浓度的氢氧化钠或盐酸溶液调节其PH值分别为8、9、10和11四个梯度，浓度为0. 3毫克/毫升(mg/mL)，转速为2500转/分钟(r/min)，时间分别为10、20、30、40、50和60分钟(min)、考察对超滤效果的影响。I. 2. 2不同浓缩比对超滤效果的影响将I. 2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，采用不同量溶解，使其浓缩比分别为0. 2,0. 3,0. 4和0. 5mg/mL四个梯度，转速为2500r/min, pH值为9，时间分别为10、20、30、40、50和60min、考察对超滤效果的影响。1.2. 3不同转速对超滤效果的影响将I. 2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，使其转速分别为1500、2500、3500和4500r/min四个梯度，浓度为0. 3mg/mL, pH值为9，时间分别为10、20、30、40、50和60min、考察对超滤效果的影响。I. 2. 4不同时间对超滤效果的影响将I. 2项下制备得到的美洲大蠊水提物溶解，使其时间分别为10、20、30、40、50和60min六个梯度,浓度为0. 3mg/mL, pH值为9,转速为2500r/min,考察对超滤效果的影响。通过以上单因素试验，确定其主要影响因素及其范围分别是浓缩比(0. 2,0. 3和0. 4mg/mL)、转速(2500、3500 和 4500r/min)和 pH 值(9、10 和 11)。I. 2. 5用三因素三水平正交实验验证出最佳提取参数通过三因素三水平正交实验，推断出超滤提取最佳组合是转速4500r/min、pH= 11 和浓度为 0. 3mg/mL。I. 2. 6分子量<5KDa多肽样品制备美洲大蠊水提物300毫克,用水1000毫升溶解；调制其pH值为11后,倾入置有孔径为5KDa的超滤膜的超滤装置中，以4500r/min转速超滤30分钟。滤液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽样品(65毫克)，收率21. 7%。I. 2. 7SDS-PAGE电泳检测样品A的分子量部分仪器与试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris) =Solarbio公司；十二烷基硫酸钠(SDS) :Sigma公司；甘氨酸Solarbio公司；丙烯酰胺Amresco公司；N，N'-亚甲基双丙烯酸胺Amresco公司；TEMED Bio Basic Inc.公司;N_三轻甲基甲基甘氨酸(Tricine)Solarbio公司；P-巯基乙醇Bio Basic Inc.公司；溴酚蓝生工生物工程(上海)有限公司；超低分子量标准蛋白标记(Marker，3. 3-20. IKDa) =Solarbio公司；考马斯亮蓝G-250 Solarbio公司；考马斯亮蓝R-250 Solarbio公司；3-(环己胺)-I-丙磺酸钠(CAPS)Solarbio公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF) =Solarbio公司；HD_3型紫外检测仪上海沪西分析仪器厂有限公司；HD-A型电脑采集器上海沪西分析仪器厂有限公司；QL-866型旋涡混合器海门其林贝尔仪器制造有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳系统Bio-Rad公司；TS-1型脱色摇床海门其林贝尔仪器制造有限公司；In Genius LHR型凝胶成像分析系统Gene公司。采用SDS-PAGE法，双垂直电泳槽，分离胶的质量分数为15%，浓缩胶的质量分数为3. 5%，供试品上样量为10微升，浓缩胶电压为10mA，分离胶电压为20mA。采用考马斯亮蓝染色法。与标准低分子量蛋白质marker比较，确认由上述方法制备而得的美洲大蠊水提物超滤膜分离后得到的样品95%以上为分子量<5KDa的物质。 I. 2. 8SDS-PAGE电泳检测样品A的性质采用Folin-酚试剂法(Lowry法)测定样品A中蛋白质的含量为65%。将样品A按照标准方法水解后与标准氨基酸以HPLC法比对后确定，该分子量<5KDa多肽样品由17种常见氨基酸组成。I. 3与用D-IOl大孔树脂法得到的活性部位之收率比较I. 3. I按照专利ZL 200810060885. 9公开的内容制备样品B(I)美洲大蠊药材3公斤，加55%乙醇10000毫升，室温浸泡提取，提取3次，每次24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。(2)取得到的美洲大蠊醇提物20克，用30克D-IOl大孔吸附树脂吸附拌样，上200克D-IOl大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至无色，续用30 %乙醇-水溶液洗脱至无色，取洗脱液10毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，即得提取物(11-30)[美洲大蠊醇提物D-IOl大孔吸附树脂柱层析30%醇洗液];续用60%乙醇-水溶液洗脱至无色，取洗脱液10毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，得提取物(11-60)[美洲大蠊醇提物D-IOl大孔吸附树脂柱层析60%醇洗液]，即样品B。I. 3. 2样品B收率将上述方法制备得到的提取物11-30与11-60称重，分别为2. 96克和724. 9毫克。针对美洲大蠊醇提物20克而言，提取物11-60 (即样品B)的收率为3.6%。而按照本实施例之超滤膜法，300毫克美洲大蠊粗提物经超滤膜操作后得到65毫克有效部位，收率为21. 7% ;显而易见，以超滤膜法进行对多肽部位的富集，损失小，收率大大提高(为大孔树脂方法制备得到的样品之6倍)。I. 4与用D-IOl大孔树脂法得到的活性部位的分子量之比较I. 4. I将上述I. 3项制备得到的样品B (11-60 [美洲大蠊醇提物D-IOl大孔吸附树脂柱层析60%醇洗液])按照本实施例I. 2. 7项所描述之SDS-PAGE电泳法检测分子量，以超低分子量标准蛋白Marker (3. 3-20. IKDa)为对照，可知样品B中分子量<5KDa的物质占52% ;而5-15KDa者为38% ;>15KDa者占10%。与美洲大蠊水提物超滤膜分离后得到的有效部位样品95%以上为分子量<5KDa的物质相比，用D-IOl大孔树脂法得到的活性部位分子量分布较为分散，质量控制上不如用超滤膜方法得到的分子量集中的多肽部位容易受到控制。实施例2 :美洲大蠊醇提物经超滤膜分离法富集分子量小于5KDa的多肽类有效部位(样品C)的制备2. I美洲大蠊醇提物的制备美洲大蠊药材3公斤，加55%乙醇10000毫升，室温浸泡提取，提取3次，每次24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。2. 2分子量<5KDa多肽活性物质(样品C)的制备依照实施例I中正交试验优选出的提取参数，取2. I制备得到的美洲大蠊醇提物 300毫克,用温水1000毫升溶解；调制其pH值为11后,倾入置有孔径为5KDa的超滤膜的超滤装置中，以4500rpm转速超滤30分钟。滤液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽样品(69晕克)，收率23%。2. 3SDS-PAGE电泳检测样品C的分子量仪器与试剂同实施例I。采用SDS-PAGE法，双垂直电泳槽，分离胶的质量分数为15%,浓缩胶的质量分数为3. 5%,供试品上样量为10微升,浓缩胶电压为IOmA,分尚胶电压为20mA。采用考马斯亮蓝染色法。与标准低分子量蛋白质marker比较，确认由2. 2方法制备而得的样品C其93%以上为分子量<5KDa的物质。2. 4SDS-PAGE电泳检测样品C的性质采用Folin-酚试剂法(Lowry法)测定2. 2方法所制备出之样品C中蛋白质的含量为66%。将样品C按照标准方法水解后与标准氨基酸以HPLC法比对后确定，该分子量<5KDa多肽样品由17种常见氨基酸组成。实施例3 :美洲大蠊丙酮-水提物经超滤膜分离法富集分子量小于5KDa的多肽类有效部位(样品D)的制备3. I美洲大蠊丙酮-水提物的制备美洲大蠊药材3公斤，加70%丙酮水溶液10000毫升，室温浸泡提取，提取3次，每次24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊丙酮-水提物。3. 2分子量<5KDa多肽样品(样品D)的制备依照实施例I中正交试验优选出的提取参数，取2. I制备得到的美洲大蠊丙酮-水提物300毫克，用温水1000毫升溶解；调制其pH值为11后，倾入置有孔径为5KDa的超滤膜的超滤装置中，以4500rpm转速超滤30分钟。滤液真空干燥，即得分子量<5KDa多肽样品(67毫克)，收率为22. 3%。3. 3SDS-PAGE电泳检测样品D的分子量仪器与试剂同实施例I。采用SDS-PAGE法，双垂直电泳槽，分离胶的质量分数为15%,浓缩胶的质量分数为3. 5%,供试品上样量为10微升,浓缩胶电压为IOmA,分尚胶电压为20mA。采用考马斯亮蓝染色法。与标准低分子量蛋白质marker比较，确认由3. 2方法制备而得的样品D其90%以上为分子量<5KDa的物质。3. 4SDS-PAGE电泳检测样品D的性质采用Folin-酚试剂法(Lowry法)测定3. 2方法所制备的样品D中蛋白质的含量为61%。将样品D按照标准方法水解后与标准氨基酸以HPLC法比对后确定，该分子量<5KDa多肽样品由17种常见氨基酸组成。
实施例4 :美洲大蠊不同提取物中制备出的分子量<5KDa多肽样品抑制格兰氏阳性菌能力检测4. I 原理采用“管碟法”研究试验药物的体外抗菌活性，利用加在牛津杯中的试验药物扩散到接种有试验菌的培养基中，从而抑制细菌的生长。通过检测在牛津杯周围形成的抑菌圈的直径大小来确定试验药物的抗菌活性。4. 2 检测菌金黄色葡萄球菌26003-23，购自中国药品生物制品检定所。乙型溶血性链球菌32210，购自中国药品生物制品检定所。
4. 3试验药物及仪器4. 3. I试验药物DMSO DMS0 溶剂对照；阳性对照药物诺氟沙星2. 5mg/mL ；测试样品来自实施例1-3中制得的四种样品(样品A :1. 2. 6所述之美洲大蠊水提物经超滤膜制备的分子量<5KDa多肽样品；样品B :1. 3. I所述之美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60%醇洗液；样品C :实施例2中依2. 2法制得的美洲大蠊醇提物中分子量<5KDa多肽样品；样品D :实施例3中依3. 2法制得的美洲大蠊丙酮_水提物中分子量<5KDa多肽样品)。样品用DMSO溶解并配置成2. 5mg/mL。4. 3. 2 仪器CO2培养箱美国Shellab公司产品；XD-2倒置显微镜重庆光电仪器有限公司产品；生物安全柜美国LABC0NC0公司产品；LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂产品。4. 4方法与步骤4. 4. I制备M-H琼脂、M-H肉汤及试验菌液。4. 4. 2双碟的制备(I)M-H琼脂底层取灭菌M-H琼脂液体自然冷却凝固。(2) M-H琼脂菌层取菌液150微升(ill)与30毫升(mL)的M-H琼脂混匀。取约5mL含菌液琼脂，均匀摊布在具有M-H琼脂底层的平皿内。4. 4. 3待培养基凝固后，在每个平皿中均匀放立加满试验药液牛津杯。4. 4. 4 置 37°C培养 24 小时。4.4. 5用游标卡尺测量抑菌圈直径。4. 5 结果样品A-D及阳性对照药物诺氟沙星抑菌试验结果见表I。表I.样品A-D及诺氟沙星(2. 5mg/mL)对标准致病菌的抑菌圈直径(毫米mm)
权利要求
1.一种从蟑螂中提取的抗菌活性物质用于制备防治细菌感染性疾病的药物用途，其特征是所述活性物质是分子量小于5000道尔顿的多肽；细菌是指革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌；所述药物用途通过药物制剂、医疗器械、日化用品形式体现。
2.根据权利要求I的药物用途，其中细菌性感染性疾病是指革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌或乙型溶血性链球菌感染所致的病症，或革兰氏阴性菌中的大肠杆菌感染所致病症。
3.根据权利要求2的药物用途，金黄色葡萄球菌感染所致的病症是指疖子、脓疱、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血症、中毒性休克综合症、淋巴结炎、咽炎、子宫颈炎、盆腔炎，以及肌肉、皮肤、尿殖道、中枢神经系统的脓肿中的一种或多种。
4.根据权利要求2的药物用途，乙型溶血性链球菌感染所致的病症是指皮肤、呼吸道 或软组织感染引起的肺炎、菌血症、心内膜炎、脑膜炎、泌尿道炎症或关节炎。
5.根据权利要求2的药物用途，大肠杆菌感染所致病症是指致病性大肠杆菌或其毒素引起的肠道炎症或下痢。
6.根据权利要求I的药物用途，其特征是所述药物制剂、医疗器械、日化产品的形式是水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂。
7.一种制备权利要求I中所述活性物质的方法，其特征为用超滤膜分离法截取蟑螂提取物中分子量小于5000道尔顿的物质；其中蟑螂提取物是指蜚蠊科昆虫蟑螂虫体经水或有机溶剂及缓冲溶液提取出的物质。
8.一种具有抗革兰氏阳性菌感染和/或抗革兰氏阴性菌感染的药物组合物，其特征是该药物组合物含有治疗有效量的根据权利要求I的活性物质、药用辅料、可药用载体或外伤敷料。
9.一种具有抗革兰氏阳性菌感染和/或抗革兰氏阴性菌感染的饲料添加剂组合物，其特征是该饲料添加剂组合物含有根据权利要求I的活性物质。
全文摘要
本发明涉及蟑螂多肽的制备及其抗革兰氏阳性及阴性菌医药用途。具体而言，本发明涉及一种具有防治细菌感染性疾病功能的蟑螂提取物有效部位及其制备方法和医药用途。本发明的美洲大蠊提取物有效部位是分子量小于5000道尔顿的多肽类物质，由蜚蠊科美洲大蠊(Periplaneta americana)虫体鲜品或干品经溶剂提取和膜分离法精制而成，该有效部位多肽类活性物质具有明显的抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌活性，可制备成水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂形式，用于制备防治革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染相关疾病的药物、日化用品以及医疗器械。
文档编号A61K35/64GK102743741SQ201210137410
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月6日 优先权日2012年5月6日
发明者巫秀美, 杨荣新, 赵昱, 钱金栿, 高鹏飞 申请人:大理学院