专利名称：制备h因子浓缩物的方法及其药物形式的用途的制作方法
制备H因子浓缩物的方法及其药物形式的用途 本申请是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/FR2006/002693，国际申请日是2006年12月7日，中国国家申请号为200680052193. 9，进入中国的日期为2008年8月I日，发明名称为“制备H因子浓缩物的方法及其药物用途”。本发明涉及H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征(HUS)的药物的用途，本发明还涉及从冷冻的新鲜血浆中纯化H因子的方法，本发明还涉及由上述方法获得的H因子。
背景技术：
溶血性尿毒症综合征(HUS)以微血管溶血性贫血、血小板减少症和肾脏病变的联合出现为特征。它是3岁以下儿童的肾衰竭的主要原因。存在两种形式的HUS。
典型形式的HUS出现于患者出血性腹泻发作后的夏季。在大多数病例中，典型性HUS是感染的继发症，所述感染的病原为肠道致病性大肠杆菌(Escherichia coli),特别是产生志贺菌毒素(verotoxins)的0157:H7血清型。除了典型形式之外，某些患者还具有一些不同的表现。非典型性HUS的出现没有前驱症状，并且具有更慢性的病程，经常可导致慢性肾衰竭。非典型性HUS可出现于任何年龄。它仅占儿童HUS病例的5%。所述综合征的临床指征归因于小血管中出现的富含血小板的微小凝块。这特别影响到肾小球，从而导致急性肾脏病症。典型性HUS通常为家族性的，但是也可能为散发性。在上述两种情况中，疾病通常产生复发性的恶化。疾病的预后较差。而且，在肾移植后复发该疾病的风险也很高，这在大多数病例中会导致对移植物的排斥。HUS中可并发补体减少症。补体在防御生物体免受病原体侵害以及炎症过程中起着关键作用。补体包括血浆蛋白和多种不同的细胞表面受体，以及保护宿主细胞免受自身攻击的膜调节蛋白，所述细胞表面受体中一部分存在于炎性细胞表面，另一部分存在于免疫系统的细胞表面。补体的血浆蛋白大约有20种，它们的功能可为酶类或结合蛋白或调节蛋白(抑制物或激活物)。补体可通过如图3所示的两种不同的途径被激活常规途径和替代途径。在图3中，酶促步骤用粗箭头表示。框中的蛋白为调节蛋白膜蛋白用粗体表示，循环蛋白用斜体表示(H因子就属于这一类，表示为FH)。常规途径由抗体与外源颗粒的结合激活。因此它要依赖于抗体。替代途径由微生物的入侵激活；因此它不依赖于抗体，并且在宿主抵抗细菌感染的过程中极为重要。H因子是一种155kDa的蛋白质，它在血浆中的浓度为110-615 y g/mL。它在肝脏、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和血小板中合成。这种蛋白的分泌形式由20个相同的亚基组成，每个亚基为60个氨基酸。H因子是补体的替代途径中最重要的调节因子。它参与血液中免疫复合物水平的调节，因此，其生成过程和其降解过程之间为一种平衡状态。H因子与I因子一起使游离的和结合在细胞表面的C3b分子失活。这样，由抗原-抗体复合物和C3b补体组分结合形成的免疫复合物就不能再激活补体(组分C5-C9)后续的级联反应。H因子的功能主要可分为以下三种活性I)首先，H因子是I因子的辅助因子。因此，H因子和I因子一起通过切割C3b的蛋白链而将补体的C3b蛋白转化为C3bi (无活性的分子)。这样无活性的C3 b蛋白就不能再发挥其补体过程中的作用，也不能再参与形成C3转化酶；2)H因子参与与内皮细胞和血小板的结合机制；3)最后，H因子在补体激活的替代途径中参与预形成的C3转化酶(C3bBb)的解离。这最后一种活性直接依赖于H因子的分子完整性，已证实这一活性特别依赖于H因子中存在的asn323-asn324键的完整性。缺少H因子的缺陷导致了许多非典型性HUS的病例，因此导致了补体的过度激活，这表现为某些患者的肾脏组织活检中观察到的C3蛋白沉积和血流中存在的C3蛋白水平下降。在某些患有非典型性HUS的患者中，仅在疾病的急性期观察到C3水平降低。有很强的论据支持这一论点在非典型性HUS的病原学中，定性和定量的H因子缺乏通常会引起 C3 水平的下降。(Rougier N，Kazatchkine MD, et al. , Human complementfactor H deficiency associated with hemolytic uremic syndrome, J. Am.Soc.Nephrol.1998:9:2318-2326)。H因子缺乏会引起补体替代途径的永久性激活，这又会引起C3水平的降低。已经证实，编码补体调节蛋白的区域，特别是位于染色体I上的编码H因子的区域，与非典型性 HUS 有关(Noris et al. , Hypocomplementemia discloses geneticpredisposition to hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenicpurpura:role of Factor H abnormalities, J. Am. Soc. Nephrol. 1999，10:281-293) ; (Warwicker et al. , Genetic studies into hemolytic uremic syndrome, Kidney Int. , 1998;53:836-844); (Warwicker et al. , Familial relapsing hemolytic uremic syndrome andcomplement Factor H deficiency，Nephrol. Dial. Transplant.，1999;14:1229-1233)。然后，在隐性或显性常染色体遗传的家族性HUS病例中发现了 H因子的基因突变(Buddies et al.，Complement Factor H gene mutation associated withautosomal recessive atypical hemolytic uremic syndrome, Am. J. Hum. Genet.，2000;66:1721-1722);(Caprioli et al，The molecular basis of familial hemolyticuremic syndrome:mutation analysis of Factor H gene reveals a hot spot inshort consensus repeat 20，J.Am.Soc.Nephrol. 2001;12:297-307) ; (Ohali etal. , Hypocomplementemic autosomal recessive hemolytic uremic syndrome withdecreased Factor H，Pediatr. Nephrol. 1998;12:619-624);(Ying et al.，ComplementFactor H gene mutation associated with autosomal recessive atypical hemolyticuremic syndrome, Am. J. Hum. Genet. 1999; 65:1538-1546)。
在患有非典型性HUS的患者病例中，观察到在移植后复发的比例大约有25%。这种复发病例的预后较差；一般规律是复发后会引起移植物的功能丧失。
现有技术远在补体在HUS中的作用被发现之前的上世纪70年代，人们已经经验性地进行了最初的治疗尝试，这种治疗主要为冷冻新鲜血浆的灌注，可以伴随或不伴随血浆交换。目前，伴随或不伴随血浆交换的冷冻新鲜血浆的灌注已被广泛应用于HUS的治疗。然而，冷冻新鲜血浆的灌注量和灌注频率仍然是根据经验确定的。这种灌注应以一定时间间隔重复进行，频率可为一周两次至一个月两次，每次灌注持续2-3小时。因此，这种治疗对于患者而言是漫长而重复的。
输入的冷冻新鲜血浆的量是很重要的，这会提高冷冻新鲜血浆灌注的标准风险。首先，冷冻新鲜血浆(FFP)含有抗A或抗B型溶血素，这就限制了它只能用于相同的ABO血型的患者或至少是用于没有溶血素相应的A或B型抗原的患者(相对于红细胞的相容性规则)。违背这一规则将使受血者发生因ABO不相容导致的红细胞输血后溶血。此外，为了避免针对Rhesus系统的D抗原的同种异体免疫的任何风险，特别是对于高危患者(少女、育龄妇女或多次输血的患者)而言，灌注要求患者和供体的D抗原必须具有相同的特征。其次，由于FFP特别是病毒灭活血衆(viro-attenuated plasma (VAP))中的磷酸浓度很高(9-12mmol/L)，而且HUS患者可能患有肾衰竭，因此FFP可能使HUS患者发生高磷酸盐血症。除了 VAP中的高磷酸浓度之外，可导致输注VAP的患者发生高磷酸盐血症的更重要因素有——输注的VAP体积较大，—每天重复输注，——患者已患有肾衰竭，——患者已患有高磷酸盐血症。再次，FFP的灌注量可导致蛋白载量过高和/或柠檬酸盐载量过高，这会使得循环系统中的钙浓度降低。最后，FFP有导致变态反应和病原体传播的风险。事实上，现有的检测和灭活方法的灵敏度和灭活能力有时不够强，难以检测和除去冷冻新鲜血浆中潜在存在的病原体。当灌注体积过大以至于难以通过排尿作用排出并保持正常的动脉压时，就必须联合进行血浆交换与冷冻新鲜血浆的灌注。而这种联合治疗又另外带来很大风险，这主要是由于通过血管(必须通过中央途径)、体积过载、过敏性反应、凝血问题和病毒性疾病的传播。此外，血浆交换很难在儿童身上进行。另一种疗法为肾移植。然而，移植后复发的风险很高。此外，在肾移植后对HUS患者(非典型性HUS)的诊断很困难。对移植物进行活检很难将复发和急性血管排斥或慢性排斥区分开。对复发的治疗手段主要为冷冻新鲜血浆的灌注、血浆交换或二者相结合，但是治疗效果很难预料。这种效果的难以预料可能是由于FFP灌注的次数和体积，每次灌注使用的都是几个供体捐献的混合物，各批次上并不均一。由于H因子是在肝脏中合成，因此从逻辑上看可能可以进行肝移植或肝-肾联合移植。是否进行这种移植对于医生和患者父母而言经常是很艰难的选择，手术本身就有风险，而且还有任何肝移植都会产生的排斥的风险。
发明内容
为寻找能克服现有技术缺陷的解决方法，本申请的申请人令人惊异地发现可以使用H因子来制备用于治疗HUS的药物。例如以来源于冷冻新鲜血浆的H因子浓缩物的形式使用H因子，可以作为一种安全、稳定和有效的产品，在降低注射体积和注射次数的前提下治疗HUS患者的H因子缺陷。 特别地，通过在肝移植后的一段时期内立即给予H因子，可以有效补偿所移植的肝脏H因子较低的产量，从而补偿移植物的立即复发和排斥。本发明还涉及纯化H因子的方法，包括下述步骤I)制备血浆的冷沉淀物的上清液，2)对所述上清液在阴离子交换型凝胶/树脂上进行色谱分析，3)对非保留级分在包括肝素型移植配体(ligand greffe)的凝胶/树脂上进行色谱分析，4)在步骤3)的色谱之后调整非保留级分的pH值，以使得H因子与包括肝素型移植配体的色谱载体凝胶/树脂相结合，5)用离子强度大于凝胶/树脂平衡缓冲液的缓冲液洗脱H因子，6)稀释洗脱下的级分，然后对其在强酸型阳离子交换型凝胶/树脂上进行色谱分析，7)用离子强度大于凝胶/树脂平衡缓冲液的缓冲液洗脱H因子，8)稀释洗脱下的级分，然后对其在强酸型阴离子交换型凝胶/树脂上进行色谱分析，9)洗涤凝胶/树脂并洗脱H因子，10)制备H因子的浓缩物。
图1 :纯化H因子的方法的示意图；图2 :C3转化酶通过H因子的解离。
图3 :对补体的两种不同的激活途径常规途径和替代途径。
具体实施例方式本发明的主要目的是提供H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征(HUS)的药物的用途，所述溶血性尿毒症综合征(HUS)具体为典型性HUS或非典型性HUS。本发明的一个优选实施方案为H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征的药物的用途，所述H因子是从新鲜人类血浆中纯化，或者从由本领域技术人员公知的标准方法纯化而得的血浆级分中纯化。这种纯化是本领域技术人员公知的。纯化可以通过色谱进行，可使用赖氨酸-琼脂糖柱、QAE-Sephadex 柱、DEAE-Toyopearl 柱、Sephacryl S-300 柱和轻基憐灰石柱。纯化方法在下述文献中有详细记载Fearon，J.1mmunol. 119，1248-1252(1977) ;Crossley et al. , Biochem. J. , 191, 173-182, (1980) ; Nagasawa et al. , J.1mmunol. , 125, 578-582，(1980) ; Weiler et al.，P. N. A. S.，73，3268-3272，(1976)和 Whaley et al.，J. Exp.Med.，144，1147-1163(1976)。从冷冻新鲜血浆中纯化得到的H因子可以以例如H因子浓缩物的形式存在。本发明的另一个优选实施方案为H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征的药物的用途，所述H因子是通过在细胞中表达H因子基因的基因工程方法获得，所述细胞选自 细菌、酵母、真菌或哺乳动物细胞。本发明的一个具体实施方案为H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征的药物的用途，由此获得的药物为冻干形式的药物。本发明的另一个实施方案为H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征的药物的用途，由此获得的药物要经过至少一种方法的处理，以除去或灭活至少一种病原体。病原体可包括病毒和非常规传染原(NCTA)，例如朊病毒蛋白质。特别地，所述药物可经过病毒灭活。“病毒灭活”指的是所述药物经过至少一种本领域技术人员已知的灭活方法的处理，例如通过用化学品例如溶剂/洗涤剂处理，和/或用热处理(例如干热法或巴氏消毒法)，和/或纳米过滤处理。可被上述任一方法灭活的病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、B19细小病毒、巨细胞病毒(CMV)、猪细小病毒、脊髓灰质炎病毒和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等等。本发明的另一目的是提供例如冻干的和例如上述的病毒灭活的药物组合物，所述组合物包括H因子和可药用的赋形剂和/或载体。本发明的另一目的涉及一种纯化H因子的方法，包括下述步骤I)制备血浆的冷沉淀物的上清液，2)对所述上清液在阴离子交换型凝胶/树脂上进行色谱分析，3)对非保留级分在包括肝素型移植配体的凝胶/树脂上进行色谱分析，4)在步骤3)的色谱之后调整非保留级分的pH值，以使得H因子与包括肝素型移植配体的色谱载体凝胶/树脂相结合，5)用离子强度大于凝胶/树脂平衡缓冲液的缓冲液洗脱H因子，6)稀释洗脱下的级分，然后对其在强酸型阳离子交换型凝胶/树脂上进行色谱分析，7)用离子强度大于凝胶/树脂平衡缓冲液的缓冲液洗脱H因子，8)稀释洗脱下的级分，然后对其在强酸型阴离子交换型凝胶/树脂上进行色谱分析，9)洗涤凝胶/树脂并洗脱H因子，10)制备H因子的浓缩物。
在本发明的一个具体实施方案中，步骤3)中的包括肝素型移植配体的色谱载体为肝素琼脂糖凝胶/树脂。在本发明的一个具体实施方案中，步骤4)中的包括肝素型移植配体的色谱载体为肝素琼脂糖凝胶/树脂. 在本发明的一个具体实施方案中，步骤6)中的强酸型阳离子交换型凝胶/树脂色谱为SP琼脂糖型色谱。在本发明的一个具体实施方案中，步骤8)中的强酸型阴离子交换型凝胶/树脂色谱为Q琼脂糖FF型色谱或其等同物。
有利地，应将步骤4)中的非保留级分的pH值调节至pH 5. 5至pH 6. 5的范围内，优选地调节至pH等于6. O。 有利地，应将步骤8)中的稀释级分的pH值调节至pH 6. 5至pH 7. 5的范围内。本发明的纯化方法是用于纯化来自血浆的H因子的可工业化应用的首创方法，使用该方法可以在不需要化学品或合成蛋白酶抑制剂的条件下获得纯化的H因子浓缩物，这样就不会在终产物中遗留下任何痕量的上述抑制剂。事实上，现有技术中已知的从血浆中纯化H因子的方法都只是在基础的前瞻性研究中使用，这些方法中有的使用了难以在工业上应用的沉淀纯化技术(例如使用PEG或硫酸铵)，还有的使用了蛋白酶抑制剂。这些蛋白酶抑制剂抑制了血清和血浆中存在的胰蛋白酶型蛋白酶的活性，而这些蛋白酶负责切割H因子分子中的asn323和asn324之间的蛋白键。因此，加入上述蛋白酶抑制剂会使得H因子的蛋白水解减弱，从而增加其稳定性。然而，蛋白酶抑制剂经常是毒性很大的化合物，这使得它们不适用于生产用于治疗目的的H因子的工业方法。此外，本发明的方法的明显优势在于可获得H因子的浓缩物，该浓缩物可保留H因子的三种主要活性，而按现有技术获得的H因子则不能。因此，用本发明方法获得的H因子可实现其在补体替代途径中的中心调节物活性，已证实患有HUS特别是非典型性HUS的患者体内缺乏这一活性。特别地，用本发明方法生产的H因子保留了其在补体替代途径中的解离预形成的C3蛋白酶的活性，并已证实能够通过其完整的功能活性用于治疗HUS。用本发明方法获得的H因子浓缩物还具有接近I的特异性活性(AS=O. 8至0. 9)，这使得它比冷冻新鲜血浆的溶液(AS=O. 008)更有效，冷冻新鲜血浆的溶液虽然也有治疗效果，但是也具有本申请说明书上文所述的多种缺陷。在上述缺陷中，给予血浆会向生物体中引入对治疗HUS而言不必要的其他蛋白质(清蛋白，纤维蛋白原等等)，这些蛋白质在另一方面会引发与蛋白载量相关的不良反应或引起变态反应，这被称为“血清疾病”。最后，已证实对血浆中存在的传染性病毒的灭活要比血液衍生物中的病毒灭活更困难，而且灭活的程度也较低。用本发明方法获得的H因子浓缩物更容易进行识别和测试处理，因此提供了很好的病毒安全性。在一个实施方案中，本发明涉及由本发明方法获得的H因子浓缩物，所述H因子浓缩物用于治疗因为补体激活的调控缺陷而导致的疾病。在一个实施方案中，本发明涉及由本发明方法获得的H因子浓缩物，所述H因子浓缩物用于治疗溶血性尿毒症综合征(HUS)。在一个实施方案中，本发明涉及由本发明方法获得的H因子浓缩物，所述H因子浓缩物用于治疗非典型性溶血性尿毒症综合征(aHUS)。在一个实施方案中，本发明涉及由本发明方法获得的H因子浓缩物，所述H因子浓缩物用于在体外或离体条件调控补体的激活的用途。在一个实施方案中，本发明涉及由本发明方法获得的H因子浓缩物，所述H因子浓缩物用于制备治疗或预防性治疗因为补体激活的调控缺陷而导致的疾病的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及由本发明方法获得的H因子浓缩物，所述H因子浓缩物用于制备治疗或预防性治疗溶血性尿毒症综合征(HUS)的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及由本发明方法获得的H因子浓缩物，所述H因子浓缩物用于制备治疗或预防性治疗非典型性溶血性尿毒症综合征(aHUS)的药物的用途。实施例
实施例1:纯化H因子的方法图1示例性显示了用于纯化H因子的方法。将冷冻的人类新鲜血浆置于1°C至6°C解冻，然后通过离心使冷沉淀物的上清液与冷沉淀物的不溶性级分分离。将获得的H因子浓度为约400至约500mg H因子/升的冷沉淀物的上清液上样至阴离子交换型树脂/凝胶(例如DEAE Sephadex型凝胶/树脂)色谱柱上，通过将与维生素K共存的因子保留在树脂/凝胶上而将这些因子从血浆上清液中分离。对H因子浓度为约400至约500mg H因子/升的非保留的血浆上清液级分(级分A)进行肝素琼脂糖FF型凝胶/树脂亲和色谱纯化，通过将抗纤维蛋白酶III保留在树脂/凝胶上而将抗纤维蛋白酶III从级分A中分离。将H因子浓度为约300至约400mg H因子/升的非保留的级分A(级分B)的pH调节至pH 5. 5至pH 6. 5的范围内，优选地调节至pH等于6. O。将调节好pH的级分B上样至另一个肝素琼脂糖FF型凝胶/树脂色谱柱或任何其他包括肝素移植配体的色谱载体上。然后用色谱滤液洗脱血浆级分B中的大部分蛋白。通过一系列洗涤和预洗脱可除去与凝胶/树脂吸附较弱的蛋白质。H因子保留在凝胶/树脂上，然后用离子强度大于凝胶/树脂平衡缓冲液的缓冲液洗脱H因子。稀释洗脱下来的含有H因子的级分(级分C)，然后将其上样至强酸型阳离子交换型凝胶/树脂色谱柱(例如SP琼脂糖Ff型凝胶/树脂或其等同物)上。通过一系列洗涤和预洗脱可除去与凝胶/树脂吸附较弱的蛋白质。H因子保留在凝胶/树脂上，然后用离子强度大于凝胶/树脂平衡缓冲液的缓冲液洗脱H因子。然后用溶剂或洗涤剂(例如聚山梨酯80或TnBP)处理洗脱下来的含有H因子的级分(级分D)，以对其进行病毒灭活。这样的处理很可能有效地病毒，特别是包膜型的病毒。然后稀释级分D，将其pH调节至pH 6. 5至pH 7. 5的范围内。然后将其上样至强酸型阴离子交换型凝胶/树脂色谱柱(例如Q琼脂糖FF型凝胶/树脂或其等同物)上。在一系列洗涤之后，用离子强度大于凝胶/树脂平衡缓冲液的缓冲液洗脱保留在凝胶/树脂上的H因子。在这一色谱步骤中除去了先前加入的用于实现病毒灭活的溶剂或洗涤剂等试剂，还提高了H因子的纯度水平。
然后对洗脱下来的含有H因子的级分(级分E)用开孔率约15nm的滤器进行纳米过滤的除病毒步骤。这一除病毒处理可有效地除去病毒，特别是较小的非包膜病毒。最后浓缩将所得的溶液(级分F)，然后通过超滤和0. 22 y m滤器过滤除菌进行调整。对两个不同批次测量了上述纯化方法的产率和用上述方法纯化的H因子的特异性活性。相应的结果示于表I。特异性活性(A.S.)表示为每mg蛋白质中的H因子型抗原的mg数。表I
权利要求
1.H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征(HUS)的药物的用途。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述药物用于治疗典型性HUS。
3.根据权利要求1的用途，其特征在于所述药物用于治疗非典型性HUS。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于所述H因子是重组体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于所述H因子是通过在细胞中表达H因子基因的基因工程方法产生，所述细胞选自细菌、酵母、真菌或哺乳动物细胞。
6.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于所述药物被制备为冻干的形式。
7.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于所述药物经过了至少一种方法的处理，以除去或灭活至少一种病原体。
8.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于所述药物经过了至少一种病毒灭活方法的处理。
9.根据前述权利要求任一项所述的用途，其特征在于所述药物是病毒灭活的。
全文摘要
本发明涉及H因子用于制备治疗溶血性尿毒症综合征(Hemolytic Uremic Syndrome(HUS))的药物的用途，本发明还涉及从冷冻的新鲜血浆中纯化H因子的方法，本发明还涉及由上述方法获得的H因子浓缩物。
文档编号A61P13/12GK102988958SQ201210149718
公开日2013年3月27日 申请日期2006年12月7日 优先权日2005年12月7日
发明者萨米·什图鲁·阿卡德萨达, 克劳丁·马祖里尔, 迈克尔·普勒, 伯纳德特·科万, 弗雷德里克·戴诺特 申请人:分馏及生物技术法国实验室股份有限公司