用于治疗眼新血管疾病的组合治疗的制作方法

专利名称：用于治疗眼新血管疾病的组合治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及眼科学和医学领域。更具体地讲，本发明涉及采用能抑制血小板衍生生长因子(TOGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的试剂的组合治疗眼的新血管疾病。
背景技术：
血管发生，又被称作新生血管形成，包括由现存的血管形成新枝(sprout)，以及它们侵入周围的组织。一种相关的过程，血管发生(vasculogenesis)包括业已存在于整个组织中的内皮细胞和成血管细胞的分化，以及它们随后连接在一起以便形成血管。血管发生广泛出现在发育期间，并且还出现在创伤愈合期间的健康身体内，以便在损伤或伤害之后恢复血液流向组织。不过，血管发生也与癌和肿瘤形成相关。实际上，肿瘤组织中血管的量是乳腺癌(Weidner 等，(1992) J. Natl. Cancer Inst. 84 :1875-1887)、前列腺癌(Weidner 等,(1993) Am. J. Pathol. 143 :401-409)、脑肿瘤(Li 等,(1994) Lancet344 :82-86)和黑素瘤(Foss 等，(1996)Cancer Res. 56 =2900-2903)的有力的消极预后指标。最近发现，血管发生与许多医学领域的其他疾病状态相关，包括风湿病学、皮肤病学、心脏病学和眼科学。具体地讲，不希望的或病理学组织特异性血管发生与某些特殊疾病状态相关，包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和银屑病(参见例如，Fan等，(1995)TrendSPharmacol. Sci. 16 :57 ;和 Folkman(1995)Nature Med. I :27)。另外，血管通透性的改变被认为在正常和病理学生理过程中起着作用(Cullinan-Bove等，(1993)Endocrinol. 133 :829 ;Senger 等，(1993) Cancer and Metastasis Reviews 12:303)。尽管血管生成过程在上述每一种疾病中都可能与发育血管发生和肿瘤血管发生共有很多特征，但是各自可能具有由于周围细胞的影响产生的特殊的特征。若干眼疾病涉及血管发生的改变。例如，糖尿病性视网膜病，是导致成年人失明的第三大原因(在美国占失明人数的几乎7%)，与广泛的血管生成事件相关。非增殖性视网膜病伴随着视网膜内的周细胞的选择性丧失，并且它们的丧失导致了相关毛细血管的扩张，并且导致了血流的增加。在扩张的毛细血管中，内皮细胞增殖，并且形成外翻，它形成微动脉瘤，并且相邻的毛细血管被阻塞，从而微动脉瘤周围的视网膜区域没有被灌注。最终，支路血管出现在相邻的微动脉瘤区域之间，并且可以看到具有微动脉瘤的早期糖尿病性视网膜病和无灌注的视网膜区域的临床图像。微动脉瘤泄漏，并且毛细血管可能出血，导致渗出物和出血。一旦确定了背景糖尿病性视网膜病的起始阶段，所述状况会发展数年时间段，发展成增殖性糖尿病性视网膜病，并且导致大约5%的失明病例。当视网膜的某些区域持续丧失它们的毛细血管并变得不能灌注，从而导致在视网膜盘和其他地方出现新血管时，发生增殖性糖尿病性视网膜病。这些新血管生长成玻璃体，并且容易出血，从而导致视网膜前出血。在晚期增殖性糖尿病性视网膜病中，大量的玻璃体出血可能填充玻璃体腔的大部分。另外，新血管伴随着纤维组织增殖，它可能导致牵引视网膜脱离。糖尿病性视网膜病主要与糖尿病的持续时间相关；因此,随着人群年龄和糖尿病患者生活的更长，糖尿病性视网膜病的流行率将增加。激光治疗目前被用于非增殖性和增殖性糖尿病性视网膜病。黄斑区周围的泄漏性微动脉瘤的病灶激光治疗使患有临床上显著的黄斑水肿的患者视力的丧失降低了 50%。在增殖性糖尿病性视网膜病中，全视网膜光凝固导致了在整个视网膜上散布数千个微小的灼伤(避开黄斑区)；这种治疗能降低失明比例60%。黄斑水肿和增殖性糖尿病性视网膜病的早期治疗能预防95%的患者在五年时间内失明，而晚期治疗只能防止50%的患者失明。因此，早期诊断和治疗是重要的。涉及新生血管形成的另一种眼疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)，这是一种影响65岁以上的大约1/10的美国人的疾病。AMD的特征是黄斑，即视网膜中心区的一系列病理 学变化，这种变化伴随着降低的视敏度，特别是影响中心视力。AMD涉及被称为视网膜色素上皮的单层细胞，它紧位于感觉视网膜下面。这些细胞滋养并且支持与它们接触的视网膜部分，即，包含视色素的感光细胞。视网膜色素上皮位于玻璃膜上，它是基底膜复合物，在AMD患者中，它会增厚并且硬化。新血管可能从下脉络膜穿透玻璃膜，它包括丰富的血管床。这些血管可能会泄漏流体或者在视网膜色素上皮下面出血，并且还可能在视网膜色素上皮和感觉视网膜之间出血。随后的纤维状瘢痕形成会破坏感光细胞的营养，并且导致这些细胞死亡，从而导致中央视敏度的丧失。这种类型的年龄相关性黄斑病变被称作“潮湿”类型的，这是因为泄漏的血管和视网膜下水肿或血液。潮湿类型只占年龄相关性黄斑病变病例的10%，但是导致了老年人中90%的病例因为黄斑变性而为法定盲。“干燥”类型的年龄相关性黄斑病变涉及视网膜色素上皮的分解，以及上面感光细胞的丧失。干燥类型的病变会降低视力，但是通常只有20/50-20/100的水平。AMD伴随着中心视力的失真，使目标变大或变小或直线出现扭曲、弯曲或没有中心段。在潮湿类型的AMD中，在黄斑区可能注意到感觉视网膜的小的脱离，不过，视网膜下新生血管膜的最终诊断需要荧光素血管造影术。在所述干燥类型中，玻璃疣可能干扰黄斑区的色素沉着模式。玻璃疣是视网膜色素上皮的基底膜的赘疣，它能突出进入细胞，从而导致所述细胞前部膨胀；它们作为年龄相关性黄斑病变的危险因素的原因尚不清楚。目前还没有用于治疗干燥类型的年龄相关性黄斑病变的方法。激光治疗被用于潮湿类型的年龄相关性黄斑病变，并且最初消除了新生血管膜，并且在18个月时阻止了大约50%患者的进一步视力丧失。不过，到60个月时，只有20%的患者仍然有显著效果。业已鉴定了血管发生的多种分子介体，包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、转化生长因子α和β (TGFa，TGFP )、血小板衍生生长因子(TOGF)、血管生成素、血小板衍生内皮细胞生长因子(F1D-ECGF)、白细胞介素-8 (IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)。参与血管发生的其他刺激物包括血管生成素(angiopoietirO-l、Del-1、卵泡抑素(follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、苗条蛋白、midkine、胎盘生长因子、多效蛋白(PTN)、progranulin、增殖蛋白和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)。另外，血管发生的控制还可以通过由身体产生的血管发生的多种负调节剂介导，包括angioarrestin、血管抑素(血纤蛋白溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III、软骨-衍生的抑制剂(⑶I)、⑶59补体片段、内皮抑制素(endostatin)(胶原XVIII片段)、纤连蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素多聚己糖片段、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、干扰素α/β/Y、干扰素诱导型蛋白(IP-IO)、白细胞介素-12、kringle 5 (血纤蛋白溶酶原片段)、金属蛋白酶抑制剂(HMPs)、2_甲氧雌留二醇、胎盘核糖核酸酶抑制剂、血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂、血小板因子-4(PF4)、促乳素16kD片段、增殖蛋白-相关蛋白(PRP)、类视黄醇、四氢皮质醇-S、血小板反应蛋白-I (TSP-I)、脉管抑素(vasculostatin)和血管抑制因子(vasostatin) (I丐网蛋白片段)。在上述血管生成调节剂中，VEGF似乎作为伴随着肿瘤生长的异常血管发生的正调节剂发挥关键作用(综述参见 Brown 等，(1996) Control of Angiogenesis (Goldberg andRosen, eds. ) Birkhauser, Basel, Thomas (1996) J. Biol. Chem. 271 :603-606)。另外，最近业已研究了信号传导分子的I3DGF家族的TOGF-B成员的作用，因为它似乎在血管周围细胞的形成、扩增和正常功能方面发挥作用，所述血管周围细胞有时被称作壁细胞，例如，血管 平滑肌、肾小球膜细胞和周细胞。尽管对与发育、伤口愈合和肿瘤形成伴随的血管发生或新生血管形成的了解较多，但仍然需要确定在血管发生和眼血管发生之间是否存在差异。很显然，尽管伴随着，例如，心脏上的侧支血管形成的血管发生可能对生物有利并且适应生物，但伴随着例如AMD的病理性眼新生血管形成没有已知的好处，并且通常会导致失明(有关综述参见Campochiaro (2000) J. Cell. Physiol. 184 :301-10)。因此,尽管对伴随新生血管形成的分子事件的理解业已取得了进展，但仍然需要利用这些理解去开发用于治疗新血管疾病的其他方法，所述疾病包括眼新血管疾病和诸如与AMD和糖尿病性视网膜病伴随出现的脉络膜新生血管形成的疾病。发明概述业已惊奇地发现，抗-VEGF和抗-PDGF剂的组合，在治疗眼新血管疾病时能提供协同治疗效果。因此，本发明特征在于用于治疗被诊断患有或有危险发展为新血管疾病的患者的方法。该方法包括给所述患者施用抗-VEGF剂和抗-PDGF剂，作为主要或辅助治疗。一方面，本发明提供了用于抑制有所述需要的患者的新血管疾病的方法，其通过同时或相互间隔约90天之内给患者施用TOGF拮抗剂和VEGF拮抗剂来实现，使用量足以抑制所述患者的新血管疾病。另一方面，本发明提供了用于治疗有所述需要的患者的方法，所述患者被诊断患有或有危险发展为新血管疾病，其通过同时或相互间隔90天之内给患者施用TOGF拮抗剂和VEGF拮抗剂来实现，以足以治疗患者的用量施用。在这些方面的特定实施方案中，本发明的方法包括在相互间隔大约10天内施用PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂。在本发明方法的另一种实施方案中，所述I3DGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是在相互间隔5天内施用的。在本发明方法的另一种实施方案中，所述TOGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是在相互间隔约24小时内施用的。在本发明方法的特定实施方案中，所述PDGF拮抗剂和所述VEGF拮抗剂是同时施用的。在另一种实施方案中，本发明的方法包括施用I3DGF拮抗剂，它是TOGF-B拮抗剂。在另一种实施方案中，本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂，它是VEGF-A拮抗剂。在某些实施方案中，本发明的方法包括施用TOGF拮抗剂，它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。在另一种实施方案中，本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂，它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。在特定实施方案中，本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂，它是适体，如EYE001适体。在另一种实施方案中，本发明的方法包括施用VEGF拮抗剂，它是抗体或其结合片段。在特定实施方案中，本发明的方法包括施用I3DGF拮抗剂，它是适体、抗体或其结合片段。在另一种具体实施方案中，本发明的方法包括施用TOGF拮抗剂，它是反义寡核苷
酸。 在本发明这一方面的另一种实施方案中，所述I3DGF拮抗剂和/或所述VEGF拮抗剂是前药。在一种实施方案中，本发明的方法提供了用于抑制或治疗眼新血管疾病的手段。在某些实施方案中，适合通过本发明的方法治疗或抑制的眼新血管疾病包括缺血性视网膜病、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、糖尿病性视网膜缺血或增殖性糖尿病性视网膜病。在另一种实施方案中，本发明的方法提供了用于抑制或治疗有所述需要的患者或被诊断患有或有危险发展为这种疾病的患者的银屑病或类风湿性关节炎的手段。本发明还提供了包括TOGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的，以及可以药用的载体的药用组合物。在这一方面，PDGF和VEGF拮抗剂的使用量都足以抑制所述患者的新血管疾病。在这一方面的一种实施方案中，所述药用组合物包括I3DGF拮抗剂，它是TOGF-B拮抗剂。在另一种实施方案中，所述药用组合物包括VEGF拮抗剂，它是VEGF-A拮抗剂。在某些实施方案中，本发明的药用组合物包括TOGF拮抗剂，它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。在另一种实施方案中，本发明的药用组合物包括VEGF拮抗剂，它是核酸分子、适体、反义RNA分子、核酶、RNAi分子、蛋白、肽、环肽、抗体、抗体片段的结合片段、糖、聚合物或小有机化合物。在其他特定实施方案中，本发明的药用组合物包括VEGF拮抗剂，它是适体，如EYE001适体。在一种实施方案中，本发明的药用组合物包括VEGF拮抗剂，它是抗体或其结合片段。在特定实施方案中，本发明的药用组合物包括I3DGF拮抗剂，它是抗体或其结合片段。在另一种具体实施方案中，本发明的药用组合物包括TOGF拮抗剂，它是反义寡核苷酸。本发明的药用组合物可以包括可以药用的载体，它包括小球体或水凝胶制剂。在另一种实施方案中，所述TOGF拮抗剂和/或所述VEGF拮抗剂是前药。在另一种实施方案中，本发明的药用组合物提供了用于抑制或治疗眼新血管疾病的手段。在某些实施方案中，适合通过本发明的药用组合物治疗或抑制的眼新血管疾病包括缺血性视网膜病、虹膜新生血管形成、眼内新生血管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、糖尿病性视网膜缺血或增殖性糖尿病性视网膜病。在其他实施方案中，本发明的药用组合物提供用于在有所述需要的患者，或被诊断患有或有危险发展为这种疾病的患者中抑制或治疗银屑病或类风湿性关节炎的手段。本发明还提供了包括F1DGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的药物包(pharmaceuticalpack)。在这一方面的一种实施方案中，所述药物包包括TOGF拮抗剂，它是TOGF-B拮抗剂。在这一方面的另一种实施方案中，所述药物包包括VEGF拮抗剂，它是VEGF-A拮抗剂。在另一种实施方案中，所述药物包的TOGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是分别且以单独剂量形式制备的。在另一种实施方案中，所述药物包的I3DGF拮抗剂和VEGF拮抗剂是一起制备的。在某些特定实施方案中，本发明的药物包包括VEGF拮抗剂，它是适体，如EYE001适体。在其他实施方案中，本发明的药物包包括VEGF拮抗剂，它是抗体或其结合片段。在某些实施方案中，本发明的药物包包括TOGF拮抗剂，它是抗体或其结合片段。 在其他特定实施方案中，本发明的药物包包括TOGF拮抗剂，它是反义寡核苷酸。在这一方面的另一种实施方案中，所述I3DGF拮抗剂和/或所述VEGF拮抗剂是前药。附图简述图I (A)是人TOGF-B的核酸序列(GenBank编号X02811) (SEQID NO 1)的示意图。图I⑶是人TOGF-B的氨基酸序列(GenBank编号CAA26579) (SEQ ID NO 2)的示意图。图I(C)是人 PDGF-A 的核酸序列(GenBank 编号 X06374) (SEQ ID NO 11)的示意图。图I(D)是人 PDGF-A 的多肽序列(GenBank 编号 CAA29677) (SEQ ID NO 12)的示意图。图2⑷是人VEGF的核酸序列(GenBank编号NM_003376) (SEQ ID NO :3)的示意图。图2(B)是人 VEGF 多肽氨基酸序列(GenBank 编号 NP_003367) (SEQ ID NO :4)的
示意图。图3(A)是人 PDGFR-B 核酸序列(GenBank 编号 NM_002609) (SEQ ID NO :5)的示意图。图3(B)是人 I3DGFR-B 多肽序列(GenBank 编号 NP_002600) (SEQ ID NO :6)的示意图。图3(C)是人 TOGFR-A 核酸序列(GenBank 编号 NM_006206) (SEQ ID NO :13)的示意图。图3(D)是人 PDGFR-A 多肽序列(GenBank 编号 NP_006197) (SEQ ID NO :14)的示意图。图4 ⑷是人 VEGFR-I (Flt-I)核酸序列(GenBank 编号 AF063657) (SEQ ID NO 7)的示意图。图4(B)是人 VEGFR-I (Flt-I)多肽序列(GenBank编号)(SEQID NO 8)的示意图。图4 (C)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)核酸序列(GenBank编号AF035121) (SEQ ID NO
9)的不意图。
图4 (D)是人VEGFR-2(KDR/Flk-1)多肽序列(GenBank编号 AAB88005) (SEQ ID NO
10)的示意图。图5是比较对照处理(cont)、Gleevec处理(抗-PDGF剂)和Macugen 处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF剂)的角膜新生血管形成测定结果，与用Macugen 和Gleevec的组合处理结果(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的图示。图6㈧是出现在对照(PEG-处理的)小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。图6(B)是出现在Gleevec-处理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图6(C)是出现在Macugen -处理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。图6(D)是出现在用Macugen 和Gleevec两者处理的小鼠角膜上的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。图7(A)是荧光显微镜图像的照片图示，表示正常的角膜脉管系统不会受到施用APB5 O3DGFR抗体，抗-PDGF剂)的影响。图7(B)是荧光显微镜图像的照片图示，表示正常的角膜脉管系统不受施用Gleevec的影响。图7(C)是荧光显微镜图像的照片图示，表示正常的角膜脉管系统不受同时施用Macugen (Mac)和 Gleevec 的影响。图7(D)是荧光显微镜图像的照片图示，表示正常的角膜脉管系统不受施用PEG的影响。图8是激光诱导的脉络膜新生血管形成测定结果的图示，比较了对照处理(cont)、Gleevec 处理(抗-PDGF 剂)和 Macugen 处理(即 pegaptanib 处理，抗-VEGF 剂)与用Macugen 和Gleevec组合处理的结果(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)。图9是激光诱导的脉络膜新生血管形成测定结果的图示，比较了对照-处理的(cont)、APB5-处理的(抗-PGFR抗体，它起着抗-PDGF剂的作用)和Macugen处理(即pegaptanib处理,抗-VEGF适体)与用Macugen和APB5 (Mac+APB5)组合处理的结果。

图10是视网膜发育模型结果的图示，比较了对照处理(cont)、ARC-127处理(抗-PDGF 剂)和 Macugen 处理(即 pegaptanib 处理，抗-VEGF 剂)与用 Macugen 和 ARC-127组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。图11是角膜新生血管形成测定结果的图示，比较了对照处理(cont)、ARC-127处理(抗-PDGF剂)和Macugen处理(即pegaptanib处理，抗-VEGF剂)与用Macugen和ARC-127组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。图12(A)是出现在对照小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。图12⑶是出现在ARC-127-处理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。图12(C)是出现在Macugen-处理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。
图12(D)是出现在用Macugen和ARC-127处理的小鼠角膜中的角膜新生血管形成的荧光显微镜图像的照片图示。图13是角膜新生血管形成测定结果的图示，比较了对照处理(cont)、APB-5处理(抗-PDGF 剂)和 Macugen 处理(即 pegaptanib 处理，抗-VEGF 剂)与用 Macugen 和 APB-5组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。图14是角膜新生血管形成测定结果的图示，比较了对照处理(cont)、APB-5处理(抗-PDGF 剂)和 Macugen-处理(即 pegaptanib 处理,抗-VEGF 剂)与用 Macugen 和 APB-5组合处理(抗-PDGF/抗-VEGF组合治疗)的结果。发明详述在本说明书中所提到的所有文献、专利和专利申请都被收作本文参考。定义在本文中，以下术语和短语具有下面所具有的含义。除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员所普遍了解的相同含义。“拮抗剂”表示能部分或完全抑制靶分子的活性或产生的试剂。具体地讲，术语“拮抗剂”，在本文中选择性地使用时，表示能够降低H)GF、PDGFR、VEGF或VEGFR基因表达水平、mRNA水平、蛋白水平或蛋白活性的试剂。拮抗剂的示例性形式包括，例如，蛋白、多肽、肽(如环肽)、抗体或抗体片段、肽模拟物、核酸分子、反义分子、核酶、适体、RNAi分子和小有机分子。拮抗剂抑制VEGF/VEGFR和TOGF/PDGFR配体/受体靶的示例性的非限定性机制包括抑制配体合成和/或稳定性(例如，使用靶定配体基因/核酸的反义、核酶或RNAi组合物)、阻断配体与它的同源受体的结合(例如，使用抗-配体适体、抗体或可溶性引诱同源受体)、抑制受体合成和/或稳定性(例如，使用靶定配体受体基因/核酸的反义、核酶或RNAi组合物)、阻断受体与它的同源受体的结合(例如，使用受体抗体)和阻断受体被它的同源配体的激活(例如，使用受体酪氨酸激酶抑制剂)。另外，所述拮抗剂可以直接或间接抑制IE分子。在本文中，术语“抗体”意在包括完整的抗体，例如，任何同种型的抗体(IgG、IgA、IgM、IgE等)，并且包括能够识别并且还能与脊椎动物(例如，哺乳动物)蛋白、糖类等特异性起反应的它们的片段。抗体可以使用常规技术片段化，并且以上述完整抗体相同的方式筛选这些片段的用途。因此，该术语包括抗体分子的蛋白酶剪切的片段或重组制备的部分，它能够与某些蛋白选择性地起反应。所述蛋白酶解和/或重组片段的非限定性例子包括Fab、F(ab' )2、Fab'、Fv和单链抗体(scFv)，它包括通过肽接头结合的V[L]和/或V[H]结构域。所述scFv' s可以共价或非共价连接，以便形成具有两个或两个以上结合位点的抗体。本发明包括多克隆抗体、单克隆抗体或抗体的其他纯化制剂和重组抗体。在这里，术语“适体”，可以与术语“核酸配体”互换使用，它表示核酸，所述核酸通过它适应特殊的三维构象的能力，能结合靶分子并且对它具有拮抗作用(即，抑制)。本发明的靶是I3DGF或VEGF (或它们的同源受体I3DGFR或VEGFR之一)，因此，使用了术语I3DGF适体或核酸配体或VEGF适体或核酸配体(或I3DGFR适体或核酸配体或VEGFR适体或核酸配体)。所述适体对靶的抑制可以通过下述方式进行靶的结合，催化性改变靶，以修饰/改变靶或靶的功能活性的方式与靶起反应，作为自杀抑制剂与靶共价附着，促进靶和其他分子之间的反应。适体可以包括多个核糖核苷酸单位、脱氧核糖核苷酸单位或这两种类型核苷酸残基的混合物。适体还可以包括一个或多个修饰过的碱基、糖或磷酸酯主链单位，正如在本文中进一步描述的。“抗体拮抗剂”表示本文所定义的抗体分子，它能阻断或显著减弱靶TOGF或VEGF的一种或多种活性。例如，VEGF抑制抗体可以抑制或减弱VEGF刺激血管发生的能力。如果两个序列的每一个碱基都匹配，即能够形成沃森-克里克(Watson Crick)碱基对，那么一种核苷酸序列就是与另一种核苷酸序列“互补的”。术语“互补链”在这里可以与术语“互补体”互换使用。核酸链的互补体可以是编码链的互补体或非编码链的互补体。短语“保守残基”或“保守性氨基酸取代”表示基于某些共同特性的氨基酸分组。确定独立氨基酸之间的共同特性的功能性途径是分析同源生物的相应蛋白之间的 氨基酸变化的归一化频率。根据所述分析，可以确定氨基酸的组，其中，一组中的氨基酸优选能够彼此交换，因此，它们在对总的蛋白结构的影响上最彼此类似(Schulz，G.E.和R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。以这种方式石角定的氨基酸组的例子包括(i)带电荷的组，由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成,(ii)带正电荷的组，由Lys、Arg和His组成，(iii)带负电荷的组，同Glu和Asp组成，(iv)芳族组，由 Phe、Tyr 和 Trp 组成，(V)氮环组，由His和Trp组成，(vi)大的脂族非极性组，由Val、Leu和Ile组成，(vii)略微极性组，由Met和Cys组成，(viii)小残基组，由 Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 组成，(ix)脂族组，由 Val、Leu、lie、Met 和 Cys 组成，和(X)小轻基组，由Ser和Thr组成。除上面所列举的组之外，每一种氨基酸残基可以形成它自身的组，并且由单独的氨基酸形成的组可以简单地通过本领域常用的氨基酸的单字母和/或三字母的缩写来表
/Jn ο在本文中，术语“相互作用”实际上表示包括分子之间的可检测的关系或结合(例如，生物化学相互作用)，如蛋白-蛋白、蛋白-核酸、核酸-核酸和蛋白-小分子或核酸-小分子之间的相互作用。术语“相互作用的蛋白”表示能够与目标蛋白相互作用、结合和/或以其他方式结合的蛋白，例如，PDGF或VEGF蛋白，或它们的相应的同源受体。在本文中，与核酸，如DNA或RNA相应的术语“分离的”，表示与存在于所述大分子天然来源中的其他DNAs或RNAs分别分离的分子。类似的，在本文中，与多肽相应的术语“分离的”表示与所述多肽的来源中存在的其他蛋白分离的蛋白分子。在本文中，术语分离的还表示在通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽,或者在通过化学合成时基本上不含化学前体或其他化学试剂。“分离的核酸”表示包括核酸片段，它不是作为片段天然存在的，并且不会以天然状态被发现。术语“分离的”在这里还用于表示多肽，它是从其他细胞蛋白中分离的，并且表示包括纯化的和重组多肽两者。
在本文中，术语“标记”和“可检测标记”表示能够检测的分子，包括，但不局限于，放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(例如，生物素或半抗原)等。术语“荧光剂”表示能够表现出可检测范围的荧光的物质或它的部分。可以在本发明中使用的标记的具体例子包括荧光素、若丹明、丹酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、NADPH、α-β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶。“基因在细胞中的表达水平”表示由所述细胞中的基因编码的mRNA，以及前-mRNA新生转录物，转录物加工中间物，成熟mRNA和降解产物的水平，以及由所述基因翻译的蛋白的水平。在本文中，术语“核酸”表示多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)，且如果合适的话，还表示核糖核酸(RNA)。该术语还应当被理解成包括由核苷酸类似物制备的RNA或DNA类似物作为等同物，以及在用于所述实施方案时，单链(有义或反义)和双链多核苷酸、ESTs、染色体、cDNAs、mRNAs和rRNAs是可以被称作核酸的分子的代表性例子。术语“寡核苷酸”表示核苷酸或核苷单体的寡聚体或多聚体，它是由天然存在的碱 基糖类和糖间(主链)键组成的。该术语还包括修饰过的或取代过的寡聚体，包括非天然存在的单体或它的部分，它们起着类似的作用。取代过的寡聚体的整合是基于多种因素的，包括增强了的细胞摄取，或增强了的核酸酶抗性，并且是根据本领域公知方法选择的。完整的寡核苷酸或者仅是它的一部分可以包括取代过的寡聚体。术语“百分比同一性”表示两种氨基酸序列或两种核苷酸序列之间的序列同一性。同一性可以通过比较在每一种序列上的位置确定，它们可以是为了比较而进行比对的。当比较的序列上的相同位置被相同的碱基或氨基酸所占据时，所述分子在该位置上是相同的；当相同的位点被相同或类似的氨基酸残基(例如，在空间和/或电子性质方面类似)所占据时，所述分子可以被称作在该位置上是同源的(类似的)。同源性、相似性或同一性的百分比表示由比较序列所共有的位置上相同或相似氨基酸的数目的函数。可以使用各种比对算法和 / 或程序，包括 Hidden Markov Model (HMM)、FASTA 和 BLAST。HNiM、FASTA和 BLAST 可以从以下机构获得the National Center for Biotechnology Information>National Library of Medicine、National Institutes of Health,Bethesda, Md.和 theEuropean Bioinformatic Institute EBI。在一种实施方案中，两种序列的百分比同一性可以通过所述GCG程序确定，其缺口权重为1，例如，对每一个氨基酸缺口进行加权，就如同它是两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配。用于比对的其他技术描述于以下文献中Methods in Enzymology, vol. 266 Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace& Co. , San Diego,California,美国。如果需要的话,将允许序列中存在缺口的比对程序用于比对所述序列。Smith Waterman是一种类型的允许在序列比对中存在缺口的算法(参见(1997)Meth. Mol. Biol. 70 :173-187)。同样，采用 Needleman 和 Wunsch 比对方法的 GAP程序可用于比对序列。包括使用HMM的更多的技术和算法描述于以下文献中Sequence，Structure, and Databanks A Practical Approach (2000), ed. Oxford UniversityPress, Incorporated and in Bioinformatics !Databases and Systems(1999)ed. KluwerAcademic Publishers。另一种检索策略使用了 MPSRCH软件，该软件在MASPAR计算机上运行。MPSRCH使用Smith-Watermnan算法在大量并行计算机上对序列进行评分。这种方法改善了挑选关系较远的匹配的能力，并且特别能耐受小的缺口和核苷酸序列错误。可以将核酸编码的氨基酸序列用于检索蛋白和DNA数据库。具有独立序列的数据库描述于以下文献中Methods in Enzymology, ed. Doolittle,同上。数据库包括 Genbank、EMBL 和日本的DNA 数据库(DDBJ)。“完全匹配的”在表示双链体时，表示由形成所述双链体的多核苷酸或寡核苷酸链彼此形成了双链结构，以便在每一条链上的每一个核苷酸都与另一条链上的核苷酸发生了沃森-克里克碱基配对。该术语还可以包含可以应用的核苷类似物的配对，如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷等。靶多核苷酸和寡核苷酸或多核苷酸之间的双链体的错配表示所述双链体上的一对核苷酸不能进行沃森-克里克结合。在提到三链体时，该术语表示三链体由完全配对的双链体和第三条链组成，其中，每一个核苷酸都与完全匹配的双链体上的碱基对发生了 Hoogsteen或反向Hoogsteen结合。术语“RNA干扰”、“RNAi”或“siRNA”都表示通过将一个或多个双链RNAs导入靶细胞中来减弱基因或基因产物的表达的任何方法，所述RNA与目标基因同源(特别是与目标基因，例如，PDGF或VEGF的信使RNA同源)。 多态变体还可以包括“单核苷酸多态性”(SNPs)，其中，所述多核苷酸序列有一个碱基的改变(例如，在I3DGF或VEGF中的一个碱基的改变)。SNPs的存在可以是，例如，某些群体、疾病状态或出现疾病状态的倾向的指标。异常“特征(profile) ”，例如，肿瘤细胞的生物学状态表示因为疾病状态而改变的细胞的各种成分的含量。细胞成分包括RNA水平、蛋白丰度水平或蛋白活性水平。在这里，术语“蛋白”可以与术语“肽”和“多肽”互换使用。术语“重组蛋白”表示通过重组DNA技术生产的本发明的的蛋白，其中，一般将编码表达的蛋白或RNA的DNA插入合适的表达载体，该表达载体又被用于转化宿主细胞，以便产生异源蛋白或RNA。另外，短语“源于”，在关于编码重组蛋白的重组基因时，是指在“重组蛋白”的含义内，包括具有天然蛋白的氨基酸序列，或与它类似的通过突变产生的氨基酸序列的蛋白，所述突变包括天然存在的蛋白的取代和缺失。在本文中，术语“转基因”表示核酸序列(编码例如，靶核酸之一，或它的反义转录物)，业已将所述核酸序列导入了细胞。对于导入了它的转基因动物或细胞来说，转基因可以是部分或完全异源的，即，外源的，或者与导入了它的转基因动物或细胞的内源基因同源，不过，它们被设计成或已经以这样的方式插入所述动物的基因组，以便改变插入了它的细胞的基因组(例如，它被插入的位置不同于天然基因的位置，或者它的插入导致了敲除)。转基因还能够以附加体的形式存在于细胞中。转基因可以包括一个或多个转录调控序列，以及任何其他核酸，如内含子，它们可能是所选核酸的最佳表达所必需的。“新血管疾病”表示以改变了的或不受调控的血管发生为特征的疾病，其中伴随着致癌性或致瘤性转化的疾病，即，癌症除外。新血管疾病的例子包括银屑病、类风湿性关节炎和眼新血管疾病，包括糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性。在本文中，术语“新生血管形成”和“血管发生”可以互换使用。新生血管形成和血管发生表示产生新血管进入细胞、组织或器官。血管发生的控制通常在某些疾病状态中发生改变，并且，在很多场合下，与所述疾病相关的病理学损伤与改变了的、不受调控的或不受控制的血管发生相关。持久的、不受调控的血管发生出现在多种疾病状态中，包括以内皮细胞异常生长为特征的疾病，并且支持在这些状况中出现的病理学损伤，包括血管的泄漏和通透性。“眼新血管疾病”是以患者眼中改变了的或不受调控的血管发生为特征的疾病。实例性的眼新血管疾病包括视神经盘新生血管形成、虹膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、绿内障、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、血管原性视网膜病、视网膜变性、葡萄膜炎、视网膜炎性疾病和增殖性玻璃体视网膜病变。术语“治疗”受试者的新血管疾病或“治疗”患有新血管疾病的受试者表示让所述受试者接受药物治疗，例如，施用药物，以便减弱新血管疾病的至少一种症状。因此，在本文中，术语“治疗”意在包括治愈和改善新血管状况或疾病的至少一种症状。因此，在本文中，“治疗”包括施用或开处药用组合物，用于治疗或预防眼新血管疾病。“患者”表示任何动物。术语“动物”包括哺乳动物，包括，但不局限于人和其他灵长类。该术语还包括家畜，如牛、猪、羊、马、狗和猫。 “roGF”或“血小板衍生生长因子”表示能影响血管发生或血管生成过程的哺乳动物血小板衍生生长因子。在本文中，术语“roGF”包括TOGF的各种亚型，包括roGF-B (参见图I(A)和(B))和PDGF-A(参见图I(C)和(D))。另外，在本文中，术语“PDGF”表示TOGF-相关的血管生成因子，如I3DGF-C和TOGF-D，它们通过同源TOGF受体起作用，刺激血管发生或血管生成过程。具体地讲，术语“PDGF”表示生长因子种类的任何成员，它能够⑴与诸如PDGFR-B (参见图3 (A)和(B))或PDGFR-A (参见图3 (C)和(D))的PDGF受体结合；(ii)激活与VEGF受体相关的酪氨酸激酶活性；和(iii)从而影响血管发生或血管生成过程。在本文中，术语“TOGF” 一般表示生长因子种类的以下成员，它能通过结合并且激活反应性细胞类型上的血小板衍生生长因子细胞表面受体(即，PDGFR)来诱导DNA合成和有丝分裂发生。TOGFs能实现的特殊生物学作用包括，例如定向细胞迁移(趋化性)和细胞激活；磷脂酶激活；增强了的磷脂酰肌醇周转和前列腺素代谢；刺激反应性细胞的胶原和胶原酶合成；改变细胞代谢活性，包括基质合成，细胞因子产生，和脂蛋白吸收；在缺少I3DGF受体的细胞中增殖性反应的间接诱导；和有效的血管收缩活性。术语“TOGF”表示包括“TOGF”多肽及其相应的“TOGF”编码基因或核酸。"PDGF-A"表示TOGF的A链多肽及其相应的编码基因或核酸。“H)GF-B”表示TOGF的B链多肽及其相应的编码基因或核酸。“VEGF”或“血管内皮生长因子”表示能影响血管发生或血管生成过程的哺乳动物血管内皮生长因子。在本文中，术语“VEGF”包括VEGF的各种亚型(又被称作血管通透因子(VPF)和VEGF-A)(参见图2(A)和(B))，它们是通过例如，VEGF-A/VPF基因的可变剪接产生的，包括VEGF121、VEGF165和VEGF189。另外，在本文中，术语“VEGF”表示VEGF-相关的血管生成因子，如PIGF (胎盘生长因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，它们通过同源VEFG受体起作用，刺激血管发生或血管生成过程。具体地讲，术语“VEGF”表示生长因子种类的任何成员，它能⑴与诸如 VEGFR-I (Flt-I)(参见图 4(A)和(B))、VEGFR-2 (KDR/Flk-Ι)(参见图4 (C)和(D))或VEGFR-3 (FLT-4)的VEGF受体结合；(ii)激活与VEGF受体相关的酪氨酸激酶活性；和(iii)从而影响血管发生或血管生成过程。术语“VEGF”意在包括“VEGF”多肽及其相应的“VEGF”编码基因或核酸。
“roGF拮抗剂”表示能够部分或完全减弱，或抑制roGF活性或产生的试剂。roGF拮抗剂能够直接或间接减少或抑制特殊的roGF，如roGF-B。另外，与上述“拮抗剂”的定义一致的“roGF拮抗剂”可以包括能够作用于roGF配体或它的同源受体，从而减弱或抑制PDGF-相关的受体信号的试剂。因此，所述“PDGF拮抗剂”的例子包括，例如靶定I3DGF核酸的反义、核酶或RNAi组合物；抗-PDGF适体、抗-PDGF抗体或可溶性I3DGF受体诱饵，其能防止TOGF与它的同源受体结合；靶定同源I3DGF受体(TOGFR)核酸的反义、核酶或RNAi组合物；抗-PDGFR适体或抗-PDGFR抗体，其能结合同源I3DGFR受体；和TOGFR酪氨酸激酶抑制剂。“VEGF拮抗剂”表示能部分或完全减弱或抑制VEGF活性或产生的试剂。VEGF拮抗剂能够直接或间接减弱或抑制特殊的VEGF，如VEGF165。另外，与上述“拮抗剂”定义一致的“VEGF拮抗剂”可以包括能够作用于VEGF配体或它的同源受体，从而减弱或抑制VEGF-相关的受体信号的试剂。因此，所述“VEGF拮抗剂”的例子包括，例如靶定VEGF核酸的反义、核酶或RNAi组合物；抗-VEGF适体、抗-VEGF抗体或可溶性VEGF受体诱饵，其能防止VEGF与它的同源受体结合；靶定同源VEGF受体(VEGFR)核酸的反义、核酶或RNAi组合物；能结 合同源VEGFR受体的抗-VEGFR适体或抗-VEGFR抗体；和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。“足以抑制新血管疾病的量”表示在本发明组合中用于治疗或预防新形成疾病或它的症状所必需的拮抗剂的有效量。用于实施本发明用来治疗性治疗由新血管疾病导致或造成所述新血管疾病的状况的活性拮抗剂的“有效量”根据施用方式、新血管疾病的解剖学部位、患者的年龄、体重和一般健康状况而改变。最后，医生或兽医决定合适的量和剂量方案。所述量被称作足以抑制新血管疾病的量。通过以下详细说明和权利要求书，可以了解本发明的其他特征和优点。多肽X的“变体”表示具有肽X的氨基酸序列的多肽，其中，有一个或多个氨基酸残基发生了改变。所述变体可以具有“保守性”改变，其中，取代的氨基酸具有类似的结构或化学特性(例如，用异亮氨酸取代亮氨酸)。更罕见的是，变体可能具有“非保守性”改变(例如，用色氨酸取代甘氨酸)。类似的微小变化还可以包括氨基酸缺失或插入，或这两者。决定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而又不消除生物学或免疫学活性的指南可以使用本领域所熟知的计算机程序发现，例如，LASERGENE软件(DNASTAR)。术语“变体”，在用于表示多核苷酸序列时，可以包括与基因或它的编码序列相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可以与参考分子具有显著同一性。不过，由于在mRNA加工期间外显子的可变剪接，一般具有更多或更小数目的多核苷酸。相应的多肽可以具有额外的功能结构域，或者缺少所述结构域。物种变体是在物种之间不同的多核苷酸序列。一般，所得到的多肽彼此具有显著的氨基酸同一性。多态变体是特定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。术语“载体”表示能够转运与它连接的其他核酸的核酸分子。一种类型的有用的载体是附加体，即，能够进行染色体外复制的核酸。有用的载体是能够自主复制和/或表达与它连接的核酸的载体。能够指导可操作地与它连接的基因的表达的载体在本文中被称作“表达载体”。一般，可用于重组DNA技术中的表达载体通常是“质粒”形式的，它一般表示环状双链DNA环，在它们的载体形式中，它们不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常使用的形式。不过，本发明意在包括这样的其他形式的表达载体，它们发挥等同的功能，并且它们随后为本领域所公知。组合治疗本发明部分基于VEGF和TOGF活性的特殊抑制作用，其中使用合适的生长因子拮抗剂作为有效的治疗手段，用于治疗患有新血管疾病的患者。I3DGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合施用，提供了治疗眼新血管疾病的比单独施用任意一种拮抗剂更高的治疗益处。鉴于证明这两种因子在刺激视网膜内皮细胞系统的血管发生方面没有表现出显著的协同作用的研究，抗-VEGF和抗-PDGF剂的组合作用是出乎意料的(参见Castellon等，(2001) Exp.Eye Res. 74 :523-35)。PDGF和VEGF是新血管在身体，特别是在眼中生长的重要刺激物。为了抑制I3DGF和VEGF生物学活性而进行的组合治疗提供了用于治疗或预防新血管疾病的方法。因此，本发明涉及使用组合治疗抑制新血管疾病的方法和组合物。具体地讲，本发 明利用在血管细胞中起作用的两种不同的细胞间通讯信号传导途径，即roGF和VEGF信号传导，作为新血管疾病，如眼新血管疾病的治疗靶。这种组合方法特别可用于治疗任何数目的以眼新生血管形成的发展为标志的眼科学疾病或病症，包括，但不局限于，视神经盘新生血管形成、虹膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成、角膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、绿内障、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、血管原性视网膜病、视网膜变性、黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜炎性疾病和增殖性玻璃体视网膜病变。所述组合治疗，由抑制I3DGF(如TOGF-B)和VEGF(如VEGF-Α)信号传导的拮抗剂组成，与单独使用这两种治疗相比，产生了增强了的治疗功效。尽管在下面讨论的例子，描述了单一 I3DGF拮抗剂和单一 VEGF拮抗剂的组合，但可以理解的是，多种拮抗剂的组合可能是所需的。根据本发明的抗-PDGF和抗-VEGF组合治疗可以单独进行，或者与其他治疗组合进行，并且可以在家庭、医务室、诊所、医院门诊室或医院提供。治疗一般在医院开始，从而医生能够密切观察治疗效果，并且进行任何需要的调整。组合治疗持续时间取决于接受治疗的新血管疾病的类型、患者的年龄和状况、患者疾病的阶段和类型以及患者对治疗的反应。另外，有发展为新血管疾病的较大风险的人(例如，糖尿病患者)可以接受治疗，以抑制或延缓症状的发作。本发明所提供的一个显著优点是，将roGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合用于治疗新血管疾病，使得能够施用低剂量的每一种拮抗剂，和较少的总的活性拮抗剂，因此以较低的毒性和副作用以及低成本提供了相似的功效。所述组合的每一种成分的施用剂量和频率可以独立地控制。例如,一种拮抗剂可以每天施用三次，而第二种拮抗剂可以每天施用一次。组合治疗能够以断断续续的循环形式提供，它包括静止时间段，以便患者身体有机会从任何尚无法预料的副作用中恢复。所述拮抗剂还可以一起制备，以便一次施用能够送递两种拮抗剂。PDGF和VEGF拮抗剂靶PDGF最初是从血小板裂解物分离的，并且被确定为存在于血清而不是血浆中的主要生长促进活性。首先显示roGF的促有丝分裂活性作用在结缔组织细胞上，如成纤维细胞和平滑肌细胞，并且存在于培养物中的神经胶质细胞中。业已鉴定了两种同源roGF同工型，PDGF A和B，它们是由独立的基因(位于7号和22号染色体上)编码的。来自血小板的最主要的种类是AB异源二聚体，尽管所有三种可能的二聚体(AA、AB和BB)都是天然存在的。在翻译之后，PDGF 二聚体被加工成大约30kDa的分泌蛋白。业已鉴定了以高亲和力结合I3DGF的两种细胞表面蛋白，α和β (Heldin等，(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 :3664 ；ffilliams 等，(1981)Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 79 5867)。这两个种类都包括五个免疫球蛋白-样细胞外结构域、一个跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域，该结构域是由激酶插入结构域隔开的。在过去几年中，业已阐明了三种TOGF同工型对三种受体二聚体(α/α、α/β和β/β)的特异性。α -受体同源二聚体能以高的亲和力结合所有三种TOGF同工型，β -受体同源二聚体只能以高的亲和力结合TOGF BB,而结合TOGF AB的亲和力低大约10倍，并且α / β -受体异源二聚体能够以高亲和力结合PDGF BB和PDGF AB(ffestermark&Heldin(1993)Acta Oncologica 32:101)。所述特异性模式似乎是由于A-链只能结合α-受体，而B-链能以高亲和力结合α和β_受体亚基两者的能力造成的。总的来说，本发明提供了能够抑制一种或多种I3DGF活性的试剂。这些TOGF-抑制齐U，或roGF拮抗剂能够作用于一种或多种形式的所述roGF配体。血小板衍生生长因子包括A-链(roGF-Α)和B-链(roGF-B)的同源或异源二聚体，它们通过结合两种相关的受体 酪氨酸激酶，[α ]-受体(H)GFR- [ α ])和[β ]-受体(TOGFR- [ β ])并且使其二聚化发挥作用。另外，业已鉴定了所述I3DGFR复合物的两种新的蛋白酶激活配体，PDGF-C和TOGF-D (参见 Li 等，(2000)Nat. Cell. Biol. 2 :302-9 ；Bergsten 等，(2001)Nat. Cell. Biol. 3 :512-6 ；和 Uutele 等，(2001) Circulation 103:2242-47)。由于所述 PDGFRs 的不同的配体结合特异性，已知 PDGFR-[ α ] [α ]能结合 PDGF-AA、PDGF-BB, PDGF-AB 和 PDGF-CC ； PDGFR-[β ][β ]能结合 PDGF-BB 和 PDGF-DD ;而 PDGFR-[ α ] [β ]能结合 PDGF_AB、PDGF-BB、PDGF_CC 和PDGF-DD (参见 Betsholtz 等，(2001)BioEssays 23:494-507)。VEGF是分泌的二硫键连接的同源二聚体，它能选择性地刺激内皮细胞增殖，迁移，并且产生基质降解酶(Conn 等，(1990)Proc. Natl. AcacL Sci. (USA) 87 1323-1327) ；Ferrara 和 Henzel(1989)Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 :851-858)；Pepper 等，(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 :902-906 ；Unemori 等，(1992)J. Cell. Physiol. 153 :557-562)，它们都是形成新血管所需要的过程。VEGF以四种形式(VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189, VEGF-206)存在，这是由于VEGF基因的可变剪接产生的(Houck 等,(1991)Mol-Endocrinol. 5 :1806-1814 ;Tischer 等，(1991) J. Biol.Chem. 266 11947-11954)。两种较小的形式是可扩散的，而较大的两种形式保持主要位于细胞膜上，这是它们对肝素高亲和力的结果。VEGF-165还能与肝素结合，并且是最丰富的形式。VEGF-121，即不能与肝素结合的唯一形式，似乎对VEGF受体具有较低的亲和力(Gitay-Goren 等，(1996) J. Biol. Chem. 271 =5519-5523)以及较低的促有丝分裂效力(Keyt等，(1996)J. Biol. Chem. 271 :7788-7795)。VEGF的生物学作用是由两种酪氨酸激酶受体(Flt-I和Flk-1/KDR)介导的，它们的表达在很大程度上局限于内皮来源的细胞(deVries 等，(1992) Science 255 :989-991 ;Millauer 等，(1993)Cell 72 :835-846 ；Terman等，(1991)0nCOgene 6:519-524)。尽管两种功能性受体的表达都是高亲和力结合所必需的，但内皮细胞内的趋化性和促有丝分裂信号传导似乎主要是通过KDR受体进行的(Park等，(1994) J. Biol. Chem. 269 :25646-25654 ；Seetharam 等，(1995) Oncogene 10:135-147;Waltenberger 等，(1994) J. Biol. Chem. 26988-26995)。最近业已在缺少 VEGF 基因的单个等位基因(Carmeliet 等，(1996)Nature 380 :435-439 ;Ferrara 等，(1996)Nature 380 439-442)或 Flt-I 的两个等位基因(Fong 等，(1995)Nature 376 :66-70)或 Flk-I 基因(Shalaby等，(1995) Nature 376 :62-66)的小鼠体内证实了 VEGF和VEGF受体对血管发育的重要性。在每一种场合下，都发现血管形成的明显的异常导致了胚胎致死。现在已知由组织缺氧诱导的补偿性血管生成是通过VEGF介导的(Levy等，(1996)J. Biol. Chem. 2746-2753) ;Shweiki 等，(1992)Nature 359:843-845)。在人类中所做的研究业已表明，在血管生成性视网膜疾病的玻璃体中存在高浓度的VEGF，但是在无活性的或非-新生血管形成疾病状态中不存在所述高浓度的VEGF。在实验黄斑下手术之后切断的人类脉络膜组织同样表现出高的VEGF水平。除了是唯一的已知内皮细胞特异性有丝分裂原之外，VEGF是血管生成生长因子中独特的，表现在它在诱导血管对大分子的通透性瞬时增加的能力方面(因此，它的最初 的和替代的名称是血管通透因子，VPF)(参见Dvorak等，(1979) J. Immunol. 122 :166-174 ；Senger 等，(1983) Science 219 :983-985 ;Senger 等，(1986) Cancer Res. 46 :5629-5632)。增加了的血管通透性和所导致的血浆蛋白在血管外间隙的沉积，有助于通过提供内皮细胞迁移的临时基质形成新血管(Dvorak等，(1995) Am. J. Pathol. 146 =1029-1039)。通透性过高确实是新血管的特有特征，包括与肿瘤相关的血管。PDGF 和 VEGF 桔杭剂概要本发明提供了一起用于新血管疾病的组合治疗的TOGF和VEGF的拮抗剂(即，抑制剂)。特异性TOGF拮抗剂和VEGF拮抗剂为本领域所公知，并且简单地描述于以下部分。现在或者已经是技术人员能够得到的其他TOGF拮抗剂和VEGF拮抗剂包括抗体、适体、反义寡聚体、核酶和RNAi组合物，它们能够通过本领域的常规实践结合本说明书的教导和指导鉴定和生产，包括在下面进一步提供的部分。
I3DGF 拮抗剂一般，H)GF(例如，PDGF-B)的抑制可以通过多种方式实现。例如，可以获得能抑制roGF的活性或产生的多种roGF拮抗剂，并且可将其用于本发明的方法。示例性的roGF拮抗剂包括I3DGF的核酸配体或适体，如在下文中所描述的。另外，所述I3DGF拮抗剂可以是，例如，抗-PDGF抗体或抗体片段。因此，通过抑制它与受体的结合可以使所述TOGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制I3DGF表达的诸如反义RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本发明的拮抗剂。其他TOGF拮抗剂包括肽、蛋白、环肽或小有机化合物。另外，通过破坏它的下游信号传导，能够抑制TOGF的信号传导活性，例如，通过使用多种小分子酪氨酸激酶抑制性拮抗剂，包括下面所描述的拮抗剂。化合物或试剂起着I3DGF拮抗剂作用的能力可以按照本领域已知的方法确定，且另外，可以参见以下文献，例如，Dai等，(2001)Genes&Dev. 15 :1913-25 ;Zippel，等，(1989) Eur. J. Cell Biol. 50(2) :428-34 ;和 Zwiller,等，(1991)0ncogene6 :219-21.本发明还包括本领域所公知的TOGF拮抗剂，以及下文所支持的，以及属于普通技术人员知识范围内的任何和所有等同试剂。例如，抗roGF的抑制性抗体为本领域所公知，例如，描述于美国专利号 5，976，534,5, 833，986,5, 817，310,5, 882，644,5, 662，904、5，620，687、5，468，468和PCT W02003/025019中的那些，所述文献内容被以全文形式收作本文参考。另外，本发明包括N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，它是I3DGF拮抗剂，例如公开于美国专利号 5，521，184 和 W02003/013541、W02003/078404、W02003/099771、W02003/015282和W02004/05282中的那些，所述文献被以全文形式收作本文参考。能阻断PDGF作用的小分子为本领域所公知，例如，描述于美国专利号6，528，526 (H)GFR酪氨酸激酶抑制剂)、6，524，347 (H)GFR酪氨酸激酶抑制剂)、6，482，834 O3DGFR酪氨酸激酶抑制剂)、6，472，391 O3DGFR酪氨酸激酶抑制剂)、6，696，434、6，331，555,6, 251，905,6, 245，760,6, 207，667,5, 990，141,5, 700，822,5, 618，837 和5，731，326中的那些，所述文献内容被以全文形式收作本文参考。能阻断TOGF作用的蛋白和多肽为本领域所公知，例如，描述于美国专利号6，350, 731 (PDGF肽类似物)、5，952，304中的那些，所述文献内容被以全文形式收作本文参考。能抑制EGF和/或TOGF受体酪氨酸激酶的双单-和双环芳基和杂芳基化合物为 本领域所公知，例如，描述于例如美国专利号5，476，851,5, 480，883,5, 656，643,5, 795，889和6，057，320中的那些，所述文献内容被以全文形式收作本文参考。用于抑制TOGF的反义寡核苷酸为本领域所公知，例如，描述于美国专利号5，869，462和5，821，234中的那些，每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。用于抑制I3DGF的适体(又被称作核酸配体)为本领域所公知，例如，描述于例如美国专利号 6，582，918,6, 229，002,6, 207，816,5, 668，264,5, 674，685 和 5，723，594 中的那些，每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。本领域所公知的用于抑制TOGF的其他化合物包括，描述于美国专利号5，238，950、5，418，135、5，674，892、5，693，610、5，700，822、5，700，823、5，728，726、5，795，910、5，817，310、5，872，218、5，932，580、5，932，602、5，958，959、5，990，141、6，358，954,6, 537，988和6，673，798中的那些，每一份文献的内容都以全文形式收作本文参考。VEGF 拮抗剂VEGF(例如，VEGF-Α)的抑制是通过多种方式实现的。例如，能抑制VEGF活性或产生的多种VEGF拮抗剂，包括核酸分子，如适体、反义RNA、核酶、RNAi分子和VEGF抗体可以获得，并且能够用于本发明的方法中。示例性的VEGF拮抗剂包括VEGF的核酸配体或适体，正如下文所描述的。对VEGF-A的特别有用的拮抗剂是EYE001 (以前称为NX1838)，它是修饰过的、PEG化的适体，它能以高的和特异性亲和力结合主要的可溶性人VEGF同工型(参见，美国专利号6，011，020 ;6，051，698 ;和6，147，204)。所述适体能够以与针对VEGF的高亲和力抗体类似的方式结合并且使VEGF失活。另一种有用的VEGF适体是EYE001，它是非-PEG化的形式的。另外，所述VEGF拮抗剂可以是，例如，抗-VEGF抗体或抗体片段。因此，通过抑制它与受体结合使VEGF分子失活。另外，能在核酸水平上抑制VEGF表达或RNA稳定性的诸如反义RNA、核酶和RNAi分子的核酸分子可用作本发明的方法和组合物中的拮抗剂。其他VEGF拮抗剂包括肽、蛋白、环肽和小有机化合物。例如，能结合VEGF受体而又无伴随的信号传导活性的可溶性截短形式的VEGF也可用作拮抗剂。另外，VEGF的信号传导活性可以通过破坏它的下游信号传导抑制，例如，通过使用多种拮抗剂，包括VEGF受体酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂，正如下文所进一步描述的。
化合物或试剂起着VEGF拮抗剂作用的能力，可以按照本领域所熟知的多种标准方法确定。例如，VEGF的生物学活性之一是通过与血管内皮细胞上的受体结合来增强血管通透性。所述相互作用导致了紧密的内皮连接的松弛，其后果是造成血管流体的泄漏。通过VEGF诱导的血管泄漏可以在体内测量，其通过跟踪由于皮内注射VEGF导致的伊文思蓝染料从豚鼠脉管系统的泄漏来进行(Dvorak等，in Vascular PermeabilityFactor/Vascular Endothelial Growth Factor, Microvascular Hyperpermeability, andAngiogenesisJP (1995) Am. J. Pathol. 146 :1029)。类似地，可以将所述测定方法用于测量拮抗剂阻断VEGF的这种生物学活性的能力。在血管通透性测定的有用的例子中，VEGF165 (20-30nM)与EYEOOl (30ηΜ_1 μ Μ)或候选VEGF拮抗剂离体(ex vivo)预混合，并且随后通过皮内注射施用到豚鼠背部的剔毛的皮肤中。在注射之后30分钟，按照标准方法对注射部位周围的伊文思蓝染料泄漏进行定量，其通过使用计算机化的形态度量分析系统实现。能抑制VEGF-诱导的指示染料从脉管系统中泄漏的化合物被认为是本发明的方法和组合物的有用拮抗剂。用于确定化合物是否是VEGF拮抗剂的另一种测定方法是所谓的角膜血管发生测 定。在该测定方法中，将含有VEGF165 (3pmol)的methacyrate聚合物沉淀植入大鼠的角膜基质中，以诱导血管生长进入正常的无血管角膜。然后将候选VEGF拮抗剂通过静脉内途径施用到大鼠体内，剂量为lmg/kg、3mg/kg和10mg/kg,每天一次或两次,施用5天时间。在治疗时间段结束时，对所有个体的角膜进行显微照相。新血管在角膜组织中发育的程度，以及候选化合物对它们的抑制作用，随后通过显微照片的标准化形态度量分析进行定量。与用磷酸缓冲盐水(PBS)处理相比，能抑制角膜中VEGF-依赖型血管发生的化合物被认为是本发明的方法和组合物的有用的拮抗剂。还使用早熟性视网膜病的小鼠模型鉴定了候选VEGF拮抗剂。在一个有用的例子中，分别将9、8、8、7和7只小鼠同窝崽放置在室内空气中或者增加含氧量，并且通过腹膜内用磷酸缓冲盐水(PBS)或候选VEGF拮抗剂进行处理(例如，以lmg/kg、3mg/kg或10mg/kg/天进行处理)。然后通过在来自所有处理过的和对照小鼠的每只眼的20个组织学切片中进行显微镜鉴定和新血管芽计数来估计测定终点，即新毛细血管通过角膜的内界膜长出到玻璃体液中。相对未处理过的对照而言处理过的小鼠的视网膜新脉管系统的减少被确定为鉴定有用的VEGF拮抗剂。在另一种示例性的筛选测定方法中，使用体内人类肿瘤异种移植测定鉴定候选VEGF拮抗剂。在这种筛选测定中，在植入裸鼠中的人类肿瘤异种移植物(A673横纹肌肉瘤和Wilms肿瘤)中检测候选VEGF拮抗剂的体内功效。然后用候选VEGF拮抗剂处理小鼠(例如，10mg/kg，每天腹膜内施用一次，然后发展为确定的肿瘤(200mg))。用对照试剂处理对照组。被确定为相对对照而言能抑制A673横纹肌肉瘤生长和Wilms肿瘤的候选化合物被认为是本发明的方法和组合物的有用的拮抗剂。测定VEGF拮抗剂活性的其他方法为本领域所公知，并且在下文进一步描述。本发明还包括本领域所公知的VEGF拮抗剂，以及下面所支持的那些，和普通技术人员知识范围内的任何和所有等同试剂。例如，针对VEGF的抑制抗体为本领域所公知，例如，描述于美国专利号 6，524，583,6, 451，764 (VRP 抗体)、6，448，077,6, 416，758、6，403, 088 (针对 VEGF-C)、6，383，484 (针对 VEGF-D)、6，342，221 (抗-VEGF 抗体)、6，342，219,6, 331，301 (VEGF-B 抗体)和 5，730，977，和 PCT
发明者D·施马, P·卡利亚斯, A·P·亚当米斯 申请人:奥普索特克公司